CN111763687B

CN111763687B - 一种基于基因编辑技术快速培育玉米单倍体诱导系的方法

Info

Publication number: CN111763687B
Application number: CN201910183369.3A
Authority: CN
Inventors: 陈绍江; 钟裕; 刘晨旭
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2039-03-12
Also published as: CN111763687A

Abstract

本发明公开了一种基于基因编辑技术快速培育玉米单倍体诱导系的方法。该方法包括如下步骤：(1)用基因编辑系统编辑目的玉米，获得T₀代转基因玉米；基因编辑系统中含有sgRNA编码基因；sgRNA在目的玉米中识别的靶标DNA为编码ZmDMP蛋白的DNA片段和编码ZmPLA1蛋白的DNA片段；(2)将T₀代转基因玉米自交N代，得到T_N代转基因玉米；N为1以上的自然数；ZmPLA1基因和ZmDMP基因发生突变的T_N代转基因玉米即为玉米单倍体诱导系。获得的玉米单倍体诱导系，不仅培育的时间大大缩短，而且单倍体诱导率也较高。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种基于基因编辑技术快速培育玉米单倍体诱导系的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于基因编辑技术快速培育玉米单倍体诱导系的方法。

背景技术

玉米是世界三大粮食作物之一，也是我国种植面积第一大的作物，并且我国玉米杂交种的种植面积占全部的97％(Li，2009)。优良玉米自交系的选育是玉米利用杂种优势、选育优良杂交种的基础和关键。传统的选育方法需要7-8个世代连续自交才能够获得较为稳定的自交系，而利用单倍体育种技术只需2个世代(Weber，2014)，大大的缩短了育种年限。单倍体育种技术因此被国内外种业公司规模化应用，成为现代化玉米育种三大核心技术之一(Geiger&Gordillo，2009；陈绍江等，2012)。

单倍体的产生是单倍体技术应用的前提。据现有文献报道，玉米单倍体可自然产生，也可通过体外花粉离体培养、子房离体培养或“用各种化学的、生物的刺激物诱导”产生。目前，基于孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体的方法以其低廉的成本和快速获得大量单倍体等优点，逐渐成为玉米单倍体生产的主要途径。

诱导系是单倍体育种技术的基础和起点，但是诱导系的选育过程极其耗费时力，特别是对于诱导率的选择。因此，全球多家科研单位对于Stock6及其衍生系诱导产生孤雌生殖单倍体的遗传基础和生物学基础进行了大量的研究。结果表明，玉米孤雌生殖诱导能够产生玉米单倍体这一性状是可遗传的，并受到多个遗传位点的控制：

等(1999)首次检测到2个控制诱导率性状的遗传位点，分别位于1号染色体和2号染色体，共能解释约17.9％的表型变异；Barrant等(2008)同样在1号染色体相同区域检测到了一个既影响单倍体诱导率又引起群体偏分离的主效QTL；Prigge等(2012)利用多个群体进行全基因组扫描，共发现8个控制诱导率的遗传位点，其中有2个为主效QTL，位于1号染色体上的1.04bin区域的主效QTL位点qhir1能够解释66％的遗传变异，位于9号染色上的9.01bin区域的主效QTL位点qhir8能够解释20％的遗传变异。其中qhir1已被定位到了243kb的物理区间(Dong Xet al.，2013)，并成功在该区间克隆到一个磷脂酶基因ZmPLA1，该基因功能丧失能够诱导单倍体的产生(Kelliher T et al.，2017；Liu C et al，2017；Gilles L M，et al，2017)。qhir8作为另一个主效QTL，能够显著提高单倍体诱导率。Liu等(2015)对qhir8进行了精细定位，以诱导能力低的诱导系CAUHOI(2％)和诱导率高的诱导系UH400(8％)杂交后代为定位群体，最终将qhir8定位到了标记4292232和umc1867之间，其物理距离约789kb。后来研究有进一步将在qhir8定位于318bp区间，并在该区间克隆到一个编码DUF679结构域膜蛋白(DUF679 domain membrane protein)的基因ZmDMP，该基因突变后能在ZmPLA1基因的基础上极大提高单倍体诱导能力。

虽然以上的结果为诱导系的选育提供了有效的分子辅助选择标记，提高了诱导系的选育效率，但是该选育过程所需的时间还未能得到有效缩短。

发明内容

本发明的目的是提供玉米单倍体诱导系。

本发明首先保护的培育玉米单倍体诱导系的方法。

本发明所保护的培育玉米单倍体诱导系的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：用基因编辑系统编辑目的玉米，获得T0代转基因玉米；ZmPLA1基因和ZmDMP基因发生突变的T0代转基因玉米即为玉米单倍体诱导系；

所述基因编辑系统中含有sgRNA编码基因；所述sgRNA在目的玉米中识别的靶标DNA为编码ZmDMP蛋白的DNA片段和编码ZmPLA1蛋白的DNA片段；

所述ZmDMP蛋白可为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1)衍生的蛋白质；

所述ZmPLA1蛋白可为a3)或a4)：

a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

a4)将序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a3)衍生的蛋白质。

本发明所保护的培育玉米单倍体诱导系的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：

(1)用基因编辑系统编辑目的玉米，获得T0代转基因玉米；

所述ZmDMP蛋白可为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

所述ZmPLA1蛋白可为a3)或a4)：

a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

a4)将序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a3)衍生的蛋白质；

(2)完成步骤(1)后，将所述T₀代转基因玉米自交N代，得到T_N代转基因玉米；N为1以上的自然数；

ZmPLA1基因和ZmDMP基因发生突变的T_N代转基因玉米即为玉米单倍体诱导系。

上述方法二中，所述步骤(2)中，“将所述T₀代转基因玉米自交N代”具体可为将ZmPLA1基因和ZmDMP基因发生突变的T₀代转基因玉米自交N代。

上述任一所述的方法中，所述“用基因编辑系统编辑目的玉米”可为向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，所述玉米基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因。所述玉米基因组编辑的载体还可含有Cas9蛋白的编码基因。

上述任一所述“ZmPLA1基因和ZmDMP基因发生突变”的玉米(如T_N代转基因玉米、T₀代转基因玉米)的筛选步骤可如下：

(a1)提取玉米叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用ZmDMP_F：5’-TGAACTCAAGCACTGCCTAACG-3’和ZmDMP_R：5’-CCGGTCCTGAACAGCGACA-3’组成的引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲；采用ZmPLA1_F：5’-CCCTCGACGAGTATCTATAGC-3’和ZmPLA1_R：5’-CACTTGCCGTTGTACTTTGG-3’组成的引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙；

(a2)将PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙进行测序(如Sanger测序)；

(a3)将PCR扩增产物甲的测序结果与序列表中序列1自5’末端起第78-438位所示的DNA片段(简称目标DNA片段甲)进行比对，然后进行如下判断：如果测序结果与目标DNA片段甲比对有碱基插入、缺少或替换时，则玉米的ZmDMP基因发生突变；如果测序结果与目标DNA片段甲比对无差异，则玉米的ZmDMP基因未发生突变；

(a4)将PCR扩增产物乙的测序结果与序列表中序列3自5’末端起第28-625位所示的DNA片段(简称目标DNA片段乙)进行比对，然后进行如下判断：如果测序结果与目标DNA片段乙比对有碱基插入、缺少或替换时，则玉米的ZmPLA1基因发生突变；如果测序结果与目标DNA片段乙比对无差异，则玉米的ZmPLA1基因未发生突变。

本发明还保护一种培育玉米单倍体的方法，为将上述任一所述方法培育的玉米单倍体诱导系和目的玉米进行杂交，获得玉米单倍体。

上述方法中，所述“将上述任一所述玉米单倍体诱导系和目的玉米进行杂交”具体可为上述任一所述玉米单倍体诱导系作为父本，目的玉米作为母本进行杂交。

上述方法中，进行杂交的目的玉米和培育玉米单倍体诱导系使用的目的玉米可以相同，也可以不同。

上述方法中，可以通过田间表型鉴定玉米单倍体。具体鉴定方法可为：将进行杂交得到的玉米籽粒播种于田间，正常田间管理，观察玉米植株的单株表型，然后进行如下判断：如果植株矮小、叶片较窄且上冲、株型紧凑、雄性不育，则该玉米植株为玉米单倍体；否则为二倍体。

上述方法中，可以通过流式细胞鉴定玉米单倍体。具体鉴定方法可为：

(a)分别提取二倍体玉米(如玉米B104)幼嫩叶片的细胞核(以下简称二倍体玉米细胞核)和进行杂交得到的玉米植株幼嫩叶片的细胞核(以下简称杂交细胞核)；

(b)完成步骤(a)后，采用流式细胞仪检测二倍体玉米细胞核的信号；

(c)完成步骤(b)后，采用流式细胞仪检测杂交细胞核的信号，并进行如下判断：如果杂交细胞核的信号峰在二倍体玉米细胞核信号峰的一半左右，则该玉米植株为玉米单倍体；如果杂交细胞核的信号峰与二倍体玉米细胞核信号峰位置相同，该玉米植株为二倍体。

上述任一所述杂交具体可为有性杂交。

本发明还保护一种玉米基因组编辑的载体，可含有sgRNA编码基因和Cas9蛋白的编码基因；

所述sgRNA在目的玉米中识别的靶标DNA为编码ZmDMP蛋白的DNA片段和编码ZmPLA1蛋白的DNA片段；

所述ZmDMP蛋白为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

所述ZmPLA1蛋白为a3)或a4)：

a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

上述任一所述sgRNA识别的靶位点可为序列表中序列1自5’末端起第163-182位所示的DNA分子、序列表中序列1自5’末端起第211-230位所示的DNA分子和序列表中序列3自5’末端起第264-283位所示的DNA分子。

上述任一所述sgRNA的核苷酸序列可如序列表中序列6所示。

上述任一所述sgRNA编码基因可为序列表中序列5所示的DNA分子。

上述任一所述玉米基因组编辑的载体具体可为重组质粒pBUE411-sgRNA。所述重组质粒pBUE411-sgRNA可为向pBUE411载体的限制性内切酶BsaI的识别位点之间插入序列表中序列5所示的DNA分子，得到的重组质粒。

上述任一所述编码ZmDMP蛋白的基因(即ZmDMP基因)的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。上述任一所述编码ZmPLA1蛋白的基因(即ZmPLA1基因)的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。

上述任一所述“ZmPLA1基因和ZmDMP基因发生突变”是指ZmPLA1基因和ZmDMP基因出现碱基插入、缺失和替换中的至少一种。

上述任一所述的载体在培育玉米单倍体诱导系中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的载体在培育玉米单倍体中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，采用本发明提供的方法培育的玉米单倍体诱导系，不仅培育时间大大缩短，而且获得的玉米单倍体诱导系的诱导率明显提高。由此可见，通过对单倍体诱导基因ZmPLA1和ZmDMP的编辑能快速获得高频的单倍体诱导系。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为采用流式细胞仪检测二倍体玉米的信号图。

图2为采用流式细胞仪检测单倍体玉米的信号图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pBUE411载体记载于文献“A CRISPR/Cas9toolkit formultiplex genome editing in plants.Xing HL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,LiuB,Wang XC,Chen QJ.BMC Plant Biol.2014 Nov 29；14(1):327.10.1186/s12870-014-0327-y PubMed 25432517”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的野生型玉米B104记载于文献“Hallauer A R,Lamkey K R,WhiteP R.Registration of five inbred lines of maize:B102,B103,B104,B105,and B106[J].Crop science,1997,37(4):1405-1406.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。在下文中，野生型玉米B104简称玉米B104。

农杆菌EHA105感受态细胞为北京奥森鼎信生物技术有限公司的产品。

下述实施例选择表1中第2列所示的三个靶点进行实验，靶点位置、靶点序列依次见表1中第3列和第4列，对应的靶基因见表1中第1列。

表1

ZmDMP基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。ZmDMP蛋白的核苷酸序列如序列表中序列2所示。ZmPLA1基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。ZmPLA1蛋白的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

实施例1、玉米单倍体诱导系的获得

一、重组质粒pBUE411-sgRNA的构建

1、根据靶位点设计sgRNA序列为GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(序列6)。编码该sgRNA的DNA分子如序列表中序列5所示。序列5为：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc。

2、向pBUE411载体的限制性内切酶BsaI的识别位点之间插入序列表中序列5所示的编码sgRNA的DNA分子，得到重组质粒pBUE411-sgRNA。

二、转基因玉米的获得及其验证

1、EHA105/pBUE411-sgRNA的获得

将重组质粒pBUE411-sgRNA通过热激转化至农杆菌EHA105感受态细胞，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pBUE411-sgRNA。

2、T₀代转基因玉米的获得

采用农杆菌侵染法，将EHA105/pBUE411-sgRNA转化至玉米B104幼胚，经过筛选、分化和生根，获得26株T₀代转基因玉米。

3、T₀代转基因玉米突变类型的分子检测

(1)检测26株T₀代转基因玉米中ZmDMP基因的突变类型

(1-1)分别提取26株T₀代转基因玉米叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用ZmDMP_F：5’-TGAACTCAAGCACTGCCTAACG-3’和ZmDMP_R：5’-CCGGTCCTGAACAGCGACA-3’组成的引物对甲进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。

(1-2)将各个PCR扩增产物进行Sanger测序。

(1-3)将步骤(1-2)得到的测序结果分别与序列表中序列1自5’末端起第78-438位所示的DNA片段(简称目标DNA片段甲)进行比对，然后进行如下判断：如果测序结果与目标DNA片段甲比对有碱基插入、缺少或替换时，则相应的T₀代转基因玉米的ZmDMP基因发生突变；如果测序结果与目标DNA片段甲比对无差异，则相应的T₀代转基因玉米的ZmDMP基因未发生突变。

(2)检测26株T₀代转基因玉米中ZmPLA1基因的突变类型

(2-1)分别提取26株T₀代转基因玉米叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用ZmPLA1_F：5’-CCCTCGACGAGTATCTATAGC-3’和ZmPLA1_R：5’-CACTTGCCGTTGTACTTTGG-3’组成的引物对乙进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。

(2-2)将各个PCR扩增产物进行Sanger测序。

(2-3)将步骤(2-2)得到的测序结果分别与序列表中序列3自5’末端起第28-625位所示的DNA片段(简称目标DNA片段乙)进行比对，然后进行如下判断：如果测序结果与目标DNA片段乙比对有碱基插入、缺少或替换时，则相应的T₀代转基因玉米的ZmPLA1基因发生突变；如果测序结果与目标DNA片段乙比对无差异，则相应的T₀代转基因玉米的ZmPLA1基因未发生突变。

实验结果如下：26株T₀代转基因玉米中，18株T₀代转基因玉米的ZmPLA1基因和ZmDMP基因均发生突变，5株T₀代转基因玉米的ZmPLA1基因发生突变且ZmDMP基因未发生突变，2株T₀代转基因玉米的ZmDMP基因发生突变且ZmPLA1基因未发生突变，1株T₀代转基因玉米的ZmPLA1基因和ZmDMP基因均未发生突变。ZmPLA1基因和/或ZmDMP基因发生突变的T₀代转基因玉米即为阳性T₀代转基因玉米(即共获得25株阳性T0代转基因玉米)。

4、T₁代转基因玉米的获得和基因型鉴定

(1)将步骤3得到的阳性T₀代转基因玉米进行自交，收获种子后再播种，得到T₁代转基因玉米。

(2)分别提取T₁代转基因玉米叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用引物对甲或引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行Sanger测序。

(4)将步骤(3)中采用引物对甲进行PCR扩增得到的PCR扩增产物的测序结果分别与目标DNA片段甲进行比对，然后进行如下判断：如果测序结果与目标DNA片段甲比对有碱基插入、缺少或替换时，则相应的T₁代转基因玉米的ZmDMP基因发生突变；如果测序结果与目标DNA片段甲比对无差异，则相应的T₁代转基因玉米的ZmDMP基因未发生突变。将步骤(3)中采用引物对乙进行PCR扩增得到的PCR扩增产物的测序结果分别与目标DNA片段乙进行比对，然后进行如下判断：如果测序结果与目标DNA片段乙比对有碱基插入、缺少或替换时，则相应的T₁代转基因玉米的ZmPLA1基因发生突变；如果测序结果与目标DNA片段乙比对无差异，则相应的T₁代转基因玉米的ZmPLA1基因未发生突变。

根据测序结果，将T₁代转基因玉米的基因型分为如下四种：一是T₁代转基因玉米的ZmPLA1基因和ZmDMP基因均未发生突变，基因型记为ZmPLA1-ZmDMP；二是T₁代转基因玉米的ZmDMP基因发生突变且ZmPLA1基因未发生突变(即ZmDMP基因单独纯合突变)，基因型记为ZmPLA1-zmdmp；三是T₁代转基因玉米的ZmPLA1基因发生突变且ZmDMP基因未发生突变(即ZmPLA1基因单独纯合突变)，基因型记为zmpla1-ZmDMP；四是T₁代转基因玉米的ZmPLA1基因和ZmDMP基因均发生突变，基因型记为zmpla1-zmdmp。

ZmPLA1基因和ZmDMP基因发生突变的T₁代转基因玉米(即基因型为zmpla1-zmdmp的T₁代转基因玉米)即本发明获得的玉米单倍体诱导系。

实施例2、玉米单倍体诱导系的诱导率评价

一、单倍体的产生

分别以实施例1中获得的T₁代转基因玉米(ZmPLA1-ZmDMP、ZmPLA1-zmdmp、zmpla1-ZmDMP和zmpla1-zmdmp均有)为父本，以郑单958或京科968为母本，杂交(进行杂交的穗数见表2中第3列)，得到玉米籽粒。

统计正常籽粒数。统计结果见表2中第5列。

表2

二、单倍体的鉴定

A、田间表型鉴定

将步骤一得到的玉米籽粒播种于田间，正常田间管理，观察玉米植株的单株表型，然后进行如下判断：如果植株矮小、叶片较窄且上冲、株型紧凑、雄性不育，则该玉米植株为单倍体植株；如果植株高大、叶片宽大、披散、育性正常，则该玉米植株为二倍体植株。

B、流式细胞鉴定

(a)分别提取玉米B104幼嫩叶片的细胞核(以下简称104细胞核)和步骤A获得的玉米植株幼嫩叶片的细胞核(以下简称杂交细胞核)。

(b)完成步骤(a)后，采用流式细胞仪检测104细胞核的信号。

(c)完成步骤(b)后，采用流式细胞仪检测杂交细胞核的信号，并进行如下判断：如果杂交细胞核的信号峰与104细胞核信号峰位置相同，该玉米植株被鉴定为二倍体植株(见图1)；如果杂交细胞核的信号峰在104细胞核信号峰的一半左右，则该玉米植株被鉴定为单倍体植株(见图2)。

如果玉米植株采用田间表型鉴定和流式细胞鉴定的任一种方法鉴定为单倍体植株，则该玉米植株即为单倍体植株。

统计单倍体株数。统计结果见表2中第4列。

三、计算单倍体诱导率

按照如下公式计算单倍体诱导率。单倍体诱导率＝(单倍体株数/正常籽粒数)×100％。

结果见表2中第6列。结果表明，基因型为ZmPLA1-ZmDMP的T₁代转基因玉米与母本(郑单958或京科968)杂交后，杂交后代中均不可获得单倍体。基因型为ZmPLA1-zmdmp、zmpla1-ZmDMP或zmpla1-zmdmp的T₁代转基因玉米与母本(郑单958或京科968)杂交后，杂交后代中均可获得单倍体；且基因型为zmpla1-zmdmp的单倍体诱导率明显高于ZmPLA1-zmdmp或zmpla1-ZmDMP。由此可见，通过对单倍体诱导基因ZmPLA1和ZmDMP的编辑能快速获得高频的单倍体诱导系。

<110> 中国农业大学

<120> 一种基于基因编辑技术快速培育玉米单倍体诱导系的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1061

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 1

aaaccaacag ctttgcattt ccagtctctg ggaacgtcgc gaaaacagtt ccacgctctc 60

cggacaagaa cgcgcccatg gatcgcagca acgccggtgc ggtgtccgtc gaggtgcgcg 120

gcggcggcgg cggctcgccg ccgggcgcgg gaaggaagcg ccgcgcggtg gcgaggggcg 180

tgcagaagac gctctccaag acgtccatgc tggccaactt cctccccacg ggcacgctgc 240

taaccttcga gatgctactc ccggccgccg caggcgacgg cacctgctcg gcggtcagcg 300

ccgcgatgct cagggccctg ctcgcgctct gcgccgcctc ctgcttcctc ttccacttca 360

ccgacagctt ccgcgccccg gacgggaagg tgtactacgg cttcgtcacg ccgcggggcc 420

tgtcgctgtt caggaccggg ctcggcgtcg aggtgcccag ggaggaaagg taccggctcg 480

ccttcgtcga cgtcgtgcac gctgtcatgt ccgtgctggt ctttgcggcc gtcacgctcg 540

ccgactaccg ggtctccggg tgcctcgtcg ccggccaccg caaggagatg gacgaggtga 600

tggagagctt cccgctcatg gtgggcgccg tgtgcagcgg cctcttcctc ttgttcccca 660

acacccgcta cggcatcggt tgtttggctc cgtaaaaaac agcagactgg aacagagagt 720

acggcagtgt aactttcttc cgtacctgtg aatctggctt gatcatttta tgcttcatgt 780

tttcttagca actgtaaaaa cttggatgtg atgtgatcct atctttaatc agtaccgatt 840

tgaaatttct tgagaatgga ttatacaaga gaatgaatgg tcaccaaaaa tagctttaca 900

tcagatgcaa aatgcattcc tttcaaaaga atggtagact ggctcaatct atcctaacgt 960

aagctgccgc ccatgtatcc tacattctgg caagatacta gtattttaca agccacacag 1020

taagcaaagc agcactctcc tacctaccca aaaaaaaaag a 1061

<210> 2

<211> 205

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 2

Met Asp Arg Ser Asn Ala Gly Ala Val Ser Val Glu Val Arg Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Pro Pro Gly Ala Gly Arg Lys Arg Arg Ala Val Ala

20 25 30

Arg Gly Val Gln Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ser Met Leu Ala Asn Phe

35 40 45

Leu Pro Thr Gly Thr Leu Leu Thr Phe Glu Met Leu Leu Pro Ala Ala

50 55 60

Ala Gly Asp Gly Thr Cys Ser Ala Val Ser Ala Ala Met Leu Arg Ala

65 70 75 80

Leu Leu Ala Leu Cys Ala Ala Ser Cys Phe Leu Phe His Phe Thr Asp

85 90 95

Ser Phe Arg Ala Pro Asp Gly Lys Val Tyr Tyr Gly Phe Val Thr Pro

100 105 110

Arg Gly Leu Ser Leu Phe Arg Thr Gly Leu Gly Val Glu Val Pro Arg

115 120 125

Glu Glu Arg Tyr Arg Leu Ala Phe Val Asp Val Val His Ala Val Met

130 135 140

Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Val Thr Leu Ala Asp Tyr Arg Val Ser

145 150 155 160

Gly Cys Leu Val Ala Gly His Arg Lys Glu Met Asp Glu Val Met Glu

165 170 175

Ser Phe Pro Leu Met Val Gly Ala Val Cys Ser Gly Leu Phe Leu Leu

180 185 190

Phe Pro Asn Thr Arg Tyr Gly Ile Gly Cys Leu Ala Pro

195 200 205

<210> 3

<211> 1795

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 3

agttcatcac taatcacact tattgtgccc tcgacgagta tctatagcta gctcattaat 60

cgattcgggg gtgtgttgtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120

aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg 180

cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc 240

atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg 300

gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360

gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420

cagaactgcc cgcgcatctt tcctcagaag tgagtccgat gctgccgcca ttgttcttgc 480

atccatccag catcgtacgt acgtcctcta tacatctgcg gatcatcatg tgcgcatgtt 540

tgtggcatgc atgcatgcat gtgagcagga gcaggcttgc ggccgccatg tccgcgctga 600

ggaagccaaa gtacaacggc aagtgcatgc gcagcctgat taggagcatc ctcggcgaga 660

cgagggtaag cgagacgctg accaacgtca tcatccctgc cttcgacatc aggctgctgc 720

agcctatcat cttctctacc tacgacgtac gtacgtcgtc acgaatgatt catctgtacg 780

tcgtcgcatg cgaatggctg cctacgtacg ccgtgcgcta acatactcag ctctttccta 840

tctgctgcgc caatttgcag gccaagagca cgcctctgaa gaacgctctg ctctcggacg 900

tgtgcattgg cacgtccgcc gcgccgacct acctcccggc gcactacttc cagactgaag 960

acgccaacgg caaggagcgc gaatacaacc tcatcgacgg cggtgtggcg gccaacaacc 1020

cggtaactga ctagctaact ggaaaacgga cgcacagact ccatgtccat ggcggcccac 1080

aaggtcgatg ctaattgttg cttatgtatg tcgcccgatt gcacatgcgt agacgatggt 1140

tgcgatgacg cagatcacca aaaagatgct tgccagcaag gacaaggccg aggagctgta 1200

cccagtgaag ccgtcgaact gccgcaggtt cctggtgctg tccatcggga cggggtcgac 1260

gtccgagcag ggcctctaca cggcgcggca gtgctcccgg tggggtatct gccggtggct 1320

ccgcaacaac ggcatggccc ccatcatcga catcttcatg gcggccagct cggacctggt 1380

ggacatccac gtcgccgcga tgttccagtc gctccacagc gacggcgact acctgcgcat 1440

ccaggacaac tcgctccgtg gcgccgcggc caccgtggac gcggcgacgc cggagaacat 1500

gcggacgctc gtcgggatcg gggagcggat gctggcacag agggtgtcca gggtcaacgt 1560

ggagacaggg aggtacgaac cggtgactgg cgaaggaagc aatgccgatg ccctcggtgg 1620

gctcgctagg cagctctccg aggagaggag aacaaggctc gcgcgccgcg tctctgccat 1680

caacccaaga ggctctagat gtgcgtcgta cgatatctaa gacaagtggc tttactgtca 1740

gtcacatgct tgtaaataag tagactttat tttaataaaa cataaaaata tatat 1795

<210> 4

<211> 428

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 4

Met Ala Ser Tyr Ser Ser Arg Arg Pro Cys Asn Thr Cys Ser Thr Lys

1 5 10 15

Ala Met Ala Gly Ser Val Val Gly Glu Pro Val Val Leu Gly Gln Arg

20 25 30

Val Thr Val Leu Thr Val Asp Gly Gly Gly Val Arg Gly Leu Ile Pro

35 40 45

Gly Thr Ile Leu Ala Phe Leu Glu Ala Arg Leu Gln Glu Leu Asp Gly

50 55 60

Pro Glu Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Ser

65 70 75 80

Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Leu Thr Ala Pro Gly Lys Asp Lys

85 90 95

Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Lys Asp Ile Asn His Phe Tyr Met Gln Asn

100 105 110

Cys Pro Arg Ile Phe Pro Gln Lys Ser Arg Leu Ala Ala Ala Met Ser

115 120 125

Ala Leu Arg Lys Pro Lys Tyr Asn Gly Lys Cys Met Arg Ser Leu Ile

130 135 140

Arg Ser Ile Leu Gly Glu Thr Arg Val Ser Glu Thr Leu Thr Asn Val

145 150 155 160

Ile Ile Pro Ala Phe Asp Ile Arg Leu Leu Gln Pro Ile Ile Phe Ser

165 170 175

Thr Tyr Asp Ala Lys Ser Thr Pro Leu Lys Asn Ala Leu Leu Ser Asp

180 185 190

Val Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala His Tyr

195 200 205

Phe Gln Thr Glu Asp Ala Asn Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Asn Leu Ile

210 215 220

Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala Met Thr Gln

225 230 235 240

Ile Thr Lys Lys Met Leu Ala Ser Lys Asp Lys Ala Glu Glu Leu Tyr

245 250 255

Pro Val Lys Pro Ser Asn Cys Arg Arg Phe Leu Val Leu Ser Ile Gly

260 265 270

Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gln Gly Leu Tyr Thr Ala Arg Gln Cys Ser

275 280 285

Arg Trp Gly Ile Cys Arg Trp Leu Arg Asn Asn Gly Met Ala Pro Ile

290 295 300

Ile Asp Ile Phe Met Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Asp Ile His Val

305 310 315 320

Ala Ala Met Phe Gln Ser Leu His Ser Asp Gly Asp Tyr Leu Arg Ile

325 330 335

Gln Asp Asn Ser Leu Arg Gly Ala Ala Ala Thr Val Asp Ala Ala Thr

340 345 350

Pro Glu Asn Met Arg Thr Leu Val Gly Ile Gly Glu Arg Met Leu Ala

355 360 365

Gln Arg Val Ser Arg Val Asn Val Glu Thr Gly Arg Tyr Glu Pro Val

370 375 380

Thr Gly Glu Gly Ser Asn Ala Asp Ala Leu Gly Gly Leu Ala Arg Gln

385 390 395 400

Leu Ser Glu Glu Arg Arg Thr Arg Leu Ala Arg Arg Val Ser Ala Ile

405 410 415

Asn Pro Arg Gly Ser Arg Cys Ala Ser Tyr Asp Ile

420 425

<210> 5

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 6

<211> 76

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugc 76

Claims

1.一种培育玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤：用基因编辑系统编辑目的玉米，获得T₀代转基因玉米；ZmPLA1基因和ZmDMP基因发生突变的T₀代转基因玉米即为玉米单倍体诱导系；

所述ZmDMP蛋白为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

所述ZmPLA1蛋白为氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

所述sgRNA的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述用基因编辑系统编辑目的玉米为向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，所述玉米基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶位点为序列表中序列1自5’末端起第163-182位所示的DNA分子、序列表中序列1自5’末端起第211-230位所示的DNA分子和序列表中序列3自5’末端起第264-283位所示的DNA分子。

4.一种培育玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤：

（1）用基因编辑系统编辑目的玉米，获得T₀代转基因玉米；

所述ZmDMP蛋白为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

所述ZmPLA1蛋白为氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

所述sgRNA的核苷酸序列如序列表中序列6所示；

（2）完成步骤（1）后，将所述T₀代转基因玉米自交N代，得到T_N代转基因玉米；N为1以上的自然数；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，“将T₀代转基因玉米自交N代”为将ZmPLA1基因和ZmDMP基因发生突变的T₀代转基因玉米自交N代。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述用基因编辑系统编辑目的玉米为向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，所述玉米基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶位点为序列表中序列1自5’末端起第163-182位所示的DNA分子、序列表中序列1自5’末端起第211-230位所示的DNA分子和序列表中序列3自5’末端起第264-283位所示的DNA分子。

8.一种培育玉米单倍体的方法，为将权利要求1至7任一所述方法培育的玉米单倍体诱导系和目的玉米进行杂交，获得玉米单倍体。

9.一种玉米基因组编辑的载体，含有sgRNA编码基因和Cas9蛋白的编码基因；

所述ZmDMP蛋白为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

所述ZmPLA1蛋白为氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

所述sgRNA的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶位点为序列表中序列1自5’末端起第163-182位所示的DNA分子、序列表中序列1自5’末端起第211-230位所示的DNA分子和序列表中序列3自5’末端起第264-283位所示的DNA分子。

11.权利要求9或10所述的载体在培育玉米单倍体诱导系中的应用。

12.权利要求9或10所述的载体在培育玉米单倍体中的应用。