CN109912703B

CN109912703B - 蛋白质OsARE1在调控植物衰老中的应用

Info

Publication number: CN109912703B
Application number: CN201711329688.8A
Authority: CN
Inventors: 左建儒; 王青; 粘金沯; 李家洋; 钱前; 谢先芝; 陈凡
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2017-12-13
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2037-12-13
Also published as: CN109912703A

Abstract

本发明公开了蛋白质OsARE1在调控植物衰老中的应用。所述蛋白质OsARE1为氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质。实验证明，将水稻中蛋白质OsARE1的编码基因沉默或敲除，可以延缓植物衰老。蛋白质OsARE1及其编码基因是改良植物抗衰老能力及相关性状的一个有效遗传靶点，在农业领域具有潜在的市场价值和广阔的应用前景。本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质OsARE1在调控植物衰老中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白质OsARE1在调控植物衰老中的应用。

背景技术

衰老是生物体在细胞、组织、器官及个体水平上随时间推移逐渐退化的一个生物学过程，其引发生命的终结。植物衰老是一个器官水平上的衰退过程，往往伴随叶肉细胞和个体的死亡，如水稻、玉米和大豆等一年生植物灌浆期间叶片的衰老。对树木等多年生植物而言，衰老主要体现在秋季叶片颜色的变化上。

植物衰老并非一个被动无序的衰退过程，其本质上是一个叶肉细胞的程序性死亡过程。叶片是植物进行光合作用的主要场所，经过一段时间的光合作用并积累营养物质，叶肉细胞进入衰老期。衰老期间，叶肉细胞的结构、代谢和基因表达均经历有序的变化。叶绿体含有叶肉细胞约70％的总蛋白，是第一个被降解的细胞器。衰老叶片叶绿素含量迅速降低，是叶片衰老速率的一个重要指标。随后，过氧化物酶体等细胞器活性逐渐降低并降解。细胞核和线粒体控制基因转录和能量供应，其完整性一直维持到衰老最后阶段。在细胞代谢方面，衰老叶片的碳同化过程逐渐被叶绿素、蛋白质、膜脂及RNA等生物大分子的降解过程取代，从而促进养分转移至幼嫩叶片、种子和果实等器官中。叶片衰老是自然界所有植物生命活动必须经历的一个生理现象，是植物演化过程中被选择保留下的一个生物学过程。在农业生产上，叶片衰老缩短作物生命周期，降低作物产量，导致蔬菜作物叶片黄化及养分流失。因此，挖掘叶片衰老的遗传控制基因，有助于加深人类对该生理现象的认识，从而为生物工程技术改良衰老相关性状提供理论依据。

研究表明，植物衰老受内在遗传因素和生长环境等外在因素互作调控。影响衰老发生的外在因素包括高温、低温、干旱、臭氧、营养缺乏、病原菌侵染和荫蔽等各种环境胁迫因素，内在因素主要包括基因(如光合作用调控基因CAB2、蛋白合成调控基因RPS与RBC，以及衰老相关标志基因SAGs等)表达水平的波动和植物激素(如细胞分裂素、乙烯、乙酰水杨酸和茉莉酸等)含量的变化等。

通常来说，处于某一生育时期的植物，理应存在一类识别并传导衰老信号的调控基因，以精确控制衰老标志基因的表达，从而引发衰老相关生理过程。目前，响应衰老发生的信号分子及识别或感知该信号物质的基因未见报道。有研究表明，糖浓度升高抑制叶片光合活性并促进衰老，暗示植物可能通过识别体内糖含量的变化决定叶片生长或衰老，其具体分子机理有待进一步研究。参与控制衰老过程的下游组分已被大量报道，主要以转录因子为主。拟南芥、水稻、小麦、大麦、苜蓿和白杨等多个物种转录组测序分析结果发现，叶片大量转录因子编码基因表达量在衰老起始后发生显著变化，表明衰老过程至少在基因表达水平上被精细调控。例如，拟南芥中编码WRKY类转录因子基因AtWRKY53和AtWRKY6分别参与调控衰老过程。AtWRKY53基因在叶片衰老起始阶段上调表达而在后期下调表达，AtWRKY53基因突变延缓拟南芥叶片衰老，表明AtWRKY53正调控衰老过程。AtWRKY6基因受衰老和逆境胁迫诱导表达，其可能通过激活下游的类受体蛋白激酶编码基因SIRK正调控衰老过程。此外，受AtWRKY6调控的下游基因还包括衰老偶联蛋白基因SEN1、茉莉酸信号转导基因NAC2和谷胱甘肽转移酶基因等。虽然AtWRKY6功能缺失突变改变上述SAGs基因表达量，但其突变体并没有明显的衰老相关表型，这可能是由于WRKY基因家族存在功能冗余造成。另有报道，拟南芥和小麦中一类植物特异转录因子NAC突变体具有明显的晚衰表型，表明NAC促进植物衰老发生。现有研究结果表明，转录因子是参与调控植物衰老的重要成员，为解析衰老发生的分子机理奠定了坚实基础，是基因工程技术改造叶片衰老性状的重要理论依据。

除基因转录水平外，蛋白质翻译后修饰参与调控植物衰老亦有报道。ore9突变体具有明显的晚衰表型且不影响拟南芥其它生长发育相关性状，ORE9基因编码一个包含F-box结构域的泛素E3连接酶亚基，其可能通过泛素化修饰并降解SAGs基因的转录抑制子而促进衰老的发生。dls1突变体具有晚衰表型，DLS1基因编码一个精氨酰tRNA蛋白转移酶，DLS1蛋白通过对底物蛋白N端进行精氨酸修饰而泛素化降解衰老抑制子。因此，DLS1可能采用与ORE9类似的分子机制，即通过控制衰老抑制子的降解而调控衰老过程。

植物激素参与调控植物生长发育的多个过程，其中包括衰老。研究表明，细胞分裂素、乙烯、脱落酸、茉莉酸、水杨酸和油菜素内酯等多种植物激素参与调控叶片衰老过程，包括衰老的起始、发生和终止各个环节。细胞分裂素是公认的一类延缓衰老最有效的植物激素。衰老叶片中细胞分裂素含量显著降低，外源施加或利用衰老诱导基因SAG12启动子驱动细胞分裂素合酶基因均延缓衰老发生。与此相一致，衰老叶片中细胞分裂素合酶基因和IPT3基因表达量均降低，而细胞分裂素氧化酶基因表达量增加。虽然细胞分裂素在延缓叶片衰老方面发挥重要生理功能，但细胞分裂素调控衰老的分子机理目前还不清晰。有研究发现，细胞分裂素受体之一AHK3可能参与调控细胞分裂素介导的晚衰现象。AHK3基因功能获得型突变体ore12-1具有晚衰表型，而AHK3基因功能缺失型突变体ahk3对细胞分裂素诱导的晚衰现象不敏感，且AHK3对细胞分裂素信号通路下游组分ARR2的磷酸化是细胞分裂素延缓衰老所必需的。分离鉴定细胞分裂素信号转导通路ARR2的下游组分，有助于进一步阐明细胞分裂素调控叶片衰老的分子机理。

与细胞分裂素生理功能不同，乙烯、茉莉酸、油菜素内酯和水杨酸等植物激素促进衰老。乙烯是公认的促进叶片和花器官衰老及果实成熟的一类激素。对大多数植物而言，叶片衰老期间乙烯含量迅速增加。与此相一致，编码ACC合酶、ACC氧化酶及腈水解酶等乙烯生物合成相关基因的表达量在衰老叶片中增加。在拟南芥中，乙烯受体功能缺失突变体etr1和乙烯信号转导功能缺陷突变体ein2，均具有明显的晚衰表型，表明乙烯信号转导通路正调控衰老过程。值得指出的是，拟南芥old1-1突变体具有早衰表型，外源施加乙烯加速old1-1叶片衰老速率(Jing et al.,2002)。old1-1etr1双突变体同样具有早衰表型，但乙烯处理不能加速old1-1etr1双突变体衰老速率，表明OLD1基因位于乙烯信号转导通路的遗传学上游抑制乙烯介导的衰老过程。OLD1基因为阐明乙烯信号通路控制叶片衰老的分子调控网络提供了新线索。脱落酸是介导植物响应环境胁迫的一类激素，在种子萌发和植物生长过程中亦发挥重要生理功能。外源施加脱落酸促进叶片衰老，但其中的分子机制有待进一步解析。茉莉酸和水杨酸在植物病原菌抗性和病原菌介导的细胞死亡中发挥主要生物学功能。外源施加茉莉酸诱导SAGs基因(如SEN4和SEN5等)表达而促进叶片衰老。茉莉酸不敏感突变体coi1中茉莉酸诱导的早衰现象消失，表明茉莉酸信号转导通路参与调控叶片衰老过程。通过对水杨酸和油菜素内酯信号通路突变体表型及SAGs基因表达量分析发现，水杨酸和油菜素内酯促进衰老的发生。叶片衰老期间，茉莉酸含量增加近4倍，但其生物合成和信号通路突变体没有衰老相关表型，茉莉酸与其它信号通路存在部分功能冗余可能是其原因之一。

目前已鉴定到的衰老调控基因极大地促进了人类对衰老过程的认识，但挖掘新的衰老调控基因仍将具有重要的理论意义和应用价值。虽然分离鉴定SAGs调控基因的技术方法已经成熟，但仍需考虑如何鉴定大量不依赖SAGs途径调控衰老的新基因。利用正向遗传学方法筛选衰老相关突变体，是鉴定到此类基因的有效方法之一。我们知道，衰老起始、发生和结束是一个受到精细调控的复杂生物学过程，现有遗传筛选远未达到饱和，因此选用不同衰老突变体克隆新的衰老调控基因显得尤为重要。相比T-DNA插入突变体库，化学诱变方法将更加有价值，因为其可提供新的等位变异，如AHK3/ORE12参与调控衰老现象的发现过程。筛选现有衰老突变体的抑制突变有助于进一步解析调控衰老的分子遗传网络。此外，衰老是叶片发育的最后一步，因此衰老控制基因也可能参与到其它生物学过程中发挥作用。为鉴定偶联调控衰老过程的其他生物学通路，分析衰老突变体转录组变化可提供重要线索。值得指出的是，目前叶片衰老的分子调控机理主要基于基因表达水平的解析，基因表达仅仅是基因发挥生物学功能的一方面，其它调控机制(如蛋白水平、蛋白稳定性和蛋白亚细胞定位等)介导的衰老过程亦需被考虑到。整合蛋白质组和代谢组学分析方法有助于加深对衰老分子调控机理的进一步解析。叶片衰老研究领域的另一个重大挑战是评估衰老控制基因的应用前景。利用生物工程技术对单个基因进行遗传修饰而定向改良目标性状(如作物产量、营养品质、耐逆性或抗病性等)的方法已日趋成熟，能否鉴定到切实有效的衰老控制基因显得尤为重要。对大田生长的农作物而言，由于面临各种竞争抑制和环境胁迫，筛选到本质上改变作物衰老性状的调控基因，对选育抗衰老作物新品种具有重要的理论意义和应用价值。考虑到未来面临的粮食短缺和能源匮乏等重大问题，提高作物产量理应被优先考虑。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的衰老。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质OsARE1在调控植物衰老和/或调控植物叶片中叶绿素含量中的应用。所述蛋白质OsARE1来源于禾本科稻属粳稻亚种(Oryzasativa L.)，全称为ABC1REPRESSOR1。所述蛋白质OsARE1可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物衰老和/或植物叶片中叶绿素含量相关的蛋白质；

a4)与序列表中序列1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于水稻且与植物衰老和/或植物叶片中叶绿素含量相关的蛋白质。

其中，序列表中序列1由427个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质，均可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第467-1750位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′末端和/或3′末端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质OsARE1的核酸分子在调控植物衰老和/或调控植物叶片中叶绿素含量中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述编码所述蛋白质OsARE1的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

b3)编码区如序列表中序列2自5′末端起第467-1750位所示的DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于水稻且编码所述蛋白质OsARE1的DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质OsARE1的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子可为编码所述蛋白质OsARE1的基因及其调控序列形成的核酸分子。

序列表中序列2由2640个核苷酸组成，序列表中序列2自5′末端第467-1750位所示的核苷酸序列编码序列表中序列1所示的氨基酸序列。

序列表中序列3所示的核苷酸序列是cDNA(序列表中序列2所示)的基因组DNA。序列表中序列3由7229个碱基组成，序列表中序列3中，自5′末端起第1至1810位为启动子区，第1811至2276位为5′UTR区，第6340至7229位为3′UTR区，第2277至2883位为第一个外显子，第2884至3476位为第一个内含子，第3477至3564位为第二个外显子，第3565至3800位为第二个内含子，第3801至3972位为第三个外显子，第3973至4116位为第三个内含子，第4117至4232位为第四个外显子，第4233至4722位为第四个内含子，第4723至4820位为第五个外显子，第4821至5692位为第五个内含子，第5693至5828位为第六个外显子，第5829至6272位为第六个内含子，第6273至6339位为第七个外显子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质OsARE1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的蛋白质OsARE1的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质OsARE1且来源于水稻，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码蛋白质OsARE1的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。

所述编码所述蛋白质OsARE1的核酸分子既可为OsARE1基因的cDNA序列，也可为OsARE1基因的基因组基因序列；与OsARE1基因具有90％以上同一性且编码蛋白质OsARE1的DNA序列，是将OsARE1基因的cDNA用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效的发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变异的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明还提供了的培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法一，可包括向出发植物甲中导入提高所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性的物质，得到转基因植物甲的步骤；所述转基因植物甲与所述出发植物甲相比植物早衰和/或植物叶片中叶绿素含量降低。

上述方法一中，所述“提高所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到表达或过量表达所述蛋白质、或提高所述蛋白质的活性的效果。

上述方法一中，所述“向出发植物甲中导入提高所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性的物质”具体可为向出发植物甲中导入编码所述蛋白质OsARE1的核酸分子。

上述方法一中，所述“向出发植物甲中导入编码所述蛋白质OsARE1的核酸分子”通过重组表达载体导入所述出发植物甲；所述重组表达载体为向pCAMBIA1300载体的限制性内切酶PstI和SalI之间插入序列表中序列3所示的DNA分子，得到的重组质粒。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法二，可包括向出发植物乙中导入抑制所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性的物质，得到转基因植物乙的步骤；所述转基因植物乙与所述出发植物乙相比植物晚衰和/或植物叶片中叶绿素含量增加。

上述方法二中，所述“抑制所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制所述蛋白质的表达量和/或活性的目的。

上述方法二中，所述“抑制所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性的物质”可为特异RNA分子；所述特异RNA分子如式(I)所示：A_反向-Y-A_正向(I)；所述A_正向的序列为编码所述蛋白质OsARE1的基因中的200-500bp DNA片段转录得到的单链RNA分子；所述A_反向的序列与所述A_正向的序列反向互补；所述Y是所述A_正向与所述A_反向之间的间隔序列，在序列上，所述Y与所述A_正向及所述A_反向均不互补。

上述方法二中，所述“在出发植物乙中导入特异RNA分子”的实现方法可如下：将特异DNA分子甲导入出发植物乙；所述特异DNA分子甲如式(II)所示：SEQ_反向-X-SEQ_正向(II)；所述SEQ_正向的序列为编码所述蛋白质OsARE1的基因中的200-500bp DNA片段；所述SEQ_反向的序列与所述SEQ_正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ_正向与所述SEQ_反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ_正向及所述SEQ_反向均不互补。

上述方法二中，所述特异DNA分子甲通过重组表达载体导入所述出发植物乙；所述重组表达载体为将序列表中的序列5第14至1138位所示的DNA分子插入pTCK303载体的SacI和BamHI识别位点之间得到的重组表达载体。

上述方法二中，所述“抑制所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性的物质”可为植物基因组编辑的载体；所述植物基因组编辑的载体含有gRNA编码基因；所述gRNA在植物中识别的靶标DNA为编码蛋白质OsARE1的DNA片段。

上述方法二中，所述gRNA编码基因是序列表中序列2自5′末端起第552-570位和/或第1094-1112位所示的DNA分子。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法三，包括将通过上述方法一或上述方法二获得的转基因植物与待改良植物杂交，得到后代转基因植物的步骤；所述后代转基因植物与所述转基因植物(即作为亲本的转基因植物)的表型(植物衰老和/或植物叶片中叶绿素含量)一致。

本发明还保护特异RNA分子、特异DNA分子、特异重组质粒或植物基因组编辑的载体。

所述特异RNA分子如式(I)所示：A_反向-Y-A_正向(I)；所述A_正向的序列为编码所述蛋白质OsARE1的基因中的200-500bp DNA片段转录得到的单链RNA分子；所述A_反向的序列与所述A_正向的序列反向互补；所述Y是所述A_正向与所述A_反向之间的间隔序列，在序列上，所述Y与所述A_正向及所述A_反向均不互补。

所述特异DNA分子可为特异DNA分子甲或特异DNA分子乙。

所述特异DNA分子甲如式(II)所示：SEQ_反向-X-SEQ_正向(II)；所述SEQ_正向的序列为编码所述蛋白质OsARE1的基因中的200-500bp DNA片段；所述SEQ_反向的序列与所述SEQ_正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ_正向与所述SEQ_反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ_正向及所述SEQ_反向均不互补。

所述特异DNA分子乙可包括DNA片段一、间隔序列和DNA片段二；所述DNA片段一的序列为编码所述蛋白质OsARE1的基因中的200-500bp DNA片段；所述DNA片段二与所述DNA片段一的序列反向互补。

所述特异重组质粒可为含有所述特异DNA分子的重组质粒。

所述植物基因组编辑的载体可含有gRNA编码基因；所述gRNA在植物中识别的靶标DNA为编码蛋白质OsARE1的DNA片段。

上述任一所述A_正向的序列可为编码所述蛋白质OsARE1的基因中5′UTR区或3′UTR区的200-500bp DNA片段转录得到的单链RNA分子。

上述任一所述SEQ_正向的序列或上述任一所述DNA片段一的序列可为编码所述蛋白质OsARE1的基因中5′UTR区或3′UTR区的200-500bp DNA片段。

所述5′UTR区的核苷酸序列可如序列表中序列2自5′末端起第1至466位所示。所述3′UTR区的核苷酸序列可如序列表中序列2自5′末端起第1751至2640位所示。

上述任一所述特异RNA分子中，所述A_正向的序列具体可为序列表中序列4自5′末端起第840至1138位所示。其中，序列表中序列2自5′末端第567至865位核苷酸序列转录出序列表中序列4自5′末端第840至1138位核苷酸。

上述任一所述SEQ_正向的序列或上述任一所述DNA片段一的序列具体可为序列表中序列5自5′末端起第840至1138位所示。其中，序列表中序列2自5′末端第567至865位核苷酸序列为序列表中序列5自5′末端第840至1138位核苷酸。

上述任一所述SEQ_反向的序列或上述任一所述DNA片段二的序列具体可为序列表中序列5自5′末端起第14至312位所示。

上述任一所述间隔序列的核苷酸序列可如序列表中的序列5自5′末端起第313至839位所示。

上述任一所述特异DNA分子甲或上述任一所述特异DNA分子乙的核苷酸序列可为如下s1)或s2)或s3)或s4)所示的DNA分子：

s1)核苷酸序列是序列表中序列5自5′末端起第14至1138位所示的DNA分子；

s2)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

s3)与s1)或s2)限定的核苷酸序列具有70％或70％以上同一性，来源于水稻且具有相同生物学功能的DNA分子；

s4)在严格条件下与s1)或s2)限定的核苷酸序列杂交，来源于水稻且具有相同生物学功能的DNA分子。

上述任一所述植物基因组编辑的载体中，所述gRNA编码基因可为序列表中序列2自5′末端起第552-570位和/或第1094-1112位所示的DNA分子。

上述任一所述植物基因组编辑的载体具体可为OsARE1基因敲除载体。所述OsARE1基因敲除载体为将序列表中序列2自5′末端起第552至570位和/或第1094至1112位所示的DNA分子插入pYLCRISPR/Cas9-MH载体BsaI识别位点得到的重组表达载体。OsARE1基因敲除载体特异识别序列表中序列3自5′末端起第2362至2380位和/或第3497至3515位所示的DNA分子。

上述任一所述特异RNA分子、上述任一所述特异DNA分子、上述任一特异重组质粒、或上述任一所述植物基因组编辑的载体在培育晚衰和/或叶片中叶绿素含量增加的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护植物育种方法一或植物育种方法二：

所述植物育种方法一，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性，从而植物早衰和/或植物叶片中叶绿素含量降低；

所述植物育种方法二，可包括如下步骤：降低植物中所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性，从而植物晚衰和/或植物叶片中叶绿素含量增加。

上述任一所述植物衰老可为植物叶片衰老。

上述任一所述植物晚衰可为植物叶片晚衰。

上述任一所述植物早衰可为植物叶片早衰。

上述任一所述晚衰可体现为衰老的起始和/或发生速率变慢。

上述任一所述早衰可体现为衰老的起始和/或发生速率变快。

上述任一所述调控植物衰老可为促进植物衰老或延缓植物衰老。

上述任一所述调控植物叶片中叶绿素含量可为增加植物叶片中叶绿素含量或降低植物叶片中叶绿素含量。

上述任一所述植物可为如下c1)至c12)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种日本晴；c6)水稻品种9311；c7)水稻品种明恢63号；c8)水稻品种中花11号；c9)水稻品种Lemont；c10)水稻品种特青1号；c11)水稻品种南京6号；c12)水稻品种黄华占。

以蛋白质OsARE1或其编码基因作为RNA干扰靶点而培育抗衰老转基因植物的应用也属于本发明保护的范围。

携带有本发明OsARE1基因或其它同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任一一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。转基因植株衰老过程的改变包括植物体内各组织和器官内各种色素分子或其它生物大分子含量的提高或降低，以及植物衰老相关性状的改变。

上述任一所述双子叶植物还可为拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草。上述任一所述单子叶植物还可为玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁或草坪草。

实验证明，蛋白质OsARE1正调控植物衰老过程，过量表达OsARE1基因促进衰老发生，下调或敲除OsARE1基因抑制衰老发生。are1-1突变是改良水稻早衰品种衰老相关性状，尤其是改良水稻叶片叶绿素含量的有效遗传位点。利用植物基因工程技术对OsARE1基因进行定点改造，为培育抗衰老作物新品种提供了有效分子策略。

附图说明

图1为abc1-1are1-1双突变体的遗传筛选；

a为水稻在分蘖期的表型(标尺为15cm)；

b为a中植物顶层叶片的表型(标尺为5cm)；

c为水稻分别在幼苗期、分蘖期、拔节期、抽穗期和灌浆期时顶层叶片相对叶绿素含量(SPAD)的定量分析，数值表示平均值±标准偏差，每个生育时期样本容量为50株植物；

WT为野生型水稻品种日本晴，abc1-1为日本晴背景的abc1-1突变体，abc1-1are1-1为日本晴背景的abc1-1are1-1双突变体。

图2为are1-1单突变体的表型分析；

a-e为水稻分别在幼苗期、分蘖期、拔节期、抽穗期和灌浆期时植株的表型(标尺为15cm)；

f为水稻开花后0-60d旗叶中相对叶绿素含量(SPAD)的定量分析(水稻旗叶SPAD值的变化趋势作为植物衰老速率的指标)，数值表示平均值±标准偏差，每个时间点样本容量为40株植物；

g为水稻开花后0-60d旗叶中部的表型(标尺为1cm)；

WT为野生型水稻，are1-1为are1-1单突变体。

图3为OsARE1基因的图位克隆；

a为利用水稻籼稻品种明恢63号和南京6号分别与abc1-1are1-1双突变体构建的F₂遗传定位群体中170棵交换单株，OsARE1基因被初步定位于水稻第8号染色体(Chr.8)短臂的两个SSR分子标记RM3374和RM3481之间；n代表交换单株的数目；

b为利用扩大的F₂定位群体中分离的1233棵交换单株，OsARE1基因被进一步精细定位在两个SNP分子标记M79和M81之间约410kb区间内；直线下的数字表示OsARE1基因与该分子标记之间交换单株的数目；

c为OsARE1基因精细定位区间内13个候选基因在染色体上的相对位置和方向；黑色箭头指示OsARE1基因所在位置和方向；

d为OsARE1基因编码区简图；黑色方框表示外显子，细线表示内含子；三角形符号指示are1-1突变体中OsARE1基因发生单核苷酸缺失突变的突变位点。

图4为OsARE1基因的遗传互补分析；

a为水稻在灌浆期的表型(标尺为15cm)；

b为水稻在成熟期的表型(标尺为15cm)；

c为b中植物旗叶中部的表型(标尺为2cm)；

d为水稻开花后0-60d旗叶中相对叶绿素含量(SPAD)的定量分析，数值表示平均值±标准偏差，每个时间点样本容量为40株植物；

WT为野生型水稻，abc1-1为abc1-1突变体，are1-1为are1-1单突变体，abc1-1are1-1为abc1-1are1-1双突变体，a中的pARE1为将OsARE1基因的基因组全长序列(序列表中序列3所示DNA分子)转入abc1-1are1-1双突变体得到的T₁代转基因植物，b、c和d中的pARE1为将上述OsARE1基因全长序列转入are1-1单突变体得到的T₁代转基因植物。

图5为OsARE1基因过量表达和基因沉默植物的表型分析；

a为水稻籼稻品种9311和3个独立转OsARE1基因全长序列的植物家系(#5、#1和#6)在成熟期的表型(标尺为15cm)；

b为a中植物旗叶中OsARE1基因相对表达量的定量分析；

c为a中植物旗叶中相对叶绿素含量(SPAD)的定量分析；

d为水稻品种日本晴和3个独立的OsARE1基因沉默植物家系(#1、#37和#24)在成熟期的表型(标尺为15cm)；

e为d中植物旗叶中OsARE1基因相对表达量的定量分析；

f为d中植物旗叶中相对叶绿素含量(SPAD)的定量分析；

b、c、e和f中数值均表示平均值±标准偏差，b和e中每个样品包含3个单株，c和f的样本容量为40株。**表示在t测验中二者差异达到极显著性水平(P<0.01)；

9311为水稻籼稻品种9311，NPB为水稻品种日本晴。

图6为OsARE1基因敲除植物的表型分析；

a为OsARE1基因经CRISPR/Cas9系统敲除产生的5种等位变异形式；本发明的发明人分别选取OsARE1基因的两个目标序列进行基因编辑，目标序列1为自5′末端第94至111位核苷酸，目标序列2为自5′末端第622至649位核苷酸(转录起始位点被视为+1)；灰色字体指示插入突变，灰色圆点指示缺失突变；

b为蛋白质OsARE1与a中OsARE1基因敲除产生的5种突变蛋白N端1-225个氨基酸经MegAlign软件的Clustal W方法进行的序列比对结果；黑色箭头指示a中目标序列1被gRNA编辑的首个氨基酸残基的位置，灰色箭头指示a中目标序列2被gRNA编辑的首个氨基酸残基的位置，*指示突变蛋白质翻译提前终止；

c为携带a中不同等位变异形式的OsARE1基因敲除植物在成熟期的表型(标尺为15cm)；

d为c中植物旗叶中相对叶绿素含量(SPAD)的定量分析；数值表示平均值±标准偏差，样品容量为30株。**表示在t测验中二者差异达到极显著性水平(P<0.01)。

图7为are1-1片段代换系植物的表型与产量分析；

a-e分别为明恢63号、中花11号、Lemont、特青1号和南京6号背景下的are1-1片段代换系植物及其相应受体亲本在水稻成熟期的田间表型；利用遗传回交方法，将受体亲本与are1-1单突变体(日本晴遗传背景)杂交获得F₁代植物，继续用受体亲本回交6次，通过测序方法分离鉴定到are1-1突变的BC₅F₃代are1-1片段代换系植物；

f为a-e中植物旗叶中相对叶绿素含量(SPAD)的定量分析；数值表示平均值±标准偏差，样品容量为30株，**表示在t测验中二者差异达到极显著性水平(P<0.01)；

g为a-e中植物在正常大田生长条件下单株产量的定量分析；数值表示平均值±标准偏差，样本容量为40株植物，*和**分别表示在t测验中二者差异达到显著性水平(P<0.05)和极显著性水平(P<0.01)；

Minghui63为明恢63号，Minghui63^are1-1为明恢63号背景的are1-1片段代换系植物，Zhonghua11为中花11号，Zhonghua11^are1-1为中花11号背景的are1-1片段代换系植物，Lemont^are1-1为Lemont背景的are1-1片段代换系植物，Teqing为特青1号，Teqing^are1-1为特青背景的are1-1片段代换系植物，Nanjing6为南京6号，Nanjing6^are1-1为南京6号背景的are1-1片段代换系植物。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中涉及的引物的信息见表2，第1列为引物名称，第2列为引物的核苷酸序列，第3列为在实施例中的用途。

表2

引物名称	引物的核苷酸序列(5'-3')	在实施例中的用途
			ARE1Comp1F	ATTGGCAAGGAATATGCCTCAACATGGGTC	构建OsARE1互补载体
ARE1Comp1R	AGGAGTTTCTGGCTGCGCCTTACATCAAGC	构建OsARE1互补载体
			ARE1Comp2F	TGCAGAATTGATTACATGGAACATTACACA	构建OsARE1互补载体
ARE1Comp2R	ATCGGCTTCAAGGCCGTAGTGCTCGAGAAT	构建OsARE1互补载体
			ARE1Comp3F	AAGAAGATTCGTCCAAAATGTTCAAAGAAGTT	构建OsARE1互补载体
ARE1Comp3R	GAGCTCCATTCTTTCTTTTACTTAAATGTTAATTTG	构建OsARE1互补载体
			ARE1qrt5F	TAGCATTATTGATTGTGATTCCAT	荧光定量PCR
ARE1qrt5R	TGGAGGAGATTTACCAATCTCTACT	荧光定量PCR
			ARE1RNAiF	CGGTACCACTAGTACACTGGTTCCCAAAGGGGTAG	构建OsARE1基因沉默载体
ARE1RNAiR	CGGATCCGAGCTCCCTCCCACGAGCGCCCTTCCGC	构建OsARE1基因沉默载体
			M34F	AACATCTGTCAGAAGAGGGCAGC	图位克隆
M34R	TATTGTTTTCACGGCTTCTTGTAGT	图位克隆
			M36F	CCCCACACCACGTTGTTCTTT	图位克隆
M36R	CATTAAAAATAAGAAACACTTGGCAGTA	图位克隆
			M79F	CGCACAAATAACGAAATGAGGATT	图位克隆
M79R	TACACAACAAACAAATGTAGTCTC	图位克隆
			M81F	CGTCAACTGTTCGGGATAGAGGTATTAACG	图位克隆
M81R	TGCATTTCTTTAATAGGGTTTACTCTTGC	图位克隆
			RM22613F	TTTCTGGCCCAGTTCAGTACAGC	图位克隆
RM22613R	TGGTGCGTACATATCCCTTTAACC	图位克隆
			RM22633F	TTTCACCACTGTAGTCTCTCTCC	图位克隆
RM22633R	CTCGACAGTTTCTTAGCTAGTCC	图位克隆
			RM22659F	GTCGTCGGAGACCACGATAGTCC	图位克隆
RM22659R	CGGCGCGCGACTACTATTACG	图位克隆
			RM3374F	ACCGAGCAGACAAAGAGTAGC	图位克隆
RM3374R	TGGTGATCTAGGTCAAGTTGG	图位克隆
			RM3481F	CCTCACGTCGTGCTCTCCAACC	图位克隆
RM3481R	CCTCGTCGCGTTCGTCAACC	图位克隆
			RM3644F	TGCTCCTCCACCTACTACCATCC	图位克隆
RM3644R	GCAGAAATCTTGACAGAAGAGAGTGG	图位克隆
			RM6838F	TCCTCCTCCACCTCAATCACACC	图位克隆
RM6838R	CCGAGCTCGCCATTAGCTTGC	图位克隆
			RM8271F	AGCAGCTCCGATTGTGTTAGCC	图位克隆
RM8271R	AATGGCGTCTGTGGTACTTTGC	图位克隆
			U6aF	GCCGCATGCAAGATGTTCGACAC	构建OsARE1基因敲除载体
U6aR	AAACGTGTCGAACATCTTGCATG	构建OsARE1基因敲除载体
			U6bF	GTTGATTGTGATTCCATGGGTGT	构建OsARE1基因敲除载体
U6bR	AAACACACCCATGGAATCACAAT	构建OsARE1基因敲除载体
			UBQ-F	ACCCTGGCTGACTACAACATC	荧光定量PCR
UBQ-R	AGTTGACAGCCCTAGGGTG	荧光定量PCR

实施例1、abc1-1are1-1双突变体的遗传筛选

细胞分裂素是一类重要的植物激素，参与调控植物生长发育各个环节，包括延缓叶片衰老。本发明的发明人通过化学诱变水稻品种日本晴(Nipponbare，NPB)，筛选到一个细胞分裂素响应异常的突变体，并将其命名为abnormal cytokinin reponse1突变体(abc1-1突变体)(Yang et al.，2016)。abc1-1突变体具有明显的生长发育缺陷表型，包括植株矮化、分蘖数减少及叶片黄化等，该突变体其它等位变异先后被多个研究组筛选到并分别被命名为gogat1、lc7、early senescence7(es7)和spotted leaf32(spl32)(Agron.J.Zeng et al.，2017；Bi et al.，2017；Chen et al.，2016；Sun et al.，2017)。ABC1基因编码一个叶绿体定位的Fd-GOGAT蛋白，是催化氮同化过程的一个关键酶。研究结果表明，ABC1/Fd-GOGAT基因功能缺陷突变体具有明显的早衰表型，这为挖掘叶片衰老控制基因提供了理想的遗传筛选材料。为了分离鉴定水稻衰老调控基因，本发明的发明人筛选了abc1-1突变体的抑制突变abc1-1repressors(are1-1突变)，并鉴定到一系列株高、分蘖数或叶色部分恢复的abc1-1are1-1双突变体。

叶片叶绿素含量的高低是指示叶片衰老速率的一个重要参考指标。本发明的发明人通过连续多年多点的田间表型分析实验，对are1-1突变进行分离与功能研究，结果如下：are1-1突变能够部分抑制abc1-1突变体株高降低、分蘖数减少和叶片黄化等表型(图1中a)；abc1-1are1-1双突变体叶片叶绿素含量几乎恢复到野生型水平(图1中b)；在水稻生命周期的后期阶段(如抽穗期)，abc1-1are1-1双突变体叶片叶绿素含量显著高于abc1-1突变体(图1中c)，表明are1-1突变增加叶片叶绿素含量，因而可能具有抗衰老的生物学功能。

实施例2、are1-1单突变体的表型分析

为获得are1-1单突变体，本发明的发明人将abc1-1are1-1双突变体与水稻品种日本晴回交3次，得到BC₂F₂分离群体。通过对BC₂F₂分离群体进行表型与连锁分析，获得are1-1单突变体。

与水稻品种日本晴相比，are1-1单突变体在营养生长阶段不具有明显的表型差异(图2中a、b和c)；进入抽穗期后，are1-1单突变体株高逐渐增加，分蘖数略有降低，抽穗期推迟大约3至5d，叶片叶绿素含量显著增加(图2中d和e)。为了明确are1-1突变是否影响叶片衰老过程，本发明的发明人分析了are1-1单突变体开花后旗叶中叶绿素含量的变化趋势。结果如下：水稻品种日本晴开花后叶片叶绿素含量迅速降低，而are1-1单突变体叶片叶绿素含量在开花后25d几乎保持不变，开花后35d叶绿素增加近一倍，开花后35至60d叶绿素降低速率显著降低(图2中f和g)。结果表明，are1-1突变具有延缓衰老的生物学功能。

实施例3、OsARE1基因的图位克隆

为了确定are1-1突变的性质，本发明的发明人将are1-1单突变体与水稻品种日本晴进行回交分析。回交获得的18株杂种F₁代植物全部表现为水稻品种日本晴的表型，在F₂分离群体中具有正常和晚衰表型的植物呈现出接近3:1的表型分离比(561:196＝2.86:1；χ²c<χ² _0.05＝3.84)。由此可见，are1-1单突变体是由单个核基因的隐性突变造成。

本发明的发明人采用图位克隆方法分离鉴定候选的OsARE1基因。利用abc1-1are1-1双突变体与籼稻品种明恢63号和南京6号分别构建了遗传作图群体。以叶片晚衰表型作为挑选指标，利用F₂分离群体中170棵具有类似abc1-1are1-1双突变体晚衰表型的交换单株，OsARE1基因被初步定位在第8号染色体短臂的两个SSR分子标记RM3374与RM3481之间(图3中a)。通过扩大F₂遗传作图群体，利用1233棵交换单株，OsARE1基因被进一步精细定位在两个SNP分子标记M79和M81之间约410kb的区间内(图3中b)。通过比对水稻基因组注释数据库(Rice Genome Annotion Project)发现，该区间内共包含13个有功能注释的候选基因(图3中c)，将其全部测序发现只有Loc_Os08g12780基因发生突变。在abc1-1are1-1双突变体和are1-1单突变体中，该基因第4个外显子均发生单碱基缺失突变，造成其编码产物蛋白质OsARE1发生移码突变，产生一个C端截短的蛋白质(图3中d)。

实施例4、OsARE1基因的遗传互补验证

一、水稻基因组DNA的提取

1)取约400mg水稻品种日本晴叶片，装入含有钢珠的离心管(规格为2mL)中，加入400μL DNA提取液(含500mM NaCl、50mM EDTA和1％(1mg/100mL)SDS的pH7.5、100mM Tris-HCl缓冲液)。

2)完成步骤1)后，将所述离心管装载至混合磨样仪(RETSCH公司的产品，型号为MM400)，以最大频率振荡3min，然后65℃水浴30min，冷却至室温。

3)完成步骤2)后，取所述离心管，加入等体积氯仿，振荡混匀，13000r/min离心10min。

4)完成步骤3)后，取所述离心管，转移上清至另一新的离心管(规格为1.5mL)，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置1h。

5)完成步骤4)后，取所述离心管，13000r/min离心10min，弃上清，70％(v/v)乙醇水溶液洗涤沉淀2次，晾干。

6)完成步骤5)后，取所述离心管，加入400μL去离子水，混匀，得到水稻基因组DNA。-20℃保存备用。

二、OsARE1互补载体的构建

1)以水稻基因组DNA为模板，采用引物对甲(ARE1Comp1F和ARE1Comp1R组成)进行PCR扩增，然后采用DNA琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(Biomed公司的产品，产品目录号为DH101)纯化回收，得到约5000bp的产物甲；取克隆载体pBluescript SK II(-)(Alting-Mees et al.，1992)，用限制性内切酶EcoRV酶切，得到载体骨架；将载体骨架和产物甲连接，得到中间载体甲。

按照上述步骤，将引物对甲替换为引物对乙(ARE1Comp2F和ARE1Comp2R组成)，其它步骤均不变，得到中间载体乙。

按照上述步骤，将引物对甲替换为引物对丙(ARE1Comp3F和ARE1Comp3R组成)，其它步骤均不变，得到中间载体丙。

2)将中间载体甲、中间载体乙和中间载体丙分别转化大肠杆菌DH5□，得到重组大肠杆菌菌株甲、菌株乙和菌株丙；采用Wizard Plus Minipreps DNAPurification System试剂盒(Promega公司的产品，产品目录号为A9280)小量提取质粒DNA，然后测序。

测序结果表明，中间载体甲中含有序列表中序列3自5′末端起第1至3860位所示的核苷酸序列，中间载体乙中含有序列表中序列3自5′末端起第3761至5760位所示的核苷酸序列，中间载体丙中含有序列表中序列3自5′末端起第5041至7229位所示的核苷酸序列。

3)用限制性内切酶PstI和KpnI酶切中间载体甲，回收约3809bp的酶切产物甲。用限制性内切酶KpnI酶切中间载体乙，回收约1880bp的酶切产物乙。用限制性内切酶KpnI和SalI酶切中间载体丙，回收约1540bp的酶切产物丙。

取pCAMBIA1300载体(Roberts et al.，1997)，用限制性内切酶PstI和SalI酶切，得到载体骨架甲；将载体骨架甲、酶切产物甲、酶切产物乙和酶切产物丙连接，得到OsARE1互补载体。

将OsARE1互补载体进行测序。根据测序结果，对OsARE1互补载体进行结构描述如下：向pCAMBIA1300载体的限制性内切酶PstI和SalI之间插入序列表中序列3所示的DNA分子(Loc_Os08g12780基因的基因组全长序列)，得到的重组质粒。

三、电激转化法与根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

1)采用电激转化法，将OsARE1互补载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/OsARE1-Comp。

2)采用根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/OsARE1-Comp导入abc1-1are1-1双突变体，得到T₁代转OsARE1基因的abc1-1are1-1双突变体。

3)采用根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/OsARE1-Comp导入are1-1单突变体，得到T₁代转OsARE1基因的are1-1单突变体。

四、OsARE1转基因互补植物的表型分析

T₁代转OsARE1基因的双突变体能够完全互补abc1-1are1-1双突变体至abc1-1突变体表型，包括株高降低、分蘖数减少、叶绿素含量降低及整个植株生物量降低等(图4中a)；T₁代转OsARE1基因的are1-1单突变体能够完全互补are1-1突变体至水稻品种日本晴表型(图4中b)，尤其是叶片叶绿素含量降低和早衰表型(图4中c和d)。

水稻遗传互补实验结果证明，Loc_Os08g12780基因就是OsARE1基因。OsARE1基因的基因组全长序列的核苷酸序列如序列表中序列3所示，OsARE1基因的cDNA的核苷酸序列如序列表中序列2所示，序列表中序列2自5′末端起第467-1750位所示的核苷酸序列编码序列表中序列1所示的蛋白质OsARE1。

实施例5、OsARE1转基因植物的表型分析

一、日本晴的cDNA的获得

1)采用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司的产品，产品目录号为DP432)提取水稻品种日本晴叶片中总RNA，得到日本晴总RNA。

2)取1-2μg日本晴总RNA，采用TransScript First-Strand cDNASynthesisSuperMix试剂盒(TransGen Biotech公司的产品，产品目录号为AT301)合成第一链cDNA，得到日本晴的cDNA。

二、OsARE1基因沉默载体的构建

通过水稻基因组序列比对，选取OsARE1基因转录起始位点下游101-400bp(转录起始位点被视为+1)序列作为OsARE1基因沉默的靶标序列。

1)以日本晴的cDNA为模板，采用引物对(ARE1RNAiF和ARE1RNAiR组成)进行PCR扩增，然后采用DNA琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化回收，得到约323bp的产物；取克隆载体pBluescript SK II(-)，用限制性内切酶EcoRV酶切，得到载体骨架；将载体骨架和产物连接，得到中间载体。

将中间载体进行测序。测序结果表明，中间载体中含有序列表中序列5自5′末端第840至1138位所示的核苷酸序列。

2)用限制性内切酶SpeI和SacI酶切中间载体，回收约305bp的DNA片段1；用限制性内切酶SpeI和SacI酶切pTCK303载体(Wang et al.，2004)，回收约14.6kb的载体骨架1；将DNA片段1和载体骨架1连接，得到重组质粒1；用限制性内切酶KpnI和BamHI酶切中间载体，回收约311bp的DNA片段2；用限制性内切酶KpnI和BamHI酶切重组质粒1，回收约14.9kb的载体骨架2；将DNA片段2和载体骨架2连接，得到OsARE1基因沉默载体。

将OsARE1基因沉默载体进行测序。根据测序结果，对OsARE1基因沉默载体进行结构描述如下：将序列表中的序列5自5′末端第14至312位所示的DNA分子插入pTCK303载体的SpeI和SacI识别位点之间，同时将序列表中的序列5自5′末端第840至1138位所示的DNA分子插入pTCK303载体的KpnI和BamHI识别位点之间得到的重组表达载体。OsARE1基因沉默载体表达序列表中序列4自5′末端第14至1138位所示的RNA分子。

三、OsARE1转基因植物的表型分析

1)采用电激转化法，将OsARE1基因沉默载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/OsARE1-RNAi。

2)采用根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/OsARE1-RNAi导入水稻品种日本晴，得到3个独立的T₁代OsARE1基因沉默的日本晴。

3)采用根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/OsARE1-Comp导入水稻籼稻品种9311，得到3个独立的T₁代转OsARE1基因的9311。

结果如下：3个独立的T₁代转OsARE1基因的9311叶片中OsARE1基因表达量显著增加，叶片叶绿素含量显著降低，转基因植物具有早衰表型(图5中a、b和c)；3个独立的T₁代OsARE1基因沉默的日本晴叶片中OsARE1基因表达量显著降低，叶片叶绿素含量增加，转基因植物具有晚衰表型(图5中d、e和f)。OsARE1转基因植物表型分析结果表明，OsARE1基因参与正调控植物衰老过程。

实施例6、OsARE1基因敲除植物的表型分析

研究表明，转基因作物具有众多优良性状，包括高产、优质、抗逆性和抗病虫害等，但其商品化大面积种植存在一定的生物安全隐患。CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术已日趋成熟，该技术通过转化靶标基因的导向RNA(guiding RNA，gRNA)而定点突变目标序列。利用人工回交方法或转基因植物通过自交可将外源转基因分离出植物体，从而获得仅目的基因发生变异而基因组其它序列均未改变的非转基因作物，不影响改良作物的推广种植。为了分析CRISPR/Cas9系统对OsARE1基因的突变效果及OsARE1基因敲除对叶片衰老过程的影响，本发明的发明人构建了OsARE1基因敲除载体并分析了OsARE1基因敲除植物的表型。

一、OsARE1基因敲除载体的构建

为了提高基因编辑效率，通过比对水稻基因组数据库，选择OsARE1基因外显子区2个高特异性序列5′-ATGTTCGACACTGGTTCC-3′(被编辑的目标序列1，位于第1个外显子中，转录起始位点下游94-111bp位置，转录起始位点被视为+1)和5′-TTATTGATTGTGATTCCATGGGTGTTGG-3′(被编辑的目标序列2，位于第2个外显子中，转录起始位点下游622-649bp位置，转录起始位点被视为+1)，作为OsARE1基因编辑的潜在靶点(图6中a)。

1)利用特异引物对a(U6aF和U6aR组成)合成gRNAa接头(含有转录起始位点下游86-104bp的OsARE1基因片段，转录起始位点被视为+1)；用限制性内切酶BsaI酶切gRNA表达载体pYLgRNA-U6a(Ma et al.,2016)，回收约3kb的载体骨架a；将gRNAa与载体骨架a连接，得到重组质粒a；

2)利用特异引物对b(U6bF和U6bR组成)，合成gRNAb接头(含有转录起始位点下游628-646bp的OsARE1基因片段，转录起始位点被视为+1)；用限制性内切酶BsaI酶切gRNA表达载体pYLgRNA-U6b(Ma et al.,2016)，回收约3kb的载体骨架b；将gRNAb与载体骨架b连接，得到重组质粒b；

3)用限制性内切酶BsaI分别酶切重组质粒a和重组质粒b，分别回收约800bp和600bp的gRNA表达盒a(U6a启动子驱动gRNAa表达)和gRNA表达盒b(U6b启动子驱动gRNAb表达)；用限制性内切酶BsaI酶切单子叶植物基因组编辑载体pYLCRISPR/Cas9-MH(Ma etal.,2016)，回收约16.5kb的载体骨架；将gRNA表达盒a和gRNA表达盒b与载体骨架连接，获得OsARE1基因敲除载体。

将OsARE1基因敲除载体进行测序。根据测序结果，对OsARE1基因敲除载体进行结构描述如下：将序列表中序列2自5′末端起第552至570位和/或第1094至1112位所示的DNA分子插入pYLCRISPR/Cas9-MH载体BsaI识别位点得到的重组表达载体。OsARE1基因敲除载体特异识别序列表中序列3自5′末端起第2362至2380位和/或第3497至3515位所示的DNA分子。

二、OsARE1基因敲除植物的表型分析

1)采用电激转化法，将OsARE1基因敲除载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/OsARE1-KO。

2)采用根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将EHA105/OsARE1-KO导入水稻品种黄华占(HHZ，一个推广面积大、适应性强的水稻品种，其具有一定的早衰表型)，得到OsARE1基因敲除的黄华占。

为了分析OsARE1基因是否被编辑及其编辑效果，本发明的发明人通过测序方法检测了OsARE1基因敲除的黄华占中OsARE1基因的完整性。结果表明，在OsARE1基因目标序列1和目标序列2区域均产生1至多个碱基的缺失或插入突变，共获得5类OsARE1基因等位变异形式的T₁代转基因植物(图6中a)。与野生型黄华占(基因型为HHZ^ARE1)相比，HHZ^are1-2在目标序列1处缺失4个碱基TCGA；HHZ^are1-10在目标序列1处缺失3个碱基CGA，在目标序列2处增加1个碱基T；HHZ^are1-12在目标序列1处缺失2个碱基GA，在目标序列2处缺失1个碱基G；HHZ^are1-18在目标序列1处增加1个碱基G，在目标序列2处缺失37个碱基；HHZ^are1-25在目标序列1处增加1个碱基T(图6中a)。将5类OsARE1基因等位变异衍生的OsARE1突变蛋白序列与蛋白质OsARE1序列进行比对发现，5类等位变异均导致氨基酸移码突变及蛋白翻译提前终止(图6中b)，表明5类等位变异的突变性质均为OsARE1基因功能缺失型突变。因此，本发明的发明人对这5类OsARE1基因敲除植物的表型进行了分析，侧重衰老相关性状的分析。

在正常生长条件下，与野生型黄华占相比，OsARE1基因敲除植物株高、分蘖数和生育期等农艺性状未表现出明显的表型差异，但5个独立家系植物均呈现出明显的晚衰表型(图6中c)。分析旗叶叶绿素含量发现，OsARE1基因敲除植物旗叶中叶绿素含量较野生型黄华占增加近1倍(图6中d)。OsARE1基因敲除植物表型分析结果表明，利用CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑方法定点敲除OsARE1基因，为农业生产上改良作物早衰性状提供了有效方法与遗传靶点。

实施例7、are1-1片段代换系在水稻抗衰老过程中的应用

农业生产上，早衰抑制作物灌浆期间叶片光合能力，从而制约作物产量。为检测are1-1突变在改良作物早衰中的应用潜力，本发明的发明人选用水稻高产品种(如明恢63号或特青1号)和早衰品种(如中花11号、Lemont或南京6号)两类受体品种，构建了一系列are1-1片段代换系进行分析。将are1-1单突变体分别与不同受体品种杂交并获得杂种F₁代植物，继续用受体品种回交5次，获得are1-1突变的BC₅F₃代片段代换系。

在正常生长条件下，are1-1片段代换系叶片衰老速率较受体亲本显著降低，表明are1-1突变具有改良植物叶片衰老的应用潜力(图7中a、b、c、d和e)。旗叶是作物灌浆期间进行光合作用的主要场所，其光合能力高低对作物产量具有重要影响。研究发现，水稻抽穗后30d，are1-1片段代换系旗叶仍维持较高的叶绿素含量(图7中f)，表明其有效光合活性增加。通过测定are1-1突变对水稻产量的影响发现，are1-1片段代换系产量较受体亲本均有不同程度的增加(图7中g)。值得指出的是，明恢63号和特青1号等高产水稻品种的片段代换系增产约9.5-11.7％，而中花11号、Lemont和南京6号等早衰品种的片段代换系增产高达14.3-19.6％，表明are1-1位点具有增产效应，且对早衰品种的增产效果尤为明显。以上分析表明，are1-1位点为改良作物衰老性状提供了优良遗传变异，也为提高作物产量提供了潜在靶点。

上述实验结果表明，are1-1突变显著延缓叶片衰老，过量表达OsARE1基因促进叶片衰老，下调OsARE1基因表达量或敲除OsARE1基因延缓叶片衰老。OsARE1基因主要在叶片等绿色组织中表达，编码一个调控叶片衰老过程的蛋白质OsARE1。将are1-1位点导入到多个早衰和高产水稻品种中，均显著改良叶片衰老性状。蛋白质OsARE1是控制叶片衰老的重要因子，为改良作物叶片衰老提供了有效的遗传靶标。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 蛋白质OsARE1在调控植物衰老中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 427

<212> PRT

<213> 水稻Oryza sativa L.

<400> 1

Met Ser Arg Ser Ala Val Ser Ser Glu Gly Gly Ile Ala Leu Arg Leu

1 5 10 15

Phe Val Asp Trp Arg Ile Arg Arg Arg Arg Val Cys Ala Cys Lys Met

20 25 30

Phe Asp Thr Gly Ser Gln Arg Gly Arg Val Lys Gln Leu Val Ala Phe

35 40 45

Ala Lys Lys Arg Arg Arg Pro Lys Lys Gln Pro Ser Arg Arg Pro Trp

50 55 60

Trp Lys Ala Trp Phe Ser Asp Trp Asn Asp Glu Glu Glu Ser Leu Ser

65 70 75 80

Gly Trp Arg Glu Asp Glu Glu Leu Leu Glu Glu Val Gly Gly Glu Glu

85 90 95

Gly Leu Ser Asp Asp Glu Lys Phe Glu Thr Trp Lys Arg Lys Ala Glu

100 105 110

Ala Ile Val Glu Leu Arg Glu Ala Arg Gln Asp Ala Met Asn Ala Glu

115 120 125

Gly Arg Ser Trp Glu Asp Trp Ile Gly Gly Gly Ser Ser Thr Ala Gly

130 135 140

Asp Gly Gly Gly Asp Trp Gly Gly Asp Leu Asp Val Ser Asp Leu Ile

145 150 155 160

Thr Asp Asp Pro Thr Glu Ile Val Arg Asp Lys Gly Leu Ile Glu Thr

165 170 175

Phe Arg Asp Ser Val Asp Glu Asp Tyr Asn Asp Met Leu Phe Glu Asp

180 185 190

Arg Val Phe Leu Tyr Ala Ser Thr Asn Ser Ala Lys Phe Leu Ala Leu

195 200 205

Leu Ile Val Ile Pro Trp Val Leu Asp Phe Leu Val His Asp Tyr Val

210 215 220

Leu Met Pro Phe Leu Glu Arg Tyr Val Gln Lys Val Pro Leu Ala Ala

225 230 235 240

Glu Leu Leu Asp Val Arg Arg Ser Gln Lys Leu Leu Met Val Lys Asp

245 250 255

Ile Asn Thr Glu Lys Ala Arg Tyr Arg Phe Glu Val Glu Ile Gly Lys

260 265 270

Ser Pro Pro Leu Ser Asp Asp Glu Leu Trp Ser Glu Leu Arg Glu Lys

275 280 285

Ala Ile Glu Leu Arg Asp Glu Trp Arg Leu Glu Asn Arg Lys Ala Phe

290 295 300

Ala Asn Ile Trp Ser Asp Met Val Tyr Gly Ile Ser Leu Phe Leu Leu

305 310 315 320

Met Tyr Phe Asn Gln Ser Lys Val Ala Met Leu Lys Phe Thr Gly Tyr

325 330 335

Lys Leu Leu Asn Asn Ile Ser Asp Ser Gly Lys Ala Phe Leu Ile Ile

340 345 350

Leu Val Ser Asp Ile Leu Leu Gly Tyr His Ser Glu Ser Gly Trp His

355 360 365

Ser Leu Val Glu Val Ile Leu Glu His Tyr Gly Leu Glu Ala Asp Gln

370 375 380

Ala Ala Ile Thr Phe Phe Val Cys Leu Val Pro Val Ala Leu Asp Val

385 390 395 400

Phe Ile Lys Phe Trp Val Tyr Lys Tyr Leu Pro Arg Leu Ser Pro Ser

405 410 415

Val Gly Asn Ile Leu Asp Glu Ile Lys Arg His

420 425

<210> 2

<211> 2640

<212> DNA

<213> 水稻Oryza sativa L.

<400> 2

cgggcgtccc cttcccgtgt cttatccact cccaacgttc cattctgtgg atgcttccgc 60

caccgccacc gcccaacgac cagcagcaag cagctcagcc aaggggctcc ccatcgtatc 120

gatccccatt cgcgccgtcc tcttcttctt cttcttcttc tcgattcata ggtgtggttt 180

ccatttcttg ctgtggttgc tggttgaact agcttttgct ttgcttggat tgtgttttga 240

ttgaggggtt tgttagtgtt agcaatctaa cccaagatat ctttgcaatt atatgctcca 300

gttaatccgt caggcttttg ttgcttgctg ctgctgctgc ggtggcgggt ggggaggaag 360

gatgctgatt gcggctgatt tcccgggaga ttcgacggtg tcccgatgcg cattccccgg 420

tttgttctga gtgatgatgc ggtctccgtt tcgtgatctt tgattgatga gccgttccgc 480

ggtaagctct gaaggcggca ttgcgctccg gctcttcgtg gactggagga tccggcgccg 540

gagggtctgc gcatgcaaga tgttcgacac tggttcccaa aggggtaggg tgaagcagct 600

ggtggctttt gccaagaaga ggaggcggcc caagaagcag ccgtcgcggc ggccatggtg 660

gaaggcgtgg ttctcggact ggaacgacga ggaggagagc ttgtctggct ggagggagga 720

tgaggagctg ctcgaggagg ttggcggcga ggaagggctg tcggacgacg agaagtttga 780

gacgtggaag aggaaggccg aggctattgt cgagctgcgg gaggcgcggc aggatgccat 840

gaacgcggaa gggcgctcgt gggaggattg gattggcggg ggcagtagca cagcggggga 900

tggcggcggt gactggggtg gggatttgga tgtgtcagac ctgataacgg atgatcctac 960

agagatagtg agggataaag gtttgattga aactttcaga gactctgtag atgaagatta 1020

caatgacatg ctgtttgaag accgggtttt tctgtatgct tcaacgaatt cggccaaatt 1080

tctagcatta ttgattgtga ttccatgggt gttggatttt ctggttcatg actatgttct 1140

gatgccattt ttggaaaggt acgtccagaa ggtaccactt gctgctgagc tgcttgatgt 1200

aaggcgcagc cagaaactcc tgatggtaaa ggacataaat actgagaaag caagatatcg 1260

ttttgaagta gagattggta aatctcctcc actttctgat gatgagctct ggtcagagtt 1320

acgggaaaaa gcgatagagt tgagagatga atggagatta gaaaaccgaa aagcgtttgc 1380

aaatatctgg tctgacatgg tttatggaat ttccctattc cttcttatgt acttcaacca 1440

gagtaaagtt gcgatgctga aattcacagg atataagtta ctaaataata tttcagacag 1500

tgggaaagca ttccttataa ttctagtttc agacatcctt ctagggtacc attcagagtc 1560

aggttggcat tctttggtag aagtcattct cgagcactac ggccttgaag ccgatcaagc 1620

tgcaatcacc ttctttgttt gtctggttcc tgttgccttg gatgtattta taaaattttg 1680

ggtatacaaa taccttccaa gattatcacc tagtgtgggt aacattttgg atgaaataaa 1740

gcgtcattag agactttcca tcaggaattt gatctgctta attcattcca ttaagaattt 1800

gaaggaaaga ccatccttcc aggtatgtat tcggtgttat atacctttgg cttgtattgt 1860

gttgttatca aaggttcatt agcaactttt tgtgatggtg tttgcgaggt gcttcttgat 1920

tctttcttaa attgttgaaa tattggcttt ctttctttct ttctttcttt ctttttgaac 1980

cagactgtga atgaaacaga gataaacatg tctgattgac aaaagaacta gttacatatt 2040

gctgtgagca gttaatcgtt cattgagaaa gcaaatttga atctgagttt ctgaagaaag 2100

ctactctgct gcagggctca ctcggggcta gtgtctgatt gatgaaatgc caacatagtt 2160

gccatggatt gcaatttcgg aggtcgccct aaccagtgct taccctacaa aaggcataca 2220

taacattctg tagtatatat actctccaca taaaaaaaat gtgctgatta cacatatcat 2280

ccaggaatat tcaggttgat gcggtattca ccgataatga gcgattttgt cccaggatgc 2340

tcacatatcg aaccttctgt gttttcatct ttttgttatg tgaaattcga aacaactatg 2400

tatatgtata caaacagcag aggctgcagt aggaatttgc ctttccccct tttttctcca 2460

ttgtagttcc ttgtggcatt tgtaatgtta tcaaggaatt taggccagtc taagaaaata 2520

atttaggtcc aatttggtgt gcgggatgag actattttct tgttcctgca ggaaattatt 2580

caattcatgc atgtgaggaa atacctatgc ttcaatcaga aattgctccc ttttttacaa 2640

<210> 3

<211> 7229

<212> DNA

<213> 水稻Oryza sativa L.

<400> 3

ctgcagggga ggagggtgcc gccgcgccag ccaggaggag gatgttggga aggaggaggc 60

ctaccgggga ggagtgtgac gggcagggag gagggcgcca cccgggatga gggcgtcggc 120

aggggaggag ggcgccggcc aggaggagcg gcgtagatcc gtggaggcgc agctagcggg 180

atatttcacg tgaaaaaaga agtgcccgcg tgtctctgcc gcggatgggg gctgcggaga 240

aagcccctgg gactgggggc ctgaggggat aatttggagg ccttcctatt ttaggggctt 300

tagtaggggc cttattggac ctgatttttt agtctcaact ctcaaaatta gtataggggc 360

tgtgtttaga acctctactg gagatgctct aagggaaaat atatggaatg gagcctctgc 420

aaccctaatt agtgtggatc catcttatat atattgtcat cacataatat ttcatgatag 480

gaaaaactat aagctataga actttaacac cgctgaggtc gataacatag cacacctcaa 540

agtttaggtg gatcaaacac gttagccact tgccactagg tcatggctga tcagtgacag 600

tacatggtgg attggtgccg ccctgatgct tagaccattg ctaagatttt cagcccgtgt 660

caaaagacaa aaaaagaggt ttctatttaa caaatactaa ataaacagag tacattttac 720

ttcaatctat ataaatatag aaaaattgca tgaatttcat gtgatcaacg tcaactagag 780

ctataccaaa ggaacttact aactgacaac gatggtgatg atcatgacta agtaggaact 840

aagaagaatt atcatatcat aaagcagtga ttcagttctc cttactaagc gaacaaatat 900

agtggaacct ttactgcctg gaatgcacat tcacatcatc atcatgagct ttagttcttt 960

gaggtagctg tagccgagaa aaaacaagct tgttctagct aaataagtga aagagaaaaa 1020

gagactttaa aaaatagaac aagaagatct taaaattata ttaaaagtgc atttggcttt 1080

gactggatta taaaataaga ggttattttt tgaagggaag atgttgggtt ctggacagca 1140

aagttgggtc acgtgttcca ctatgtcata taggacgctc cgtctttggt tgaggtagtg 1200

cactatgatt aaatttacaa tttttgtaac ctgttattga atttaggttt cgtagaactc 1260

ccatccggtt aatgaaatgg tcgacaattt tgtcgacaag agtttttttc tttaagaatt 1320

ttgtgtaaca caatatataa tatatgtttt gagataggag atacagtagg tagcaaggcc 1380

ctcgtagcga tgtcgcaaac ttacaataga aggtcaggcc aaagttataa aatttgataa 1440

tttgattgta ttaacacttg tggcaatgac cacgtgggac cttctcgagt ctacgacggt 1500

aagtcaggat gtcaaataat caaagtactc cctccgtctc aaaaaaagta aacctaggag 1560

gggatgtgac attttctggt acaacaaatc tagataaagg gctgtccaga tttattgtat 1620

taggagatgt cacatatttg cttgagtttt tttttttgac ggagtacagt ttatatagga 1680

tgttaaaaaa agaagagaga gagagagaaa gatatctctg ggccaaaggt agggtcggac 1740

aaatgggccc aacagccaat acggtactag ttacgtagcc cagcaacatg gcgccatccg 1800

tggaacggaa cgggcgtccc cttcccgtgt cttatccact cccaacgttc cattctgtgg 1860

atgcttccgc caccgccacc gcccaacgac cagcagcaag cagctcagcc aaggggctcc 1920

ccatcgtatc gatccccatt cgcgccgtcc tcttcttctt cttcttcttc tcgattcata 1980

ggtgtggttt ccatttcttg ctgtggttgc tggttgaact agcttttgct ttgcttggat 2040

tgtgttttga ttgaggggtt tgttagtgtt agcaatctaa cccaagatat ctttgcaatt 2100

atatgctcca gttaatccgt caggcttttg ttgcttgctg ctgctgctgc ggtggcgggt 2160

ggggaggaag gatgctgatt gcggctgatt tcccgggaga ttcgacggtg tcccgatgcg 2220

cattccccgg tttgttctga gtgatgatgc ggtctccgtt tcgtgatctt tgattgatga 2280

gccgttccgc ggtaagctct gaaggcggca ttgcgctccg gctcttcgtg gactggagga 2340

tccggcgccg gagggtctgc gcatgcaaga tgttcgacac tggttcccaa aggggtaggg 2400

tgaagcagct ggtggctttt gccaagaaga ggaggcggcc caagaagcag ccgtcgcggc 2460

ggccatggtg gaaggcgtgg ttctcggact ggaacgacga ggaggagagc ttgtctggct 2520

ggagggagga tgaggagctg ctcgaggagg ttggcggcga ggaagggctg tcggacgacg 2580

agaagtttga gacgtggaag aggaaggccg aggctattgt cgagctgcgg gaggcgcggc 2640

aggatgccat gaacgcggaa gggcgctcgt gggaggattg gattggcggg ggcagtagca 2700

cagcggggga tggcggcggt gactggggtg gggatttgga tgtgtcagac ctgataacgg 2760

atgatcctac agagatagtg agggataaag gtttgattga aactttcaga gactctgtag 2820

atgaagatta caatgacatg ctgtttgaag accgggtttt tctgtatgct tcaacgaatt 2880

cggtgagctc tttacctatc ttgttttctg tcaccaaatg ttataaccca ctgtccagtg 2940

ataaccatga gatacttgta atgctttttg aatatgatga actacttcct ccgtttcata 3000

ttttaagtcg ttttgacttt tttcttcatc aaacttcttt aaatttgacc aaatttgtag 3060

aaaaaattag caacacctat cacaccaaat tagtttcatt aaatatagca ttgaatatat 3120

tttgatagta cgtttgtttt atgttggaaa tgttaccata tttttctata aacttggtca 3180

aactaaaaaa agtttgactg gtaaaaaagc caaaacgacg tataatatga aatagaggta 3240

gtactatata atattggagt gcataatata gcaacaaact ttaatcttta caccttacaa 3300

tattatcgaa cgctgagggt ccattttgat ggtaatgatt ttgcatctgg tggctggtgt 3360

attttgacca ttttgatgat taaaaattaa aaatgttaaa aagtgtagca gcattatatt 3420

gttatattaa gaccctagca aattggatct aacaaaagaa agtttgcact ttcaggccaa 3480

atttctagca ttattgattg tgattccatg ggtgttggat tttctggttc atgactatgt 3540

tctgatgcca tttttggaaa ggtaaatcct ctcacagtgt tccattttta ctttcttaac 3600

tttttcccct cacttcttaa tgtaagaaaa tgcattccat gtacacccaa tctgatgttt 3660

aggaatttat aaggtgaagt ttcaagcact gatgatattc tcagtttctc actctctgtg 3720

cttctgaaat tacatgcgat caataatcat ctatgctaaa tgcagaattg attacatgga 3780

acattacaca ataacaggta cgtccagaag gtaccacttg ctgctgagct gcttgatgta 3840

aggcgcagcc agaaactcct gatggtaaag gacataaata ctgagaaagc aagatatcgt 3900

tttgaagtag agattggtaa atctcctcca ctttctgatg atgagctctg gtcagagtta 3960

cgggaaaaag cgtgagaaac actctaacta ttatactttc ttgccttgtt gtaacttctg 4020

ttgatgcact agcattgtct gacatgagca atggaccttc tatcctgcaa tttcatatgt 4080

tcaatcttaa cagatctgct ctgctacttg atcaggatag agttgagaga tgaatggaga 4140

ttagaaaacc gaaaagcgtt tgcaaatatc tggtctgaca tggtttatgg aatttcccta 4200

ttccttctta tgtacttcaa ccagagtaaa gtatgtttta tcagataagc agctttgttt 4260

tttttttcca tctttgattg tgttccaata aatttttcag ctttctgagt gtgcatgtga 4320

gctaagtgat tggttataaa taaacacccc acaagttgac aaatttctgc actattaggc 4380

ctctctcaga gttatccgat ttctgctgtt aatacatagt acatgatgat tttgtgccaa 4440

aagaactgca gtgatgaact gaccagagta ttcccccatt ctatttgtac ctggttatac 4500

atcatacttt tctgacctag tgcagtagta agaccacctc agtttctgca atatgtttga 4560

ttgttagtat catttagtaa cacatacctg gagtccatga tttatgtaca atgaattcat 4620

caatctatct tatccatcat cgtagcctat ttttctctcc cattgaatgc ttagtgttat 4680

cctgcgtaca acttattctt attgcctgct aagctttcag gttgcgatgc tgaaattcac 4740

aggatataag ttactaaata atatttcaga cagtgggaaa gcattcctta taattctagt 4800

ttcagacatc cttctagggt gagttacaat tcatttttct tgagttcata tatacatgtg 4860

gttttagtgt gaacctagtt tgtaacaaag catacactaa acaattgtgc tatttctttt 4920

gctggataat ggatgtcagc aacctaacta aaggcaaata acatgagttc taacctacct 4980

ctctcatgtg ttacctgctt atctaaaaaa tcatacattt aaataagtaa ttcttgttaa 5040

aagaagattc gtccaaaatg ttcaaagaag ttaaagagga ggccagagct ccctccaggg 5100

gagagtgcct tttcttttca gaaactaata tcagggggat actcagcagc atgttttaga 5160

aagcaattca ttatatcttg tcatcatgat tcatgagcga ttttttaaat attctctcat 5220

aagtatggat aagtttgtaa aaatgcatgg aagaaatatt atagctattt tttttgtcag 5280

gaatgaggca gatggttctg tgtttcttct tcgttcgcac ttcaaatatg atcttaatat 5340

ttcttcattt ttctctctct tcaaagatgt ttgtagcatt cgtgtggcag aatcttattt 5400

atcatctagt tagaaactta gaatagtgaa cctaagtggt acagtatccc gttagaagtt 5460

aattcacaca aatgcatatg aactgctttg cgaataatgg aattcttcct gttcatgctt 5520

atgttataca tcatgacatc ttttctgttt caaacaaact atggatagtt tgtaattttg 5580

tttctgcttt ttttcttgtt ttcatgtaaa cgtaacacaa ggttaacatt gttttggttt 5640

gtctgtgatc ttgttgacta tattaacatc atttagctgc attttcacag gtaccattca 5700

gagtcaggtt ggcattcttt ggtagaagtc attctcgagc actacggcct tgaagccgat 5760

caagctgcaa tcaccttctt tgtttgtctg gttcctgttg ccttggatgt atttataaaa 5820

ttttgggtca gtccacttct tgccttcaca caatcaagct aatagggcta tgaacattta 5880

ttttattctt taaaaaacat ttatttcatt ttatcttttt ttaaaaaaga atataagtgt 5940

ttgttaaggc ctcataattt atgactagtt tcacccaaag ttgataacat tatagattca 6000

cgtttggcta ctcagcgcta acatttcaga taatattaac tgaaagtttt atagtctttc 6060

tacaaagtga tttgaacttt attgctgggc cgacagttat taggaagaca accttttgta 6120

gatacaattt catttcctga cactgctctt aaatcaattg ttcaccttgc atgtgctaga 6180

acccattgca ttttttaata actggaaata catgttctct tgataagatc aacaattcga 6240

cgtacttaat tttatttcct tattttccag gtatacaaat accttccaag attatcacct 6300

agtgtgggta acattttgga tgaaataaag cgtcattaga gactttccat caggaatttg 6360

atctgcttaa ttcattccat taagaatttg aaggaaagac catccttcca ggtatgtatt 6420

cggtgttata tacctttggc ttgtattgtg ttgttatcaa aggttcatta gcaacttttt 6480

gtgatggtgt ttgcgaggtg cttcttgatt ctttcttaaa ttgttgaaat attggctttc 6540

tttctttctt tctttctttc tttttgaacc agactgtgaa tgaaacagag ataaacatgt 6600

ctgattgaca aaagaactag ttacatattg ctgtgagcag ttaatcgttc attgagaaag 6660

caaatttgaa tctgagtttc tgaagaaagc tactctgctg cagggctcac tcggggctag 6720

tgtctgattg atgaaatgcc aacatagttg ccatggattg caatttcgga ggtcgcccta 6780

accagtgctt accctacaaa aggcatacat aacattctgt agtatatata ctctccacat 6840

aaaaaaaatg tgctgattac acatatcatc caggaatatt caggttgatg cggtattcac 6900

cgataatgag cgattttgtc ccaggatgct cacatatcga accttctgtg ttttcatctt 6960

tttgttatgt gaaattcgaa acaactatgt atatgtatac aaacagcaga ggctgcagta 7020

ggaatttgcc tttccccctt ttttctccat tgtagttcct tgtggcattt gtaatgttat 7080

caaggaattt aggccagtct aagaaaataa tttaggtcca atttggtgtg cgggatgaga 7140

ctattttctt gttcctgcag gaaattattc aattcatgca tgtgaggaaa tacctatgct 7200

tcaatcagaa attgctccct tttttacaa 7229

<210> 4

<211> 1145

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ggauccgagc ucccucccac gagcgcccuu ccgcguucau ggcauccugc cgcgccuccc 60

gcagcucgac aauagccucg gccuuccucu uccacgucuc aaacuucucg ucguccgaca 120

gcccuuccuc gccgccaacc uccucgagca gcuccucauc cucccuccag ccagacaagc 180

ucuccuccuc gucguuccag uccgagaacc acgccuucca ccauggccgc cgcgacggcu 240

gcuucuuggg ccgccuccuc uucuuggcaa aagccaccag cugcuucacc cuaccccuuu 300

gggaaccagu guacuagugg uacccucgag gucgacagau cugcuagcgg uaaguuacua 360

caaaccuuuu uguacuuaug uuccagugac aauuauuugu guucucaugu uccacguauc 420

acuuuaaugu ucaugguuga ucauuguacc gccucaucuc uuuuagagga ucaagaguau 480

augccugucu uaacuuuuuc uuucucuggu ccagucuuuc cgcugauauu aagaugaauu 540

uuacaacaaa aaaugugcug ccuguguaug aagguucaga ggcauaguuc auaauuuuac 600

ccuguucuca auuaggaaau guauuuugca aggucauaaa gucuugacau ugaugaucaa 660

auauuuucua gagcuaaaau uucauaauca aauaugacag uuccacggca guagauaaag 720

aguacccacu guauauauua guaugaagau uaacacuuga aaaaaccuuu gauuguuccu 780

auaacaccua augauugacu augacacggc uguuucgaga uuuucagauc gauacuagua 840

cacugguucc caaaggggua gggugaagca gcugguggcu uuugccaaga agaggaggcg 900

gcccaagaag cagccgucgc ggcggccaug guggaaggcg ugguucucgg acuggaacga 960

cgaggaggag agcuugucug gcuggaggga ggaugaggag cugcucgagg agguuggcgg 1020

cgaggaaggg cugucggacg acgagaaguu ugagacgugg aagaggaagg ccgaggcuau 1080

ugucgagcug cgggaggcgc ggcaggaugc caugaacgcg gaagggcgcu cgugggaggg 1140

agcuc 1145

<210> 5

<211> 1145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

ggatccgagc tccctcccac gagcgccctt ccgcgttcat ggcatcctgc cgcgcctccc 60

gcagctcgac aatagcctcg gccttcctct tccacgtctc aaacttctcg tcgtccgaca 120

gcccttcctc gccgccaacc tcctcgagca gctcctcatc ctccctccag ccagacaagc 180

tctcctcctc gtcgttccag tccgagaacc acgccttcca ccatggccgc cgcgacggct 240

gcttcttggg ccgcctcctc ttcttggcaa aagccaccag ctgcttcacc ctaccccttt 300

gggaaccagt gtactagtgg taccctcgag gtcgacagat ctgctagcgg taagttacta 360

caaacctttt tgtacttatg ttccagtgac aattatttgt gttctcatgt tccacgtatc 420

actttaatgt tcatggttga tcattgtacc gcctcatctc ttttagagga tcaagagtat 480

atgcctgtct taactttttc tttctctggt ccagtctttc cgctgatatt aagatgaatt 540

ttacaacaaa aaatgtgctg cctgtgtatg aaggttcaga ggcatagttc ataattttac 600

cctgttctca attaggaaat gtattttgca aggtcataaa gtcttgacat tgatgatcaa 660

atattttcta gagctaaaat ttcataatca aatatgacag ttccacggca gtagataaag 720

agtacccact gtatatatta gtatgaagat taacacttga aaaaaccttt gattgttcct 780

ataacaccta atgattgact atgacacggc tgtttcgaga ttttcagatc gatactagta 840

cactggttcc caaaggggta gggtgaagca gctggtggct tttgccaaga agaggaggcg 900

gcccaagaag cagccgtcgc ggcggccatg gtggaaggcg tggttctcgg actggaacga 960

cgaggaggag agcttgtctg gctggaggga ggatgaggag ctgctcgagg aggttggcgg 1020

cgaggaaggg ctgtcggacg acgagaagtt tgagacgtgg aagaggaagg ccgaggctat 1080

tgtcgagctg cgggaggcgc ggcaggatgc catgaacgcg gaagggcgct cgtgggaggg 1140

agctc 1145

Claims

1.蛋白质OsARE1在调控植物衰老和/或调控植物叶片中叶绿素含量中的应用；

所述蛋白质OsARE1为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

所述植物为水稻。

2.编码权利要求1中所述蛋白质OsARE1的核酸分子在调控植物衰老和/或调控植物叶片中叶绿素含量中的应用；所述植物为水稻。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述编码权利要求1中所述蛋白质OsARE1的核酸分子为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

b3)编码区如序列表中序列2自5′末端起第467至1750位所示的DNA分子。

4.培育转基因植物的方法，包括向出发植物甲中导入提高权利要求1中所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性的物质，得到转基因植物甲的步骤；所述转基因植物甲与所述出发植物甲相比植物早衰和/或植物叶片中叶绿素含量降低；

所述植物为水稻。

5.培育转基因植物的方法，包括向出发植物乙中导入抑制权利要求1中所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性的物质，得到转基因植物乙的步骤；所述转基因植物乙与所述出发植物乙相比植物晚衰和/或植物叶片中叶绿素含量增加；

所述植物为水稻。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述向出发植物乙中导入抑制权利要求1中所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性的物质为向出发植物乙中导入特异RNA分子；所述特异RNA分子如式(I)所示：A_反向-Y-A_正向(I)；所述A_正向的序列为编码所述蛋白质OsARE1的基因中的200-500bp DNA片段转录得到的单链RNA分子；所述A_反向的序列与所述A_正向的序列反向互补；所述Y是所述A_正向与所述A_反向之间的间隔序列，在序列上，所述Y与所述A_正向及所述A_反向均不互补。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述向出发植物乙中导入特异RNA分子的实现方法如下：将特异DNA分子甲导入出发植物乙；所述特异DNA分子甲如式(II)所示：SEQ_反向-X-SEQ_正向(II)；所述SEQ_正向的序列为编码所述蛋白质OsARE1的基因中的200-500bp DNA片段；所述SEQ_反向的序列与所述SEQ_正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ_正向与所述SEQ_反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ_正向及所述SEQ_反向均不互补。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述向出发植物乙中导入抑制权利要求1中所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性的物质为向出发植物乙中导入植物基因组编辑的载体；所述植物基因组编辑的载体含有gRNA编码基因；所述gRNA在植物中识别的靶标DNA为编码蛋白质OsARE1的DNA片段。

9.植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1中所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性，从而植物早衰和/或植物叶片中叶绿素含量降低；

所述植物为水稻。

10.植物育种方法，包括如下步骤：降低植物中权利要求1中所述蛋白质OsARE1的含量和/或活性，从而植物晚衰和/或植物叶片中叶绿素含量增加；

所述植物为水稻。