CN110184252B

CN110184252B - 雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法

Info

Publication number: CN110184252B
Application number: CN201910367861.6A
Authority: CN
Inventors: 梁婉琪; 赵国超; 张旭; 张大兵; 袁政; 陈明姣
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-05-05
Filing date: 2019-05-05
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2039-05-05
Also published as: CN110184252A

Abstract

本发明提供了一种雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法；所述的雄性不育基因OsDAF1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述应用为：采用常规方法敲除、改变或抑制OsDAF1基因，使得常规水稻品种中的OsDAF1基因表达水平降低或丧失，进而获得水稻雄性不育株系。本发明还涉及恢复Osdaf1雄性不育性状的方法，包括：使用遗传转化方法将SEQ ID NO.2转化到Osdaf1突变体，使其育性恢复到野生型表型。本发明制备的水稻雄性不育株系在水稻营养生长时期无异常表型出现，但在生殖生长时期的花药发育过程中出现异常，表现完全雄性不育。应用于杂交育种，可免除母本去雄的工作，大大提高生产效率。

Description

雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法

技术领域

本发明涉及常规水稻遗传育种技术领域，具体地，涉及一种雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法。

背景技术

水稻是全世界重要的粮食作物，世界上约有50％的人口以水稻为主食，大米也是加工许多食品的原材料。由于水稻的基因组较小，且水稻转化系统非常成熟，可以作为单子叶研究的模式植物，人们对水稻生殖发育机制还有待了解。水稻雄性不育系的发现及其利用开创了水稻杂交育种的新时代，对提高水稻产量发挥了巨大作用。由于目前水稻杂交过程中使用的不育系存在育性不稳定、细胞质负效应等缺点，因此深入开展水稻雄性不育调控机制的研究，对获得新型水稻不育系，提高农业产量等具有重要意义。同时对揭示植物生殖发育的分子调控机理等方面也具有重要的理论意义。雄性不育系：是指一种雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉无力生活，不能自花授粉结实，只有依靠外来花粉才能受精结实，因此借助这种母水稻作为遗传工具，通过人工辅助授粉的方法，就能产生大量杂交种子。从育种战略上看，杂交水稻的发展可以分为三系法、两系法和一系法三个发展阶段。每进入一个新阶段，都是育种上的一次突破，从而会把水稻的产量提高到一个新台阶。现在生产上用的杂交水稻属于三系法品种间杂交优势利用的范畴，这种三系杂交稻一般要比常规水稻增产20％左右，当前仍处于方兴未艾时期。但是，三系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系关系限制，使优良组合的筛选比较困难。因此，科学家一直在筛选和培育新的不育系，以期扩展细胞质背景，为远缘杂交和杂种优势的利用奠定基础。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法。

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法，利用OsDAF1基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，及其利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种雄性不育基因OsDAF1，所述雄性不育基因OsDAF1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述雄性不育基因OsDAF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

第二方面，本发明提供一种雄性不育基因OsDAF1的应用，所述应用为：采用常规方法敲除、改变或抑制OsDAF1基因，使得常规水稻品种中的OsDAF1基因表达水平降低或丧失，进而获得水稻雄性不育株系。

第三方面，本发明提供一种水稻雄性不育株系创制的方法，包括如下步骤：对常规水稻品种进行处理、培育，即得所述水稻雄性不育株系；

所述处理为：采用常规基因工程方法或CRISPR-CAS9基因编辑方法，使得水稻中编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述水稻品种包括粳稻品种9522、籼稻品种广陆矮4号、9311或龙特甫4号中的至少一种。

优选地，所述处理的具体方法为：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列突变为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。进而获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-1突变体。

更优选地，所述处理的具体方法为：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID NO.3。进而获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-1突变体。上述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4分别是辐射突变后的DNA序列和氨基酸序列。

优选地，所述处理的具体方法为：采用CRISPR-CAS9方法，使常规水稻品种中如SEQID NO.1所示的氨基酸序列移码并提前终止，突变为如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。进而获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-3突变体。

更优选地，所述处理的具体方法为：采用CRISPR-CAS9方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID NO.11。进而获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-3突变体。上述SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12分别是CRISPR敲除后的DNA序列和氨基酸序列。

优选地，所述CRISPR-CAS9基因编辑方法为：改变编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO.2，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平或者破坏所述氨基酸序列对应多肽的活性。

优选地，所述CRISPR-CAS9基因编辑方法中CRISPR-CAS9基因编辑载体的构建方法包括如下步骤：

A1、选择OsDAF1基因编码区序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第393位至第413位共20bp的特异性片段为靶标位点；

A2、基于现有方法(参考文献(Xie et al.Boosting CRISPR/Cas9multiplexediting capability with the endogenous tRNA-processingsystem.Proc.Natl.Acad.Sci.112,3570–3575(2015))中的方法)，采用两对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列作为引物，以质粒pGTR为模板，分别扩增出两段序列；混合两段序列，以限制性内切酶Bsa1和T7连接酶进行边切边连；产物作为模板，以如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的序列作为引物，扩增出tRNA连接gRNA的片段，Fok1限制性内切酶处理该片段后，插入Bsa1处理后的pRGEB32载体中，测序验证后成功构建pRGEB32-OsDAF1质粒，转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。

第四方面，本发明提供一种水稻不育株系在水稻制种中的用途，以如前述所述应用获得的水稻雄性不育株系作为母本，配合具有杂交优势的父本，生产杂种F1代，进行杂交育种。

第五方面，本发明提供一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包括如下步骤：采用遗传手段将所述OsDAF1基因，转入如前述所述方法获得的水稻雄性不育株系，进而使得突变体恢复野生型表型。

优选地，所述方法包括如下步骤：将含OsDAF1互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsDAF1互补构建含有编码如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选地，所述方法的具体步骤为：

B1、从野生型水稻幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，采用碱基序列如SEQ IDNo.13和SEQ ID No.14所示的引物，扩增出OsDAF1基因的如SEQ ID NO.15所示的7234bp的基因组序列片段；

B2、提供携带表达OsDAF1互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105；其中，所述OsDAF1互补构建含有如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；

B3、将含OsDAF1互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得。

优选地，所述野生型水稻为野生型9522。

优选地，所述步骤B3具体为：将水稻细胞或组织或器官与步骤B2中的根癌农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列SEQ ID NO.15转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，进行再生，获得水稻植株。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明通过控制水稻OsDAF1基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖的变异株，实现控制水稻生殖过程；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为OsDAF1突变体雄性不育表型，基因编辑突变体表型及基因组互补表型示意图；其中：图1A为粳稻9522去除内外稃花表型图；图1B为Osdaf1-1不育株去除内外稃花表型图；图1C为基因编辑Osdaf1-3不育株去除内外稃花表型图；图1D为OsDAF1基因组DNA表达载体转化Osdaf1-1不育株去内外稃花表型图；图1E为粳稻9522花粉粒I2-KI染色图；图1F为Osdaf1-1花粉粒I₂-KI染色图；图1G为Osdaf1-3花粉粒I2-KI染色图；图1H为OsDAF1基因组DNA表达载体转化Osdaf1-1不育株花粉粒I2-KI染色图；图1I为粳稻9522花粉粒扫描电镜图；图1J为Osdaf1-1花粉粒扫描电镜图；图1K为Osdaf1-3花粉粒扫描电镜图；图1L为OsDAF1基因组DNA表达载体转化Osdaf1-1不育株花粉粒扫描电镜图；图1A到图1D的图标等于50微米；图1E到图1H的图标等于20微米；图1I到图1L的图标等于5微米；

图2为OsDAF1基因定位、结构和突变位点示意图；其中，图2A为OsDAF1基因定位示意图；图2B为基因结构及突变位点示意图；

图3为OsDAF1表达模式示意图；其中，横坐标所述的S9、S10a、S10b、S11、S12、S13表示水稻雄性生殖发育的各个时期野生型花药材料。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所述OsDAF1基因为编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

实施例1、水稻雄性不育株系创制的方法

1.1创制Osdaf1-1水稻雄性不育株系

本实施例中通过RNA干扰或者序列变异等常规基因工程方法获得粳稻背景野生型水稻武育粳7号(又名9522)的雄性不育突变体Osdaf1-1。

1.2水稻育性控制蛋白基因的克隆

利用本领域内技术人员清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定位于二号染色体上的AP004771和AP004852两个BAC之间，约4188kb。在此基础上，利用高通量测序及RGAP(Rice Genome Annotation Project)网站对该区域内基因的注释分析，测序确定其中一个水稻雄性生殖发育控制蛋白OsDAF1基因发生突变(图2A)。

1.3水稻育性控制蛋白基因OsDAF1的点突变

本实施例的OsDAF1突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过常规基因工程方法获得后，经过图位克隆和测序分析比较，发现水稻雄性生殖发育控制蛋白OsDAF1的关键氨基酸缺失会使得水稻雄性生殖器官不能正常发育，造成植株不育。

全核苷酸序列分析结果表明：水稻雄性育性OsDAF1基因全长为2240bp(SEQ IDNO.16，包含调控区和内含子)。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO.2所示，编码全长为695个氨基酸的水稻雄性生殖发育控制蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过测序和序列对比发现，相比于野生型序列(SEQ ID NO.2)，突变体Osdaf1-1发生了15个碱基对缺失(其序列如SEQ ID NO.3所示)。具体突变类型为在激酶结构域(Kinasedomain)上缺失15个碱基导致关键氨基酸缺失(图2B)。

图2为OsDAF1基因定位、结构和突变位点示意图；其中，图2A为OsDAF1基因定位示意图，Chr.2表示基因位于2号染色体上；小箭头上方标记的数字和字符为重组子和群体数目及所用InDel标记名称；以“AP”开头的数字为BAC克隆名称；4188kb表示Y3’和YH42-5两个InDel标记之间的物理距离；最下方表示利用高通量测序在4188kb范围内定位到的基因OsDAF1的位置；图2B为基因结构及突变位点示意图。

1.4通过CRISPR-CAS9手段敲除水稻品种中的OsDAF1创制Osdaf1-3水稻雄性不育株系

为了对OsDAF1蛋白进行应用，构建了OsDAF1基因CRISPR-CAS9敲除的载体，并转化野生型9522植株，从而敲除或降低OsDAF1的表达，达到改变水稻育性的目的。

参考文献(Xie et al.Boosting CRISPR/Cas9multiplex editing capabilitywith the endogenous tRNA-processing system.Proc.Natl.Acad.Sci.112,3570–3575(2015))中的方法，用两对引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8以质粒pGTR为模板，分别扩增出两段序列。

L5AD5-F:5’CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACC AGTGG 3’(SEQ IDNO.5)

OsDAF1-CRI82-R:5’CGGGTCTCAGCCGAGGAAAGTTGCACCAGCCGGG 3’(SEQ ID NO.6)

OsDAF1-CRI82-F:5’TAGGTCTCCCGGCGCTTCCAAGTTTTAGAGCTAGAA 3’(SEQ ID NO.7)

L5AD5-R:5’TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAA GCACCGACTCG 3’(SEQ ID NO.8)

混合两段序列，以限制性内切酶Bsa1和T7连接酶进行边切边连。产物作为模板,以引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10扩增出tRNA连接gRNA的片段。

S5AD5-F:5’CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA 3’(SEQ ID NO.9)

S5AD5-R:5’TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC 3’(SEQ ID NO.10)

Fok1限制性内切酶处理该片段后，插入Bsa1处理后的pRGEB32载体中，测序验证后成功构建pRGEB32-OsDAF1质粒，转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。

将含有pRGEB32-OsDAF1构建的农杆菌在含有Kan(50μg/μl)的YEB平板上划线，获的单菌落。挑单菌落接种到3ml含(Kan和rif)抗生素的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的YEB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD₆₀₀为0.3至0.6左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM-AS液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼穗愈伤。取幼穗分化形成后穗长约3-5cm的小穗进行诱导，N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，15天后继代，培养8天后可用于转化。将愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮，使用浓度为100μM/L。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有50mg/L潮霉素和特美汀的选择培养基上进行选择培养。12天后将抗性愈伤组织转到含有50mg/L潮霉素和特美汀的选择培养基上继续筛选。12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基上培养两周左右(24小时光照)，代绿芽点长出后更换新的分化培养基继续分化培养至有芽长出。再生的小苗在1/2M培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。

阳性植株提取叶片总DNA，用鉴定引物测序鉴定成功敲除OsDAF1的转基因植株Osdaf1-3，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID NO.11，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列移码并提前终止，突变为SEQ ID NO.12，进而获得Osdaf1-3水稻雄性不育株系。

从表型上来看，Osdaf1-3突变体在成熟时期，花药偏小(图1C),进行碘染发现，正常的花粉粒很少且花粉形态不正常(图1G，1K)，而野生型的花粉碘染及花粉形态正常(图1E，1I)，这说明OsDAF1基因敲除后使花粉的发育受到影响，能够获得新的水稻雄性不育系。

1.5OsDAF1蛋白关键氨基酸缺失或移码提前终止导致水稻雄性发育异常，花粉形态异常

对Osdaf1突变体植株的形态学观察。如图1，野生型9522花药发育正常，而Osdaf1-1和Osdaf1-3突变型花药变小(图1A，1B，1C)；野生型9522碘染正常(图1E)，大部分Osdaf1-1和Osdaf1-3突变型花粉碘染不正常(图1F，1G)，部分能碘染上的花粉结构也不正常(图1J，1K)。

1.6OsDAF1表达特征

利用Osdaf1突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用荧光定量PCR的方法确定OsDAF1基因的表达模式(图3)，发现OsDAF1基因在水稻中是广泛表达的，在根、茎、叶、雌蕊和不同发育时期的花药中都有表达。在水稻雄性生殖发育时期花药的Stage8至Stage10显著表达。

1.7OsDAF1基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用

将Osdaf1突变体与籼稻广陆矮4号、9311、龙特甫4号水稻品系杂交，在F2代中具有籼型特征的植株中均出现了雄性不育株系，符合3:1分离规律，进而证明OsDAF1基因在其他水稻品种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生雄性不育植株。

实施例2、Osdaf1突变体在水稻制种中的用途

将Osdaf1突变体作为母本与三系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到F1代。在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将所筛选的植株与原不育亲本对应的保持系杂交。再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交筛选后获得新的雄性不育系，适宜作为杂交组合中的母本。

实施例3、恢复Osdaf1突变体雄性不育性状的方法

将编码OsDAF1基因的基因组核苷酸序列转入突变体Osdaf1突变体植株，能够使突变体恢复到野生型表型。从野生型9522幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，用引物：

OsDAF1gDNAF:5’GCAGGCATGCAAGCTTCTCAACATCTGGCTTCAGTTGA 3’(SEQ ID NO.13)

OsDAF1gDNAR:5’ATTCGAGCTGGTCACCAGAGAGCAGGTAATATCTGGAAT 3’(SEQ IDNO.14)

扩增出OsDAF1基因如SEQ ID NO.15所示的7234bp的基因组序列片段；将该片段通过大连宝生物公司的In-Fusion转化体系将扩增的DNA片段插入到用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，得到OsDAF1互补构建根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，使用遗传转化手段转化突变体Osdaf1突变体营养生殖生长期的幼穗愈伤，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸SEQ ID NO.15转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；再生，获得水稻植株；以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。

T0代获得互补植株，图1显示T0代互补植株花药正常(图1D)，可以产生花粉，并被I2/KI染色(图1H)，并且花粉形态正常(图1L)即表现出的野生型表型。

综上所述，本发明通过控制编码水稻凝集素受体激酶的OsDAF1基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性；本发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常，花粉败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法

<130> DAG38201

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 695

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

Met Pro Pro Arg Cys Arg Arg Leu Pro Leu Leu Phe Ile Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Val Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ile Ala Ala Ala

20 25 30

Pro Ala Ser Ser Tyr Arg Arg Ile Ser Trp Ala Ser Asn Leu Thr Leu

35 40 45

Leu Gly Ser Ala Ser Leu Leu Pro Gly Ala Ala Gly Val Ala Leu Thr

50 55 60

Thr Pro Ser Arg Asp Gly Val Gly Ala Gly Arg Ala Leu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Pro Val Arg Leu Leu Leu Pro Gln Asp Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ala

85 90 95

Ser Arg Ala Ala Thr Pro Ala Ser Phe Ser Thr Arg Phe Thr Phe Arg

100 105 110

Ile Thr Pro Ser Pro Thr Tyr Gly Asp Gly Leu Ala Phe Leu Leu Thr

115 120 125

Ser Ser Arg Thr Phe Leu Gly Ala Ser Asn Gly Phe Leu Gly Leu Phe

130 135 140

Pro Ser Ser Ser Ala Ser Asp Glu Gly Glu Leu Arg Asp Val Ser Thr

145 150 155 160

Val Ala Val Glu Ile Asp Thr His Leu Asp Val Ala Leu His Asp Pro

165 170 175

Asp Gly Asn His Val Ala Leu Asp Ala Gly Ser Ile Phe Ser Val Ala

180 185 190

Ser Ala Gln Pro Gly Val Asp Leu Lys Ala Gly Val Pro Ile Thr Ala

195 200 205

Trp Val Glu Tyr Arg Ala Pro Arg Arg Arg Leu Asn Val Trp Leu Ser

210 215 220

Tyr Ser Pro Ser Arg Arg Pro Glu Lys Pro Ala Leu Ser Ala Asp Val

225 230 235 240

Asp Leu Ser Gly Leu Leu Arg Thr Tyr Met Tyr Ala Gly Phe Ser Ala

245 250 255

Ser Asn Gly Asn Gly Ala Ala Leu His Val Val Glu Arg Trp Thr Phe

260 265 270

Arg Thr Phe Gly Phe Pro Asn Ser Ser Tyr Ala Pro Pro Pro Thr Lys

275 280 285

Tyr Ile Gly Pro Met Pro Pro Asn Asn Gln Pro Leu Pro Pro Pro Pro

290 295 300

Ser Pro Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro His

305 310 315 320

Pro Asn His Arg Arg Arg His Leu Phe Tyr Lys Val Leu Gly Gly Val

325 330 335

Leu Gly Gly Met Val Leu Leu Gly Leu Val Val Val Gly Ser Ala Val

340 345 350

Leu Leu Gly Arg Ser Val Arg Arg Lys Asn Gln Glu His Ala Val Ala

355 360 365

Ser Glu Asp Met Gly Glu Ala Thr Leu Ser Met Glu Val Ala Arg Ala

370 375 380

Ala Thr Lys Gly Phe Asp Ser Gly Asn Val Ile Gly Val Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Ala Thr Val Tyr Glu Gly Val Leu Pro Ser Gly Ser Arg Val Ala

405 410 415

Val Lys Arg Phe Gln Ala Ile Gly Ser Cys Thr Lys Ala Phe Asp Ser

420 425 430

Glu Leu Lys Ala Met Leu Asn Cys Pro His His Pro Asn Leu Val Pro

435 440 445

Leu Ala Gly Trp Cys Arg Ser Lys Asp Glu Leu Val Leu Val Tyr Glu

450 455 460

Phe Met Pro Asn Gly Asn Leu Asp Ser Ala Leu His Thr Leu Gly Gly

465 470 475 480

Ala Thr Leu Pro Trp Glu Ala Arg Phe Arg Ala Val Tyr Gly Val Ala

485 490 495

Ser Ala Leu Ala Tyr Leu His Asp Glu Cys Glu Asn Arg Ile Ile His

500 505 510

Arg Asp Val Lys Ser Ser Asn Val Met Leu Asp Ala Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Arg Leu Gly Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Val Ser His Gly Gly Leu

530 535 540

Pro Leu Thr Thr Gln Pro Ala Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu

545 550 555 560

Tyr Val His Thr Gly Val Ala Thr Glu Arg Ser Asp Val Tyr Ser Phe

565 570 575

Gly Val Leu Ala Leu Glu Val Ala Thr Gly Arg Arg Pro Ala Glu Arg

580 585 590

Gly Ile Ser Val Val Asn Trp Val Trp Thr Leu Trp Gly Arg Arg Arg

595 600 605

Leu Val Asp Ala Ala Asp Arg Arg Leu Gln Gly Arg Phe Val Ala Asp

610 615 620

Glu Met Arg Arg Val Leu Leu Val Gly Leu Cys Cys Val His Pro Asp

625 630 635 640

Cys Arg Lys Arg Pro Gly Met Arg Arg Val Val Ser Met Leu Asp Gly

645 650 655

Thr Ala Pro Leu Ile Leu Val Pro Asp Lys Met Pro Pro Val Leu Leu

660 665 670

Gln Pro Val Pro Asn Ala Ser Ser Met Asn Ser Ala Asp Thr Ala Asn

675 680 685

Thr Ala Phe Phe Ser Cys Arg

690 695

<210> 2

<211> 2088

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

atgcctccac gctgtaggcg cctccccctc ctcttcatcc tcctccttgc cgtccgccca 60

ctctccgccg ccgccgcgtc gagcatcgct gcggcccccg cctcctccta ccgccgcatc 120

tcgtgggcga gcaacctcac gctcctcggc tcagcctcgc tcctcccggg cgcggccggc 180

gtcgcgctca ccaccccttc ccgcgacggc gtcggcgccg gccgcgctct cttctcggag 240

cccgtgcgcc tcctcctgcc ccaggacgcg gccgcctccg cctccgcctc gcgtgccgct 300

accccggcct ccttctccac ccgcttcacc ttccgcatca cgccctcccc cacctacggc 360

gacggcctcg cgttcctcct cacctcctcc cgcactttcc tcggcgcttc caacgggttc 420

cttggcctgt tcccctcctc atccgcctcc gacgaggggg agctccgcga cgtctccacc 480

gtcgccgtcg agatcgacac ccacctcgac gtggcgctgc atgacccgga cggcaaccac 540

gtcgcgctcg acgcggggtc catcttctcc gtcgcgtccg cgcaaccagg cgtcgacctc 600

aaggccggcg tgcccatcac cgcctgggtt gagtaccgcg cgccgcgccg ccgcctcaac 660

gtatggctgt cctactcgcc gtcccgccgc cccgagaagc ccgccctctc ggccgatgtc 720

gacctctccg gcctcctgcg cacctacatg tacgcggggt tttcggcctc caatggcaac 780

ggcgctgcgc ttcacgtcgt cgagcgctgg accttccgca ccttcggctt ccccaactct 840

tcatacgccc cgccgccgac caagtacata ggcccaatgc cacccaataa ccagcctctc 900

cctccccctc cctctccctc tccctctccc cctccccctt cccctccccc tccccctcac 960

cctaaccacc gccgccgcca tctgttctac aaggtgcttg gcggagtcct cggtggtatg 1020

gtattgctgg gccttgtcgt cgttggttct gctgtcttgc ttggccggtc agtgcgccgc 1080

aaaaatcaag aacatgcagt ggcaagcgag gacatggggg aagcgacact ctctatggag 1140

gtggcacggg cagcaacaaa gggctttgac agtggcaatg tgatcggcgt tggtggctct 1200

ggtgctactg tgtatgaggg ggtgctcccc tctgggtcga gggttgctgt caaacggttt 1260

caggctattg gatcgtgcac caaggcattt gacagtgagc tcaaggccat gcttaattgc 1320

cctcatcacc caaatctcgt gccgcttgct gggtggtgca gaagtaagga tgagcttgtg 1380

cttgtttatg agttcatgcc caacgggaat ctagactctg cattgcacac actgggtggg 1440

gcaacacttc cctgggaggc acggttcagg gctgtatatg gtgttgcatc agcgctagca 1500

tatctgcatg atgagtgtga gaaccggatt atacatcgtg atgtcaagtc atcaaatgtt 1560

atgcttgatg cagagttcaa tgctcggcta ggtgattttg gccttgctcg cactgtgagc 1620

catggtgggt tgccacttac aacacagcca gcaggcacac tggggtacct tgcaccagaa 1680

tatgttcata caggggtggc tacagagcgg tctgatgtgt acagctttgg ggtgcttgct 1740

ctggaagtgg ccactggacg aaggcctgct gagaggggaa tctctgttgt taattgggtg 1800

tggactctat ggggtcgtcg aaggctggtt gatgcagcag accggcggct ccagggacga 1860

tttgttgcag atgagatgcg acgggtgctg cttgtgggtc tgtgttgtgt acatccagac 1920

tgccggaagc ggcctggtat gcgaagggta gtcagtatgc ttgatggtac tgcaccgttg 1980

atattggtac cagataagat gccaccagtt cttctacagc cagtaccaaa tgcttcatca 2040

atgaactctg cagatactgc caatactgca ttcttcagtt gtcgctga 2088

<210> 3

<211> 2073

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 3

atgcctccac gctgtaggcg cctccccctc ctcttcatcc tcctccttgc cgtccgccca 60

ctctccgccg ccgccgcgtc gagcatcgct gcggcccccg cctcctccta ccgccgcatc 120

tcgtgggcga gcaacctcac gctcctcggc tcagcctcgc tcctcccggg cgcggccggc 180

gtcgcgctca ccaccccttc ccgcgacggc gtcggcgccg gccgcgctct cttctcggag 240

cccgtgcgcc tcctcctgcc ccaggacgcg gccgcctccg cctccgcctc gcgtgccgct 300

accccggcct ccttctccac ccgcttcacc ttccgcatca cgccctcccc cacctacggc 360

gacggcctcg cgttcctcct cacctcctcc cgcactttcc tcggcgcttc caacgggttc 420

cttggcctgt tcccctcctc atccgcctcc gacgaggggg agctccgcga cgtctccacc 480

gtcgccgtcg agatcgacac ccacctcgac gtggcgctgc atgacccgga cggcaaccac 540

gtcgcgctcg acgcggggtc catcttctcc gtcgcgtccg cgcaaccagg cgtcgacctc 600

aaggccggcg tgcccatcac cgcctgggtt gagtaccgcg cgccgcgccg ccgcctcaac 660

gtatggctgt cctactcgcc gtcccgccgc cccgagaagc ccgccctctc ggccgatgtc 720

gacctctccg gcctcctgcg cacctacatg tacgcggggt tttcggcctc caatggcaac 780

ggcgctgcgc ttcacgtcgt cgagcgctgg accttccgca ccttcggctt ccccaactct 840

tcatacgccc cgccgccgac caagtacata ggcccaatgc cacccaataa ccagcctctc 900

cctccccctc cctctccctc tccctctccc cctccccctt cccctccccc tccccctcac 960

cctaaccacc gccgccgcca tctgttctac aaggtgcttg gcggagtcct cggtggtatg 1020

gtattgctgg gccttgtcgt cgttggttct gctgtcttgc ttggccggtc agtgcgccgc 1080

aaaaatcaag aacatgcagt ggcaagcgag gacatggggg aagcgacact ctctatggag 1140

gtggcacggg cagcaacaaa gggctttgac agtggcaatg tgatcggcgt tggtggctct 1200

ggtgctactg tgtatgaggg ggtgctcccc tctgggtcga gggttgctgt caaacggttt 1260

caggctattg gatcgtgcac caaggcattt gacagtgagc tcaaggccat gcttaattgc 1320

cctcatcacc caaatctcgt gccgcttgct gggtggtgca gaagtaagga tgagcttgtg 1380

cttgtttatg agttcatgcc caacgggaat ctagactctg cattgcacac actgggtggg 1440

gcaacacttc cctgggaggc acggttcagg gctgtatatg gtgttgcatc agcgctagca 1500

tatctgcatg atgagtgtga gaaccgtgtc aagtcatcaa atgttatgct tgatgcagag 1560

ttcaatgctc ggctaggtga ttttggcctt gctcgcactg tgagccatgg tgggttgcca 1620

cttacaacac agccagcagg cacactgggg taccttgcac cagaatatgt tcatacaggg 1680

gtggctacag agcggtctga tgtgtacagc tttggggtgc ttgctctgga agtggccact 1740

ggacgaaggc ctgctgagag gggaatctct gttgttaatt gggtgtggac tctatggggt 1800

cgtcgaaggc tggttgatgc agcagaccgg cggctccagg gacgatttgt tgcagatgag 1860

atgcgacggg tgctgcttgt gggtctgtgt tgtgtacatc cagactgccg gaagcggcct 1920

ggtatgcgaa gggtagtcag tatgcttgat ggtactgcac cgttgatatt ggtaccagat 1980

aagatgccac cagttcttct acagccagta ccaaatgctt catcaatgaa ctctgcagat 2040

actgccaata ctgcattctt cagttgtcgc tga 2073

<210> 4

<211> 690

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 4

Met Pro Pro Arg Cys Arg Arg Leu Pro Leu Leu Phe Ile Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Val Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ile Ala Ala Ala

20 25 30

Pro Ala Ser Ser Tyr Arg Arg Ile Ser Trp Ala Ser Asn Leu Thr Leu

35 40 45

Leu Gly Ser Ala Ser Leu Leu Pro Gly Ala Ala Gly Val Ala Leu Thr

50 55 60

Thr Pro Ser Arg Asp Gly Val Gly Ala Gly Arg Ala Leu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Pro Val Arg Leu Leu Leu Pro Gln Asp Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ala

85 90 95

Ser Arg Ala Ala Thr Pro Ala Ser Phe Ser Thr Arg Phe Thr Phe Arg

100 105 110

Ile Thr Pro Ser Pro Thr Tyr Gly Asp Gly Leu Ala Phe Leu Leu Thr

115 120 125

Ser Ser Arg Thr Phe Leu Gly Ala Ser Asn Gly Phe Leu Gly Leu Phe

130 135 140

Pro Ser Ser Ser Ala Ser Asp Glu Gly Glu Leu Arg Asp Val Ser Thr

145 150 155 160

Val Ala Val Glu Ile Asp Thr His Leu Asp Val Ala Leu His Asp Pro

165 170 175

Asp Gly Asn His Val Ala Leu Asp Ala Gly Ser Ile Phe Ser Val Ala

180 185 190

Ser Ala Gln Pro Gly Val Asp Leu Lys Ala Gly Val Pro Ile Thr Ala

195 200 205

Trp Val Glu Tyr Arg Ala Pro Arg Arg Arg Leu Asn Val Trp Leu Ser

210 215 220

Tyr Ser Pro Ser Arg Arg Pro Glu Lys Pro Ala Leu Ser Ala Asp Val

225 230 235 240

Asp Leu Ser Gly Leu Leu Arg Thr Tyr Met Tyr Ala Gly Phe Ser Ala

245 250 255

Ser Asn Gly Asn Gly Ala Ala Leu His Val Val Glu Arg Trp Thr Phe

260 265 270

Arg Thr Phe Gly Phe Pro Asn Ser Ser Tyr Ala Pro Pro Pro Thr Lys

275 280 285

Tyr Ile Gly Pro Met Pro Pro Asn Asn Gln Pro Leu Pro Pro Pro Pro

290 295 300

Ser Pro Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro His

305 310 315 320

Pro Asn His Arg Arg Arg His Leu Phe Tyr Lys Val Leu Gly Gly Val

325 330 335

Leu Gly Gly Met Val Leu Leu Gly Leu Val Val Val Gly Ser Ala Val

340 345 350

Leu Leu Gly Arg Ser Val Arg Arg Lys Asn Gln Glu His Ala Val Ala

355 360 365

Ser Glu Asp Met Gly Glu Ala Thr Leu Ser Met Glu Val Ala Arg Ala

370 375 380

Ala Thr Lys Gly Phe Asp Ser Gly Asn Val Ile Gly Val Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Ala Thr Val Tyr Glu Gly Val Leu Pro Ser Gly Ser Arg Val Ala

405 410 415

Val Lys Arg Phe Gln Ala Ile Gly Ser Cys Thr Lys Ala Phe Asp Ser

420 425 430

Glu Leu Lys Ala Met Leu Asn Cys Pro His His Pro Asn Leu Val Pro

435 440 445

Leu Ala Gly Trp Cys Arg Ser Lys Asp Glu Leu Val Leu Val Tyr Glu

450 455 460

Phe Met Pro Asn Gly Asn Leu Asp Ser Ala Leu His Thr Leu Gly Gly

465 470 475 480

Ala Thr Leu Pro Trp Glu Ala Arg Phe Arg Ala Val Tyr Gly Val Ala

485 490 495

Ser Ala Leu Ala Tyr Leu His Asp Glu Cys Glu Asn Arg Val Lys Ser

500 505 510

Ser Asn Val Met Leu Asp Ala Glu Phe Asn Ala Arg Leu Gly Asp Phe

515 520 525

Gly Leu Ala Arg Thr Val Ser His Gly Gly Leu Pro Leu Thr Thr Gln

530 535 540

Pro Ala Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Tyr Val His Thr Gly

545 550 555 560

Val Ala Thr Glu Arg Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Leu Ala Leu

565 570 575

Glu Val Ala Thr Gly Arg Arg Pro Ala Glu Arg Gly Ile Ser Val Val

580 585 590

Asn Trp Val Trp Thr Leu Trp Gly Arg Arg Arg Leu Val Asp Ala Ala

595 600 605

Asp Arg Arg Leu Gln Gly Arg Phe Val Ala Asp Glu Met Arg Arg Val

610 615 620

Leu Leu Val Gly Leu Cys Cys Val His Pro Asp Cys Arg Lys Arg Pro

625 630 635 640

Gly Met Arg Arg Val Val Ser Met Leu Asp Gly Thr Ala Pro Leu Ile

645 650 655

Leu Val Pro Asp Lys Met Pro Pro Val Leu Leu Gln Pro Val Pro Asn

660 665 670

Ala Ser Ser Met Asn Ser Ala Asp Thr Ala Asn Thr Ala Phe Phe Ser

675 680 685

Cys Arg

690

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> L5AD5-F

<400> 5

cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc aacaaagcac cagtgg 46

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> OsDAF1-CRI82-R

<400> 6

cgggtctcag ccgaggaaag ttgcaccagc cggg 34

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> OsDAF1-CRI82-F

<400> 7

taggtctccc ggcgcttcca agttttagag ctagaa 36

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> L5AD5-R

<400> 8

taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa caaaaaaaaa agcaccgact cg 52

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> S5AD5-F

<400> 9

cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc a 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> S5AD5-R

<400> 10

taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa c 31

<210> 11

<211> 2089

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 11

atgcctccac gctgtaggcg cctccccctc ctcttcatcc tcctccttgc cgtccgccca 60

ctctccgccg ccgccgcgtc gagcatcgct gcggcccccg cctcctccta ccgccgcatc 120

tcgtgggcga gcaacctcac gctcctcggc tcagcctcgc tcctcccggg cgcggccggc 180

gtcgcgctca ccaccccttc ccgcgacggc gtcggcgccg gccgcgctct cttctcggag 240

cccgtgcgcc tcctcctgcc ccaggacgcg gccgcctccg cctccgcctc gcgtgccgct 300

accccggcct ccttctccac ccgcttcacc ttccgcatca cgccctcccc cacctacggc 360

gacggcctcg cgttcctcct cacctcctcc cgcactttcc tcggcgcttc ccaacgggtt 420

ccttggcctg ttcccctcct catccgcctc cgacgagggg gagctccgcg acgtctccac 480

cgtcgccgtc gagatcgaca cccacctcga cgtggcgctg catgacccgg acggcaacca 540

cgtcgcgctc gacgcggggt ccatcttctc cgtcgcgtcc gcgcaaccag gcgtcgacct 600

caaggccggc gtgcccatca ccgcctgggt tgagtaccgc gcgccgcgcc gccgcctcaa 660

cgtatggctg tcctactcgc cgtcccgccg ccccgagaag cccgccctct cggccgatgt 720

cgacctctcc ggcctcctgc gcacctacat gtacgcgggg ttttcggcct ccaatggcaa 780

cggcgctgcg cttcacgtcg tcgagcgctg gaccttccgc accttcggct tccccaactc 840

ttcatacgcc ccgccgccga ccaagtacat aggcccaatg ccacccaata accagcctct 900

ccctccccct ccctctccct ctccctctcc ccctccccct tcccctcccc ctccccctca 960

ccctaaccac cgccgccgcc atctgttcta caaggtgctt ggcggagtcc tcggtggtat 1020

ggtattgctg ggccttgtcg tcgttggttc tgctgtcttg cttggccggt cagtgcgccg 1080

caaaaatcaa gaacatgcag tggcaagcga ggacatgggg gaagcgacac tctctatgga 1140

ggtggcacgg gcagcaacaa agggctttga cagtggcaat gtgatcggcg ttggtggctc 1200

tggtgctact gtgtatgagg gggtgctccc ctctgggtcg agggttgctg tcaaacggtt 1260

tcaggctatt ggatcgtgca ccaaggcatt tgacagtgag ctcaaggcca tgcttaattg 1320

ccctcatcac ccaaatctcg tgccgcttgc tgggtggtgc agaagtaagg atgagcttgt 1380

gcttgtttat gagttcatgc ccaacgggaa tctagactct gcattgcaca cactgggtgg 1440

ggcaacactt ccctgggagg cacggttcag ggctgtatat ggtgttgcat cagcgctagc 1500

atatctgcat gatgagtgtg agaaccggat tatacatcgt gatgtcaagt catcaaatgt 1560

tatgcttgat gcagagttca atgctcggct aggtgatttt ggccttgctc gcactgtgag 1620

ccatggtggg ttgccactta caacacagcc agcaggcaca ctggggtacc ttgcaccaga 1680

atatgttcat acaggggtgg ctacagagcg gtctgatgtg tacagctttg gggtgcttgc 1740

tctggaagtg gccactggac gaaggcctgc tgagagggga atctctgttg ttaattgggt 1800

gtggactcta tggggtcgtc gaaggctggt tgatgcagca gaccggcggc tccagggacg 1860

atttgttgca gatgagatgc gacgggtgct gcttgtgggt ctgtgttgtg tacatccaga 1920

ctgccggaag cggcctggta tgcgaagggt agtcagtatg cttgatggta ctgcaccgtt 1980

gatattggta ccagataaga tgccaccagt tcttctacag ccagtaccaa atgcttcatc 2040

aatgaactct gcagatactg ccaatactgc attcttcagt tgtcgctga 2089

<210> 12

<211> 174

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 12

Met Pro Pro Arg Cys Arg Arg Leu Pro Leu Leu Phe Ile Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Val Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ile Ala Ala Ala

20 25 30

Pro Ala Ser Ser Tyr Arg Arg Ile Ser Trp Ala Ser Asn Leu Thr Leu

35 40 45

Leu Gly Ser Ala Ser Leu Leu Pro Gly Ala Ala Gly Val Ala Leu Thr

50 55 60

Thr Pro Ser Arg Asp Gly Val Gly Ala Gly Arg Ala Leu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Pro Val Arg Leu Leu Leu Pro Gln Asp Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ala

85 90 95

Ser Arg Ala Ala Thr Pro Ala Ser Phe Ser Thr Arg Phe Thr Phe Arg

100 105 110

Ile Thr Pro Ser Pro Thr Tyr Gly Asp Gly Leu Ala Phe Leu Leu Thr

115 120 125

Ser Ser Arg Thr Phe Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Pro Trp Pro Val

130 135 140

Pro Leu Leu Ile Arg Leu Arg Arg Gly Gly Ala Pro Arg Arg Leu His

145 150 155 160

Arg Arg Arg Arg Asp Arg His Pro Pro Arg Arg Gly Ala Ala

165 170

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> OsDAF1gDNA-F

<400> 13

gcaggcatgc aagcttctca acatctggct tcagttga 38

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> OsDAF1gDNA-R

<400> 14

attcgagctg gtcaccagag agcaggtaat atctggaat 39

<210> 15

<211> 7234

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 15

ctcaacatct ggcttcagtt gatttctatt tgtgcaagac tagcaccacg aatgggaagt 60

tgatgggcca cagccacggc tttgatcaac ggactctgac gaagacgact accactgcgg 120

catccgcgat ggagagacgg gatgttccac cccaattcgc tgctgctctg gatggccttc 180

atgtgcttca tcttcttgcc cccaaggcgg cgacgatggc gaggacagac gcctccgccg 240

ctcgtccaac gcgcggattt gctcctcgcc ctcgatctga catgcttctc tggatggatt 300

tggcgtgcgg agtgggatga agcggcgagc cagcgagatg gccggactac cggagtgggg 360

agagaaaggg aaaacgcaca cgggatcagg tagggttggt gcgggcccac aaaagctatt 420

tcctatcggc cgtgctgact gcttgcgagc gatatgcgcg tgagaaaccg tgctgccgcc 480

agcgacaaaa ttaggtggtg tctgcgtagg acggaccaaa ctttagtctc tcttatagga 540

ctaaaatttt tgtgagccaa acactacctt agtcactcgc ttcattctct ctccttgatt 600

ctcttccttt cacgtaggat tttgctgatg tataattttt tggagcctgc tgagtcatta 660

tattgtacct actcttaggg tatccacaat gtgcatctaa agtgggtagt aagaaataaa 720

atactactac tattaggtta tatacattgt gagagtagta actaactaat accaggtaac 780

atgcttacta tctagacata agaaataaac aaatgatttc tctcaatttt ctctcatggc 840

tagtgattgt ggggtccaac ttactaccca cttttgttct ttcactattg tgactacaac 900

aacaactaat acccaccgac acagggccca cccgtattca caaagtaggt agtaaatatc 960

ggtgatgccc ttaggtagtc aaagtgtgcc gacgtgtcat gtagagcaac gtaggagatt 1020

cacctccaaa acatcgtctc acgattggac ggttcatccg tgtacgagtg agggtgtgca 1080

acgtctatga acgaaatgag acgatatggg gatttttatg actataggtt tatatagtcc 1140

taggtatgtc ttacgtacct acccttttgc atggcaattg tatcctaaat attttcttat 1200

tttgtttggc acataaaggt ccggtagtgt atggctccgt tgtgctatgt cactgtatca 1260

cttagtggca tcaccacctt ctcatgttta tatttgatat ttgaccgtct tgcttgcatg 1320

tatcattccg ccgcacgatt cacagctcca caccgatttt gtggagaaga attaagagag 1380

tagaatattt atggtaggat atgagatgcg gcaaagggta attcccaaaa cattaacaat 1440

ttttttgtta aaaaatgttt gaagggatat ctctccctcc aaaattcttt ttagtgttgg 1500

taggctataa gtgtgtgtta tttttcctta ttcctcgttt gccatgagca tgattcctaa 1560

attgcaaaat tgtatgtttt ctcaaaaatt ttttactgtt tcaaataaat gtcattacaa 1620

ttcatctatt aataacagtg tcactgaaat ttgataaaat tagaactgtg ccactaccat 1680

cacattttct atcttcttcg tcatttggca cataggaccc acccttagat tcatcttttt 1740

ccttcatcct cccttattct tttttttcca tctctcttca ccactatctc tctcacaaaa 1800

ataaaaaatg gggacaacat gccgcacgaa tcgggaccaa agagctcgag gtccggagga 1860

ggaggaggag gtgaagtccc tcgtcgacgg tgttcgtccc cacgtggttt tctgcccgac 1920

tactcctaca gcaagcactg catcctagac ggcttgaagg gggaagcgga cggcatgagg 1980

gtgaagacct cgagtttccc gacgtctttt gggcatcctg aaggcgacgc tgagttcaat 2040

tgctttgatg agtgagcaga gagatgatgc aggtggacat gagagaccgt cgatgagcca 2100

aagttggaga agaatcccga ccccagtaag ctctacctcg ggtccgcgcc gcatggatct 2160

ctgacgaaga gggcaccgcc gcaaggaatt ctgttgtttc caccccgctc cccgcatgca 2220

ccggagtgct gccgtcaccg ggttttgctg ctgctcccgc tcccactccc cgcgcacgct 2280

agagtgtcgt catcgttgcc gctgctgctg ggtcgctgcc cgctgtcccg tcctcgagtc 2340

gccacctgcc acgcctccgt cgccgtcgcc gctcgcactg ctacccgtcg tcgcaacgca 2400

agaaaatggg aagagagaat gaagaagaca taaaagaaaa gagatgaatg aaaaatataa 2460

cgacagtggc acaatttaaa ttttgtaata tttcaatggc atgattacta atagaggaat 2520

cgtaattaca tttatctgag atagtatatt tgccgtatgg attgaattaa ctctcggaat 2580

tctcatagct gtcaccaggc tggtcagtgg tcagcaactc aggaaaacaa atccctgctc 2640

cctaccccac gatttccact gaacggacca gattgagcat cgtcttccat ccgttcgctt 2700

cgcagcgtgg cctgcgggtg tctggacccc acatgtcatc agaacatatt gcaaaaccct 2760

tctctgtctt ccccaaatcc cccatcccca ccgccattct cgacggtttc tcgagctcca 2820

cctcctcgcg tgcccacgcc atccatggct tcttccgcac acaatgtgac cacctagcag 2880

cgccatcgcc atgcctccac gctgtaggcg cctccccctc ctcttcatcc tcctccttgc 2940

cgtccgccca ctctccgccg ccgccgcgtc gagcatcgct gcggcccccg cctcctccta 3000

ccgccgcatc tcgtgggcga gcaacctcac gctcctcggc tcagcctcgc tcctcccggg 3060

cgcggccggc gtcgcgctca ccaccccttc ccgcgacggc gtcggcgccg gccgcgctct 3120

cttctcggag cccgtgcgcc tcctcctgcc ccaggacgcg gccgcctccg cctccgcctc 3180

gcgtgccgct accccggcct ccttctccac ccgcttcacc ttccgcatca cgccctcccc 3240

cacctacggc gacggcctcg cgttcctcct cacctcctcc cgcactttcc tcggcgcttc 3300

caacgggttc cttggcctgt tcccctcctc atccgcctcc gacgaggggg agctccgcga 3360

cgtctccacc gtcgccgtcg agatcgacac ccacctcgac gtggcgctgc atgacccgga 3420

cggcaaccac gtcgcgctcg acgcggggtc catcttctcc gtcgcgtccg cgcaaccagg 3480

cgtcgacctc aaggccggcg tgcccatcac cgcctgggtt gagtaccgcg cgccgcgccg 3540

ccgcctcaac gtatggctgt cctactcgcc gtcccgccgc cccgagaagc ccgccctctc 3600

ggccgatgtc gacctctccg gcctcctgcg cacctacatg tacgcggggt tttcggcctc 3660

caatggcaac ggcgctgcgc ttcacgtcgt cgagcgctgg accttccgca ccttcggctt 3720

ccccaactct tcatacgccc cgccgccgac caagtacata ggcccaatgc cacccaataa 3780

ccagcctctc cctccccctc cctctccctc tccctctccc cctccccctt cccctccccc 3840

tccccctcac cctaaccacc gccgccgcca tctgttctac aaggtgcttg gcggagtcct 3900

cggtggtatg gtattgctgg gccttgtcgt cgttggttct gctgtcttgc ttggccggtc 3960

agtgcgccgc aaaaatcaag aacatgcagt ggcaagcgag gacatggggg aagcgacact 4020

ctctatggag gtggcacggg cagcaacaaa gggctttgac agtggcaatg tgatcggcgt 4080

tggtggctct ggtgctactg tgtatgaggg ggtgctcccc tctgggtcga gggttgctgt 4140

caaacggttt caggctattg gatcgtgcac caaggcattt gacagtgagc tcaaggccat 4200

gcttaattgc cctcatcacc caaatctcgt gccgcttgct gggtggtgca gaagtaagga 4260

tgagcttgtg cttgtttatg agttcatgcc caacgggaat ctagactctg cattgcacac 4320

actgggtggg gcaacacttc cctgggaggc acggttcagg gctgtatatg gtgttgcatc 4380

agcgctagca tatctgcatg atgagtgtga gaaccggatt atacatcgtg atgtcaagtc 4440

atcaaatgtt atgcttgatg cagagttcaa tgctcggcta ggtgattttg gccttgctcg 4500

cactgtgagc catggtgggt tgccacttac aacacagcca gcaggcacac tggggtacct 4560

tgcaccagaa tatgttcata caggggtggc tacagagcgg tctgatgtgt acagctttgg 4620

ggtgcttgct ctggaagtgg ccactggacg aaggcctgct gagaggggaa tctctgttgt 4680

taattgggtg tggactctat ggggtcgtcg aaggctggtt gatgcagcag accggcggct 4740

ccagggacga tttgttgcag atgagatgcg acgggtgctg cttgtgggtc tgtgttgtgt 4800

acatccagac tgccggaagc ggcctggtat gcgaagggta gtcagtatgc ttgatggtac 4860

tgcaccgttg atattggtac cagataagat gccaccagtt cttctacagc cagtaccaaa 4920

tgcttcatca atgaactctg cagatactgc caatactgca ttcttcagtt gtcgctgagc 4980

atacaagtta taggttagcg aatacaaatt tcttattcat atcatctata gtcatgttaa 5040

tgttttgaac catcttctgt tctttcctgc taaagacaaa aaaggtcaaa tgtaaatagg 5100

agactgttct gattgttaca aaaatgttgc ttgatcttaa ctgttaagcg tagcgaatga 5160

ctgctttttg agggaacctg tagagagttt tattttctga ctcaaaacca cagttaaaca 5220

tgtcatactt tttactgctc agatctggtg tcagtcgttt gaagatagtt ttgatggtat 5280

ctgtaatgca tgtcttatgg tctgtgcagt ttgtcctgac aaaatttgac attaccatca 5340

tgttttataa tagaaagttc aatcctaatt ctggcattta actgcctgga aattgctgta 5400

atgtgtatca tgaaaaatgt agcactgcct ccaatgttga tgcaaatgca acaaatgtct 5460

gctgatgtag agcaaataaa atttgtcatt gcttgtgctt tgtaagtttg ctgaaacatt 5520

aataaagcat gacaagaatg aagatattgt atgctgctga atagttactt cgaaagtttt 5580

agtagcaacc aaacctttac taattgttgt gactgttgaa ttgattgtta ataacgttta 5640

tgtgaagcag gttagatgtg aactctggat taacagacaa tttgattgtt gtacaacttg 5700

tagaagttca gaattagaca agcacttgaa catattttct tttgcttcac tttatgagta 5760

gcaaattgaa gctactctgt tgggcgaatt gtcagaaaga gcttactgtt agacagcata 5820

ttgggagcta tgttaagaag gaaaaactgt tagctgcatc tagttgtatc gagaatattt 5880

catccagtaa ttatttgaat ttgattaagt ttcatttgtc ccatattcta gctatatctc 5940

ccatgaccat tcaaatgctt tgaaagtaca catagttgat caatgaaata attctgttgt 6000

agtgttgttg ccatggtttt ttttatcttc attatatgcg gatcaattga ctttaccttt 6060

tttttttcaa gatgtataca atgcttaagg tactaaggta tatccacttg gaacacatca 6120

attgctagtc actttaatgt gactaatacc ttcctgtcaa tatttctaaa aagtaaaggt 6180

acttctagta cttacaattt caggcaccac aaaatgtccc ctagttttca tcatatcatt 6240

gtgagtatgg acaaggctgt acaattatga gtagtttccc tgacatataa taggttggtc 6300

taacacatct gtaatctgtg tagaatgctc tatatgtact gaaatctttc aaattattca 6360

gggttcattt gcctcatgtt tgcttctttg gataatttga tcgcttctgc agcacaagca 6420

tatgatcaac ttgggaaatt ttgttctaca gcctatatgg cactgataag atgacctgga 6480

tatgtagaat ggatcaacca gcgttgccct ttgtgttgtt ttaaagctaa ggcattgacc 6540

tttgtaccga acaagaattt tttgatgcgg gctctgctca ctctgcttca cctgctgggt 6600

ggtatgaaaa tcctgatagt tttctttacc aagaatcgta actagattcg ggaatttctc 6660

ttatgctatc tttatttgtc ccaatcattg tacatacttt gttctgcaag taatctattc 6720

tggaaggcat aggcagatgc gtctctggca tacctaagtt aagaaccatt attagtcttc 6780

cacagtctat caacacttgt tgctatgtac agcagtttct gcatgagaga ctagacaaaa 6840

ttgatttcaa tctatactgt agtcctagtc tgagtcctga gttcctgact aggtggtgca 6900

gtagagtggc ctcctttgga acatgaatta gttcatttcc tgcattcctg taaaattagt 6960

tcatttcctt tgagacatga attatcctcc tttgctggaa tttcatttcc tgtaaaattc 7020

ctcaaaaaat cctgcattcc gaagtatttt tggagctgac ttcatcgaaa taagcaatgt 7080

cagagaaatc ttttagtagt atatattgca attttcgatg aggctgatcg cacttccgat 7140

tatgagtaca cgactcattc attggtccat ttcaatgtgt ataccttgtt ttcaaagaat 7200

tggtccaaac aattccagat attacctgct ctct 7234

<210> 16

<211> 2240

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 16

aaatccccca tccccaccgc cattctcgac ggtttctcga gctccacctc ctcgcgtgcc 60

cacgccatcc atggcttctt ccgcacacaa tgtgaccacc tagcagcgcc atcgccatgc 120

ctccacgctg taggcgcctc cccctcctct tcatcctcct ccttgccgtc cgcccactct 180

ccgccgccgc cgcgtcgagc atcgctgcgg cccccgcctc ctcctaccgc cgcatctcgt 240

gggcgagcaa cctcacgctc ctcggctcag cctcgctcct cccgggcgcg gccggcgtcg 300

cgctcaccac cccttcccgc gacggcgtcg gcgccggccg cgctctcttc tcggagcccg 360

tgcgcctcct cctgccccag gacgcggccg cctccgcctc cgcctcgcgt gccgctaccc 420

cggcctcctt ctccacccgc ttcaccttcc gcatcacgcc ctcccccacc tacggcgacg 480

gcctcgcgtt cctcctcacc tcctcccgca ctttcctcgg cgcttccaac gggttccttg 540

gcctgttccc ctcctcatcc gcctccgacg agggggagct ccgcgacgtc tccaccgtcg 600

ccgtcgagat cgacacccac ctcgacgtgg cgctgcatga cccggacggc aaccacgtcg 660

cgctcgacgc ggggtccatc ttctccgtcg cgtccgcgca accaggcgtc gacctcaagg 720

ccggcgtgcc catcaccgcc tgggttgagt accgcgcgcc gcgccgccgc ctcaacgtat 780

ggctgtccta ctcgccgtcc cgccgccccg agaagcccgc cctctcggcc gatgtcgacc 840

tctccggcct cctgcgcacc tacatgtacg cggggttttc ggcctccaat ggcaacggcg 900

ctgcgcttca cgtcgtcgag cgctggacct tccgcacctt cggcttcccc aactcttcat 960

acgccccgcc gccgaccaag tacataggcc caatgccacc caataaccag cctctccctc 1020

cccctccctc tccctctccc tctccccctc ccccttcccc tccccctccc cctcacccta 1080

accaccgccg ccgccatctg ttctacaagg tgcttggcgg agtcctcggt ggtatggtat 1140

tgctgggcct tgtcgtcgtt ggttctgctg tcttgcttgg ccggtcagtg cgccgcaaaa 1200

atcaagaaca tgcagtggca agcgaggaca tgggggaagc gacactctct atggaggtgg 1260

cacgggcagc aacaaagggc tttgacagtg gcaatgtgat cggcgttggt ggctctggtg 1320

ctactgtgta tgagggggtg ctcccctctg ggtcgagggt tgctgtcaaa cggtttcagg 1380

ctattggatc gtgcaccaag gcatttgaca gtgagctcaa ggccatgctt aattgccctc 1440

atcacccaaa tctcgtgccg cttgctgggt ggtgcagaag taaggatgag cttgtgcttg 1500

tttatgagtt catgcccaac gggaatctag actctgcatt gcacacactg ggtggggcaa 1560

cacttccctg ggaggcacgg ttcagggctg tatatggtgt tgcatcagcg ctagcatatc 1620

tgcatgatga gtgtgagaac cggattatac atcgtgatgt caagtcatca aatgttatgc 1680

ttgatgcaga gttcaatgct cggctaggtg attttggcct tgctcgcact gtgagccatg 1740

gtgggttgcc acttacaaca cagccagcag gcacactggg gtaccttgca ccagaatatg 1800

ttcatacagg ggtggctaca gagcggtctg atgtgtacag ctttggggtg cttgctctgg 1860

aagtggccac tggacgaagg cctgctgaga ggggaatctc tgttgttaat tgggtgtgga 1920

ctctatgggg tcgtcgaagg ctggttgatg cagcagaccg gcggctccag ggacgatttg 1980

ttgcagatga gatgcgacgg gtgctgcttg tgggtctgtg ttgtgtacat ccagactgcc 2040

ggaagcggcc tggtatgcga agggtagtca gtatgcttga tggtactgca ccgttgatat 2100

tggtaccaga taagatgcca ccagttcttc tacagccagt accaaatgct tcatcaatga 2160

actctgcaga tactgccaat actgcattct tcagttgtcg ctgagcatac aagttatagg 2220

ttagcgaata caaatttctt 2240

Claims

1.一种雄性不育基因OsDAF1的应用，其特征在于，所述雄性不育基因OsDAF1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示；所述应用为：通过RNA干扰或者序列变异基因工程方法由编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列突变获得序列如SEQ IDNO.3 所示的15个碱基对缺失导致关键氨基酸缺失的水稻雄性不育株系，即突变体Osdaf1- 1；

或采用CRISPR-CAS9方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列移码并提前终止，突变为如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-3突变体。

2.一种水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，包括如下步骤：对常规水稻品种进行处理、培育，即得所述水稻雄性不育株系；

所述处理为：通过RNA干扰或者序列变异基因工程方法由编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列突变获得序列如SEQ ID NO.3 所示的15个碱基对缺失导致关键氨基酸缺失的水稻雄性不育株系，即突变体Osdaf1-1；

3.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述CRISPR-CAS9基因编辑方法中CRISPR-CAS9基因编辑载体的构建方法包括如下步骤：

A1、选择OsDAF1基因编码区序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第393位至第413位共20bp的特异性片段为靶标位点；

A2、基于现有方法，采用两对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的序列作为引物，以质粒pGTR为模板，分别扩增出两段序列；混合两段序列，以限制性内切酶Bsa1和T7连接酶进行边切边连；产物作为模板，以如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的序列作为引物，扩增出tRNA连接gRNA的片段，Fok1限制性内切酶处理该片段后，插入Bsa1处理后的pRGEB32载体中，测序验证后成功构建pRGEB32-OsDAF1质粒，转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens）EHA105。

4.一种水稻不育株系在水稻制种中的用途，其特征在于，以如权利要求1所述应用获得的水稻雄性不育株系作为母本，配合具有杂交优势的父本，生产杂种F1代，进行杂交育种。

5.一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用遗传手段将含OsDAF1 互补构建的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 转入如权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系，培育，进而使得突变体恢复野生型表型；其中OsDAF1 互补构建编码如SEQ ID NO. 1 所示氨基酸序列的如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：

B1、从野生型水稻幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，采用碱基序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物，扩增出OsDAF1基因的如SEQ ID NO.15所示的7234bp的基因组序列片段；

B2、提供携带表达OsDAF1互补构建载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105；其中，所述OsDAF1互补构建如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；

B3、将含OsDAF1互补构建的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得。