CN105671075B - 水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法，所述雄性不育基因CSA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用具体是，采用基于CRISPR/Cas9系统敲除、改变或抑制CSA基因，使得常规水稻品种中的CSA基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。所述定点敲除方法为分别利用基于CH‑CRISPR/Cas9系统的CC‑CSA‑1载体和基于Gateway‑CRISPR/Cas9系统的GC‑CSA‑1载体对水稻雄性不育基因CSA进行定向基因编辑。本发明为创造基于水稻雄性不育基因CSA的雄性不育系种质资源、水稻两系杂交制种提供一种高效的敲除方法和育种方式。

Description

水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法
技术领域
本发明属于水稻育种技术领域，涉及水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法，具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法及利用该方法在不同水稻品种中的创制雄性不育系的应用。
背景技术
雄性不育系为水稻杂交制种技术提供关键的育种材料，在全世界范围内展开了广泛的研究。水稻花粉碳饥饿(Carbon Starved Anther，csa)基因编码一个参与水稻花药发育和糖分配调控的R2R3MYB转录因子，主要在花药绒毡层细胞和糖转运维管组织中表达(Zhang et al,2010)。CSA基因的突变会造成水稻光敏雄性不育，表现出在短光照下雄性不育、长日照下恢复可育的特征；此外，csa不育系和恢复系JP69杂交产生的F1代具有杂种优势(Zhang et al,2013)，因此，基于csa的光敏雄性不育系，可用于水稻两系杂交稻制种，应用前景广阔。
CRISPR/Cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白)系统是近几年出现的基因组编辑新技术，在各种生物和细胞等领域都有广泛的研究和应用。CRISPR/Cas9系统是一种源于原核生物抵御噬菌体、质粒等入侵长期进化的获得性免疫系统，其在指导RNA下完成对外源遗传物质的降解。CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白与sgRNA形成复合体，切割与sgRNA上spacer互补的基因组DNA序列，产生DNA双链断裂(DSB)，激活细胞启动DNA损伤修复机制，通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)方式引入突变。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系统技术具有设计简单、构建快速、突变效率高、多把点同时编辑等优势。
目前，水稻雄性不育系的创制主要是通过杂交将不育基因或位点导入其他水稻品种中，但是转育周期较长、过程较复杂、劳动成本大。通过CRISPR/Cas9系统的靶向修饰直接对水稻CSA基因进行定点突变或敲除，创制基于CSA基因的水稻雄性不育株系，大大缩短育种周期。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种水稻OsCSA基因(即水稻雄性不育基因CAS)的应用及其定点敲除方法，提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法及利用该方法在不同水稻品种中的创制雄性不育系的应用，利用CSA基因及其蛋白参与水稻花药发育调控的特点及CRISPR/Cas9系统的基因组靶向修饰，通过突变CSA基因核苷酸序列筛选水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种水稻OsCSA基因的应用，所述OsCSA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用具体是，采用基于CRISPR/Cas9系统敲除、改变或抑制CSA基因，使得常规水稻品种中的CSA基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。
优选地，所述CRISPR/Cas9系统为II类CRISPR/Cas9载体系统。
优选地，所述CRISPR/Cas9载体系统为：基于psgR-Cas9-Os和pCAMBIA1300载体的CH－CRISPR/Cas9构建、基于pOs-sgRNA和pH-Ubi-Cas9载体的Gateway-CRISPR/Cas9构建中的一种或两种；
所述CRISPR/Cas9载体系统采用的靶序列为CSA序列中任一包括XXXNGG的核酸序列；其中，XXX为19－20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。
优选地，所述常规水稻品种为粳稻品种9522，交源5B，或空育13。
第二方面，本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻OsCSA基因的定点敲除方法，所述定点敲除方法包括如下步骤：
a)构建含有水稻OsCSA基因靶序列CSA-1的psgR-Cas9-Os表达盒CH-CSA-1质粒；
b)酶切CH-CSA-1质粒，将含有CSA-1片段的序列构建到pCAMBIA1300质粒中形成CC-CSA-1质粒；
c)将含CC-CSA-1质粒的根癌农杆菌转入水稻品种中；
其中，所述靶序列CSA-1为位于SEQ ID NO.2的第49位至第68位的核酸序列；所述CC-CSA-1质粒含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻OsCSA基因的定点敲除方法，所述定点敲除方法包括如下步骤：
a)构建含有水稻OsCSA基因靶序列CSA-1的pOs-sgRNA表达盒sgRNA-CSA-1质粒；
b)通过gateway克隆将含有CSA-1片段的序列构建到pH-Ubi-Cas9质粒中形成GC-CSA-1质粒；
c)将含GC-CSA-1质粒的根癌农杆菌转入水稻品种；
其中，所述靶序列CSA-1为位于SEQ ID NO.2的第49位至第68位的核酸序列；所述GC-CSA-1质粒含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
第四方面，本发明涉及一种水稻OsCSA基因定点敲除获得水稻雄性不育株系的方法，所述方法包括如下步骤：取常规水稻品种，采用如权利要求3或4所述的方法进行处理，之后进行筛选鉴定，进而获得水稻雄性不育株系。
采所述定点敲除方法在所述常规水稻品种中表达是通过所述CC-CSA-1质粒将编码所述CC-CSA-1的基因导入所述常规水稻品种中实现的；所述采用权利要求4所述定点敲除方法在所述常规水稻品种中表达是通过所述GC-CSA-1质粒将编码所述GC-CSA-1的基因导入所述常规水稻品种中实现的。
优选地，所述筛选为转化植株筛选，具体包括如下步骤：通过CRISPR/Cas9系统载体自身的通用引物M13F和所述CSA-1靶序列引物的聚合酶链式反应扩增实现的。
优选地，所述鉴定为突变植株鉴定，具体包括如下步骤：通过将CSA基因的特异性引物扩增CSA基因的基因组片段进行测序实现的。
优选地，所述常规水稻品种为粳稻品种9522，交源5B，或空育13。
本发明的基于CRISPR/Cas9系统水稻OsCSA基因定点敲除方法，具体为分别利用基于CH-CRISPR/Cas9系统的CC-CSA-1载体和基于Gateway-CRISPR/Cas9系统的GC-CSA-1载体对水稻雄性不育基因CSA实现定向基因编辑；
所述CC-CSA-1载体为特异性修饰所述水稻OsCSA基因内CSA-1靶序列的CH-CRISPR/Cas9系统；所述CC-CSA-1载体的靶序列CSA-1由SEQ ID No.2序列的第49位至第68位的核酸序列组成；所述CSA-1靶序列长度为20bp；单独使用所述CC-CSA-1载体可在所述水稻品种CSA基因内靶序列处引入插入缺失突变，使所述水稻品种CSA基因失去原有的功能；
所述GC-CSA-1载体为特异性修饰所述水稻OsCSA基因内靶序列的Gateway-CRISPR/Cas9系统；所述GC-CSA-1载体的靶序列CSA-1由SEQ ID No.2序列的第49位至第68位的核酸序列组成；所述CSA-1靶序列长度为20bp；单独使用所述GC-CSA-1载体可在所述水稻品种CSA基因内靶序列处引入插入缺失突变，使所述水稻品种CSA基因失去原有的功能。
实验证明，单独使用CC-CSA-1导入所述水稻品种中获得的CSA基因突变植株的突变率16.7％；单独使用GC-CSA-1导入所述水稻品种中获得的CSA基因突变植株的突变率为50.0％；同时在所述水稻品种中定点敲除诱导产生的纯合突变转化植株表现出雄性不育特征。本发明为创造基于水稻OsCSA基因的雄性不育系种质资源、水稻杂交制种提供一种高效的育种方式。
本发明具有如下的有益效果：
1、本发明利用CSA基因及其蛋白参与水稻花药发育调控的特点及CRISPR/Cas9系统的基因组靶向修饰，通过突变该基因核苷酸序列筛选水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。
2、本发明为创造基于水稻雄性OsCSA基因的雄性不育系种质资源、水稻杂交制种提供一种高效的育种方式。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为基于CRISPR/Cas9系统水稻OsCSA基因定点敲除方法的载体活性检测测序峰图；
图2为基于Gateway-CRISPR/Cas9系统载体元件的阳性转化植株筛选；
图3为水稻品种9522中定点敲除诱导纯合水稻突变植株的表型观察图；其中，图3A为长光照条件下野生型、csa突变体和9522csa突变体的穗型；图3B为短光照条件下野生型、csa突变体和9522csa突变体的穗型；图3C为短光照条件下野生型的小穗；图3D为短光照条件下csa突变体的小穗；图3E为为短光照条件下9522csa突变体的小穗；图3F为短光照条件下野生型的小花；图3G为短光照条件下csa突变体的小花；图3H为短光照条件下9522csa突变体的小花；图3I为短光照条件下野生型的雄蕊及其育性检测结果；图3J为短光照条件下csa突变体的雄蕊及其育性检测结果；图3K为短光照条件下9522csa突变体的雄蕊及其育性检测结果；所述野生型为粳稻品种9522；所述csa为γ射线在粳稻品种9522中创制的水稻雄性不育突变体；9522csa为利用CRISPR/Cas9系统创制的9522csa突变体；
图4为水稻品种交源5B、空育131中定点敲除诱导纯合水稻突变植株的表型观察图；其中，图4A为短光照条件下野生型(JY5B)的穗型；图4B为长光照条件下JY5Bcsa突变体的穗型；图4C为短光照条件下JY5Bcsa突变体的穗型；图4D为短光照条件下野生型(JY5B)的小花；图4E为长光照条件下JY5Bcsa突变体的小花；图4F为短光照条件下JY5Bcsa突变体的小花；图4D1为短光照条件下野生型(JY5B)的育性检测结果；图4E1为长光照条件下JY5Bcsa突变体的育性检测结果；图4F1为短光照条件下JY5Bcsa突变体的育性检测结果；图4G为低温条件下野生型(KY131)的穗型；图4H为高温条件下KY131csa突变体的穗型；图4I为低温条件下KY131csa突变体的穗型；图4J为低温条件下野生型(KY131)的小花；图4K为高温条件下KY131csa突变体的小花；图4L为低温条件下KY131csa突变体的小花；图4J1为低温条件下野生型(KY131)的育性检测结果；图4K1为高温条件下KY131csa突变体的育性检测结果；图4L1为低温条件下KY131csa突变体的育性检测结果；所述JY5Bcsa为利用CRISPR/Cas9系统创制JY5Bcsa突变体；KY131csa为利用CRISPR/Cas9系统创制KY131csa突变体。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中如无特殊说明的实验方法，均为常规方法。
实施例1、基于CH-CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法
1、水稻雄性不育基因CSA的序列及分析
水稻雄性不育基因CSA的序列SEQ ID No.2所示。序列分析显示，该基因共包括3个外显子，分别为SEQ ID No.2序列的第49—298位(第一外显子)、第380-852位(第二外显子)、第1072-1146位(第三外显子)。
本发明以水稻雄性不育基因CSA第一外显子上的序列为基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法的CSA-1靶序列。
2、CH-CRISPR/Cas9系统引物设计及其重组表达载体的构建
2.1CH-CRISPR/Cas9系统靶序列的选择
CH-CRISPR/Cas9系统靶向水稻CSA基因的第一外显子的正义链，CSA-1靶序列如SEQ ID No.3序列所示。
2.2CH-CRISPR/Cas9系统靶序列引物的设计与合成
基于CH-CRISPR/Cas9系统设计靶向CSA基因的靶序列引物，CSA-1靶序列引物CC-CSA-1F和CC-CSA-1R序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；
分别合成基于CH-CRISPR/Cas9系统的CSA-1靶序列引物CC-CSA-1F和CC-CSA-1R。
2.3CH-CRISPR/Cas9系统重组表达载体的构建
将CSA-1靶序列引物CC-CSA-1F和CC-CSA-1R通过引物退火方法合成双链靶序列，并通过BbsⅠ酶切、连接方法插入到psgR-Cas9-Os载体的水稻U3启动子下游，获得CH-CSA-1表达盒；经测序证实，CH-CSA-1表达盒的水稻U3启动子下游插入如SEQ ID No.4所示序列；通过HindⅢ-HF和EcoRⅠ-HF酶切、连接方法将CH-CSA-1表达盒插入到pCAMBIA1300载体CAMV35S启动子下游，获得重组表达载体CC-CSA-1；经测序证实，重组表达载体CC-CSA-1的CAMV35S启动子下游插入如SEQ ID No.4所示序列；
所述psgR-Cas9-Os载体、pCAMBIA1300载体来源于中国科学院上海生命科学研究院朱健康老师实验室(Mao et al.,2013)。
3、CC-CSA-1重组表达载体的活性检测
将实施例2中的重组表达载体CC-CSA-1通过PEG介导导入水稻原生质体，获得重组表达载体CC-CSA-1的瞬时表达结果；经测序验证，获得重组表达载体CC-CSA-1在水稻原生质体中诱导生成的定点突变峰图(图1)。
4、重组根癌农杆菌的获得
将实施例2中重组表达载体CC-CSA-1电击转化农杆菌EH105，获得含有重组表达载体CC-CSA-1的重组农杆菌，命名为EH105-CC-CSA-1。
实施例2、基于CH-CRISPR/Cas9系统定点敲除方法在不同水稻品种的应用
将实施例4中的重组农杆菌EH105-CC-CSA-1分别侵染水稻品种9522、空育131成熟胚诱导的愈伤组织，将获得的水稻转化植株分别命名为9522-CC-CSA-1、空育131-CC-CSA-1；实验具体方法如下：
1、将重组农杆菌接种于YEB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平)中，28℃、200rpm条件下振荡培养至OD600为0.6-0.8；以5000rpm、4℃离心5min，用AAM液体培养基(乙酰丁香酮浓度为200μM/L，pH 5.2)重悬菌体沉淀浓度至OD600为0.6-0.8。
2、分别将水稻品种9522、空育131的成熟种子除去颖壳，在75％乙醇中浸泡1min,然后在NaClO溶液中(与水1:2混合，加1滴吐温20)振荡消毒20min，重复2次。经无菌水冲洗数次至无异味,将消毒后的水稻9522、空育131种子分别接种于NBD2培养基上诱导愈伤组织，26℃黑暗培养8-10天，切除根和残留胚乳，继代培养10天，获得成熟胚愈伤组织。
3、将步骤2获得的成熟胚愈伤组织分别浸于步骤1获得的重组农杆菌重悬液中，20—30min后移出水稻材料，接种于含有两层滤纸的共培养培养基(乙酰丁香酮浓度为100μM/L，pH 5.2)上，26℃黑暗条件下共培养3天。
4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于筛选培养基(潮霉素浓度为50mg/L，pH5.8)中，28℃黑暗条件下筛选培养12天，转移抗性愈伤组织至含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。
5、重复筛选2次后，转移抗性愈伤组织至分化培养基上(24小时光照/天)诱导分化；待新的无根幼苗生成，转移再生幼苗至1/2MS培养基上诱导生根；待小苗茁壮后移入人工气候室进行营养液栽培。
6、获得的再生植株移栽成活后，提取再生植株的叶片总DNA，分别以基于重组表达载体CC-CSA-1的M13F引物SEQ ID No.6所示序列和CC-CSA-1R靶序列引物如SEQ ID No.5所示序列进行PCR扩增筛选阳性转化植株。统计检测的再生植株数、阳性转化植株数及阳性转化植株数占检测的再生植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表1所示。
表1.CC-CSA-1转化水稻品种的阳性率检测结果
再生植株 再生植株数 阳性转化植株数 阳性率(％)
9522-CC-CSA-1 30 6 20.0
空育131-CC-CSA-1 59 22 37.3
7、以水稻雄性不育基因CSA的基因组为模板，用水稻雄性不育基因CSA特异性引物CSA-F如SEQ ID No.7所示序列和CSA-R如SEQ ID No.8所示序列进行PCR扩增，将所获得398bp扩增产物进行测序验证。测序验证结果如表2所示。统计检测的再生植株数、发生突变转化植株数及发生突变转化植株数占检测的再生植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表2所示。
表2.CC-CSA-1诱导水稻雄性不育基因CSA发生突变的检测结果
再生植株 再生植株数 发生突变转化植株数 突变效率(％)
9522-CC-CSA-1 30 5 16.7
空育131-CC-CSA-1 59 4 6.8
8、收集水稻品种9522中杂合突变植株的种子，以自主分离的方式筛选纯合突变植株；从水稻品种9522中T1代纯合突变植株表型上来看，在长光照(LD)条件下，与高结实率的野生型相比，9522csa突变体的穗型与csa突变体(其制备方法参见专利文献ZL201110431162.7)均表现出部分结实的特征；而在短光照条件下，9522csa突变体的穗型小穗、花和雄蕊与csa突变体表型相似，花粉碘染结果证实9522csa突变体与csa突变体在短光照(SD)条件下不育(图3)，而野生型花粉碘染结果显示在短光照条件下可育(图3)，这说明利用CRISPR/Cas9系统创制的9522csa突变体具有与csa突变体相似的光敏不育性，可用于水稻两系杂交制种。
9、收集水稻品种空育131中杂合突变植株的种子，以自主分离的方式筛选纯合突变植株；从水稻品种空育131中T1代纯合突变植株表型上来看，与野生型植株相比，在19-31℃(HT)范围和12.5-13.0h光照(SD)条件下，KY131csa突变体表现出部分不育的特征，而在17-29℃(LT)范围和11.5-12.0h光照(SD)条件下，KY131csa突变体表现出不育的特征(图4)，这说明利用CRISPR/Cas9系统创制的KY131csa突变体的雄性生殖发育育性可能受CSA基因的控制，具有水稻两系杂交制种的应用潜力。
实施例3、基于Gateway-CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法
1、水稻雄性不育基因CSA的序列及分析
水稻雄性不育基因CSA的序列SEQ ID No.2所示。序列分析显示，该基因共包括3个外显子，分别为SEQ ID No.2序列的第49—298位(第一外显子)、第380-852位(第二外显子)、第1072-1146位(第三外显子)。
本发明以水稻雄性不育基因CSA第一外显子上的序列为基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法的CSA-1靶序列。
2、Gateway-CRISPR/Cas9系统引物设计及其重组表达载体的构建
2.1Gateway-CRISPR/Cas9系统靶序列的选择
Gateway-CRISPR/Cas9系统靶向水稻CSA基因的第一外显子的正义链，CSA-1靶序列如SEQ ID No.3序列所示。
2.2Gateway-CRISPR/Cas9系统靶序列引物的设计与合成
基于Gateway-CRISPR/Cas9系统设计靶向CSA基因的靶序列引物，CSA-1靶序列引物GC-CSA-1F和GC-CSA-1R序列分别如SEQ ID No.9序列和SEQ ID No.10序列所示；
分别合成基于Gateway-CRISPR/Cas9系统的CSA-1靶序列引物GC-CSA-1F和GC-CSA-1R。
2.3Gateway-CRISPR/Cas9系统重组表达载体的构建
将CSA-1靶序列引物GC-CSA-1F和GC-CSA-1R通过引物退火方法合成双链靶序列，并通过BsaⅠ酶切、连接方法插入到pOs-sgRNA载体的水稻U3启动子下游，获得sgRNA-CSA-1表达盒；经测序证实，sgRNA-CSA-1表达盒的水稻U3启动子下游插入如SEQ ID No.9序列；通过gateway克隆(Invitrogen公司Gateway LR Clonase II Mix克隆酶)将sgRNA-CSA-1表达盒插入到pH-Ubi-Cas9的玉米ubiquitin启动子上游，获得重组表达载体GC-CSA-1；经测序证实，重组表达载体GC-CSA-1的玉米ubiquitin启动子上游插入如SEQ ID No.9序列；
所述pOs-sgRNA载体、pH-Ubi-Cas9载体来源于北京大学生命科学学院瞿礼嘉老师实验室(Miao et al.,2013)。
3、GC-CSA-1重组表达载体的活性检测
将实施例2中的重组表达载体GC-CSA-1通过PEG介导导入水稻原生质体，获得重组表达载体GC-CSA-1的瞬时表达结果；经测序验证，获得重组表达载体GC-CSA-1在水稻原生质体中诱导生成的定点突变峰图(图1)。
4、重组根癌农杆菌的获得
将实施例2中重组表达载体GC-CSA-1电击转化农杆菌EH105，获得含有重组表达载体GC-CSA-1的重组农杆菌，命名为EH105-GC-CSA-1。
实施例4、基于Gateway-CRISPR/Cas9系统定点敲除方法在不同水稻品种的应用
将实施例4中的重组农杆菌EH105-GC-CSA-1分别侵染水稻品种9522、交源5B成熟胚诱导的愈伤组织，将获得的水稻转化植株分别命名为9522-GC-CSA-1、交源5B-GC-CSA-1；实验具体方法如下：
1、将重组农杆菌接种于YEB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平)中，28℃、200rpm条件下振荡培养至OD600为0.6-0.8；以5000rpm、4℃离心5min，用AAM液体培养基(乙酰丁香酮浓度为200μM/L，pH 5.2)重悬菌体沉淀浓度至OD600为0.6-0.8。
2、分别将水稻品种9522、交源5B的成熟种子除去颖壳，在75％乙醇中浸泡1min,然后在NaClO溶液中(与水1:2混合，加1滴吐温20)振荡消毒20min，重复2次。经无菌水冲洗数次至无异味,将消毒后的水稻9522、交源5B分别接种于NBD2培养基上诱导愈伤组织，26℃黑暗培养8-10天，切除根和残留胚乳，继代培养10天，获得成熟胚愈伤组织。
3、将步骤2获得的成熟胚愈伤组织分别浸于步骤1获得的重组农杆菌重悬液中，20—30min后移出水稻材料，接种于含有两层滤纸的共培养培养基(乙酰丁香酮浓度为100μM/L，pH 5.2)上，26℃黑暗条件下共培养3天。
4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于筛选培养基(潮霉素浓度为50mg/L，pH5.8)中，28℃黑暗条件下筛选培养12天，转移抗性愈伤组织至含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。
5、重复筛选2次后，转移抗性愈伤组织至分化培养基上(24小时光照/天)诱导分化；待新的无根幼苗生成，转移再生幼苗至1/2MS培养基上诱导生根；待小苗茁壮后移入人工气候室进行营养液栽培。
6、获得的再生植株移栽成活后，提取再生植株的叶片总DNA，分别以重组表达载体GC-CSA-1的M13F引物SEQ ID No.6所示序列和GC-CSA-1F靶序列引物如SEQ ID No.9所示序列进行PCR扩增筛选阳性转化植株。统计检测的再生植株数、阳性转化植株数及阳性转化植株数占检测的再生植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表3所示。
表3.GC-CSA-1转化水稻品种的阳性率检测结果
再生植株 再生植株数 阳性转化植株数 阳性率(％)
9522-GC-CSA-1 2 1 50.0
交源5B-GC-CSA-1 26 14 53.8
7、以水稻雄性不育基因CSA的基因组为模板，用水稻雄性不育基因CSA特异性引物CSA-F如SEQ ID No.7所示序列和CSA-R如SEQ ID No.8所示序列进行PCR扩增，将所获得398bp扩增产物进行测序验证。测序验证结果如表4所示。统计检测的再生植株数、发生突变转化植株数及发生突变转化植株数占检测的再生植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表4所示。
表4.GC-CSA-1诱导水稻雄性不育基因CSA发生突变的检测结果
再生植株 再生植株数 发生突变转化植株数 突变效率(％)
9522-GC-CSA-1 2 1 50.0
交源5B-GC-CSA-1 26 18 69.2
8、以GC-CSA-1转化水稻阳性植株的筛选和诱导水稻雄性不育基因CSA发生纯合突变的实验结果来看，获得的7株T0代纯合突变转化植株的阳性转化鉴定中，部分交源5B-GC-CSA-1植株中未检测到Gateway-CRISPR/Cas9系统的载体元件，结果如图2所示：扩增产物为239bp；1为9522-GC-CSA-1植株，2-7为交源5B-GC-CSA-1植株，CK1为重组表达载体GC-CSA-1阳性对照，CK2为PCR体系阴性对照。
9、从水稻品种9522中纯合突变植株表型上来看，在长光照(LD)条件下，与高结实率的野生型相比，9522csa突变体的穗型与csa突变体均表现出部分结实的特征；而在短光照条件下，9522csa突变体的穗型小穗、花和雄蕊与csa突变体表型相似，花粉碘染结果证实9522csa突变体与csa突变体在短光照(SD)条件下不育(图3)，而野生型花粉碘染结果显示在短光照条件下可育(图3)，这说明利用CRISPR/Cas9系统创制的9522csa突变体具有与csa突变体相似的光敏不育性，可用于水稻两系杂交制种。
10、从水稻品种交源5B中纯合突变植株表型上来看，与野生型植株相比，在短光照条件下，JY5Bcsa突变体表现出雄性不育的特征，而在长光照条件下，JY5Bcsa突变体表现出恢复可育的特征(图4)，这说明利用CRISPR/Cas9系统创制JY5Bcsa突变体的雄性生殖发育和育性受CSA基因的控制，具有水稻两系杂交制种的应用潜力。
综上所述，本发明提供一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA的定点敲除方法，并在不同水稻品种中实现控制水稻雄性生殖发育和育性；本发明筛选的水稻突变体在营养生长时期与受体材料来源无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常、花粉败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
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Figure IDA0000943096720000021
Figure IDA0000943096720000031
Figure IDA0000943096720000041

Claims (4)

1.一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻OsCSA基因的定点敲除方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统为：基于pOs-sgRNA和pH-Ubi-Cas9载体的Gateway-CRISPR/Cas9构建；
所述定点敲除方法包括如下步骤：
a)将水稻OsCSA基因靶序列CSA-1插入pOs-sgRNA载体的水稻U3启动子下游，构建含有水稻OsCSA基因靶序列CSA-1的表达盒sgRNA-CSA-1；
b)通过gateway克隆将含有CSA-1片段的序列构建到pH-Ubi-Cas9质粒中形成GC-CSA-1质粒；
c)将含GC-CSA-1质粒的根癌农杆菌转入水稻品种；
其中，所述靶序列CSA-1为位于SEQ ID NO.2的第49位至第68位的核酸序列；所述GC-CSA-1质粒含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述水稻品种为交源5B。
2.一种水稻OsCSA基因定点敲除获得水稻雄性不育株系的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：取水稻品种交源5B，采用如权利要求1所述的方法进行处理，之后进行筛选鉴定，进而获得水稻雄性不育株系。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述筛选为转化植株筛选，具体包括如下步骤：通过CRISPR/Cas9系统载体自身的通用引物M13F和所述靶序列CSA-1引物的聚合酶链式反应扩增实现的。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述鉴定为突变植株鉴定，具体包括如下步骤：通过将OsCSA基因的特异性引物扩增OsCSA基因的基因组片段进行测序实现的。
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