CN118028308A - 穗发育相关转录因子TaMYC2及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种穗发育相关转录因子TaMYC2及应用，所述转录因子TaMYC2对应基因的三个拷贝在NCBI中基因序列号为TraesCS1A02G193200、TraesCS1B02G208000、TraesCS1D02G196900，分别是由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列组成。本发明还公开了所述转录因子TaMYC2在KN9204和Cadenza两种背景下产生的Tamyc2‑A1突变体植株，并将其顶端的小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度与各自野生型做比较，结果都表明Tamyc2‑A1突变体的小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度均大于野生型。可见，TaMYC2基因在调控植物穗型以及穗发育方面起着重要的作用，对于培育高产量小麦具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及穗发育相关转录因子TaMYC2及应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivumL.)是世界的重要粮食作物之一，为全球约35-40％的人口提供了重要的能量摄入和蛋白质来源。我国是小麦生产和消费第一大国，培育高产小麦品种，不断提高小麦产量是保障我国粮食安全的重要措施之一。小麦产量是由多基因控制的复杂性状，由产量三要素包括千粒重、穗粒数和单位面积有效穗数构成。其中穗粒数的潜力主要由小麦的穗部结构决定，粒重的潜力主要由籽粒的大小和形状决定。在小麦产量构成要素中，粒重主要受品种遗传特性的限制，环境条件的影响相对有限，而提高穗粒数是目前进一步提高产量的关键因素。
小麦穗长和穗密度也是重要的穗部形态相关性状，与小麦产量密切相关。因此，解析小麦穗长和穗密度的遗传机制，鉴定、验证和克隆相关的主效QTL，对于利用分子育种手段调控小麦穗型具有重要意义。
然而参与调节穗长和穗密度的基因目前研究的还比较少，Q、C和S是三个已知调控小麦穗型的重要基因。Q基因位于小麦染色体5A长臂末端，编码一个AP2转录因子，参与调控包括株高、穗长、穗密度、脆轴性等多个性状C基因位于染色体2D，对小麦穗长、穗密度、籽粒形状和大小等具有显著影响。因为其在穗型调控中的重要作用，定义了六倍体小麦亚种-密穗小麦；S基因位于小麦染色3D，决定了小麦圆形籽粒和短而密的穗型，定义了另一种六倍体小麦亚种-印度圆粒小麦(T.aestivum ssp.Sphaerococcum)。然而，由于这三个基因在现代小麦品种中较低的多态性，已不再是目前小麦遗传改良的主要育种目标。另外，除了直接调控穗长和穗密度的基因外，还有一些基因间接的发挥着调控作用。春化基因Vrn-1和光周期基因Ppd-1也对小麦穗型具有重要作用。Vrn-1包括Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1参与调控小麦顶端分生组织从营养生长到生殖生长的过渡，对小麦穗长和穗密度具有较大影响；Ppd-1的光周期不敏感等位基因Ppd-A1a、Ppd-B1a和Ppd-D1a促进小麦开花，缩短营养生长的持续时间，进而影响小麦穗长、穗密度等穗型相关性状。另外，一些赤霉素敏感的矮杆基因，如Rht5、Rht8、Rht22、Rht24和Rht25等，在影响小麦株高的同时，也会显著影响小麦穗长和穗密度。除了上述研究比较深入的基因外，在小麦的21条染色体上均有小麦穗长和穗密度相关的QTL被报道。然而在这些被报道的QTL中，只有极少数位点是主效，且在不同遗传背景和环境中被验证的，极大的限制了它们在小麦育种中的应用。所以找到调控穗长和穗密度的基因和相关基因对育种和提高小麦产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控穗型改变基因表达的转录因子TaMYC2及其应用，该转录因子降低穗密度相关基因的表达。
为了实现上述目的，本发明的技术方案包括：
本发明通过8个穗发育关键时期的转录组、染色质可及性和多种组蛋白修饰测序，绘制了小麦穗发育过程的动态转录和表观修饰图谱，搭建了小麦穗发育过程的转录调控网络，并结合多维组学数据与群体遗传学，鉴定到TaMYC2是其中潜在的穗发育调控因子之一。并利用KN9204突变体库对该基因进行通量表型鉴定，发现该基因突变可导致穗型的改变，突变体穗密度大于野生型穗密度。TaMYC2基因的原位杂交结果显示其在穗顶端高度表达，亚细胞定位为明显的核定位。
其中，调控穗型改变基因表达的转录因子TaMYC2，该转录因子降低穗发育相关基因的表达，所述转录因子对应基因的三个拷贝在NCBI中基因序列号(Sequence ID)分别为TraesCS1A02G193200、TraesCS1B02G208000、TraesCS1D02G196900。其中，TraesCS1A02G193200编码序列长度为2082bp，序列如SEQ ID NO.1所示，包括694个氨基酸；TraesCS1B02G208000基因的编码序列长度为2082bp，序列如SEQ ID NO.2所示，包括694个氨基酸；TraesCS1D02G196900基因的编码序列长度为2088bp，序列如SEQ ID NO.3所示，包括696个氨基酸。
本发明公开了TaMYC2基因在影响穗型发育的生物学功能，主要表现在调控植物小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度中的应用，通过对比发现，与野生型相比，TaMYC2基因突变体的小穗数多、穗粒数多、穗长度长且穗密度大。
其中，所述小穗数多表现为有效小穗数多，无效小穗数正常；所述穗密度为植物的每个穗的有效穗粒数除以穗长度。优选地，所述植物为小麦。
并且经过研究发现，所述TaMYC2基因主要在小麦穗顶部发挥作用。对小麦穗基部几乎不影响。
本发明提供鉴定突变体的引物对。其中，鉴定KN9204背景下突变体正向引物的序列为SEQ ID NO.4所示，反向引物的序列为SEQ ID NO.5所示；鉴定Cadenza背景下突变体正向引物的序列为SEQ ID NO.6所示，反向引物的序列为SEQ ID NO.7所示。
本发明还公开了一种小麦育种方法，所述方法为：通过抑制/阻断小麦中TaMYC2基因的转录/表达，获得小麦小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度均高于野生型的植株；所述TaMYC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3任一个所示。
优选地，为了防止亚基因组之间的功能冗余，常常同时抑制/阻断上述三个基因的转录/表达来达到最佳的效果。
“抑制/阻断植物中TaMYC2基因的转录/表达”的实现方式可为如下(1)或(2)或(3)或(4)：
(1)利用RNA干扰技术引入小的双链TaMYC2 RNA，产生TaMYC2表达量降低的转基因株系；；
(2)通过CRISPR/Case9技术构建TaMYC2基因编辑载体获得突变体；
(3)通过EMS等化学试剂和/或γ射线等物理途径获得TaMYC2基因突变体；
(4)本领域内的其它常见方法。
另外，抑制TaMYC2在小麦中的表达可以通过基因敲除的方式，因此，一个具体的操作方法是将所述的转录因子编码基因TaMYC2在植物中敲除，筛选出TaMYC2基因敲除的转基因阳性植株。
因此，一种提高小麦小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度的育种方法，还可以为：
(1)构建能够敲除TaMYC2的载体；(2)将所构建的基因敲除载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)筛选TaMYC2基因敲除株系；相较于野生型，所述TaMYC2基因敲除株系的穗密度提高。
所述植物包括，但不限于，小麦、水稻、拟南芥玉米、棉花、油菜或大豆。
本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根、花、穗子、组织和器官。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。
本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根等。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。
本发明的优点：
本发明通过8个穗发育关键时期的转录组、染色质可及性和多种组蛋白修饰测序，绘制了小麦穗发育过程的动态转录和表观修饰图谱，搭建了小麦穗发育过程的转录调控网络，并结合多维组学数据与群体遗传学，鉴定到TaMYC2是其中潜在的穗发育调控因子之一。并利用KN9204以及Cadenza突变体库筛选出了TaMYC2基因突变体Tamyc2-A1(KN9204)、Tamyc2-A1(Cadenza)，经过3代回交纯化突变体背景后，对该基因进行通量表型鉴定，发现该基因突变可导致穗型的改变，突变体小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度均大于野生型。
总之，TaMYC2能够降低小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度，并且主要在穗顶部表达发挥作用。可以通过转基因的方式来获得的小穗数多、穗粒数多、穗长度长以及穗密度高的小麦植株，具体地，在实际操作过程中，可以采用转基因的方式，具体可以通过获得TaMYC2RNAi转基因小麦或者敲除TaMYC2基因，为植物高产高效育种提供一种新的途径。
附图说明
图1是TaMYC2基因的亚细胞定位和时空表达模式。A：pSuper-eGFP-TaMYC2与细胞核标记基因H2B的核定位信号重合，证明TaMYC2在细胞核内表达，刻度线为10μm；B：原位杂交结果所示TaMYC2-A1的时空表达模式，说明TaMYC2-A1在穗顶部表达；蓝色三角形表示基因表达位置(W2.5阶段TaMYC2在小穗分生的起始区域表达，W3.5阶段TaMYC2在小穗分生区域的顶端表达)。基因的探针被检测为阴性对照。刻度条为100毫米。
图2是KN9204背景回交所产生的野生型、杂合体、突变体的农艺性状比较。A：将KN9204背景下的三个突变体D2108066、D2109194、D2109102进行杂交分离所得的野生型、杂合体、纯合体相比，纯合植株每穗的小穗数比野生型和杂合体多；B：纯合突变体的每穗的可育小穗数比野生型和杂合体多；C：纯合突变体的每穗的不育小穗数与野生型和突变体无明显差异；D：纯合突变体的每穗的穗粒数比野生型和杂合体多；E：纯合突变体的穗长度比野生型和杂合体长；F：纯合突变体的穗密度比野生型和杂合体大。
图3是Cadenza背景回交所产生的野生型、杂合体、突变体的农艺性状比较。A：将Cadenza背景下的突变体Cadenza1777进行杂交分离所得的野生型、杂合体、纯合体相比，纯合植株每穗的小穗数比野生型和杂合体多；B：纯合突变体的每穗的可育小穗数比野生型和杂合体多；C：纯合突变体的每穗的不育小穗数与野生型和突变体无明显差异；D：纯合突变体的每穗的穗粒数比野生型和杂合体多；E纯合突变体的穗长度比野生型和杂合体长；F：纯合突变体的穗密度比野生型和杂合体大。
图4是KN9204背景突变体与野生型穗密度表型及统计。A：KN9204背景的三个突变体品系和野生型表型，突变体的穗密度要大于野生型；B：突变体与野生型的穗密度数据统计。
图5是Cadenza背景突变体与野生型穗密度表型及统计。A：Cadenza背景的三个突变体品系和野生型表型，突变体的穗密度要大于野生型；B：突变体与野生型的穗密度数据统计。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释。
生物材料
小麦Tamyc2-A1(KN9204)：D2108066、D2109194、D2109102；Tamyc2-A1(Cadenza)：Cadenza1777种子为突变体库中种子，通过分别与背景杂交得到杂合体和野生型；
过表达载体pSuper-eGFP为实验室保存；
大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101为实验室保存；
引物合成及测序，由华大六合生物公司完成。
实验试剂
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购买自诺唯赞生物科技有限公司；
NaCl等常用试剂购买自索莱宝公司；
潮霉素购买自索莱宝生物公司；
各种核酸内切酶购买自莫纳生物科技有限公司；
一步克隆酶购买自诺唯赞生物科技有限公司；
质粒小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购买自北京天根生物技术有限公司。
实验设备
PCR仪购买自Bio-rad公司；
制冷离心机购买自Eppendorf公司；
定量PCR仪购买自Bio-rad公司；
激光共聚焦显微镜购买自蔡司公司；
高温高压灭菌器MLS-3750购买自日本三洋公司；
核酸检测仪Nanodrop 2000C购买自Thermo Scientific公司；
常温离心机、酶标仪SpectraMax iD5购买自Thermo Scientific公司。
实施例1TaMYC2突变体的获得
分别筛选Cadenza、KN9204突变体库，得到小麦Tamyc2-A1(KN9204)突变体：D2108066、D2109194、D2109102；Tamyc2-A1(Cadenza)突变体：Cadenza1777。
实施例2小麦TaMYC2基因功能
1.TaMYC2基因的克隆和突变体鉴定
提取小麦KN9204、Cadenza和突变体的DNA作为模版，克隆TaMYC2基因的编码序列，经Snapgene软件进行基因序列比对。TraesCS1A02G193200基因的编码序列，包含2082bp碱基，所编码的蛋白为694个氨基酸。TraesCS1B02G208000基因的编码序列，包含2082bp碱基，所编码的蛋白为694个氨基酸。TraesCS1D02G196900基因的编码序列，包含2088bp碱基，所编码的蛋白为696个氨基酸。
设计突变体鉴定引物，序列如下：
Tamyc2-a1-KN9204-F：AGATCCATCAGTTCGAGAAC(SEQ ID NO.4)；
Tamyc2-al-KN9204-R：GGTGCTGGTTCTGCCTCTGC(SEQ ID NO.5)；
Tamyc2-al-Cadenza-F：AGCTCAACTCGCTCATAGCC(SEQ ID NO.6)；
Tamyc2-al-Cadenza-R：TGGCCCGGCAAGCCCAT(SEQ ID NO.7)；
然后，利用上述突变体DNA为模板进行突变体鉴定。
2.表达载体pSuper-eGFP-TaMYC2的构建与亚细胞定位观察
为了观察TaMYC2的亚细胞定位，发明人构建了pSuper-eGFP-TaMYC2过表达载体，具体过程简要介绍如下。
首先，设计带有限制性内切酶XbaI和SalI酶切位点的的引物，序列如下：
TaMYC2-F：ACCAAATCGACTCTAGAATGAACCTGTGGACGGAC；
TaMYC2-R：TAGTATTTAAATGTCGACTTACCGGATTTGCATCG；
然后，以KN9204和Cadenza的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，并纯化回收扩增产物；
第三，对pSuper-eGFP载体采用XbaI和SalI酶进行酶切，对酶切产物进行纯化。
第四，把PCR扩增产物和酶切后的载体进行同源重组连接。
第五，采用热激转化法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，进行Kana(卡那霉素，50μg/mL)抗性筛选，选择阳性菌落进行PCR检测，对PCR检测鉴定正确菌落进行扩增、送测序，测序正确的菌液提取质粒备用。
第六，将所提取的质粒转化至农杆菌感受态细胞GV3101中，注射烟草，在显微镜下观察亚细胞定位。
同时将核标记基因H2B注射烟草以显示细胞核位置，结果如图1-A显示，TaMYC2-A1信号与H2B信号重合，说明其定位于细胞核中，TaMYC2-A1在细胞核的定位表明其在核内行使功能，符合转录因子的特征。
3.TaMYC2-A1的RNA提取和原位杂交
使用HiPure Plant RNA微量试剂盒提取总RNA。Annoroad基因技术进行了RNA-seq库的构建和测序。取小麦幼嫩小穗在FAA溶液中固定，4℃过夜。用乙醇脱水，ParaplastPlus(Sigma-Aldrich，P3683)包埋剂进行包埋，并使用切片机(LeicaMicrosystems，RM2235)以8毫米宽切片。使用DIG Northern Starter Kit(Roche，11277073910)进行地高辛标记获得RNA探针。结果显示，TaMYC2-A1在穗顶部表达。TaMYC2-A1在SM起始区(W2.5期蓝色三角形)表达，并在峰上部的SM中高表达(W3.5期蓝色三角形)(图1-B)。
4.小麦农艺性状的测量与统计
通过统计与计算突变体与野生型和杂合体的小穗数、有效小穗数、无效小穗数、穗粒数、穗长度、穗密度，结果如图2、图3、图4、图5所示，与野生型和杂合体相比，TaMYC2转录因子突变体的小穗数多，有效小穗数多，无效小穗数正常，穗粒数多，穗长度长且穗密度大，因此TaMYC2转录因子降低了小麦的小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度。
综上，突变TaMYC2基因后小麦的小穗数多、穗粒数多、穗长度长、穗密度大，表明TaMYC2基因负调控小麦穗发育；可见，TaMYC2基因在调控植物穗型以及穗发育方面起着重要的作用，对于培育高产量小麦具有重要的意义。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (9)
1.穗发育相关转录因子TaMYC2，其特征在于，所述转录因子TaMYC2对应基因的三个拷贝在NCBI中基因序列号分别为TraesCS1A02G193200、TraesCS1B02G208000、TraesCS1D02G196900，具体分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列组成。
2.权利要求1所述的转录因子TaMYC2在调控植物小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度中的应用，其特征在于，与野生型相比，TaMYC2基因突变体的小穗数多、穗粒数多、穗长度长且穗密度大。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述突变体存在于KN9204和Cadenza EMS诱变突变体库，KN9204背景下的三个突变体分别为D2108066、D2109194、D2109102，Cadenza背景下的突变体为Cadenza1777。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小穗数多表现为有效小穗数多，无效小穗数正常；所述穗密度为植物的每个穗的有效穗粒数除以穗长度。
5.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物为小麦。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述TaMYC2基因在小麦穗顶部发挥作用。
7.一种小麦育种方法，其特征在于，所述方法为：通过抑制/阻断小麦中TaMYC2基因的转录/表达，获得小麦小穗数、穗粒数、穗长度以及穗密度均高于野生型的植株；所述TaMYC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3任一个所示。
8.根据权利要求7所述的育种方法，其特征在于，通过同时抑制/阻断小麦中核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的三个基因的转录/表达，获得小麦穗密度高于野生型的植株。
9.根据权利要求8所述的育种方法，其特征在于，抑制/阻断小麦中TaMYC2基因的转录/表达的方法包括：
(1)利用RNA干扰技术，获得TaMYC2表达量降低的转基因株系；
(2)通过CRISPR/Case9技术构建TaMYC2基因编辑载体获得突变体；
(3)通过EMS化学试剂和/或γ射线物理途径获得TaMYC2基因突变体。
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