CN110938122B

CN110938122B - 雄性不育基因OsNIN5及其应用和育性恢复的方法

Info

Publication number: CN110938122B
Application number: CN201911267383.8A
Authority: CN
Inventors: 梁婉琪; 张大兵; 汪冲; 李焕军; 袁政
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN110938122A

Abstract

本发明涉及水稻育种技术领域，具体涉及一种雄性不育基因OsNIN5及其应用和育性恢复的方法；所述的雄性不育基因OsNIN5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用是：采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsNIN5基因，使得常规水稻品种中的OsNIN5基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。本发明通过引物扩增OsNIN5基因，使用遗传转化的手段，能够使突变体恢复到野生型表型。本发明获得的水稻Osnin5不育系营养生长阶段没有明显异常,在长光高温条件下完全不育，可应用于杂交育种，在海南省生长(短日低温)部分可育，繁种简易，在农业生产上具有重要的应用。

Description

雄性不育基因OsNIN5及其应用和育性恢复的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的水稻株系创制的方法，具体是一种雄性不育基因OsNIN5及其应用和育性恢复的方法。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一，更是我国最重要的粮食作物。中国约有60％以上的国人以稻米为主食,是世界上最大的稻米生产国和消费国。杂交水稻可以大幅度的提高水稻产量，是解决粮食问题的重要方法。目前生产上使用的杂交水稻属于三系杂交水稻，比常规水稻增产20％左右。但是三系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系的限制。因此，科学家们一直在筛选和培育新的不育系，为远缘杂交和杂交优势的利用奠定基础。其中，利用分子生物学手段阻断雄性配子体的发育，制造雄性不育系是杂交育种的重要手段。

雄性不育在自然界中普遍存在，水稻雄性配子体成熟于水稻花药中，雄性配子体的成熟包括复杂的生物学过程。首先，造孢细胞增殖发育形成花粉母细胞，花粉母细胞经过减数分裂形成四分体，随后包裹在四分体周围的胼胝质降解，释放出小孢子，单核小孢子经过两次有丝分裂形成两个生殖核和一个营养核，同时小孢子表面形成外壁结构最终发育成为成熟花粉。减数分裂过程是形成单倍体配子，进而保证在双受精过程中遗传物质恢复原来倍性。在减数分裂过程中，同源染色体进行联会、配对，保证同源染色体能够正确的分配到子细胞中，并能正确形成单倍体配子。雄配子体发育过程受到多种因素的调节，其中一个环节出错将会导致小孢子不能正常发育进而导致雄性不育。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种雄性不育基因OsNIN5及其应用和育性恢复的方法，本发明首次发现该OsNIN5基因在短日低温条件下具有部分可育的特性。利用OsNIN5基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，及其利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种水稻雄性不育基因OsNIN5，所述雄性不育基因OsNIN5编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，编码所述雄性不育基因OsNIN5的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

第二方面，本发明涉及一种水稻雄性不育基因OsNIN5的应用，所述雄性不育基因OsNIN5编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的应用具体是，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsNIN5基因，使得常规水稻品种中的OsNIN5基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。

第三方面，本发明涉及一种水稻雄性不育株系的制备方法，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，使得水稻中编码如SEQ ID No.1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失；

所述水稻品种为粳稻品种9522、籼稻9311或广陆矮4号；更优选为粳稻品种9522。

优选地，所述水稻中编码如SEQ ID No.1所示氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，所述水稻雄性不育株系的制备方法包括如下步骤：采用物理诱变的方法，使常规水稻品种中如SEQ ID No.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID No.10，进而获得所述水稻雄性不育株系，即Osnin5突变体。

优选地，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤：采用物理诱变的方法，使常规水稻品种中如SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.11，进而获得所述水稻雄性不育株系，即Osnin5突变体。

优选地，所述基于CRISPR/Cas9系统具体包括：采用CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法，敲除OsNIN5基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达。

更优选地，所述CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：

a)合成单核苷酸序列，引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

OsNIN5CRISPRUP(SEQ ID No.3):GCTCGCCTTCAGTTAAGAGA

OsNIN5CRISPRLOW(SEQ ID No.4):AAGTCGAATATCCAGTCAGG

b)通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与pRGEB32载体片段进行连接反应，构建含有水稻OsNIN5基因靶序列的OsNIN5-RGEB32质粒；所述靶序列如SEQ IDNo.13所示；

c)用含OsNIN5-RGEB32质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d)通过将OsNIN5基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序,筛选突变植株。

所述水稻OsNIN5基因靶序列如下所示：

SEQ ID No.13:CTGAAAGTCCTGAATGCCAAAGG

采用pRGEB32质粒对于基因组的多重编辑能力更强、效率更高。

第四方面，本发明还涉及一种前述的方法获得的水稻雄性不育株系在水稻制种中的用途，所述用途包括：以所述水稻雄性不育株系作为母本，进行杂交育种；在海南省的短日低温条件下进行种植，水稻Osnin5不育株系可部分结实，用于种子繁殖。

第五方面，本发明还涉及一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包括如下步骤：采用常规遗传手段将所述OsNIN5基因转入上述方法获得的水稻雄性不育株系中，进而使得突变体恢复野生型表型。

优选地，所述方法包括如下步骤：将含OsNIN5互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsNIN5互补构建含有序列如SEQ ID No.5所示的核苷酸。

更优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从水稻9522基因组中用碱基序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的引物扩增出OsNIN5基因的6082bp的基因组序列片段(包含启动子序列)；

(b)提供携带表达OsNIN5互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105；

(c)将水稻雄性不育株系的细胞或组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织或器官，再生，获得恢复育性的水稻植株。

本发明的研究表明，长光高温条件下，Osnin5完全不育，可以用于杂交育种；而在海南生长条件下(短日低温)，可以使Osnin5部分结实，通过种子保存该突变体，免去利用保持系保存不育系的繁琐工作。

本发明具有如下的有益效果：

本发明通过控制雄性不育基因OsNIN5及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育的变异株，实现控制水稻生殖过程；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到部分不育或完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为pRGEB32载体及OsNIN5 CRISPR的构建示意图；

图2为Osnin5突变体植株的形态学观察示意图；其中，图2A为野生型和Osnin5突变体整株表型；图2B为野生型和Osnin5突变体穗形；图2C为野生型和Osnin5突变体小花；图2D为野生型和Osnin5突变体小花内部结构；图2E为野生型和2F为Osnin5突变体I2/KI染色结果；图2G为野生型和Osnin5突变体成熟穗子；图2H为野生型和Osnin5突变体结实率的统计结果；

图3为Osnin5基因表达模式图；

图4为野生型和Osnin5突变体在上海和海南的结实率统计结果；

图5为互补突变体得到野生型表型示意图；其中，图5A为野生型小花内部结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果；图5B为Osnin5突变体小花内部结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果；图5C为Osnin5突变体恢复株系小花内部结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所述OsNIN5基因为编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

实施例1、水稻雄性不育株系创制的方法

1.1通过物理诱变手段创制Osnin5水稻雄性不育株系

本实施例中OsNIN5基因的编码区序列如SEQ ID No.2所示。本实施例的Osnin5突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过常规的基因工程方法突变而得。

本领域人员知晓，还可以采用诸如射线照射等其他手段诱变水稻常规品种进行突变，具体包括经过⁶⁰Coγ射线诱变获得Osnin5突变体，处理剂量为280Gy(参照方法：陈亮，储黄伟,袁政,et al.60Coγ-Ray射线诱变水稻突变体的分离和遗传学初步分析[J].厦门大学学报：自然科学版,2006,(S1):82-85)。对诱变的突变体回交三代，获得隐性核单基因控制的稳定遗传的Osnin5突变体。将Osnin5突变体与9522回交，所有F1代的表型都与9522一致，表现为可育。突变体与野生型杂交的F1代自交后产生的F2代群体中，可育与不育植株的分离比约为3:1(可育：不育＝183：62，χ²＝0.012，P>0.05)，表明这是一个由隐性单基因突变导致的突变体不育的表型。

1.2水稻雄性育性控制基因OsNIN5的克隆

利用发明人构建的包含雄性不育基因OsNIN5(其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)及其突变基因Osnin5(其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)组成的、本领域内技术人员清楚的水稻基因图位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定位于1个小的基因组片段内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因组DNA克隆。经测序和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整水稻雄性生殖发育控制蛋白OsNIN5。

经全核苷酸序列分析结果表明：雄性不育基因OsNIN5全长为3113bp(SEQ IDNo.12，包含调控区和内含子)。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID No.2所示，编码全长为560个氨基酸的蛋白OsNIN5，其序列如SEQ ID No.1所示。

1.3水稻雄性育性控制蛋白基因的点突变

本实施例的Osnin5突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过对OsNIN5基因的序列变异获得，经过对Osnin5突变基因与OsNIN5基因的序列比较，水稻雄性生殖发育控制蛋白的点突变(I376T)使得水稻雄性生殖器官不能正常发育，造成植株不育；本实施例Osnin5的突变基因是在编码区的单个碱基替换(其序列如SEQ ID No.10所示),使SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.11，从而引起水稻雄性生殖发育控制蛋白功能改变。

1.4通过CRISPR手段突变水稻品种中的OsNIN5基因

为了对OsNIN5蛋白进行应用，构建了OsNIN5基因CRISPR的载体(OsNIN5-RGEB32)，并转化野生型9522植株，以阻碍OsNIN5的完整表达，从而达到改变水稻育性的目的。pRGEB32载体及OsNIN5 CRISPR的构建示意图如图1所示。具体步骤如下：

1.4.1合成单核苷酸序列引物

OsNIN5CRISPRUP(其序列如SEQ ID No.3所示):GCTCGCCTTCAGTTAAGAGA

OsNIN5CRISPRLOW(其序列如SEQ ID No.4所示):AAGTCGAATATCCAGTCAGG

1.4.2通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与pRGEB32载体片段(由华中农业大学谢卡斌教授惠赠)进行连接反应，构建含有水稻OsNIN5基因靶序列(如SEQID No.13所示)的OsNIN5-RGEB32质粒；

1.4.3将OsNIN5-RGEB32质粒转入农杆菌中构建得到含有OsNIN5-RGEB32质粒的农杆菌在含有Kan(50μg/μl)的YEB平板上划线培养，获的单菌落。挑单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的YEB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD₆₀₀为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，形成的AAM农杆菌菌液此时即可用于转化水稻各种受体材料。

1.4.4本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的9522未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中(与水1:3混合，加2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并接种在N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤组织浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将幼胚愈伤组织移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮，使用浓度为100μM。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有25mg/L Hyg的选择培养基上进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。

1.4.5将获得的阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。测序检测靶位点基因序列，如果发生纯合突变则为有效的基因敲除植株，即Osnin5突变体植株。

1.5OsNIN5蛋白活性丧失或表达水平降低导致水稻雄性发育异常

对上海市的长光高温条件下(温度为28-32℃、光照条件为12.5-14小时)种植得到的Osnin5突变体植株的形态学观察。如图2所示，Osnin5突变体与野生型相比营养生长、小穗、小花以及穗子的形态均无异常(图2A,2B,2C,2G),野生型9522花药发育正常(图2D)，而Osnin5突变型花药呈淡黄色且变小(图2D)；野生型9522成熟花粉可被I₂/KI染色(图2E)，突变型Osnin5与野生型花药成熟期相对应的时期观察到少数花粉粒可被I₂/KI染色，绝大部分花粉形态皱缩，不能被I₂/KI染色(图2F)。

1.6OsNIN5表达特征

利用Osnin5突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用荧光定量PCR的方法确定OsNIN5基因的表达模式(如图3)，发现OsNIN5基因在水稻雄性生殖发育时期有广泛表达，且在水稻雄性生殖发育时期Stage7和Stage8表达最高；此外，营养发育过程中的根中有较低表达。

1.7 OsNIN5基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用

将Osnin5突变体与籼稻品种9311或广陆矮4号水稻品系杂交，在F2代中具有籼型特征的植株中均出现了雄性不育株系，符合3:1分离规律，进而证明OsNIN5基因在其他水稻品种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生雄性不育植株。不同生态型的Osnin5不育株系在海南省的短光低温条件下(温度为22-25℃、光照条件为11-12小时)种植，育性部分恢复，可进行种子繁殖。

实施例2 Osnin5突变体在水稻制种中的用途

将Osnin5突变体作为母本与三系杂交组合保持系亲本JY5B杂交，得到F1代。在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将该植株继续回交，再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与JY5B杂交，经多代杂交筛选后获得新的雄性不育系JY5-nin5，适宜作为杂交组合中的母本。进一步分析表明，长光高温条件下(温度为28-32℃、光照条件为12.5-14小时)，Osnin5完全不育，可以用于杂交育种；而在短光低温生长条件下(温度为22-25℃、光照条件为11-12小时)，Osnin5可部分结实(如图4)，通过种子保存该突变体，免去利用保持系保存不育系的繁琐工作。

实施例3恢复Osnin5突变体雄性不育性状的方法

将编码OsNIN5基因的基因组核苷酸序列转入突变体Osnin5植株，能够使突变体恢复到野生型表型。具体为将含OsNIN5互补构建的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsNIN5互补构建含有序列如SEQ IDNo.5所示的核苷酸。具体步骤如下：

3.1从水稻9522基因组中用引物：

OsNIN5-1F(其序列如SEQ ID NO.6所示):TCTAGAAGTGGTACCCAGCACCTGCTAG(XbaI)

OsNIN5-1R(其序列如SEQ ID NO.7所示):CCATGGTTCAATTGTGAAGGAAATGCT(NcoI)

扩增3579bp OsNIN5-L启动子片段，用内切酶XbaI和NcoI酶切后连接水稻的双元载体pCAMBIA1301；测序正确后，获得pCAMBIA1301-OsNIN5pro载体。

3.2从水稻9522基因组中用引物：

OsNIN5-2F(其序列如SEQ ID NO.8所示):CACAATTGAACCATGGATATAACCATTTAGCCATAAA

OsNIN5-2R(其序列如SEQ ID NO.9所示):TCCAGATCTACCATGGTCAAAGCCATCCAGGTCTAAT

扩增出OsNIN5基因的2497bp的基因组序列片段。

3.3将上一步构建好的pCAMBIA1301-OsNIN5pro载体经过NcoI酶切，与步骤3.2得到的扩增片段通过Infusion体系连接；测序验证正确，获得pCAMBIA1301-OsNIN5载体，该载体通过电击导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，得到OsNIN5互补根癌农杆菌EHA105，使用遗传转化手段转化Osnin5突变体的成熟胚愈伤组织，从而使编码如SEQID NO.1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；再生，获得水稻植株；以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。获得T₀代互补植株(即Osnin5突变体恢复株系)，图5显示T₀代互补植株可以产生花粉，并被I₂/KI染色，即表现出野生型表型。

综上所述，本发明通过控制水稻雄性生殖发育相关基因OsNIN5及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性；本发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常、花粉基本败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110>上海交通大学

<120>雄性不育基因OsNIN5及其应用和育性恢复的方法

<130>KAG41619

<160>13

<170>Patent In version 3.5

<210> 1

<211> 560

<212> PRO

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Val Leu Tyr Ala Asp Pro Pro Pro Pro Ile Lys Pro Pro Glu Ile Lys Ile Lys Glu

1 5 10 15 20

Leu Ala Asn Lys Ser Thr Tyr Glu Ser Ser Met Met Glu Gln Lys Thr Arg Leu His Ala

21 25 30 35 40

Ile Glu Arg His Arg Ser Cys Glu Val Ser Gln Ala Ile Leu Ser Glu Val Glu Asn Arg

41 45 50 55 60

His Gln His Gln Thr Leu Glu Pro Ile Lys Ser Pro Ile Ser Gly Cys Ser Pro Ser Val

61 65 70 75 80

Glu Ser Thr Thr Asp Thr Asn Thr Val His Arg His Thr Val Ala Asp Ala Ala Trp Glu

81 85 90 95 100

Ala Leu Lys Lys Ser Ile Val His Phe Arg Gly Gln Pro Ile Gly Thr Val Ala Ala Ile

101 105 110 115 120

Asp Lys Ser Gln Gly Ala Leu Asn Tyr Asp Gln Val Phe Met Arg Asp Phe Val Pro Ser

121 125 130 135 140

Ala Leu Ala Phe Leu Met Lys Gly Glu Pro Thr Ile Val Lys Asn Phe Leu Leu Glu Thr

141 145 150 155 160

Ala Arg Leu Gln Leu Arg Glu Lys Met Val Asp Leu Phe Lys Leu Gly Gln Gly Val Met

161 165 170 175 180

Pro Ala Ser Phe Lys Val His His Cys Asn Ser Lys His Lys Thr Glu Ser Leu Leu Ala

181 185 190 195 200

Asp Phe Gly Glu Thr Ala Ile Gly Arg Val Ala Pro Val Asp Ser Gly Leu Trp Trp Ile

201 205 210 215 220

Ile Leu Leu His Ala Tyr Thr Ile Trp Thr Arg Asp Asn Ser Leu Ala Glu Ser Pro Glu

221 225 230 235 240

Cys Gln Arg Ala Met Arg Leu Ile Leu Lys Leu Cys Leu Ser Glu Gly Phe Asp Thr Ser

241 245 250 255 260

Pro Ala Leu Leu Cys Ala Asp Gly Cys Ser Met Ile Asp Arg Arg Met Gly Ile Tyr Gly

261 265 270 275 280

Tyr Pro Ile Asp Ile Gln Ala Leu Phe Phe Met Ala Leu Arg Cys Ala Val Thr Leu Leu

281 285 290 295 300

Lys Glu Asp His Asn Asp Asp Phe Val Tyr Gln Ile Ser Arg Arg Ile Lys Ala Leu Ser

301 305 310 315 320

Tyr His Leu His Ser Tyr Tyr Trp Leu Asp Phe Gln Arg Leu Asn Glu Ile Tyr Arg Tyr

321 325 330 335 340

Lys Thr Glu Glu Tyr Ser Glu Thr Ala Leu Asn Lys Phe Asn Val Ile Pro Glu Ser Ile

341 345 350 355 360

Pro Asp Trp Ile Phe Asp Phe Met Pro Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Ile Gly Asn Val Ser

361 365 370 375 380

Pro Ala Arg Met Asp Phe Arg Trp Phe Cys Leu Gly Asn Phe Ile Ala Ile Leu Ser Ser

381 385 390 395 400

Leu Thr Thr Gly Glu Gln Ala Glu Ala Ile Leu Asp Leu Val Glu Glu Arg Trp Glu Glu

401 405 410 415 420

Leu Ile Gly Glu Met Pro Met Lys Val Cys Tyr Pro Ala Met Glu Asn Gln Glu Trp Gln

421 425 430 435 440

Ile Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys Asn Thr Arg Trp Ser Tyr His Asn Gly Gly Ser Trp

441 445 450 455 460

Pro Val Leu Leu Trp Leu Leu Val Ala Val Ser Val Lys Leu Gly Arg Pro His Ile Ala

461 465 470 475 480

Arg Arg Ala Val Glu Val Met Glu Lys Arg Leu Val Lys Asp Glu Phe Pro Glu Tyr Tyr

481 485 490 495 500

Asp Gly Lys Ala Gly Arg Tyr Val Gly Lys Gln Ala Arg Lys Phe Gln Thr Trp Ser Val

501 505 510 515 520

Ala Gly Tyr Leu Val Ala Lys Met Leu Leu Asp Asp Pro Ser Asn Leu Arg Ala Val Ser

521 525 530 535 540

Leu Ala Asp Asp Cys His Ile Arg Ser Ala Pro Val Leu Lys Arg Ser Asn Ser Phe Pro

541 545 550 555 560

<210> 2

<211> 1683

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggtacttt atgctgatcc tcctccccca ataaaacccc ctgaaattaa aatcaaagaa 60

ctagcaaata agtctacata tgagtcctca atgatggagc aaaagacaag actgcacgcc 120

attgagcgcc acaggtcgtg tgaagtgagt caagcaatct tatctgaggt agaaaatcgt 180

catcaacatc aaacccttga gcccatcaaa agcccaatat ctgggtgttc tccttcagta 240

gaatcaacta cagacaccaa cacagtacac aggcatacgg ttgcagatgc tgcttgggag 300

gccctaaaga aatcaatagt tcacttcaga ggccagccaa ttggaactgt tgctgcaata 360

gacaagtctc agggagcact caactatgac caggttttca tgagggattt tgttcctagt 420

gcattggctt tcttgatgaa aggagaacca acaatagtga agaatttcct gttagaaact 480

gctcgccttc agttaagaga gaagatggtt gacctcttta agcttggtca gggtgtgatg 540

ccagctagtt tcaaggtgca ccactgcaac tctaagcaca aaactgaaag cctgcttgct 600

gattttggtg aaactgccat cggaagagtt gctcctgtgg actctggctt atggtggatt 660

attcttcttc atgcttatac catatggaca agggacaatt ctctggctga aagtcctgaa 720

tgccaaaggg caatgcgtct tattctcaaa ttgtgtctct ctgaagggtt tgatacatct 780

ccagctttgc tttgtgctga tggctgttcc atgattgacc gaagaatggg tatatatggc 840

tatccgattg atatccaggc tctgtttttc atggctctga gatgtgccgt tactttgttg 900

aaagaagatc acaacgacga ctttgtgtac caaatatcaa ggagaatcaa agctttgagc 960

taccatctgc acagttacta ctggcttgac ttccagaggc tgaatgagat ataccgctac 1020

aagacagagg agtactcaga gacagccttg aacaagttca acgtgatacc agaatcaatc 1080

cctgactgga tattcgactt catgcccagc cgcggcgggt acttcatcgg caacgtcagc 1140

cctgcgagga tggacttccg ctggttctgc ctgggcaact tcatcgcgat cctctcctcg 1200

ctgacaaccg gagaacaggc tgaagcaatc ctggaccttg tggaggagcg ctgggaggag 1260

ctcatcggag agatgcccat gaaggtgtgt taccccgcga tggagaacca ggagtggcag 1320

atcgtcaccg ggtgcgaccc caagaacacc agatggagct accacaatgg aggatcatgg 1380

ccagtgttgc tgtggctgct ggtggcggtg agcgtgaagc tggggcggcc acacatcgcg 1440

aggcgggcgg tggaggtgat ggagaagcgg ctggtgaagg acgagttccc ggagtactac 1500

gacgggaagg ccgggaggta cgtggggaag caagcgcgca agttccagac gtggtccgtg 1560

gccggctacc tggtcgccaa gatgctcctc gacgacccct ccaacctccg cgccgtctcc 1620

ctcgccgacg actgccacat ccgctccgcc cccgtcctca agcgcagcaa ctccttcccg 1680

tga 1683

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gctcgccttc agttaagaga

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aagtcgaata tccagtcagg

<210> 5

<211> 6082

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 5

agtggtaccc agcacctgct agcttactaa tgagaaactg aacagcacga ccctaactag 60

tttctagaat tgcaaattgc attcattgtt tgtatggaga gttagggacc aaccggaaaa 120

cggttattac aaacataaga tccattatcc tgtacaaatg atatttcatc catataatat 180

ttttccatat tattgaaact gtatgcagtt gctgaatgta ttcttttcat tttcgcagga 240

ggtcttatca ggcaataaag agcgaccttc tggaagcagc tacatcaatc ttgattctgg 300

cccaaagttt ctgatctctg gacatatcaa tccagtaaac cgggatcact tggcatcata 360

ccgcgtccat caaccgtaca ttgttcgata tggatcttca agcttaccgc ggttgagagg 420

atacaggctg tagcaagcaa aactaactgc acctatagcc tcattgctgt gtcctgtgtc 480

aaacaatgac caccaggcgc ctgtgggaga ggatgaagcg gctgtgcttc cagtagatgc 540

ttagataatt aaatatggta aagtttgtgt attcagttgt cagtcagcag aagcaaatcc 600

taaattgtgt taaattctag tactccgtag tagtaatcta gtctagtttt taacttcact 660

gaagctcccc atttctgtat ggagaagttc taccatgtcg gaagaagggc tctgtaagtt 720

gtatatatac accattagta gaactgcagt tgttaccagg agctacctgg catcttatcg 780

taaattttct actacttccc aggagtaaaa acctgatgca ctaaatgata tttggatgct 840

tcatagcaga agacagtgaa actgacagga tgcaaatcac acagtagtta gtatccttaa 900

gcttcgtatc tattctagtc agagttattt taattattgc aaaagaatta ggactcacaa 960

ctcttgcaaa acattttttg atgggtaatt tgactcttgc aaaacatatt tttgatgggt 1020

aattttattt tactcctgaa aagaaaaaaa aagaaggaaa aatcgcaaca ggaggtgggt 1080

gggcctagca gagtagcagt agcaggtgaa cccgcaccag cctcctcctc actatataaa 1140

cacaccaccg ccttagctct ctcgagcgcc tcccttcctc ccccttcccg caactttcta 1200

gaagcatctg gaagcttcgg ttgggtgccc caggtgaggg atctcgtctc cgatctccct 1260

cctccctaac ctgcaccgcc ttgatcgaac ccaaacctct atccaattcc catagttttg 1320

aaagattttt tcagtttgct ttcaattgtc gtagtcgtca gtttgcccgg cgccgccgcc 1380

tccggcgatc cccatccatc ccgcgagcga ggagggccac ggcgccgtcg ttcgttctgc 1440

tgcttccgct ggcatcaatc ctggtgtggt gagcacatcc tccgccacct ccgcctgcgc 1500

ggctgcgccg atccccatcc atcgcgcgag cgagcgagcg agcagggtcg ccgtcgttgt 1560

cgttcgtcct gctgattccg ccgcatccgt tacgcgtcgc gcatcctctt tcccatctct 1620

ctctactcgc gcactttttc tcgaatttga atttgcgtta atcctagctg cttctgttct 1680

agaaatttgc cttaaccttt taatactaat aacagtttgt ttgttcccga aaagtttggg 1740

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gaccttcccg tcatggaatg cgatgaacgg tttttggatt ttggtggaaa tggttggctt 1860

gataatttag aagaattctg agtgatcatt ttgggatcta tttataattt tgatctagaa 1920

agttggattg ttctgacatc tcagttggcc atattaaagg tttttgcaaa gggttatccg 1980

gttcaaatgt accttctgtt tcttctctgt tctgtagaac aaagtgtagt ttgttgtata 2040

ttttggttcg ttatacactg cagatagaac ttctgatatg ctagttcatc tgttcatgta 2100

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tcaatcccct gtaatacttt tccacttctg atcttctttc aagaataatc tgtatttgca 2220

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aacccatgct tttatgtttt tttatggaat aacccatgct tttattcatg aatttaagca 2400

atcttaactg tcacacctac tcacaagtcg gaaagttttc caaaattatc acaccagcaa 2460

gtaatatgcg aattttcagt tcatttcctt tttctgagtt cactactaac tcttgtgatc 2520

atcaaccaaa caaaagtcat ggggattaca cttgtagagt gtagtcattt tggagcccgt 2580

atctatttta ataatagtaa tagtaccatg tgatgatttt attagagaac tagtcaagta 2640

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cagcttcaaa caagctgcat atcattctgc aaatgtttcg acctgtatgt tttatggaca 2760

taattgtgcc ttcttgtcaa gttactttat ataggacata ctggtagttt acttatgtac 2820

tggacaaaga aactagcaca tgtggattga tcaaatcaac tcataaaaaa ataatatcac 2880

tagcacccgt tgcatgttag atttatttcg ttttggttgc atcataaatg catgttgtga 2940

acttgtgatg catcactttt cccatttcaa gtagcgagag ctagtggcag agtaaagctt 3000

gcctattcta ttagactgtc atgcatttcc ttttaggttt aggtttatat ttgaaatgga 3060

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ccatcagaga ttttgctatc tgagaatagg tgagctagaa acatggtact ttatgctgat 3180

cctcctcccc caataaaacc ccctgaaatt aaaatcaaag aactagcaaa taagtctaca 3240

tatgagtcct caatgatgga gcaaaagaca agactgcacg ccattgagcg ccacaggtcg 3300

tgtgaagtga gtcaagcaat cttatctgag gtagaaaatc gtcatcaaca tcaaaccctt 3360

gagcccatca aaagcccaat atctgggtgt tctccttcag tagaatcaac tacagacacc 3420

aacacagtac acaggcatac ggttgcagat gctgcttggg aggccctaaa gaaatcaata 3480

gttcacttca gaggccagcc aattggaact gttgctgcaa tagacaagtc tcagggagca 3540

ctcaactatg accaggttag catttccttc acaattgaac catggatata accatttagc 3600

cataaaggtt ccttaatatt gttactatta tctctatata accttaccaa atacactcag 3660

cacatgccac tcttagaata ttcagatagg taaaataatg atgggtgtga ttatttctct 3720

tcctgtaaaa aaacctagaa actcataatt ctccttatac atggacatcc aatgcaattg 3780

acaatgataa agttcttgtc actctggagc aggttttcat gagggatttt gttcctagtg 3840

cattggcttt cttgatgaaa ggagaaccaa caatagtgaa gaatttcctg ttagaaactg 3900

ctcgccttca gttaagagag aagatggttg acctctttaa gcttggtcag ggtgtgatgc 3960

cagctagttt caaggtgcac cactgcaact ctaagcacaa aactgaaagc ctgcttgctg 4020

attttggtga aactgccatc ggaagagttg ctcctgtgga ctctggctta tggtggatta 4080

ttcttcttca tgcttatacc atatggacaa gggacaattc tctggctgaa agtcctgaat 4140

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cagctttgct ttgtgctgat ggctgttcca tgattgaccg aagaatggta agccacttaa 4260

acccaacatt gctttgtttt gttattgatg gtatgtctct taactgtttg cttactttcc 4320

tactagagtg ttaacagtcc tgatgcattg tcagaagtat tatcttgatc aaagttgaaa 4380

ttgcattagg tttgttgtag taacatatac tgacgctttt gaatttattc aatctggggt 4440

ttaaaaggaa ctgccttctg tcaggtcctg cctattcggt ttattattga ctgcagaaac 4500

attaagaatg ggatagggta gagcattact tttagttgcc atgagcaata tgtacatgtt 4560

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tatcaggatt ttttaaaaaa tatttgggct gttaacggaa gagacgtaat gctgaatggt 4680

tatagtggta ccttctgata catgtttatg ttgttaaaga tcggcttgtt acatattaat 4740

caattggatg ctcttaaatt tgggatagca aattatctac ttgtcagcat gaacatattt 4800

ctgcatggtt atctttccct tacttacaga ttgcaatctg tgcatgtgca gggtatatat 4860

ggctatccga ttgatatcca ggctctgttt ttcatggctc tgagatgtgc cgttactttg 4920

ttgaaagaag atcacaacga cgactttgtg taccaaatat caaggagaat caaagctttg 4980

agctaccatc tgcacagtta ctactggctt gacttccaga ggctgaatga gatataccgc 5040

tacaagacag aggagtactc agagacagcc ttgaacaagt tcaacgtgat accagaatca 5100

atccctgact ggatattcga cttcatgccc agccgcggcg ggtacttcat cggcaacgtc 5160

agccctgcga ggatggactt ccgctggttc tgcctgggca acttcatcgc gatcctctcc 5220

tcgctgacaa ccggagaaca ggctgaagca atcctggacc ttgtggagga gcgctgggag 5280

gagctcatcg gagagatgcc catgaaggtg tgttaccccg cgatggagaa ccaggagtgg 5340

cagatcgtca ccgggtgcga ccccaagaac accagatgga gctaccacaa tggaggatca 5400

tggccaggta cgtacgtact atagcagtat aatctccaaa tgttgtgcat cgatctgcag 5460

ctgtttcttg tggatgacaa tcataattga ttggaatgat gatgatggat cagtgttgct 5520

gtggctgctg gtggcggtga gcgtgaagct ggggcggcca cacatcgcga ggcgggcggt 5580

ggaggtgatg gagaagcggc tggtgaagga cgagttcccg gagtactacg acgggaaggc 5640

cgggaggtac gtggggaagc aagcgcgcaa gttccagacg tggtccgtgg ccggctacct 5700

ggtcgccaag atgctcctcg acgacccctc caacctccgc gccgtctccc tcgccgacga 5760

ctgccacatc cgctccgccc ccgtcctcaa gcgcagcaac tccttcccgt gatgatcaac 5820

acaatgctca aactaagctc acaccgcact tcacatatac tcaccaccac cacgtaatta 5880

acgctgcctc gctgttaatg ttcttatacg tacttagtag tagaagtact ggtagtagga 5940

atttgggtgc actcgtttca ccggatgcct cagctggtgg agattttggt agcttggaag 6000

tgcacgcgca aaccttgggg tggaaatgga tttttttgat caggatgttg ggacgctcat 6060

gattagacct ggatggcttt ga 6082

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tctagaagtg gtacccagca cctgctag

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ccatggttca attgtgaagg aaatgct

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cacaattgaa ccatggatat aaccatttag ccataaa

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tccagatcta ccatggtcaa agccatccag gtctaat

<210> 10

<211> 1683

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 10

atggtacttt atgctgatcc tcctccccca ataaaacccc ctgaaattaa aatcaaagaa 60

ctagcaaata agtctacata tgagtcctca atgatggagc aaaagacaag actgcacgcc 120

attgagcgcc acaggtcgtg tgaagtgagt caagcaatct tatctgaggt agaaaatcgt 180

catcaacatc aaacccttga gcccatcaaa agcccaatat ctgggtgttc tccttcagta 240

gaatcaacta cagacaccaa cacagtacac aggcatacgg ttgcagatgc tgcttgggag 300

gccctaaaga aatcaatagt tcacttcaga ggccagccaa ttggaactgt tgctgcaata 360

gacaagtctc agggagcact caactatgac caggttttca tgagggattt tgttcctagt 420

gcattggctt tcttgatgaa aggagaacca acaatagtga agaatttcct gttagaaact 480

gctcgccttc agttaagaga gaagatggtt gacctcttta agcttggtca gggtgtgatg 540

ccagctagtt tcaaggtgca ccactgcaac tctaagcaca aaactgaaag cctgcttgct 600

gattttggtg aaactgccat cggaagagtt gctcctgtgg actctggctt atggtggatt 660

attcttcttc atgcttatac catatggaca agggacaatt ctctggctga aagtcctgaa 720

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ccagctttgc tttgtgctga tggctgttcc atgattgacc gaagaatggg tatatatggc 840

tatccgattg atatccaggc tctgtttttc atggctctga gatgtgccgt tactttgttg 900

aaagaagatc acaacgacga ctttgtgtac caaatatcaa ggagaatcaa agctttgagc 960

taccatctgc acagttacta ctggcttgac ttccagaggc tgaatgagat ataccgctac 1020

aagacagagg agtactcaga gacagccttg aacaagttca acgtgatacc agaatcaatc 1080

cctgactgga tattcgactt catgcccagc cgcggcgggt acttcaccgg caacgtcagc 1140

cctgcgagga tggacttccg ctggttctgc ctgggcaact tcatcgcgat cctctcctcg 1200

ctgacaaccg gagaacaggc tgaagcaatc ctggaccttg tggaggagcg ctgggaggag 1260

ctcatcggag agatgcccat gaaggtgtgt taccccgcga tggagaacca ggagtggcag 1320

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ccagtgttgc tgtggctgct ggtggcggtg agcgtgaagc tggggcggcc acacatcgcg 1440

aggcgggcgg tggaggtgat ggagaagcgg ctggtgaagg acgagttccc ggagtactac 1500

gacgggaagg ccgggaggta cgtggggaag caagcgcgca agttccagac gtggtccgtg 1560

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tga 1683

<210> 11

<211> 560

<212> PRO

<213> Oryza sativa

<400> 11

Met Val Leu Tyr Ala Asp Pro Pro Pro Pro Ile Lys Pro Pro Glu Ile Lys Ile Lys Glu

1 5 10 15 20

Leu Ala Asn Lys Ser Thr Tyr Glu Ser Ser Met Met Glu Gln Lys Thr Arg Leu His Ala

21 25 30 35 40

Ile Glu Arg His Arg Ser Cys Glu Val Ser Gln Ala Ile Leu Ser Glu Val Glu Asn Arg

41 45 50 55 60

His Gln His Gln Thr Leu Glu Pro Ile Lys Ser Pro Ile Ser Gly Cys Ser Pro Ser Val

61 65 70 75 80

Glu Ser Thr Thr Asp Thr Asn Thr Val His Arg His Thr Val Ala Asp Ala Ala Trp Glu

81 85 90 95 100

Ala Leu Lys Lys Ser Ile Val His Phe Arg Gly Gln Pro Ile Gly Thr Val Ala Ala Ile

101 105 110 115 120

Asp Lys Ser Gln Gly Ala Leu Asn Tyr Asp Gln Val Phe Met Arg Asp Phe Val Pro Ser

121 125 130 135 140

Ala Leu Ala Phe Leu Met Lys Gly Glu Pro Thr Ile Val Lys Asn Phe Leu Leu Glu Thr

141 145 150 155 160

Ala Arg Leu Gln Leu Arg Glu Lys Met Val Asp Leu Phe Lys Leu Gly Gln Gly Val Met

161 165 170 175 180

Pro Ala Ser Phe Lys Val His His Cys Asn Ser Lys His Lys Thr Glu Ser Leu Leu Ala

181 185 190 195 200

Asp Phe Gly Glu Thr Ala Ile Gly Arg Val Ala Pro Val Asp Ser Gly Leu Trp Trp Ile

201 205 210 215 220

Ile Leu Leu His Ala Tyr Thr Ile Trp Thr Arg Asp Asn Ser Leu Ala Glu Ser Pro Glu

221 225 230 235 240

Cys Gln Arg Ala Met Arg Leu Ile Leu Lys Leu Cys Leu Ser Glu Gly Phe Asp Thr Ser

241 245 250 255 260

Pro Ala Leu Leu Cys Ala Asp Gly Cys Ser Met Ile Asp Arg Arg Met Gly Ile Tyr Gly

261 265 270 275 280

Tyr Pro Ile Asp Ile Gln Ala Leu Phe Phe Met Ala Leu Arg Cys Ala Val Thr Leu Leu

281 285 290 295 300

Lys Glu Asp His Asn Asp Asp Phe Val Tyr Gln Ile Ser Arg Arg Ile Lys Ala Leu Ser

301 305 310 315 320

Tyr His Leu His Ser Tyr Tyr Trp Leu Asp Phe Gln Arg Leu Asn Glu Ile Tyr Arg Tyr

321 325 330 335 340

Lys Thr Glu Glu Tyr Ser Glu Thr Ala Leu Asn Lys Phe Asn Val Ile Pro Glu Ser Ile

341 345 350 355 360

Pro Asp Trp Ile Phe Asp Phe Met Pro Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Thr Gly Asn Val Ser

361 365 370 375 380

Pro Ala Arg Met Asp Phe Arg Trp Phe Cys Leu Gly Asn Phe Ile Ala Ile Leu Ser Ser

381 385 390 395 400

Leu Thr Thr Gly Glu Gln Ala Glu Ala Ile Leu Asp Leu Val Glu Glu Arg Trp Glu Glu

401 405 410 415 420

Leu Ile Gly Glu Met Pro Met Lys Val Cys Tyr Pro Ala Met Glu Asn Gln Glu Trp Gln

421 425 430 435 440

Ile Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys Asn Thr Arg Trp Ser Tyr His Asn Gly Gly Ser Trp

441 445 450 455 460

Pro Val Leu Leu Trp Leu Leu Val Ala Val Ser Val Lys Leu Gly Arg Pro His Ile Ala

461 465 470 475 480

Arg Arg Ala Val Glu Val Met Glu Lys Arg Leu Val Lys Asp Glu Phe Pro Glu Tyr Tyr

481 485 490 495 500

Asp Gly Lys Ala Gly Arg Tyr Val Gly Lys Gln Ala Arg Lys Phe Gln Thr Trp Ser Val

501 505 510 515 520

Ala Gly Tyr Leu Val Ala Lys Met Leu Leu Asp Asp Pro Ser Asn Leu Arg Ala Val Ser

521 525 530 535 540

Leu Ala Asp Asp Cys His Ile Arg Ser Ala Pro Val Leu Lys Arg Ser Asn Ser Phe Pro

541 545 550 555 560

<210> 12

<211> 3113

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 12

gcctattcta ttagactgtc atgcatttcc ttttaggttt aggtttatat ttgaaatgga 60

ttagataatt aatcctagct ttctgttgaa ttctcttaaa ctgttggttg cctattctaa 120

ccatcagaga ttttgctatc tgagaatagg tgagctagaa acatggtact ttatgctgat 180

cctcctcccc caataaaacc ccctgaaatt aaaatcaaag aactagcaaa taagtctaca 240

tatgagtcct caatgatgga gcaaaagaca agactgcacg ccattgagcg ccacaggtcg 300

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gagcccatca aaagcccaat atctgggtgt tctccttcag tagaatcaac tacagacacc 420

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cacatgccac tcttagaata ttcagatagg taaaataatg atgggtgtga ttatttctct 720

tcctgtaaaa aaacctagaa actcataatt ctccttatac atggacatcc aatgcaattg 780

acaatgataa agttcttgtc actctggagc aggttttcat gagggatttt gttcctagtg 840

cattggcttt cttgatgaaa ggagaaccaa caatagtgaa gaatttcctg ttagaaactg 900

ctcgccttca gttaagagag aagatggttg acctctttaa gcttggtcag ggtgtgatgc 960

cagctagttt caaggtgcac cactgcaact ctaagcacaa aactgaaagc ctgcttgctg 1020

attttggtga aactgccatc ggaagagttg ctcctgtgga ctctggctta tggtggatta 1080

ttcttcttca tgcttatacc atatggacaa gggacaattc tctggctgaa agtcctgaat 1140

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cagctttgct ttgtgctgat ggctgttcca tgattgaccg aagaatggta agccacttaa 1260

acccaacatt gctttgtttt gttattgatg gtatgtctct taactgtttg cttactttcc 1320

tactagagtg ttaacagtcc tgatgcattg tcagaagtat tatcttgatc aaagttgaaa 1380

ttgcattagg tttgttgtag taacatatac tgacgctttt gaatttattc aatctggggt 1440

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attaagaatg ggatagggta gagcattact tttagttgcc atgagcaata tgtacatgtt 1560

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tatcaggatt ttttaaaaaa tatttgggct gttaacggaa gagacgtaat gctgaatggt 1680

tatagtggta ccttctgata catgtttatg ttgttaaaga tcggcttgtt acatattaat 1740

caattggatg ctcttaaatt tgggatagca aattatctac ttgtcagcat gaacatattt 1800

ctgcatggtt atctttccct tacttacaga ttgcaatctg tgcatgtgca gggtatatat 1860

ggctatccga ttgatatcca ggctctgttt ttcatggctc tgagatgtgc cgttactttg 1920

ttgaaagaag atcacaacga cgactttgtg taccaaatat caaggagaat caaagctttg 1980

agctaccatc tgcacagtta ctactggctt gacttccaga ggctgaatga gatataccgc 2040

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atccctgact ggatattcga cttcatgccc agccgcggcg ggtacttcat cggcaacgtc 2160

agccctgcga ggatggactt ccgctggttc tgcctgggca acttcatcgc gatcctctcc 2220

tcgctgacaa ccggagaaca ggctgaagca atcctggacc ttgtggagga gcgctgggag 2280

gagctcatcg gagagatgcc catgaaggtg tgttaccccg cgatggagaa ccaggagtgg 2340

cagatcgtca ccgggtgcga ccccaagaac accagatgga gctaccacaa tggaggatca 2400

tggccaggta cgtacgtact atagcagtat aatctccaaa tgttgtgcat cgatctgcag 2460

ctgtttcttg tggatgacaa tcataattga ttggaatgat gatgatggat cagtgttgct 2520

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cgggaggtac gtggggaagc aagcgcgcaa gttccagacg tggtccgtgg ccggctacct 2700

ggtcgccaag atgctcctcg acgacccctc caacctccgc gccgtctccc tcgccgacga 2760

ctgccacatc cgctccgccc ccgtcctcaa gcgcagcaac tccttcccgt gatgatcaac 2820

acaatgctca aactaagctc acaccgcact tcacatatac tcaccaccac cacgtaatta 2880

acgctgcctc gctgttaatg ttcttatacg tacttagtag tagaagtact ggtagtagga 2940

atttgggtgc actcgtttca ccggatgcct cagctggtgg agattttggt agcttggaag 3000

tgcacgcgca aaccttgggg tggaaatgga tttttttgat caggatgttg ggacgctcat 3060

gattagacct ggatggcttt gatgatagtg gattgattgt ccatccacat tga 3113

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ctgaaagtcc tgaatgccaa agg

Claims

1.一种水稻雄性不育基因OsNIN5的应用，其特征在于，所述雄性不育基因OsNIN5编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述雄性不育基因OsNIN5的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述的应用具体是，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsNIN5基因，使得常规水稻品种中的OsNIN5基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。

2.一种水稻雄性不育株系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，使得水稻中编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变异或抑制，进而使得SEQ ID No.1所示多肽的表达水平降低或活性丧失；

所述常规水稻品种为粳稻品种9522、籼稻9311或广陆矮4号。

3.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系的制备方法，其特征在于，所述基于CRISPR/Cas9系统具体包括：采用CRISPR/Cas9系统定点敲除OsNIN5基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达。

4.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系制备的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：

a) 合成单核苷酸序列，引物如SEQ ID No.3和 SEQ ID No.4所示；

b) 通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段进行连接反应，构建含有水稻OsNIN5基因靶序列的OsNIN5-RGEB32质粒；所述靶序列如SEQ ID No.13所示；

c）用含OsNIN5-RGEB32质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d) 通过将OsNIN5基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序，筛选突变植株。

5.一种如权利要求2所述的方法获得的水稻雄性不育株系在水稻制种中的用途，其特征在于，所述用途为：在长光高温条件下，所述长光高温条件为温度28-32℃、光照12.5-14小时，所述水稻雄性不育株系完全不育，以所述水稻雄性不育株系作为母本，进行杂交育种；在短日低温条件下，所述短日低温条件为温度22-25℃，光照11-12小时，所述水稻雄性不育株系可部分结实，用于种子繁殖。

6.一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用常规遗传手段将OsNIN5基因转入如权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系中，进而使得所述水稻雄性不育株系恢复野生型表型；所述OsNIN5基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

7.如权利要求6所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：将含OsNIN5互补构建的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsNIN5互补构建含有序列如SEQ ID No. 5 所示的核苷酸。

8.如权利要求7所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从水稻9522基因组中用碱基序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的引物扩增出OsNIN5基因的基因组序列片段；

(b)提供权利要求7中含OsNIN5互补构建的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105；

(c)将根据权利要求4所述方法获得的水稻雄性不育株系的细胞、组织或器官与步骤(b)中的根癌农杆菌EHA105接触，从而使编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸的核苷酸转入所述水稻雄性不育株系的细胞、组织或器官，并且整合到所述水稻雄性不育株系的细胞的染色体上；