CN114230650B - 雄性不育基因OsALKBH5及其应用和育性恢复的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻育种技术领域，具体涉及一种雄性不育基因OsALKBH5及其应用和育性恢复的方法；所述的雄性不育基因OsALKBH5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用是：采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsALKBH5基因，使得常规水稻品种中的OsALKBH5基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。本发明通过引物扩增OsALKBH5基因，使用遗传转化的手段，能够使突变体恢复到野生型表型。本发明获得的水稻Osalkbh5不育系营养生长阶段没有明显异常,在长光高温条件下完全不育，如果应用于杂交育种中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工成本，在农业生产上具有重要的应用潜力。

Description

雄性不育基因OsALKBH5及其应用和育性恢复的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的水稻不育系创制的方法，具体是一种雄性不育基因OsALKBH5及其应用和育性恢复的方法。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一。我国约有60％以上的人口以稻米为主食,是世界上最大的稻米生产国和消费国。长期以来，人口的增长、生活质量的提高和耕地面积的减少对作物产量的要求日益增加，因而保障粮食安全一直是我国农业生产所面临的挑战。杂交优势的探索和利用可以大幅度的提高农作物的产量，是解决粮食问题的重要方法之一，在水稻、玉米等主要农作物种植中已有广泛使用。目前生产上使用的杂交水稻属于三系杂交水稻，比常规水稻增产20％左右。但是三系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系的影响较大，在生产和推广上收到一定的限制。因此，筛选和培育新的不育系一直是杂交水稻育种的重要研究方向之一。

水稻是雌雄同花植物，花药是水稻的雄性生殖器官，其配子体(花粉)成熟于水稻花药中。雄性配子体从形态建成到成熟包含一系列复杂的生物学过程。首先，初生造孢细胞通过增殖和分化形成花粉母细胞，花粉母细胞经过减数分裂形成四分体，随后四分体解离释放出游离的小孢子；小孢子的细胞核经过两次有丝分裂形成两个生殖核和一个营养核，同时小孢子表面的外壁结构逐步形成，最终发育成为成熟花粉。在减数分裂过程中，同源染色体的联会、配对等行为使染色体能够精确的分配到子细胞中，正确形成单倍体配子，进而保证在双受精过程中遗传物质的稳定。这一系列过程是复杂而精密的，任何一个关键环节失控将会导致小孢子发育异常而导致雄性败育。对水稻雄性生殖发育过程的研究对筛选水稻不育系具有重要的指导意义。

因此，利用物理、化学等手段对雄性配子体发育过程中的关键基因进行诱变，以阻断相应进程进而导致雄性不育，是创造新型水稻不育系的重要手段。

发明内容

本发明针对现有水稻不育系种质缺乏的限制，提供一种新的雄性不育基因OsALKBH5及其应用和育性恢复的方法。利用OsALKBH5基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有重要的应用前景。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种水稻雄性不育基因OsALKBH5，所述雄性不育基因OsALKBH5编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，编码所述雄性不育基因OsALKBH5的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

第二方面，本发明涉及一种水稻雄性不育基因OsALKBH5的应用，所述雄性不育基因OsALKBH5编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的应用具体是，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsALKBH5基因，使得常规水稻品种中的OsALKBH5基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。

第三方面，本发明涉及一种水稻雄性不育株系的制备方法，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系。所述处理为，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统处理，使得水稻中编码如SEQ ID No.1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失、变异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。

所述水稻品种为粳稻品种9522(武运粳7号)或秀水134，籼稻9311或广陆矮4号；更优选为粳稻品种9522和秀水134(简称为WT)。

优选地，所述水稻中编码如SEQ ID No.1所示氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，所述水稻雄性不育株系的制备方法包括如下步骤：采用物理诱变的方法，使常规水稻品种中如SEQ ID No.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID No.8，进而获得所述水稻雄性不育株系，即Osalkbh5突变体。

优选地，所述水稻雄性不育株系的制备方法包括如下步骤：采用物理诱变的方法，使常规水稻品种中如SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.9，进而获得所述水稻雄性不育株系，即Osalkbh5突变体。

优选地，所述基于CRISPR/Cas9系统处理具体包括：采用CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法，敲除OsALKBH5基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达。

更优选地，所述CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：

a)合成单核苷酸序列，引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

OsALKBH5-CRISPRUP(SEQ ID No.3):TAGGTCTCCGGCTGGTAGGCCGTTTTAGAGCTAGAA

OsALKBH5-CRISPRLOW(SEQ ID No.4):CGGGTCTCAAGCCTCGCTCCCTGCACCAGCCGGG

b)通过扩增反应克隆出目标片段，与pRGEB32载体片段(由华中农业大学谢卡斌教授惠赠)进行连接反应，构建含有水稻OsALKBH5基因靶序列的OsALKBH5-pRGEB32质粒；所述靶序列如SEQ ID No.11所示；

c)用含OsALKBH5-pRGEB32质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d)通过将OsALKBH5基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序,筛选突变植株。

所述水稻OsALKBH5基因靶序列如下所示：

SEQ ID No.11:GGGAGCGAGGCTGGTAGGCCGGG

采用pRGEB32质粒对于基因组的多重编辑能力更强、效率更高。

第四方面，本发明还涉及一种前述的方法获得的水稻雄性不育株系在水稻育种中的用途，所述用途包括：以所述水稻雄性不育株系作为母本，进行杂交育种。

第五方面，本发明还涉及一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包括如下步骤：采用常规遗传手段将所述OsALKBH5基因转入上述方法获得的水稻雄性不育株系中，进而使得突变体恢复野生型表型。

优选地，所述方法包括如下步骤：将含OsALKBH5互补构建的根癌农杆菌EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得恢复育性的水稻植株；其中OsALKBH5互补构建含有序列如SEQ ID No.5所示的核苷酸。

更优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从水稻9522基因组中用碱基序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物扩增出OsALKBH5基因的7266bp的基因组序列片段(包含启动子序列)；

(b)提供携带表达OsALKBH5互补构建载体的根癌农杆菌EHA105；

(c)将水稻雄性不育株系的细胞或组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织或器官，再生，获得恢复育性的水稻植株。

本发明的研究表明，长光高温条件下，Osalkbh5完全不育，可以用于杂交育种，免去母本去雄的繁琐工作。所述长光高温条件为：温度为28-32℃、光照条件为12.5-14小时。

本发明具有如下的有益效果：

本发明通过控制雄性不育基因OsALKBH5及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育的变异株，实现控制水稻生殖过程；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用价值。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为pRGEB32载体及OsALKBH5 CRISPR的构建示意图和敲除结果；其中，图1A为pRGEB32载体结构和靶位点序列示意图；图1B为OsALKBH5基因结构图、CRISPR敲除所得纯合株系突变位点及相应氨基酸变异结果；图1C为野生型(WT，即9522)和CRISPR敲除株系小花内部结构以及花粉I₂/KI染色结果；

图2为Osalkbh5突变体植株的形态学观察示意图；其中，图2A为野生型和Osalkbh5突变体整株表型；图2B为野生型和Osalkbh5突变体小花内部结构；图2C为野生型和Osalkbh5突变体花药对比图；图2D为野生型和Osalkbh5突变体花粉I₂/KI染色结果；

图3为将OsALKBH5基因组转化突变体得到T₀代互补恢复株系与野生型表型对比图；其中，图3A为野生型小花内部结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果；图3B为T₀代互补株系小花内部结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果；

图4为Osalkbh5-2突变体的形态学观察示意图；其中，图4A为野生型小花内部结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果；图4B为Osalkbh5-2突变体小花内部结构图和花粉I₂/KI染色结果；

图5为OsALKBH5基因表达模式图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所述OsALKBH5基因为编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

OsALKBH5基因表达模式图见图5。

实施例1水稻雄性不育株系创制的方法

1.1水稻雄性育性控制基因OsALKBH5的图位克隆

利用构建的包含雄性不育基因OsALKBH5(其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)及其突变基因Osalkbh5(其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)组成的、本领域内技术人员清楚的水稻基因图位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定位于1个小的基因组区间内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因组DNA克隆。经测序和进一步的杂交鉴定确定其中一个含编码完整水稻雄性生殖发育控制蛋白OsALKBH5的基因。

经全核苷酸序列分析结果表明：雄性不育基因OsALKBH5全长为4347bp(SEQ IDNo.10，包含调控区和内含子)。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID No.2所示，编码全长为616个氨基酸的蛋白OsALKBH5，其序列如SEQ ID No.1所示。

1.2水稻雄性育性控制蛋白基因的点突变

本实施例的Osalkbh5突变材料是由常规粳稻品种武运粳7号(9522)经过对OsALKBH5基因的序列变异获得，经过对Osalkbh5突变基因与OsALKBH5基因的序列比较，水稻雄性生殖发育控制基因的突变导致蛋白翻译过程移码和提前终止，使得水稻雄性生殖器官发育过程出现异常，造成植株不育；本实施例Osalkbh5的突变基因是在编码区的两个碱基对的缺失(其序列如SEQ ID No.8所示),使SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ IDNo.9，从而引起水稻雄性生殖发育控制蛋白翻译提前终止以及功能改变。

1.3通过CRISPR手段突变水稻品种中的OsALKBH5基因

为了对OsALKBH5蛋白进行应用，构建了OsALKBH5基因CRISPR的载体(OsALKBH5-pRGEB32)，并转化野生型9522植株，以阻碍OsALKBH5的完整表达，从而达到改变水稻育性的目的。pRGEB32载体及OsALKBH5 CRISPR的构建示意图如图1所示。其中，图1A为pRGEB32载体结构和靶位点序列示意图；图1B为OsALKBH5基因结构图、CRISPR敲除所得纯合株系突变位点及相应氨基酸变异结果；图1C为野生型(WT，即9522)和CRISPR敲除株系小花内部结构以及花粉I₂/KI染色结果；

具体步骤如下：

1.3.1合成单核苷酸序列引物

OsALKBH5-CRISPRUP(其序列如SEQ ID No.3所示):TAGGTCTCCGGCTGGTAGGCCGTTTTAGAGCTAGAA

OsALKBH5-CRISPRLOW(其序列如SEQ ID No.4所示):CGGGTCTCAAGCCTCGCTCCCTGCACCAGCCGGG

1.3.2通过扩增反应克隆出目标片段，与pRGEB32载体片段(由华中农业大学谢卡斌教授惠赠)进行连接反应，构建含有水稻OsALKBH5基因靶序列(如SEQ ID No.11所示)的OsALKBH5-pRGEB32质粒；

1.3.3将OsALKBH5-pRGEB32质粒转入农杆菌中,得到含有OsALKBH5-pRGEB32质粒的农杆菌,在含有卡那霉素(50μg/mL)和利福平(20μg/mL)的YEB平板上划线培养，获得单菌落。挑单菌落接种到3mL含卡那霉素(50μg/mL)和利福平(20μg/mL)的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1％接种量转接入50mL含卡那霉素(50μg/mL)和利福平(20μg/mL)的YEB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD₆₀₀为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，形成的AAM农杆菌菌液此时即可用于转化水稻各种受体材料。

1.3.4本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的愈伤。取成熟种子置于75％乙醇中浸泡5分钟，用无菌水漂洗3次,再用33％的次氯酸钠溶液消毒20分钟以上(期间摇匀数次)，用无菌水冲洗8-10次后，置于NBD2培养基上，在26±1℃、避光条件下培育，诱导愈伤组织；12天后进行继代，用解剖刀和镊子挑出愈伤组织并接种于NBD2培养基上继续诱导愈伤。7天后可用于转化。将愈伤组织浸泡入新鲜的用AAM培养基重悬的农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将愈伤组织移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到含100μM乙酰丁香酮(AS)的NBD2培养基上，于26℃共培养3天。3天后，从培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入筛选培养基(含有80mg/L潮霉素和400mg/L特美汀的NBD2培养基)上进行筛选。12天后将愈伤组织转到新的筛选培养基上继续筛选。10-12天后将新生的嫩黄色愈伤组织转移到分化培养基(含有干酪素0.5g/L、6-苄氨基嘌呤2mg/L、激动素0.5mg/L、萘乙酸0.5mg/L、蔗糖30g/L、山梨醇15g/L的MS培养基)培养一周左右，可见长出绿芽点。然后将包含绿芽点的愈伤组织移至新的分化培养基上分化成苗(12小时光照/天)。将幼苗转移到1/2MS培养基上培养至根茂苗壮，随后移入人工气候室栽培。

1.3.5将获得的阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。测序检测靶位点基因序列，如果发生纯合突变则为有效的基因敲除植株，即Osalkbh5突变体植株。

1.4 OsALKBH5蛋白活性丧失或表达水平降低导致水稻雄性发育异常

对上海市的长光高温条件下(温度为28-32℃、光照条件为12.5-14小时)种植得到的Osalkbh5突变体植株进行形态学观察。如图2所示，Osalkbh5突变体与野生型相比,营养生长和小花发育无明显异常(图2A、2B),野生型9522花药发育正常(图2C)，而Osalkbh5突变体花药呈淡黄色且略小(图2C)；野生型9522成熟花粉可被I₂/KI染色(图2D)，Osalkbh5突变体与野生型花药成熟期相对应的时期可观察到绝大部分花粉形态皱缩，不能被I₂/KI染色(图2D)。

1.5通过物理诱变手段创制Osalkbh5水稻雄性不育株系

本实施例中OsALKBH5基因的编码区序列如SEQ ID No.2所示。本实施例的Osalkbh5突变材料是由常规粳稻品种武运粳7号(又名9522)经过常规的基因工程方法突变而得。

本领域人员知晓，还可以采用诸如射线照射等其他手段诱变水稻常规品种进行突变，具体包括经过⁶⁰Coγ射线诱变获得Osalkbh5突变体，处理剂量为280Gy(参照方法：陈亮，储黄伟,袁政,et al.⁶⁰Coγ-Ray射线诱变水稻突变体的分离和遗传学初步分析[J].厦门大学学报：自然科学版,2006,(S1):82-85)。对诱变的突变体回交三代，获得单隐性核基因控制的稳定遗传的突变体库。经进一步筛选得到Osalkbh5突变体的等位突变体Osalkbh5-2。Osalkbh5-2的突变是在OsALKBH5编码区的一个碱基对的缺失(其序列如SEQ ID No.12所示),使SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.13，从而引起蛋白翻译提前终止以及功能改变，造成植株不育。如图4所示，野生型小花发育正常，成熟花粉可被I₂/KI染色(图4A)；Osalkbh5-2突变体与野生型相比,突变型花药呈淡黄色且略小，花粉形态皱缩，不能被I₂/KI染色(图4B)；该表型与Osalkbh5突变体一致。将Osalkbh5-2突变体与9522回交，所有F1代的表型都与9522一致，表现为可育。突变体与野生型杂交的F1代自交后产生的F2代群体中，可育与不育植株的分离比约为3:1(可育：不育＝63：25，χ²＝0.38，P>0.05)，表明Osalkbh5-2突变体表型是由OsALKBH5单基因突变导致。

1.6 OsALKBH5表达特征

利用Osalkbh5突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用荧光定量PCR的方法确定OsALKBH5基因的表达模式(如图5)。

发现OsALKBH5基因在水稻雄性生殖发育时期有广泛表达，且在水稻雄性生殖发育时期Stage10和Stage11表达最高；此外，营养发育过程中的叶、内外稃、根中都有表达。

1.7 OsALKBH5基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用

将Osalkbh5突变体与籼稻品种9311或广陆矮4号水稻品系杂交，在F2代中具有籼型特征的植株中均出现了雄性不育株系，符合3:1分离规律，进而证明OsALKBH5基因在其他水稻品种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生雄性不育植株。

实施例2恢复Osalkbh5突变体雄性不育性状的方法

将编码OsALKBH5基因的基因组核苷酸序列转入突变体Osalkbh5植株，能够使突变体恢复到野生型表型。具体为将含OsALKBH5互补构建的根癌农杆菌EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsALKBH5互补构建含有序列如SEQ ID No.5所示的核苷酸。具体步骤如下：

2.1从水稻9522基因组中用引物：

OsALKBH5-CF(其序列如SEQ ID NO.6所示):GGGGTACCGAAGCATTGGAACGACAGGC

(KpnI)

OsALKBH5-CR(其序列如SEQ ID NO.7所示):GCAGGTCACCTCATGCAGCAGTGATCCATAAT

(BstEII)

扩增OsALKBH5基因组7266bp片段(包括启动子区2868bp，ATG-TAA区域3902bp，TAA下游496bp)。用限制性内切酶KpnI和BstEII分别对OsALKBH5基因组片段和载体pCAMBIA1301进行双酶切，纯化后用T4连接酶将二者纯化产物进行连接，然后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布在含卡那霉素(100μg/mL)的LB平板上，倒置培养15小时左右；挑取单菌落并用含卡那霉素(100μg/mL)的LB液体培养基进行培养，经PCR鉴定后提取质粒并测序；测序验证正确，即获得pCAMBIA1301-OsALKBH5质粒；将该质粒转入根癌农杆菌EHA105，得到含有pCAMBIA1301-OsALKBH5质粒的根癌农杆菌EHA105，再使用遗传转化手段(步骤同1.3.3和1.3.4)转化Osalkbh5突变体的愈伤组织，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸转入Osalkbh5突变体细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；再生获得T₀代互补植株(即Osalkbh5突变体恢复株系)，以便观察是否会使突变体恢复到野生型表型。图3显示T₀代互补植株可以产生花粉，并被I₂/KI染色，即表现出野生型表型。其中，图3A为野生型小花内部结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果；图3B为T₀代互补株系小花内部结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果。

综上所述，本发明通过控制水稻雄性生殖发育相关基因OsALKBH5及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性的目的；本发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常、花粉基本败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用价值。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 雄性不育基因OsALKBH5及其应用和育性恢复的方法

<130> KAG48259

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ala Gly Gly Glu Ala Asp Ala Met

1 5 10 15

Ala Leu Val Gln Gly Tyr Asn Ala Asp Glu Leu Ala Ile Ala Gly Glu

20 25 30

Phe Leu Thr Thr Trp Leu Pro Phe Leu Ser Ala Gly Leu Cys Ala Ser

35 40 45

Cys Ala Asp Ser Leu Arg Ser Arg Val Ser Ser Leu Leu Pro Pro Gln

50 55 60

Ala Glu Glu Ser Pro Ser Ser Pro Pro Pro Arg Ile Asp Gln Ile Glu

65 70 75 80

Pro Ser Gly Trp Glu Ser Asp Pro Ala Thr Ala His Pro Gln His Leu

85 90 95

Pro Phe Glu Pro Ser Gly Trp Asp Ser Asp Pro Pro Gln Leu Pro Pro

100 105 110

Glu Gln Glu Gln Gln Lys Gln Lys Pro Gln Pro Ala Glu Lys Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Trp Ala Asp Met Ala Gln Glu Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ala

130 135 140

Glu Glu Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp Gly Glu Glu Gly Ser

145 150 155 160

Glu Ala Gly Arg Pro Gly Val Gln Leu Thr Arg Glu Gln Arg Glu Leu

165 170 175

Arg Arg Phe Arg Asn Val Val Arg Arg Lys Asp Phe Ile Cys Phe Glu

180 185 190

Arg Val Asn Gly Arg Leu Val Asn Ile Leu Ala Gly Leu Glu Leu His

195 200 205

Cys Gly Val Phe Ser Ala Ala Glu Gln Lys Arg Ile Val Asp Tyr Val

210 215 220

Tyr Asp Leu Gln Glu Met Gly Lys His Gly Glu Leu Gly Asp Arg Thr

225 230 235 240

Tyr Thr Glu Pro Gln Arg Trp Met Arg Gly Lys Gly Arg Val Thr Ile

245 250 255

Gln Phe Gly Cys Cys Tyr Asn Tyr Ala Thr Asp Lys Asn Gly Asn Pro

260 265 270

Pro Gly Ile Ile Arg Thr Ile Ala Ser Asp Pro Met Pro Ser Leu Phe

275 280 285

Lys Ile Met Ile Lys Arg Leu Val Arg Trp His Val Leu Pro Lys Thr

290 295 300

Cys Ile Pro Asp Ser Cys Ile Val Asn Ile Tyr Asp Pro Gly Asp Cys

305 310 315 320

Ile Pro Pro His Ile Asp Ser His Asp Phe Val Arg Pro Phe Cys Thr

325 330 335

Val Ser Phe Leu Ser Glu Cys Asn Ile Leu Phe Gly Ser Thr Leu Lys

340 345 350

Ile Ala Gly Pro Gly Glu Phe Thr Gly Ser Leu Pro Ile Pro Leu Pro

355 360 365

Val Gly Ser Val Leu Ile Leu Asn Gly Asn Gly Ala Asp Val Ala Lys

370 375 380

His Cys Val Pro Ala Val Pro Thr Lys Arg Ile Ser Ile Thr Phe Arg

385 390 395 400

Lys Met Asp Pro Ala Lys Arg Pro Phe Asn Phe Arg Asp Asp Pro Glu

405 410 415

Leu Leu Asn Ile Ile Pro Leu Glu Thr Ala Val Gln Glu Thr Gly Arg

420 425 430

Ser Ser Asp Glu Gly Lys Gly Lys Gln Pro Asp Ile Gln Ile Arg Asn

435 440 445

Pro Ser Lys Ala His Arg Asn Lys Lys Ser Lys Val Arg Thr Ser Pro

450 455 460

Gly Lys Gly Gly Arg Gly Gly Ile Leu Gly Asp Gly Pro Pro Gln Tyr

465 470 475 480

Ala Gln Ala Gln Val Thr Gly Ile Ser Ser Gln Gln Asn Phe His Gly

485 490 495

Gln Pro Thr Ile Ser Gly Ser Ser Ala Glu Arg Glu Arg Arg Pro Val

500 505 510

Gly Pro Leu Arg Glu Ser Arg Tyr Gln Gln Asp Ala Pro Gly Met Gln

515 520 525

Ser Asn Met Asp Gly Ile Arg Glu Arg Ala Asn Trp Leu Ala Gln Glu

530 535 540

Arg Met His Gly Asn Ser Met Asn Ser Ile Asp Asp Gly Thr Glu Ser

545 550 555 560

Gln Glu Arg Arg Gln Arg Met Glu His Arg Gln Ile Leu Met Ile Asn

565 570 575

Arg Thr Ile Asn Asp Asp Met Asp Ser Leu Ser Ile Gly Ser His Glu

580 585 590

Ser Asp Gln Thr Arg Val Ser Val Arg Thr Leu Tyr Asn Lys Pro Arg

595 600 605

Arg Thr Arg Val Asn Leu Asp Glu

610 615

<210> 2

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggacgcct cctcctccgc ctccgccggc ggcgaggccg acgcgatggc gctcgtgcag 60

gggtacaacg ccgacgagct cgccatcgcc ggggagttcc tcaccacgtg gctccccttc 120

ctctccgcgg gcctctgcgc ctcctgcgcc gactccctcc gcagccgcgt ctcctccctg 180

ctgcccccgc aagccgagga atccccgtcg tcgccgccgc cgcggatcga tcagattgag 240

ccctcggggt gggagtccga tccggctacg gctcacccgc agcatctgcc gttcgagccg 300

agcggatggg actcggatcc gccgcagctg ccaccggagc aggagcagca gaagcagaag 360

ccgcagccgg cggagaagcc gcggaagtcg tgggcagaca tggctcagga ggacgagctc 420

gccgccgcgg cagaggagga cgcggcggca gccgcggctg atgacggcga ggaagggagc 480

gaggctggta ggccgggtgt gcagctgacg agggagcagc gggagctgag gcggttccgg 540

aacgtggtgc ggaggaagga tttcatctgt tttgagaggg tcaatggtcg gctcgtcaat 600

atcctcgctg gcctggaact tcattgcggt gtgtttagcg cggccgaaca gaagcgtatt 660

gtcgactacg tatacgatct tcaggagatg ggcaagcacg gggagcttgg agatcgtacg 720

tatacggaac cccaaaggtg gatgcgtggt aaagggcgag taacaatcca atttggatgc 780

tgttataatt atgccacgga caagaatgga aacccaccag gcattattcg aactattgct 840

tctgatccga tgcctagctt atttaagatc atgatcaaga gattggtacg gtggcatgtt 900

ctaccaaaga cttgcatacc agacagttgt attgtcaata tatatgaccc tggagattgc 960

atcccaccac atattgatag tcatgatttt gttcggccat tctgtactgt ttcattcctc 1020

agtgagtgca acattctttt tggatctact ctgaaaattg ctggccctgg agagttcact 1080

ggttcacttc caattcctct gcctgttggg tcggtgctta tcctaaatgg caatggtgct 1140

gatgtagcaa agcattgtgt tcctgcagtt ccgaccaaaa ggatatccat taccttcaga 1200

aagatggatc cagcgaagcg tccgttcaat ttccgagatg atccagaatt gcttaacata 1260

attcctctag aaacagctgt acaagaaact ggcagatcat cagatgaagg taagggcaag 1320

cagcctgaca tacagatcag aaatccgagc aaagcacaca ggaacaagaa atctaaagta 1380

agaacatctc ctggaaaggg tggacggggc ggcattctcg gagatggacc tcctcaatat 1440

gcacaagctc aagtcactgg catttcgtca cagcaaaact tccatggcca gcctaccatc 1500

tctggttcaa gtgctgagag agaaagacgc cctgttggtc cattgagaga gtcaagatat 1560

cagcaggatg cacctggcat gcaatctaac atggatggta tcagagagcg ggcaaattgg 1620

ttggctcaag agaggatgca tggtaacagc atgaattcga ttgacgatgg cacggaatct 1680

caggaaagga ggcagcgaat ggagcacaga cagatattga tgatcaaccg cacgatcaac 1740

gatgatatgg attccctttc aatcgggagc catgaatctg accagactcg tgtaagcgta 1800

cgaacactat acaacaagcc aaggaggacc agggtaaacc tggatgagta a 1851

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taggtctccg gctggtaggc cgttttagag ctagaa 36

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggtctcaa gcctcgctcc ctgcaccagc cggg 34

<210> 5

<211> 7266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagcattgg aacgacaggc caacgtcgct tctggcagga ctgatgaaaa tgcgaaaaga 60

aagagggaga tatgcaatgc tctggccaga actgcttcaa aaagagtcaa gcagcaacct 120

aattagtggc ctctgaccat tgtgcatttg tgtcttcact tgttgtttag aatgtttctg 180

agaaatagcc ttgcaaaata atctcttcct tctatggagc atgtaaataa ctagtctctg 240

cttagctgtg tgaggttgca acaatagcga aatgtttccc aaaaaaaggg tcttatgttc 300

cacctgtaga ttgtgtgttc catgcaattg taccatcaag aaaaatctag tatagcgttg 360

ctggcgccat ttcactgtgg ccattagccc attactcatt ccgaagagca aactgtgaaa 420

aaaaatccat aagaacaaaa tgtgattttt gttttcaaaa gaatgaacaa ttcttagcat 480

tccatgggaa taagtgtttt tgattaagaa tgtaatgaat ccacatcata tatttttaca 540

cataaaagag ccagagtaac aatatacaat ttcggcacct gttctgtaag aaccaatcat 600

aaattcagga tttcaggtca catcacacaa ctcgaaagtt tggatataca tgcagattct 660

attagagaga tctcaaaatg agcagaggag gacatgaacg ctaattagtg attgctgcga 720

ccaaggaatg accacaacca gtcatctgga caagatttgc ggcaaaatca tgcacaattg 780

gataatgata tattaatatg taaaacccag gaacaccgag ctaaatgtct cttaggatgg 840

gccatccttt cttagcaatc tcatcaatct tggagtttat tctgttctgg gtatttgggg 900

agcagagctc agcagcgtat gcattcaact ttgcagctag tgttgaggtc aggagctcct 960

cctcgggcag gttcccaatc agttgcagga gaaacggctt gcgcttcagc tcaaatttct 1020

accaaagtac aagcaataac taaaaggaaa taaaacatag aatgtcatgg tgagttcgaa 1080

ttttcagatg ggattgctac ctgatgttcc ggttcagccg gataaaatgc acctattggt 1140

tggatctgtg tggtaatgac actgcggcga tccttagctt gttctttttc tttgctaaga 1200

ccagccaatc tagcttccac ggatccattt gtgaagatga tggatctgtg accacataag 1260

tgaagcaaga attaaaattg acgcattaca gtgctgtctg aggatcctat caaactagtg 1320

agaatgacag ctacaccatt cagtgaccaa ttatttccta agccatgatg gcaacatttt 1380

gtacacaaag gtacttgttt gaagtaggat agacaaaggt gatgaaatga aatgtacacc 1440

tttcaattct caattgcttt gttgtgaaac ttagcaaata ccatatgcta aatgctggta 1500

tggaaaccag tctaagtttt agcatgaaac atgtttataa aagataatca catcattagt 1560

atataaatct gactatggta aactgtgaac aaaaagatct attgcacaaa aggggttagg 1620

tttagaaaac tcaagcacct gtattggttg ccaacatctg gtccttgccc aaagacctct 1680

cgtggatcat gacttgccca gaagacctct agaagtttct tgtactgaat caaccgggga 1740

tcatattcaa cctaaatgac tcaaaaatgt caatcatctt agctcataaa acaccaacaa 1800

agttagttta gaaggaggcc ctgcaaagta ttaataccag tataccactc caaaacctac 1860

aacacacaca cacatgcaat tgaatgaagc actcaacgga caaacatctc cgattgtttt 1920

atgcacaaaa aaatacacac aagaagcaga tctggcagtg atgaatcgtt cctgtttgac 1980

catagaacat tccttctagt ttttttaggt aatgatacct cattaagcaa tgaaaatgaa 2040

acttggaacc aagagaaaac agattacgat ggaaatgaaa actcgcgagt attttctttc 2100

agtttttaac ttacacatac gaaatggtaa tggccaatca gattacgatg ctaactacgg 2160

aaatgaattg ctacgaccat ggaactgaac atatcattgg ttcatggtat cgatcaagaa 2220

cagctaaaag cgtgggagtc tccgcaccgc accttgacgc actcggcgtg gtcgccgagg 2280

ttgcggtact cagggcgggc cttggacccg ccggcgtagc cgacggaggt gcggatcacg 2340

ccggggaggc acccgaacgc ggcctccgac ctccagaagc ttcccagcgc gaacaccgcc 2400

gtctccgtgg ccaccgccgc cgccgccgct cccccgcgcg gctcccgccc ccggttaccc 2460

ccgctcccgc ccggaagacg cgcccccgac gccaccccca cgaggaggag aagcacccac 2520

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gacgagctcg ccatcgccgg ggagttcctc accacgtggc tccccttcct ctccgcgggc 3000

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ggtaacaatc ccgtgtgctg ggttcgccgt agttagggtt tttgtgctgt tgcctcttac 3120

gcccccccgt tcacctcgac tctgacagcc gaggaatccc cgtcgtcgcc gccgccgcgg 3180

atcgatcaga ttgagccctc ggggtgggag tccgatccgg ctacggctca cccgcagcat 3240

ctgccgttcg agccgagcgg atgggactcg gatccgccgc agctgccacc ggagcaggag 3300

cagcagaagc agaagccgca gccggcggag aagccgcgga agtcgtgggc agacatggct 3360

caggaggacg agctcgccgc cgcggcagag gaggacgcgg cggcagccgc ggctgatgac 3420

ggcgaggaag ggagcgaggc tggtaggccg ggtgtgcagc tgacgaggga gcagcgggag 3480

ctgaggcggt tccggaacgt ggtgcggagg aaggatttca tctgttttga gagggtcaat 3540

ggtcggctcg tcaatatcct cgctggcctg gaacttcatt gcggtgtgtt tagcgcggcc 3600

gaacagaagc gtattgtcga ctacgtatac gatcttcagg agatgggcaa gcacggggag 3660

cttggaggtg agatttaagc tgcatggaga ttcgatatgt ttttctatgg cgctagttga 3720

atttggctaa attttcatgt aaagtcttga gttttgagaa atgctttaat gaaaagggtt 3780

ttaggtcagg attatgtaaa attttaggca aaggttttag ctgtaattaa ggtcatgctt 3840

tgctacttag gctatggtag ttgtggggat atggatcata ggcaaacatt tagatgtcta 3900

tatgcaccac agtagttcta tcgtgtagaa ctggaacttg tatagtgttc tcgtgcaaag 3960

tagaaagccg aagaattatt ataaaattgg ttttctcatg tcttgttcta tgtggtatgc 4020

actcaaagct acaaactttt ttggtaatta ttctactaaa tcattggatc tacctaccac 4080

aagtagcaga ttagcttttg tgatttcaag caggaagata aatatggtat ttgataaatt 4140

ataggtattg ccatcataac ataatcagcc atatttgaca aaaataacac agtttcaccc 4200

tactacacaa tcagaagcat ctgccgaaat ctgtctgtcc aggagaagcg tagcggatag 4260

caaaacattt tcattgtttt ctgtacacat gattctgtca taatggtgtt tccccatttg 4320

tgtaaacctc aatatgtttc aatgtattat ttacagtaat ctctgagtgt ttttggtttc 4380

tttgcttata tgctgcataa gcgttctcag catggatatt aaaacagaca tgcatgattt 4440

tctgtgcttc ttacagtcgt gcacaccaca ataaccacga ttgaagtaaa tgtaacatgt 4500

tgagtgagat gcctgacctt cattccagtt tacatatctg cgttcttctt ttcaatttaa 4560

ttaatttaat attcaagcta tgcactattt atctactgag ggcccagtat aacactaaca 4620

aatggccaca ctttagagta ccctgaagca cctaagcctg tttgattcac cttaggccat 4680

tggaccggaa tagaatttct catccttatt tgggtgagtg tatactatat attgggaagc 4740

ctactctatt tagtgctatc caaggtcctt ctttctgctt tacaaatgct atacgcacat 4800

gaattttctt gggctcacag ctgcatttat ttatttgcca tgttttgttt atttgtattt 4860

ttgtatatct aaatccaagc ataatatccc cctgtcagat cgtacgtata cggaacccca 4920

aaggtggatg cgtggtaaag ggcgagtaac aatccaattt ggatgctgtt ataattatgc 4980

cacggtacat actctagttt tatcctctga tcccatcagc ttgaatactg cagtggtact 5040

gatttaattc acatgtgaat ccatctaagg tttgaatctg tgatgacagg acaagaatgg 5100

aaacccacca ggcattattc gaactattgc ttctgatccg atgcctagct tatttaagat 5160

catgatcaag agattggtac ggtggcatgt tctaccaaag acttgcatac cagacagttg 5220

tattgtcaat atatatgacc ctggagattg catcccacca catattgata gtcatgattt 5280

tgttcggcca ttctgtactg tttcattcct cagtgagtgc aacattcttt ttggatctac 5340

tctgaaaatt gctggccctg gagagttcac tggttcactt ccaattcctc tgcctgttgg 5400

gtatgttctc atgcttttcg ctgtgctgat agattatttg tggtagccag ttgtgctatt 5460

tgggatgtta acaaattgat tttatttatt attgttttaa acttgattac tcatgaattc 5520

aaaggctgtg tagacttctc attcgatttc ttgaatggta ttgcatggta tgattactaa 5580

gggcctgtct ggctgtcata cttctgcagc tgtgctgctg ctgtagagat tgtatgcgca 5640

gtactgtagc tgatggctgt attgcagcca aatttagtcc taccgaacag gccctgaact 5700

tttctccttt agactttgct tgaagttttt gctgagagag atttctactc catacttgtt 5760

tgttgctgtg tttccttctc attggattgt cataaactct aaaatactaa ctgtatgtaa 5820

tttttgcatt ggccacttta ataatattca attattcgtg tctcatcatg tctttcagtt 5880

ttcttctgca gctctttagt tctcttatat actaaataca aacattcaca ggtcggtgct 5940

tatcctaaat ggcaatggtg ctgatgtagc aaagcattgt gttcctgcag ttccgaccaa 6000

aaggttgtga tactgatatc ctgttctatc atttggcttt tggaactcaa ttcctttgcc 6060

tgtataacat ttgaactctg acacactaat taaaacacag gatatccatt accttcagaa 6120

agatggatcc agcgaagcgt ccgttcaatt tccgagatga tccagaattg cttaacataa 6180

ttcctctaga aacagctgta caagaaactg gcagatcatc agatgaaggt aagggcaagc 6240

agcctgacat acagatcaga aatccgagca aagcacacag gaacaagaaa tctaaagtaa 6300

gaacatctcc tggaaagggt ggacggggcg gcattctcgg agatggacct cctcaatatg 6360

cacaagctca agtcactggc atttcgtcac agcaaaactt ccatggccag cctaccatct 6420

ctggttcaag tgctgagaga gaaagacgcc ctgttggtcc attgagagag tcaagatatc 6480

agcaggatgc acctggcatg caatctaaca tggatggtat cagagagcgg gcaaattggt 6540

tggctcaaga gaggatgcat ggtaacagca tgaattcgat tgacgatggc acggaatctc 6600

aggaaaggag gcagcgaatg gagcacagac agatattgat gatcaaccgc acgatcaacg 6660

atgatatgga ttccctttca atcgggagcc atgaatctga ccagactcgt gtaagcgtac 6720

gaacactata caacaagcca aggaggacca gggtaaacct ggatgagtaa gcaagcaagc 6780

caagcctgta ctcaaatctg tgaacttgct tttgctaaaa aagaaaaaaa aaactgtgaa 6840

cttgctgttg ggaatgttga tacctgaaag catacttgcg ctgtatattt caggaggtgt 6900

gaccagaaca ccagcagata taacttacta aaacacttag tattgatttg atgaaatttg 6960

tcagctgata gtcaggcccc tattctgtag ataagagtat tttttgggaa tgctgtaatt 7020

gtgacttaat atggatgcat ttctcgttga tgaatgagga cctctcaata atttgattcc 7080

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taaacagatc gttattgcag tgctgttatc aacagaactt tgttgaatgt tatgctgtcg 7200

tttgttaata ttctaagatc agagaatgta gatggtgcag gtatattatg gatcactgct 7260

gcatga 7266

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggtaccga agcattggaa cgacaggc 28

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaggtcacc tcatgcagca gtgatccata at 32

<210> 8

<211> 1239

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggacgcct cctcctccgc ctccgccggc ggcgaggccg acgcgatggc gctcgtgcag 60

gggtacaacg ccgacgagct cgccatcgcc ggggagttcc tcaccacgtg gctccccttc 120

ctctccgcgg gcctctgcgc ctcctgcgcc gactccctcc gcagccgcgt ctcctccctg 180

ctgcccccgc aagccgagga atccccgtcg tcgccgccgc cgcggatcga tcagattgag 240

ccctcggggt gggagtccga tccggctacg gctcacccgc agcatctgcc gttcgagccg 300

agcggatggg actcggatcc gccgcagctg ccaccggagc aggagcagca gaagcagaag 360

ccgcagccgg cggagaagcc gcggaagtcg tgggcagaca tggctcagga ggacgagctc 420

gccgccgcgg cagaggagga cgcggcggca gccgcggctg atgacggcga ggaagggagc 480

gaggctggta ggccgggtgt gcagctgacg agggagcagc gggagctgag gcggttccgg 540

aacgtggtgc ggaggaagga tttcatctgt tttgagaggg tcaatggtcg gctcgtcaat 600

atcctcgctg gcctggaact tcattgcggt gtgtttagcg cggccgaaca gaagcgtatt 660

gtcgactacg tatacgatct tcaggagatg ggcaagcacg gggagcttgg agatcgtacg 720

tatacggaac cccaaaggtg gatgcgtggt aaagggcgag taacaatcca atttggatgc 780

tgttataatt atgccacgga caagaatgga aacccaccag gcattattcg aactattgct 840

tctgatccga tgcctagctt atttaagatc atgatcaaga gattggtacg gtggcatgtt 900

ctaccaaaga cttgcatacc agacagttgt attgtcaata tatatgaccc tggagattgc 960

atcccaccac atattgatag tcatgatttt gttcggccat tctgtactgt ttcattcctc 1020

agtgagtgca acattctttt tggatctact ctgaaaattg ctggccctgg agagttcact 1080

ggttcacttc caattcctct gcctgttggg tcggtgctta tcctaaatgg caatggtgct 1140

gatgtagaag cattgtgttc ctgcagttcc gaccaaaagg atatccatta ccttcagaaa 1200

gatggatcca gcgaagcgtc cgttcaattt ccgagatga 1239

<210> 9

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Asp Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ala Gly Gly Glu Ala Asp Ala Met

1 5 10 15

Ala Leu Val Gln Gly Tyr Asn Ala Asp Glu Leu Ala Ile Ala Gly Glu

20 25 30

Phe Leu Thr Thr Trp Leu Pro Phe Leu Ser Ala Gly Leu Cys Ala Ser

35 40 45

Cys Ala Asp Ser Leu Arg Ser Arg Val Ser Ser Leu Leu Pro Pro Gln

50 55 60

Ala Glu Glu Ser Pro Ser Ser Pro Pro Pro Arg Ile Asp Gln Ile Glu

65 70 75 80

Pro Ser Gly Trp Glu Ser Asp Pro Ala Thr Ala His Pro Gln His Leu

85 90 95

Pro Phe Glu Pro Ser Gly Trp Asp Ser Asp Pro Pro Gln Leu Pro Pro

100 105 110

Glu Gln Glu Gln Gln Lys Gln Lys Pro Gln Pro Ala Glu Lys Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Trp Ala Asp Met Ala Gln Glu Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ala

130 135 140

Glu Glu Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp Gly Glu Glu Gly Ser

145 150 155 160

Glu Ala Gly Arg Pro Gly Val Gln Leu Thr Arg Glu Gln Arg Glu Leu

165 170 175

Arg Arg Phe Arg Asn Val Val Arg Arg Lys Asp Phe Ile Cys Phe Glu

180 185 190

Arg Val Asn Gly Arg Leu Val Asn Ile Leu Ala Gly Leu Glu Leu His

195 200 205

Cys Gly Val Phe Ser Ala Ala Glu Gln Lys Arg Ile Val Asp Tyr Val

210 215 220

Tyr Asp Leu Gln Glu Met Gly Lys His Gly Glu Leu Gly Asp Arg Thr

225 230 235 240

Tyr Thr Glu Pro Gln Arg Trp Met Arg Gly Lys Gly Arg Val Thr Ile

245 250 255

Gln Phe Gly Cys Cys Tyr Asn Tyr Ala Thr Asp Lys Asn Gly Asn Pro

260 265 270

Pro Gly Ile Ile Arg Thr Ile Ala Ser Asp Pro Met Pro Ser Leu Phe

275 280 285

Lys Ile Met Ile Lys Arg Leu Val Arg Trp His Val Leu Pro Lys Thr

290 295 300

Cys Ile Pro Asp Ser Cys Ile Val Asn Ile Tyr Asp Pro Gly Asp Cys

305 310 315 320

Ile Pro Pro His Ile Asp Ser His Asp Phe Val Arg Pro Phe Cys Thr

325 330 335

Val Ser Phe Leu Ser Glu Cys Asn Ile Leu Phe Gly Ser Thr Leu Lys

340 345 350

Ile Ala Gly Pro Gly Glu Phe Thr Gly Ser Leu Pro Ile Pro Leu Pro

355 360 365

Val Gly Ser Val Leu Ile Leu Asn Gly Asn Gly Ala Asp Val Glu Ala

370 375 380

Leu Cys Ser Cys Ser Ser Asp Gln Lys Asp Ile His Tyr Leu Gln Lys

385 390 395 400

Asp Gly Ser Ser Glu Ala Ser Val Gln Phe Pro Arg

405 410

<210> 10

<211> 4347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggagggtgg ggcccacacg gcagcgagag acgcttcgat ggacgcctcc tcctccgcct 60

ccgccggcgg cgaggccgac gcgatggcgc tcgtgcaggg gtacaacgcc gacgagctcg 120

ccatcgccgg ggagttcctc accacgtggc tccccttcct ctccgcgggc ctctgcgcct 180

cctgcgccga ctccctccgc agccgcgtct cctccctgct gcccccgcaa ggtaacaatc 240

ccgtgtgctg ggttcgccgt agttagggtt tttgtgctgt tgcctcttac gcccccccgt 300

tcacctcgac tctgacagcc gaggaatccc cgtcgtcgcc gccgccgcgg atcgatcaga 360

ttgagccctc ggggtgggag tccgatccgg ctacggctca cccgcagcat ctgccgttcg 420

agccgagcgg atgggactcg gatccgccgc agctgccacc ggagcaggag cagcagaagc 480

agaagccgca gccggcggag aagccgcgga agtcgtgggc agacatggct caggaggacg 540

agctcgccgc cgcggcagag gaggacgcgg cggcagccgc ggctgatgac ggcgaggaag 600

ggagcgaggc tggtaggccg ggtgtgcagc tgacgaggga gcagcgggag ctgaggcggt 660

tccggaacgt ggtgcggagg aaggatttca tctgttttga gagggtcaat ggtcggctcg 720

tcaatatcct cgctggcctg gaacttcatt gcggtgtgtt tagcgcggcc gaacagaagc 780

gtattgtcga ctacgtatac gatcttcagg agatgggcaa gcacggggag cttggaggtg 840

agatttaagc tgcatggaga ttcgatatgt ttttctatgg cgctagttga atttggctaa 900

attttcatgt aaagtcttga gttttgagaa atgctttaat gaaaagggtt ttaggtcagg 960

attatgtaaa attttaggca aaggttttag ctgtaattaa ggtcatgctt tgctacttag 1020

gctatggtag ttgtggggat atggatcata ggcaaacatt tagatgtcta tatgcaccac 1080

agtagttcta tcgtgtagaa ctggaacttg tatagtgttc tcgtgcaaag tagaaagccg 1140

aagaattatt ataaaattgg ttttctcatg tcttgttcta tgtggtatgc actcaaagct 1200

acaaactttt ttggtaatta ttctactaaa tcattggatc tacctaccac aagtagcaga 1260

ttagcttttg tgatttcaag caggaagata aatatggtat ttgataaatt ataggtattg 1320

ccatcataac ataatcagcc atatttgaca aaaataacac agtttcaccc tactacacaa 1380

tcagaagcat ctgccgaaat ctgtctgtcc aggagaagcg tagcggatag caaaacattt 1440

tcattgtttt ctgtacacat gattctgtca taatggtgtt tccccatttg tgtaaacctc 1500

aatatgtttc aatgtattat ttacagtaat ctctgagtgt ttttggtttc tttgcttata 1560

tgctgcataa gcgttctcag catggatatt aaaacagaca tgcatgattt tctgtgcttc 1620

ttacagtcgt gcacaccaca ataaccacga ttgaagtaaa tgtaacatgt tgagtgagat 1680

gcctgacctt cattccagtt tacatatctg cgttcttctt ttcaatttaa ttaatttaat 1740

attcaagcta tgcactattt atctactgag ggcccagtat aacactaaca aatggccaca 1800

ctttagagta ccctgaagca cctaagcctg tttgattcac cttaggccat tggaccggaa 1860

tagaatttct catccttatt tgggtgagtg tatactatat attgggaagc ctactctatt 1920

tagtgctatc caaggtcctt ctttctgctt tacaaatgct atacgcacat gaattttctt 1980

gggctcacag ctgcatttat ttatttgcca tgttttgttt atttgtattt ttgtatatct 2040

aaatccaagc ataatatccc cctgtcagat cgtacgtata cggaacccca aaggtggatg 2100

cgtggtaaag ggcgagtaac aatccaattt ggatgctgtt ataattatgc cacggtacat 2160

actctagttt tatcctctga tcccatcagc ttgaatactg cagtggtact gatttaattc 2220

acatgtgaat ccatctaagg tttgaatctg tgatgacagg acaagaatgg aaacccacca 2280

ggcattattc gaactattgc ttctgatccg atgcctagct tatttaagat catgatcaag 2340

agattggtac ggtggcatgt tctaccaaag acttgcatac cagacagttg tattgtcaat 2400

atatatgacc ctggagattg catcccacca catattgata gtcatgattt tgttcggcca 2460

ttctgtactg tttcattcct cagtgagtgc aacattcttt ttggatctac tctgaaaatt 2520

gctggccctg gagagttcac tggttcactt ccaattcctc tgcctgttgg gtatgttctc 2580

atgcttttcg ctgtgctgat agattatttg tggtagccag ttgtgctatt tgggatgtta 2640

acaaattgat tttatttatt attgttttaa acttgattac tcatgaattc aaaggctgtg 2700

tagacttctc attcgatttc ttgaatggta ttgcatggta tgattactaa gggcctgtct 2760

ggctgtcata cttctgcagc tgtgctgctg ctgtagagat tgtatgcgca gtactgtagc 2820

tgatggctgt attgcagcca aatttagtcc taccgaacag gccctgaact tttctccttt 2880

agactttgct tgaagttttt gctgagagag atttctactc catacttgtt tgttgctgtg 2940

tttccttctc attggattgt cataaactct aaaatactaa ctgtatgtaa tttttgcatt 3000

ggccacttta ataatattca attattcgtg tctcatcatg tctttcagtt ttcttctgca 3060

gctctttagt tctcttatat actaaataca aacattcaca ggtcggtgct tatcctaaat 3120

ggcaatggtg ctgatgtagc aaagcattgt gttcctgcag ttccgaccaa aaggttgtga 3180

tactgatatc ctgttctatc atttggcttt tggaactcaa ttcctttgcc tgtataacat 3240

ttgaactctg acacactaat taaaacacag gatatccatt accttcagaa agatggatcc 3300

agcgaagcgt ccgttcaatt tccgagatga tccagaattg cttaacataa ttcctctaga 3360

aacagctgta caagaaactg gcagatcatc agatgaaggt aagggcaagc agcctgacat 3420

acagatcaga aatccgagca aagcacacag gaacaagaaa tctaaagtaa gaacatctcc 3480

tggaaagggt ggacggggcg gcattctcgg agatggacct cctcaatatg cacaagctca 3540

agtcactggc atttcgtcac agcaaaactt ccatggccag cctaccatct ctggttcaag 3600

tgctgagaga gaaagacgcc ctgttggtcc attgagagag tcaagatatc agcaggatgc 3660

acctggcatg caatctaaca tggatggtat cagagagcgg gcaaattggt tggctcaaga 3720

gaggatgcat ggtaacagca tgaattcgat tgacgatggc acggaatctc aggaaaggag 3780

gcagcgaatg gagcacagac agatattgat gatcaaccgc acgatcaacg atgatatgga 3840

ttccctttca atcgggagcc atgaatctga ccagactcgt gtaagcgtac gaacactata 3900

caacaagcca aggaggacca gggtaaacct ggatgagtaa gcaagcaagc caagcctgta 3960

ctcaaatctg tgaacttgct tttgctaaaa aagaaaaaaa aaactgtgaa cttgctgttg 4020

ggaatgttga tacctgaaag catacttgcg ctgtatattt caggaggtgt gaccagaaca 4080

ccagcagata taacttacta aaacacttag tattgatttg atgaaatttg tcagctgata 4140

gtcaggcccc tattctgtag ataagagtat tttttgggaa tgctgtaatt gtgacttaat 4200

atggatgcat ttctcgttga tgaatgagga cctctcaata atttgattcc actgtgacca 4260

caacatttct tccagcattt ttggtgtatt tttgcttcgg gcgtttgtga taaacagatc 4320

gttattgcag tgctgttatc aacagaa 4347

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggagcgagg ctggtaggcc ggg 23

<210> 12

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggacgcct cctcctccgc ctccgccggc ggcgaggccg acgcgatggc gctcgtgcag 60

gggtacaaac gccgacgagc tcgccatcgc cggggagttc ctcaccacgt ggctcccctt 120

cctctccgcg ggcctctgcg cctcctgcgc cgactccctc cgcagccgcg tctcctccct 180

gctgcccccg caagccgagg aatccccgtc gtcgccgccg ccgcggatcg atcagattga 240

<210> 13

<211> 79

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Asp Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ala Gly Gly Glu Ala Asp Ala Met

1 5 10 15

Ala Leu Val Gln Gly Tyr Lys Arg Arg Arg Ala Arg His Arg Arg Gly

20 25 30

Val Pro His His Val Ala Pro Leu Pro Leu Arg Gly Pro Leu Arg Leu

35 40 45

Leu Arg Arg Leu Pro Pro Gln Pro Arg Leu Leu Pro Ala Ala Pro Ala

50 55 60

Ser Arg Gly Ile Pro Val Val Ala Ala Ala Ala Asp Arg Ser Asp

65 70 75

Claims (4)

1.一种水稻雄性不育株系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系；

所述处理为，基于CRISPR/Cas9系统处理，使得水稻中OsALKBH5基因编码的氨基酸对应的核苷酸序列发生缺失，变异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失；所述OsALKBH5基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述基于CRISPR/Cas9系统处理具体包括：采用CRISPR/Cas9系统定点敲除OsALKBH5基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达；

所述CRISPR/Cas9系统定点敲除OsALKBH5基因的方法包括如下步骤：

a) 合成单核苷酸序列，引物如SEQ ID No.3和 SEQ ID No.4所示；

b) 通过扩增反应克隆出目标片段，与载体片段进行连接反应，构建含有水稻OsALKBH5基因靶序列的OsALKBH5-pRGEB32质粒；所述靶序列如SEQ ID No.11所示；

c）用含OsALKBH5-pRGEB32质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d) 通过将OsALKBH5基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序,筛选突变植株。

2.一种如权利要求1所述的制备方法获得的水稻雄性不育株系在水稻育种中的用途。

3.一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将编码 OsALKBH5 基因的基因组核苷酸序列转入突变体 Osalkbh5 植株，能够使突变体恢复到野生型表型；

具体为将含 OsALKBH5 互补构建的根癌农杆菌 EHA105 转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中 OsALKBH5 互补构建含有序列如 SEQ ID No.5 所示的核苷酸，引物序列为 SEQ ID No.6 和 7。

4.如权利要求3所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从水稻9522基因组中用碱基序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物扩增出OsALKBH5基因的基因组序列片段；

(b)提供携带表达OsALKBH5互补构建载体的根癌农杆菌EHA105；

(c)将水稻雄性不育株系的细胞、组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID No.1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织或器官，再生，获得恢复育性的水稻植株。

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