CN113564177B - 通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的方法。本发明提供了一种制备基因编辑小麦的方法，包括使受体小麦基因组ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低，获得所述基因编辑小麦，所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：(1)与所述受体小麦相比，所述基因编辑小麦的产量提高；(2)与所述受体小麦相比，所述基因编辑小麦的衰老延缓；(3)与所述受体小麦相比，所述基因编辑小麦的氮素利用率提高。本发明实施例利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑小麦氮素利用效率相关基因ARE1基因，通过造成移码突变，敲除了小麦ARE1基因，获得了产量明显提高的新一代小麦新种质。

Description

通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的方法。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.，2n＝42，AABBDD)是最重要的粮食作物之一，养活了世界三分之一以上的人口。氮素是植物生长的基本营养元素，也是植物尤其是农作物生长发育的主要限制因素。氮素不足会严重影响作物产量，因此农业生产上一般需大量施用氮肥促进农作物生长，从而达到粮食增产的目的。然而，小麦、玉米、大米、大麦和高粱等谷物对氮肥的利用效率不足40％。不能被充分利用的氮肥会通过浸出和挥发而流失到环境中，从而导致包括气候变化、土壤酸化及水体富营养化等一系列的环境问题。因此，提高氮素利用率(NUE)是农业可持续发展的有效策略，不仅可以降低化肥使用成本，还可以促进作物高产稳产。
CRISPR/Cas9系统是目前已经发展成熟的第三代基因编辑器，该系统因其简便性、多功能性、稳定性和成本低等优势广泛应用于各种生物的基因工程，也迅速成为作物品种遗传改良的有效工具。
发明内容
本发明提供了一种制备转基因小麦的方法，包括使所述受体小麦基因组的ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低，获得所述转基因小麦，
所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：
(1)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的产量提高；
(2)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的衰老延缓；
(3)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的氮素利用率提高。
所述ARE1蛋白活性和/或丰度降低具体可通过抑制或降低ARE1基因表达实现。
可选地，根据上述的方法，所述使受体小麦基因组的ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低采用基因编辑的方式。所述基因编辑具体采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统中的gRNA的靶序列为序列1第6915-6934位核苷酸所示和/或序列2第1-20位核苷酸所示。
例如所述CRISPR/Cas9系统为如下任一种：
(b1)包括特异gRNA和Cas9蛋白；所述特异gRNA中的靶序列识别区如序列表的序列1中第6915-6934位核苷酸所示和/或序列表的序列2中第1-20位核苷酸所示；
(b2)包括特异DNA分子和Cas9蛋白的编码基因，所述特异DNA分子转录得到所述特异gRNA；
(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒和具有所述Cas9蛋白的编码基因的质粒；
(b4)包括特异重组质粒，所述特异重组质粒表达所述特异DNA分子和所述Cas9蛋白的编码基因。
所述特异gRNA可为核苷酸序列如序列表中序列1的第6915-7017位核苷酸所示DNA分子和/或如序列表中序列2所示DNA分子转录获得的gRNA。
所述特异DNA分子可为所述特异gRNA的编码基因，例如其核苷酸序列如序列表中序列1的第6915-7017位核苷酸所示和/或如序列表中序列2所示；也可为表达所述特异gRNA的表达盒，例如其核苷酸序列如序列表中序列1的第6552-7017位核苷酸所示和/或所述特异DNA分子的核苷酸序列与序列表中序列3的第49-514位核苷酸序列反向互补。
所述Cas9蛋白的编码基因的核苷酸序列可与序列表中序列1的第392-4522位核苷酸反向互补。
所述特异重组质粒例如为下述实施例制备的重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos、重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos或重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos。
可选地，根据上述的方法，所述基因编辑为将上述CRISPR/Cas9系统导入所述受体小麦。
可选地，所述突变为如下至少一种突变：
核苷酸序列如序列5所示的ARE1基因第444-448位核苷酸缺失、第1311-1358位核苷酸缺失、第448位核苷酸缺失和/或第1338-1347位核苷酸缺失；
核苷酸序列如序列7所示的ARE1基因第441-473位核苷酸缺失、第1575位插入1个核苷酸、第448位核苷酸缺失和/或第1568-1578位核苷酸缺失；
核苷酸序列如序列9所示的ARE1基因第435-459位核苷酸缺失、第1319位T替换为A和/或第425-1360位核苷酸缺失。
本发明还提供了一种制备转基因小麦的方法，为如下1)或2)：
1)采用上述CRISPR/Cas9系统对受体小麦进行基因编辑，得到转基因小麦；
2)将上述特异重组质粒导入受体小麦，得到转基因小麦；
所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：
(1)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的产量提高；
(2)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的衰老延缓；
(3)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的氮素利用率提高。
本发明还提供了一种制备无转基因的基因编辑小麦的方法，包括1)按照上述方法制备转基因小麦；2)将所述转基因小麦自交，得到自交后代；3)从所述自交后代中筛选无转基因的基因编辑小麦；
所述无转基因的基因编辑小麦具有下述至少一种特性的：
(1)与所述受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的产量提高；
(2)与所述受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的衰老延缓；
(3)与所述受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的氮素利用率提高。
所述基因编辑小麦可为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组至少一基因组在靶序列区域发生突变，且为纯合突变型。所述无转基因可为不携带上述特异重组质粒序列。
所述无转基因的基因编辑小麦可为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组至少一基因组在靶序列区域发生突变，且为纯合突变型；不携带上述特异重组质粒序列。
所述无转基因的基因编辑小麦具体可为：实施例2得到的T0代植株T1-44自交得到T1代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组wt野生型且B基因组d33纯合突变型且D基因组d25纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株。
所述无转基因的基因编辑小麦具体可为：实施例2得到的T0代植株T1-44自交得到T1代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d5纯合突变型且B基因组d33纯合突变型且D基因组d25纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株。
所述无转基因的基因编辑小麦具体可为：实施例3得到的T0代植株T2-5自交得到T1代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d37纯合突变型且B基因组i1纯合突变型且D基因组s1纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株。
所述无转基因的基因编辑小麦具体可为：实施例4得到的T0代植株T12-23自交得到T1代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d1-d10纯合突变型且B基因组d1-d11纯合突变型且D基因组d481纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株。
本发明还提供了DNA分子。所述DNA分子可为在序列表中序列5所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第444-448位核苷酸缺失和第1311-1358位核苷酸缺失、第448位核苷酸缺失和第1338-1347位核苷酸缺失。所述DNA分子也可为在序列表中序列7所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第441-473位核苷酸缺失、第1575位插入1个核苷酸、第448位核苷酸缺失和第1568-1578位核苷酸缺失。所述DNA分子也为在序列表中序列9所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第435-459位核苷酸缺失、第1319位T替换为A和第425-1360位核苷酸缺失。
上述的特异gRNA、上述的特异DNA分子和上述CRISPR/Cas9系统也属于本发明的保护范围之内。
本发明还提供了上述的方法、上述的DNA分子、上述的特异gRNA、上述的特异DNA分子、上述的CRISPR/Cas9系统、ARE1基因、ARE1蛋白或降低ARE1蛋白活性和/或丰度的物质的应用，所述应用为如下任一种应用：
(1)在提高小麦产量中的应用；
(2)在延缓小麦衰老中的应用；
(3)在提高小麦氮素利用率中的应用
(4)在小麦育种中的应用。
上述应用中，降低ARE1蛋白活性和/或丰度的物质可为抑制或降低ARE1蛋白的编码基因(即ARE1基因)表达的物质。所述抑制或降低ARE1基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。例如，所述抑制或降低ARE1基因表达的物质可为上述CRISPR/Cas9系统。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上文中，所述ARE1基因可为如下1)或2)或3)或4)或5)或6)或7)或8)的DNA分子：
1)DNA分子包含第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子、第六外显子和第七外显子，第一外显子序列如序列5的第1-588位核苷酸所示，第二外显子序列如序列5的第795-880位核苷酸所示，第三外显子序列如序列5的第979-1152位核苷酸所示，第四外显子序列如序列5的第1322-1436位核苷酸所示，第五外显子序列如序列5的第6619-6716位核苷酸所示，第六外显子序列如序列5的第7397-7532位核苷酸所示，第七外显子序列如序列5的第7955-8023位核苷酸所示；
2)DNA分子包含第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子、第六外显子和第七外显子，第一外显子序列如序列7的第1-588位核苷酸所示，第二外显子序列如序列7的第1022-1118位核苷酸所示，第三外显子序列如序列7的第1217-1390位核苷酸所示，第四外显子序列如序列7的第1560-1674位核苷酸所示，第五外显子序列如序列7的第6251-6348位核苷酸所示，第六外显子序列如序列7的第7032-7167位核苷酸所示，第七外显子序列如序列7的第7588-7656位核苷酸所示；
3)DNA分子包含第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子、第六外显子和第七外显子，第一外显子序列如序列9的第1-588位核苷酸所示，第二外显子序列如序列9的第780-865位核苷酸所示，第三外显子序列如序列9的第964-1137位核苷酸所示，第四外显子序列如序列9的第1304-1418位核苷酸所示，第五外显子序列如序列9的第9014-9111位核苷酸所示，第六外显子序列如序列9的第9789-9924位核苷酸所示，第七外显子序列如序列9的第10459-10527位核苷酸所示；
4)序列表中序列5所示的DNA分子；
5)序列表中序列7所示的DNA分子；
6)序列表中序列9所示的DNA分子；
7)在严格条件下与1)至6)中任一限定的DNA序列杂交且编码所述ARE1蛋白的DNA分子；
8)来源于小麦且与1)至6)中任一限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且编码所述ARE1蛋白的DNA分子。
上文中，所述ARE1基因编码的ARE1蛋白可为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由序列表中序列4或序列6或序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质；
(a3)来源于小麦且与(a1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
上文中，提高小麦产量可为提高小麦分蘖数、籽粒的千粒重、粒长和/或粒宽。
上文中，所述受体小麦具体可为小麦品种郑麦7698。
上文中，术语“同一性”指与天然序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明实施例以ARE1基因为研究对象，在郑麦7698品种中分离克隆小麦的ARE1同源基因，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除载体，利用基因枪的方法对该基因进行定向敲除，获得不同编辑类型的无转基因小麦株系。
本发明实施例利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑小麦氮素利用效率相关基因ARE1基因，通过造成移码突变，敲除了小麦ARE1基因，获得了产量明显提高的新一代小麦新种质。在田间试验中，所有不含转基因的突变体系对氮饥饿的耐受性增强，衰老延迟和产量增加。与野生型对照相比，AABBdd和aabbDD突变系表现出显著增强的NUE、延迟衰老、增加产量并且没有生长缺陷。本发明对于减少氮肥使用，增加小麦产量，确保粮食安全和农业可持续发展具有重要意义。
附图说明
图1为实施例2中1株再生植株进行酶切后的电泳图。
图2为实施例2中1株再生植株进行测序后的结果。
图3为实施例2中部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果。
图4为实施例3中1株再生植株进行酶切后的电泳图。
图5为实施例3中1株再生植株进行测序后的结果。
图6为实施例3中部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果。
图7为实施例4中1株再生植株进行PCR扩增后的电泳图。
图8为实施例4中1株再生植株进行酶切后的电泳图。
图9为实施例4中1株再生植株进行测序后的结果。
图10为实施例4部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果。
图11为实施例2，实施例3和实施例4中T2代植株在不同浓度氮素处理溶液中的根尖表型及横切结构结果。
图12为实施例2，实施例3和实施例4中T2代植株田间表型结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小麦品种郑麦7698。提及“郑麦7698”的文献(在文献中称为“Zhengmai7698”)：GuoG，LeiM，Wang Y，Song B，Yang J，et al.Accumulation ofAs，Cd，and Pb in sixteenwheat cultivars grownin contaminated soils and associated health riskassessment[J].Journal of Environmental Research andPublic Health，2018，15(11)：2601.。郑麦7698用WT表示，A基因组中的相应序列用WT-A表示，B基因组中的相应序列用WT-B表示，D基因组中的相应序列用WT-D表示。
实施例1、制备重组质粒
人工合成重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos、重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos和重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos。重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos、重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos和重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos均为环形质粒。
重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，第115-367位核苷酸与NOS终止子反向互补，第392-4522位核苷酸与Cas9蛋白的编码基因反向互补，第4544-6533位核苷酸与Ubi启动子反向互补，第6552-6914位核苷酸为U6启动子，第6915-7017位核苷酸为gRNA1的编码基因(其中第6915-6934位核苷酸为靶序列识别区，第6935-7010位核苷酸为Cas9结合区(scaffold)，第7011-7017位核苷酸为polyT)。重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos表达gRNA1，gRNA1的靶序列位于小麦ARE1基因的第一外显子中。
重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos是将重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos序列中的第6915-7017位核苷酸(即gRNA1的编码基因)替换为gRNA2的编码基因序列(如序列2所示)所获得的重组质粒。序列2中第1-20位核苷酸为靶序列识别区，第21-96位核苷酸为Cas9结合区(scafford)，第97-103位核苷酸为polyT。重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos表达gRNA2，gRNA2的靶序列位于小麦ARE1基因的第四外显子中。
重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos是在重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos序列中的第6位核苷酸后插入重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos序列中的第6539-7065位核苷酸的反向互补序列(即U6启动子、gRNA2的编码基因及其旁侧序列的反向互补序列，如序列3所示)所获得的重组质粒。序列3中，第1-48位核苷酸与序列1中的第7018-7065位核苷酸反向互补，第49-151位核苷酸与gRNA2的编码基因反向互补(其中第132-151位核苷酸为靶序列识别区的反向互补)，第152-514位核苷酸与U6启动子反向互补，第515-527位核苷酸与序列1中的第6539-6551位核苷酸反向互补。重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos表达gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的靶序列位于小麦ARE1基因的第一外显子和第四外显子中。
小麦基因组中，A基因组(对应A染色体组)中的ARE1基因的核苷酸序列如序列表的序列5所示(编码序列表的序列4所示的蛋白质)，序列5中第1-588位核苷酸为基因组DNA中该基因的第一外显子，第795-880位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子，第979-1152位核苷酸为基因组DNA中该基因的第三外显子，第1322-1436位核苷酸为基因组DNA中该基因的第四外显子，第6619-6716位核苷酸为基因组DNA中该基因的第五外显子，第7397-7532位核苷酸为基因组DNA中该基因的第六外显子，第7955-8023位核苷酸为基因组DNA中该基因的第七外显子；B基因组(对应B染色体组)中的ARE1基因的核苷酸序列如序列表的序列7所示(编码序列表的序列6所示的蛋白质)，序列7中第1-588位核苷酸为基因组DNA中该基因的第一外显子，第1022-1118位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子，第1217-1390位核苷酸为基因组DNA中该基因的第三外显子，第1560-1674位核苷酸为基因组DNA中该基因的第四外显子，第6251-6348位核苷酸为基因组DNA中该基因的第五外显子，第7032-7167位核苷酸为基因组DNA中该基因的第六外显子，第7588-7656位核苷酸为基因组DNA中该基因的第七外显子；D基因组(对应D染色体组)中的ARE1基因的核苷酸序列如序列表的序列9所示(编码序列表的序列8所示的蛋白质)，序列8中第1-588位核苷酸为基因组DNA中该基因的第一外显子，第780-865位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子，第964-1137位核苷酸为基因组DNA中该基因的第三外显子，第1304-1418位核苷酸为基因组DNA中该基因的第四外显子，第9014-9111位核苷酸为基因组DNA中该基因的第五外显子，第9789-9924位核苷酸为基因组DNA中该基因的第六外显子，第10459-10527位核苷酸为基因组DNA中该基因的第七外显子。
实施例2、利用gRNA1通过基因枪法获得基因编辑小麦
一、基因枪介导的小麦遗传转化
1、取授粉后12-14天的小麦品种郑麦7698的幼胚，作为外植体。将外植体接种于诱导培养基(MS+1mg/L VB1+150mg/L ASP+2mg/L 2，4-D)，22-25℃暗培养1-2天。
2、以重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos作为待转化DNA，采用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪对完成步骤1的幼胚进行轰击(Psi900，27.5cm Hg柱)，轰击后的幼胚转移到新的诱导培养基上，22-25℃暗培养2-3周。
3、取完成步骤2的外植体，依次进行再生、筛选和壮苗，得到T0代再生植株。
二、定点编辑的检测
1、对T0代再生植株的鉴定
供试植株为：112株步骤一得到的T0代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。
(1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，利用Cas9引物(Cas9-F和Cas9-R)进行PCR扩增检测小麦遗传转化是否成功。将检测到Cas9的成簇小麦分单株剪取叶片，提取DNA作为模板，使用ABD三个基因组特异性扩增引物进行扩增。三个基因组特异引物对分别为：TaARE1-A-F和TaARE1-A-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的扩增序列如序列5中的第304-1504位所示，小麦A基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)，TaARE1-B1-F和TaARE1-B1-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的扩增序列如序列7中的第21-665位所示，小麦B基因组中ARE1基因的部分第一外显子位于其中)，TaARE1-D1-F和TaARE1-D1-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的扩增序列如序列9中的第21-661位所示，小麦D基因组中ARE1基因的部分第一外显子位于其中)。
Cas9-F：CGACCTCGACAATCTCCTCG；
Cas9-R：GTAGTACGGGATGCGGAAGG；
TaARE1-A-F：CAGACGTGGAAGAGCAAGGCA；
TaARE1-A-R：ATGGCACACTTTCACAATTGAAC；
TaARE1-B1-F：CTCTAGCGGCGTTGCGT；
TaARE1-B1-R：CGCATTGGAAAGCGGTGCAT；
TaARE1-D1-F：CTCTAGCGGCGTTGCGG；
TaARE1-D1-R：CATTGGAAAGCGGTGCACGT。
(2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，将PCR扩增产物与郑麦7698的PCR产物等量混匀，然后依次进行加热变性和退火复性，然后采用T7 endonuclease I(T7EI)进行单酶切，然后进行电泳。T7EI能识别并切割不完全配对DNA。
(3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。
如果再生植株的PCR扩增产物只有一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，该再生植株为野生型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，另一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为杂合型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，均与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为双等位突变型。如果再生植株的PCR扩增产物为一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为纯合突变型。如果再生植株的PCR扩增产物为三种以上，该再生植株为嵌合型。杂合型、双等位突变型、纯合突变型、嵌合型的植株统称为编辑植株。
112株再生植株中，1株为编辑植株(0.89％)，111株为野生型(99.11％)。将该编辑植株命名为T1-44。
T1-44进行步骤(2)酶切后的电泳图见图1。图1中，M代表DL2000Marker；A代表T0代植株T1-44的A基因组酶切图，B代表T0代植株T1-44的B基因组酶切图，D代表T0代植株T1-44的D基因组酶切图，WT为Wild-type代表郑麦7698，+代表郑麦7698相应基因组进行步骤(2)酶切产物电泳，-代表郑麦7698相应基因组进行步骤(1)PCR扩增产物电泳。图中显示T1-44的A、B、D基因组经过步骤(1)获得的扩增产物均有与郑麦7698PCR产物不完全配对的DNA。
T1-44进行步骤(3)测序后的结果见图2。图2中：CCG为PAM位点，带下划线序列为靶序列，“d”表示碱基删除，“i”表示碱基插入，“s”表示碱基替换。
(4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因，采用TaU6-F和TaU6-R1组成的引物对鉴定gRNA1基因；采用Hpt-F和Hpt-R组成的引物对鉴定hptII基因。
TaU6-F：5’-GGAGCACATTGTTACTCACTGC-3’；TaU6-R1：5’-AACACAAGCTCCCACCCCC-3’。
Hpt-F：5’-CAATGACCGCTGTTATGCGG-3’；Hpt-R：5’-CTCGGAGGGCGAAGAATCTC-3’。
T1-44基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带gRNA1基因的情况和携带hptII基因的情况见表1。
表1为T1-44基因情况
Figure BDA0003153594100000081
注：d代表删除，d5代表删除5个核苷酸，依次类推；i代表插入，i133代表插入133个核苷酸，s代表替换，s1代表替换1个核苷酸，依次类推；wt代表野生型；“，”的前和后分别代表两条染色体；例如，wt，d5代表对于A基因组中的靶序列来说，一条染色体为wt，另一条染色体为d5。例如，d33代表对于B基因组中的靶序列来说，两条染色体均为d33。Y代表鉴定结果为阳性，N代表鉴定结果为阴性。
T1-44的A基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列5所示)，一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因删除第444-448位核苷酸(即序列5第444-448位)获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第441-473位核苷酸获得的突变基因，该突变基因未造成移码突变但删除了ARE1蛋白第147-156位氨基酸，D基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第435-459位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色体中的ARE1基因为第434位后插入133个核苷酸，删除第435-444位核苷酸，第448位核苷酸T替换为C获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失。
2、对T1代植株的鉴定
取T0代植株T1-44进行自交并收获T1代种子，培育T1代种子获得T1代植株。
按照步骤1的方法，对各个T1代植株进行鉴定。
部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图3(Actin为内参基因)。图3中，-代表郑老7698作为阴性对照，+代表重组质粒oCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos作为阳性对照，1-34代表不同的T1代植株。
各项鉴定的结果见表2。
表2为T1-44的T1代植株基因情况
Figure BDA0003153594100000091
注：相关符号的含义同表1；“；”前后分别代表不同植株；25wt，d5代表25株为wt，d5杂合突变；5d5代表5株为d5纯合突变，以此类推。
结果表明，T0代ARE1被定点突变的纯合株系B基因组可以稳定遗传T1代，对于定点编辑的ARE1的杂合突变株系和双等位突变株系通过严格的自交，T1分离情况不符合孟德尔遗传规律。在T1代可获得靶序列区域发生突变且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos)序列的编辑株系。
3、CRISPR/Cas9的脱靶分析
根据网上预测软件(https：//crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/)，对ARE1基因的gRNA1靶点可能存在的脱靶位点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物：T1-OFF1-F和T1-OFF1-R组成的引物对，T1-OFF2-F和T1-OFF2-R组成的引物对。
T1-OFF1-F：5’-CAAGGAAAGGCTATGAITTAGCG-3’；
T1-OFF1-R：5’-GCGTCACCAGACGTCAACGA-3’；
T1-OFF2-F：5’-GGAACACTCCAAGTAAGATGAGG-3’；
T1-OFF2-R：5’-CTTGCCCTGCTTCGACAC-3’。
以T1-44的基因组DNA为模板，分别采用T1-OFF1-F和T1-OFF1-R组成的引物对，T1-OFF2-F和T1-OFF2-R组成的引物对进行PCR扩增并测序。
脱靶位点的信息见表3。
表3为脱靶位点信息
Figure BDA0003153594100000092
结果表明，对于上述2个预测的可能脱靶位点，T1-44未检测到脱靶现象，即gRNA1在潜在脱靶位点未检测到脱靶现象。
实施例3、利用gRNA2通过基因枪法获得基因编辑小麦
一、基因枪介导的小麦遗传转化
用重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos代替重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos，按照实施例2的步骤一进行操作。
二、定点编辑的检测
1、对T0代再生植株的鉴定
供试植株为：89株步骤一得到的T0代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。
(1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，利用Cas9引物(Cas9-F和Cas9-R)进行PCR扩增检测小麦遗传转化是否成功。将检测到Cas9的成簇小麦分单株剪取叶片，提取DNA作为模板，使用ABD三个基因组特异性扩增引物进行扩增。三个基因组特异引物对分别为：TaARE1-A-F和TaARE1-A-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列10所示，小麦A基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)、TaARE1-B2-F和TaARE1-B2-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列7中的第1331-1927位所示，小麦B基因组中ARE1基因的第四外显子位于其中)、TaARE1-D2-F和TaARE1-D2-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列9中的第885-1488位所示，小麦D基因组中ARE1基因的第四外显子位于其中)。
TaARE1-A-F：CAGACGTGGAAGAGCAAGGCA；
TaARE1-A-R：ATGGCACACTTTCACAATTGAAC；
TaARE1-B2-F：GATCGGTAAATCTCCTCCACTTTCT；
TaARE1-B2-R：GGAAAACTTAGATCAGTTGACCTCTTCA；
TaARE1-D2-F：TGGCGTTCCATATCTTCCCTTC；
TaARE1-D2-R：AATGGCACACTTTTACAATTGAATACC。
(2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Bts CI进行单酶切，然后进行电泳。
(3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。
89株再生植株中，1株为编辑植株(1.12％)，88株为野生型(98.88％)。将该编辑植株命名为T2-5。
T2-5进行步骤(2)酶切后的电泳图见图4。图4中，M表示DL2000Marker；A代表T0代植株T2-5的A基因组酶切图；B代表T0代植株T2-5的B基因组酶切图；D代表T0代植株T2-5的D基因组酶切图；WT为Wild-type代表郑麦7698，+代表郑麦7698进行步骤(2)酶切产物电泳，-代表郑麦7698进行步骤(1)PCR扩增产物电泳。图中显示T2-5的A、B、D基因组扩增产物均存在基因编辑现象。
T2-5进行测序后的结果见图5。图5中：CCG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“d”表示碱基删除，“i”表示碱基插入，“s”表示碱基替换。
(4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因，采用TaU6-F和TaU6-R2组成的引物对鉴定gRNA2基因；采用Hpt-F和Hpt-R组成的引物对鉴定hptII基因。
TaU6-F：5’-GGAGCACATTGTTACTCACTGC-3’；TaU6-R2：5’-TTCATCCCTCAGCTCTACCC-3’。
T2-5基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带gRNA2基因的情况和携带hptII基因的情况见表4。
表4为T2-5基因情况
Figure BDA0003153594100000101
注：相关符号的含义同表1和表2。
T2-5的A基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第1337位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因删除第1311-1358位核苷酸(其中外显子部分为第1322-1358位核苷酸)获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)第1575位插入1个核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；D基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)第1319位后插入1个核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因第1319位T替换为A获得的突变基因，该突变基因在翻译时导致此处天冬氨酸变为谷氨酸。
2、对T1代植株的鉴定
取T0代植株T2-5，进行自交并收获T1代种子，培育T1代种子获得T1代植株。
按照步骤1的方法，对各个T1代植株进行鉴定。
部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图6(Actin为内参基因)。图6中，-代表郑麦7698作为阴性对照，+代表重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos作为阳性对照，1-20代表不同的T1代植株。
各项鉴定的结果见表5。
表5为T2-5的T1代植株基因情况
Figure BDA0003153594100000111
注：相关符号的含义同表1和表2。
结果表明，T0代ARE1被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T1代，对于定点编辑的ARE1的双等位突变株系通过严格的自交，T1分离情况符合孟德尔遗传规律，在T1代株系中没有发现新的变异类型。在T1代可获得靶序列区域发生突变且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos)序列的编辑株系。
3、CRISPR/Cas9的脱靶分析
根据网上预测软件(https：//crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/)，对ARE1基因的gRNA2靶点可能存在的脱靶位点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物：T2-OFF1-F和T2-OFF1-R组成的引物对，T2-OFF2-F和T2-OFF2-R组成的引物对，T2-OFF3-F和T3-OFF3-R组成的引物对。
T2-OFF1-F：5’-TCATACTCTGTTAGCACCATCATG-3’；
T2-OFF1-R：5’-CGTTGTTTAGTAAATGGAATATAGTGG-3’；
T2-OFF2-F：5’-GGAAGTGAGCCACTITGGAG-3’；
T2-OFF2-R：5’-TCAACATCTGCAACAACTGATCC-3’；
T2-OFF3-F：5’-GTCGCAACAGATGGCCAGAG-3’；
T2-OFF3-R：5’-TATAAAACCTTGTGCAGGGCAC-3’。
以T2-5的基因组DNA为模板，分别采用T2-OFF1-F和T2-OFF1-R组成的引物对，T2-OFF2-F和T2-OFF2-R组成的引物对，T2-OFF3-F和T3-OFF3-R组成的引物对进行PCR扩增并测序。
脱靶位点的信息见表6。
表6为脱靶位点信息
Figure BDA0003153594100000121
结果表明，对于上述3个预测可能脱靶位点，T2-5未检测到脱靶现象，即gRNA1在潜在脱靶位点未检测到脱靶现象。
实施例4、利用gRNA1和gRNA2通过基因枪法获得基因编辑小麦
一、基因枪介导的小麦遗传转化
用重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos代替重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos，按照实施例2的步骤一进行操作。
二、定点编辑的检测
1、对T0代再生植株的鉴定
供试植株为：97株步骤一得到的T0代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。
(1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，利用Cas9引物(Cas9-F和Cas9-R)进行PCR扩增检测小麦遗传转化是否成功。将检测到Cas9的成簇小麦分单株剪取叶片，提取DNA作为模板，使用ABD三个基因组特异性扩增引物进行扩增。三个基因组特异引物对分别为：TaARE1-A-F和TaARE1-A-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列10所示，小麦A基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)、TaARE1-B1-F和TaARE1-B2-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列7中的第21-1927位所示，小麦B基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)、TaARE1-D1-F和TaARE1-D2-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列9中的第21-1488位所示，小麦D基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)，三对引物用于检测大片段删除。
gRNA1和gRNA2分别检测的方法如实施例2和实施例3“二、(1)”中所示。
(2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，gRNA1和gRNA2分别检测的方法如实施例2和实施例3中“二、(2)”所示。
(3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。
97株再生植株中，1株为编辑植株(1.03％)，96株为野生型(98.97％)。将该编辑植株命名为T12-23。
T12-23用长片段引物进行PCR扩增检测大片段删除的电泳图见图7。图7中，M表示DL2000 Marker；A代表T0代植株T12-23的A基因组PCR扩增产物电泳、B代表T0代植株T12-23的B基因组PCR扩增产物电泳、D代表T0代植株T12-23的D基因组PCR扩增产物电泳。WT为Wild-type代表郑麦7698相应基因组PCR扩增产物电泳。图中显示T12-23的D基因组出现大片段删除情况。
T12-23 A基因组和B基因组酶切电泳图见图8。图8中，M表示DL2000Marker；A1代表T0代植株T12-23的A基因组gRNA1的酶切、B1代表T0代植株T12-23的B基因组gRNA1的酶切；A2代表T0代植株T12-23的A基因组gRNA2的酶切、B2代表T0代植株T12-23的B基因组gRNA2的酶切。WT为Wild-type代表郑麦7698，+代表郑麦7698相应基因组进行步骤(2)酶切产物电泳，-代表郑麦7698相应基因组进行步骤(1)电泳产物电泳。
T12-23进行测序后的结果见图9。图9中：CCG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“d”表示碱基删除，“i”表示碱基插入。
(4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因；采用TaU6-F和TaU6-R1组成的引物对鉴定gRNA1基因；采用TaU6-F和TaU6-R2组成的引物对鉴定gRNA2基因；采用Hpt-F和Hpt-R组成的引物对鉴定hptII基因。
T12-23基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带gRNA基因的情况和携带hptII基因的情况见表7。
表7为T12-23基因情况
Figure BDA0003153594100000131
注：d代表删除，d8代表删除8个核苷酸，d8-d7代表gRNA1靶点删除8个核苷酸，gRNA2靶点删除7个核苷酸，依次类推；其他相关符号的含义同表1和表2。
T12-23的A基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第441-448位核苷酸，第1331-1337位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因删除第448位核苷酸，第1338-1347位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；B基因组中一条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第448位核苷酸，第1568-1578位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第435-451位核苷酸，第1307-1319位获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第425-1360位核苷酸(其中外显子部分为第425-588位，第780-865位，第964-1137位，第1304-1360位)获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失。
2、对T1代植株的鉴定
取T0代植株T12-23，进行自交并收获T1代种子，培育T1代种子获得T1代植株。
按照步骤1的方法，对各个T1代植株进行鉴定。
部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图10(Actin为内参基因)。图10中，-代表郑麦7698作为阴性对照，+代表重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos作为阳性对照，1-15代表不同的T1代植株。
各项鉴定的结果见表8。
表8为T12-23的T1代植株基因情况
Figure BDA0003153594100000132
注：相关符号的含义同表1和表2。
结果表明，T0代ARE1被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T1代，对于定点编辑的ARR1的双等位突变株系通过严格的自交，B基因组T1分离情况符合孟德尔遗传规律。在T1代可获得靶序列区域发生突变且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos)序列的编辑株系。
3、CRISPR/Cas9的脱靶分析
根据网上预测软件(https：//crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/)，分别对ARE1基因的gRNA1和gRNA2靶点可能存在的脱靶位点进行预测及检测，步骤与实例2与实例3中相同。
T12-23的基因组DNA为模板，分别采用T1-OFF1-F和T1-OFF1-R组成的引物对，T1-OFF2-F和T1-OFF2-R组成的引物对，T2-OFF1-F和T2-OFF1-R组成的引物对，T2-OFF2-F和T2-OFF2-R组成的引物对，T2-OFF3-F和T3-OFF3-R组成的引物对进行PCR扩增并测序。
脱靶位点的信息见表9。
表9为靶点位点信息
Figure BDA0003153594100000141
结果表明，对于上述5个预测可能脱靶位点，T12-23未检测到脱靶现象，即gRNA1和gRNA2在潜在脱靶位点未检测到脱靶现象。
实施例5、不同浓度氮素处理溶液中的根尖表型及横切结构分析以及农艺性状统计
实施例2得到的T0代植株T1-44自交得到T1代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组wt野生型且B基因组d33纯合突变型且D基因组d25纯合突变型”并且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos)序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。该T2代植株的A基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列5所示)；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第441-473位核苷酸获得的突变基因；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第435-459位核苷酸获得的突变基因，该T2代植株命名为AABBdd。
实施例2得到的T0代植株T1-44自交得到T1代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d5纯合突变型且B基因组d33纯合突变型且D基因组d25纯合突变型”并且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos)序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。该T2代植株的A基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第444-448位核苷酸获得的突变基因；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第441-473位核苷酸获得的突变基因；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第435-459位核苷酸获得的突变基因，该T2代植株命名为aaBBdd。
实施例3得到的T0代植株T2-5自交得到T1代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d37纯合突变型且B基因组i1纯合突变型且D基因组s1纯合突变型”并且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos)序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。该T2代植株A基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第1311-1358位核苷酸获得的突变基因；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)第1575位插入1个核苷酸获得的突变基因；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因第1319位T替换为A获得的突变基因，该T2代植株命名为aabbDD。
实施例4得到的T0代植株T12-23自交得到T1代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d1-d10纯合突变型且B基因组d1-d11纯合突变型且D基因组d481纯合突变型”并且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos)序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。该T2代植株A基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第448位核苷酸，第1338-1347位核苷酸获得的突变基因；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第448位核苷酸，第1568-1578位核苷酸获得的突变基因；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第425-1360位核苷酸获得的突变基因，该T2代植株命名为aabbdd。
郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株，命名为AABBDD。
一、根尖表型及横切结构分析
培育上述选择的T1代植株，收获籽粒，该籽粒即为供试编辑植株种子和野生型对照植株种子。对籽粒进行消毒处理，萌发三天后，去除胚乳，分别在0mM，0.5mM，1.0mM和1.5mM的NH4NO3水培液中培养5天，截取不同类型的编辑供试植株和野生型幼苗的根尖1.0cm制片进行根尖结构观察；截取根尖上部0.5cm的区段用0.1％的亚甲基蓝溶液[w/v]染色1min后制作切片进行横切结构观察。
不同浓度氮素处理溶液中编辑供试植株与野生型的根尖表型及横切结构见图11。对于无氮供应(0mM NH4NO3)的野生型幼苗，根干细胞区的直径较小(图11中的A)。低浓度氮(0.5mM和1.0mM NH4NO3)处理可以促进根尖发育，增加根横截面直径(图11中的B、图11中的C)，但高浓度氮(1.5mM NH4NO3)对野生型根尖的发育没有影响或影响很小(图11中的D)。在氮饥饿条件下，突变株系根干细胞区的直径远大于野生型(图11中的A)。然而，不同品系对氮处理表现出不同的反应。在不同浓度的氮供应后，aaBBdd和aabbdd突变株系根干细胞区在氮饥饿(图11中的A-D)下保持相似的形态，而在低氮(0.5mMNH4NO3)处理下，与无氮供应的植物相比，来自AABBdd和aabbDD株系的主根显着增加(图11中的B)。与在氮饥饿或供应条件下的野生型相比，不同突变株系，尤其是AABBdd和aabbDD株系中的根皮质细胞显着增大，细胞数量增加(图11中的A-D)。说明与野生型对照植株相比，供试编辑植株对氮饥饿的耐受性增强，氮素利用率提高。
二、田间表型分析
对上述供试编辑植株与野生型蜡熟期的植株(图12中的A)、旗叶(图12中的B)、成熟期的植株(图12中的C)、田间植株表型(图12中的D)、成熟期的主穗(图12中的E)以及成熟期的籽粒的粒长和粒宽(图12中的F)表型进行观察，并对其主要农艺性状进行统计，统计结果见表10。
表10为农艺性状统计结果
Figure BDA0003153594100000151
Figure BDA0003153594100000161
注：表中数据为平均值±标准误(n＝10)，对于籽粒的粒长和粒宽，n＝20。使用双尾t检验将供试编辑植株每种基因型的表型数据与野生型AABBDD进行比较，*P＜0.05，差异显著；**P＜0.01差异极显著。
结果表明，供试编辑植株与野生型植株相比，不论是在蜡熟期还是成熟期，供试编辑植株叶片均比同等时期野生型植株绿色更明显，失绿明显延后，因此可以延缓植株衰老(图12中A-D)。供试编辑植株的千粒重有明显提高，其中野生型为47.6±0.3g，AABBdd、aabbDD、aaBBdd和aabbdd编辑株系的千粒重分别为54.1±0.4g、56.4±0.6g、53.6±0.6g和53.6±0.4g。对供试编辑植株与野生型成熟期的籽粒的粒长和粒宽进行观察(图12中F)，发现供试编辑植株的粒长显著增加，野生型粒长为6.7±0.1mm，AABBdd、aabbDD、aaBBdd和aabbdd编辑株系的粒长分别为7.1±0.1mm、7.3±0.2mm、7.1±0.2mm和7.0±0.1mm。AABBdd、aabbDD和aaBBdd株系的籽粒宽度显著增加，分别为4.0±0.1mm、4.1±0.1mm和3.9±0.1mm。AABBdd、aabbDD和aaBBdd株系的株高和分蘖数显著增加。对成熟期的主穗进行观察(图12中E)，发现AABBdd、aabbDD和aabbdd的主穗长度显著增加，分别为9.1±0.3cm、9.3±0.2cm和10.8±0.4cm。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
                         序列表
<110>  中国农业科学院作物科学研究所
<120>  通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的方法
<130>  212058
<160>  9
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  15756
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
gaattcgagc tcggtacccc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt       60
aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcccgatcta      120
gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt      180
ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata      240
acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga aattatatga      300
taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc caaatgtttg      360
aacgatcggg gaaattcgga tccccaatac ttcaatcgcc gccgagttgt gagaggtcga      420
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tcatcttctt gacgacctct tcggacggca cgttatcgga cttgcccctg ttcttgtcgg      1920
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ggtccacgtc gtagtcggag aggcggttga tgtccagctc ttggtccacg tacatgtcgc      2040
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cgtttaacag gctggcatta tctactcgaa acaagaaaaa tgtttcctta gtttttttaa      6000
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aataaaatag atgtactaaa aaaattagtc tataaaaacc attaacccta aaccctaaat      6180
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agtactatag attatattat tcgtagagta aagtttaaat atatgtataa agatagataa      6420
actgcacttc aaacaagtgt gacaaaaaaa atatgtggta attttttata acttagacat      6480
gcaatgctca ttatctctag agaggggcac gaccgggtca cgctgcactg caggaattcg      6540
atatcaagct tgaccaagcc cgttattctg acagttctgg tgctcaacac atttatattt      6600
atcaaggagc acattgttac tcactgctag gagggaatcg aactaggaat attgatcaga      6660
ggaactacga gagagctgaa gataactgcc ctctagctct cactgatctg ggtcgcatag      6720
tgagatgcag cccacgtgag ttcagcaacg gtctagcgct gggcttttag gcccgcatga      6780
tcgggctttt gtcgggtggt cgacgtgttc acgattgggg agagcaacgc agcagttcct      6840
cttagtttag tcccacctcg cctgtccagc agagttctga ccggtttata aactcgcttg      6900
ctgcatcaga cttggggcgg gggtgggagc ttgtgtttta gagctagaaa tagcaagtta      6960
aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttggt      7020
accctgcatg ggagaggcgg tttgcgtatt ggtttaaaca tagctaaact atcagtgttt      7080
gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taacggatat      7140
ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc caaccacagg      7200
gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg ctgctatagt gcagtcggct      7260
tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc taagttacgc      7320
gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt agtcgcataa      7380
agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat gaacaagagc gccgccgctg      7440
gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac caacgggccg      7500
aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc accaggcgcg      7560
accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctagccct ggcgacgttg tgacagtgac      7620
caggctagac cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg gacattgccg agcgcatcca      7680
ggaggccggc gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc      7740
cggccgcatg gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat      7800
cgaccgcacc cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg      7860
ccctaccctc accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg      7920
caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact      7980
tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga      8040
cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc      8100
atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg      8160
gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg      8220
catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc      8280
gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg      8340
cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac      8400
gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa      8460
cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc      8520
cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg      8580
gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag      8640
tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact      8700
tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg ggcaaccgcc gacctggtgg      8760
agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt      8820
cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg      8880
agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg      8940
ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc      9000
tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa      9060
aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt      9120
ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga      9180
tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc      9240
tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt      9300
tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat      9360
gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc      9420
cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc      9480
ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg      9540
caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg      9600
gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt      9660
aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg      9720
ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac      9780
cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca      9840
gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat      9900
ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc      9960
cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa     10020
gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg     10080
aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc     10140
tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat     10200
tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat     10260
tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca     10320
ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga     10380
gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag     10440
tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac     10500
ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt     10560
gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg     10620
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gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc     10740
taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct     10800
ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta     10860
cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta     10920
cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc     10980
ccacatcaag gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat     11040
gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg     11100
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cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg     11220
caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc     11280
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta     11340
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag     11400
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg     11460
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg     11520
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg     11580
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga     11640
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc     11700
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt     11760
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact     11820
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg     11880
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt     11940
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt     12000
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct     12060
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg     12120
gtcatgcatt ctaggtacta aaacaattca tccagtaaaa tataatattt tattttctcc     12180
caatcaggct tgatccccag taagtcaaaa aatagctcga catactgttc ttccccgata     12240
tcctccctga tcgaccggac gcagaaggca atgtcatacc acttgtccgc cctgccgctt     12300
ctcccaagat caataaagcc acttactttg ccatctttca caaagatgtt gctgtctccc     12360
aggtcgccgt gggaaaagac aagttcctct tcgggctttt ccgtctttaa aaaatcatac     12420
agctcgcgcg gatctttaaa tggagtgtct tcttcccagt tttcgcaatc cacatcggcc     12480
agatcgttat tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct attcgtatag     12540
ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata cagctcgata     12600
atcttttcag ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc atcggcctca     12660
ctcatgagca gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt tggaacaggc     12720
agctttcctt ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt caacatcata ggtggtccct     12780
ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac cagcttatat     12840
accttagcag gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt     12900
ttcaattccg gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct tttctacagt     12960
atttaaagat accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg     13020
cattctaaaa ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt     13080
ataacatagt atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct     13140
gtcatcgtta caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag     13200
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attttattga tagaagtatt ttacaaatac aaatacatac taagggtttc ttatatgctc     13560
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tattatggag aaactcgagc ttgtcgatcg acagatccgg tcggcatcta ctctatttct     13680
ttgccctcgg acgagtgctg gggcgtcggt ttccactatc ggcgagtact tctacacagc     13740
catcggtcca gacggccgcg cttctgcggg cgatttgtgt acgcccgaca gtcccggctc     13800
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caaccaagct ctgatagagt tggtcaagac caatgcggag catatacgcc cggagtcgtg     13920
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cgaaatccgc gtgcacgagg tgccggactt cggggcagtc ctcggcccaa agcatcagct     14160
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acacatgggg atcagcaatc gcgcatatga aatcacgcca tgtagtgtat tgaccgattc     14280
cttgcggtcc gaatgggccg aacccgctcg tctggctaag atcggccgca gcgatcgcat     14340
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tgtcaagcac ttccggaatc gggagcgcgg ccgatgcaaa gtgccgataa acataacgat     14520
ctttgtagaa accatcggcg cagctattta cccgcaggac atatccacgc cctcctacat     14580
cgaagctgaa agcacgagat tcttcgccct ccgagagctg catcaggtcg gagacgctgt     14640
cgaacttttc gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt gagttcaggc tttttcatat     14700
ctcattgccc cccggatctg cgaaagctcg agagagatag atttgtagag agagactggt     14760
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atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg     15000
atggcatttg taggtgccac cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc     15060
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cctttggtct tctgagactg tatctttgat attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc     15180
caccatgtta tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc     15240
cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg     15300
aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac     15360
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taccctttgt tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt     15480
cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac catgttggca agctgctcta gccaatacgc     15540
aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc     15600
gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca     15660
ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa     15720
caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattac                         16280
<210>  2
<211>  103
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
gggtagagct gagggatgaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc  60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt                   105
<210>  3
<211>  527
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
agctatgttt aaaccaatac gcaaaccgcc tctcccatgc agggtaccaa aaaaagcacc  60
gactcggtgc cactttttca agttgataac ggactagcct tattttaact tgctatttct 120
agctctaaaa cttcatccct cagctctacc ccaagtctga tgcagcaagc gagtttataa 180
accggtcaga actctgctgg acaggcgagg tgggactaaa ctaagaggaa ctgctgcgtt 240
gctctcccca atcgtgaaca cgtcgaccac ccgacaaaag cccgatcatg cgggcctaaa 300
agcccagcgc tagaccgttg ctgaactcac gtgggctgca tctcactatg cgacccagat 360
cagtgagagc tagagggcag ttatcttcag ctctctcgta gttcctctga tcaatattcc 420
tagttcgatt ccctcctagc agtgagtaac aatgtgctcc ttgataaata taaatgtgtt 480
gagcaccaga actgtcagaa taacgggctt ggtcaagctt gatatcg               527
<210>  4
<211>  421
<212>  PRT
<213>  小麦(Triticum aestivum)
<400>  4
Met Ser Cys Tyr Val Val Ser Ser Ser Gly Val Ala Ile Trp Phe Ala
1               5                   10                  15
Val Glu Glu Arg Ile Gly His Arg Arg Phe Cys Ala Cys Lys Met Phe
            20                  25                  30
Asp Val Gly Pro Gln Arg Arg Arg Val Gly Arg Arg Leu Val Gly Phe
        35                  40                  45
Ala Lys Lys Arg Arg Arg Ser Lys Arg Gln Gln Pro Trp Trp Lys Ala
    50                  55                  60
Trp Phe Ser Asp Trp Asn Asp Glu Glu Glu Ser Leu Ala Gly Trp Arg
65                  70                  75                  80
Glu Asp Asp Glu Leu Leu Gln Gln Val Val Ser Asn Glu Asp Leu Ser
                85                  90                  95
Glu Asp Asp Lys Phe Gln Thr Trp Lys Ser Lys Ala Glu Ala Ile Val
            100                 105                 110
Asp Leu Arg Glu Ala Gln Gln Gly Ala Glu Asn Ala Glu Gly Arg Ser
        115                 120                 125
Trp Glu Asp Trp Ile Gly Trp Gly Ser Thr Ser Gly Asp Gly Asp Trp
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Asp Gln Ile Thr Asp Asp Pro Thr Glu
145                 150                 155                 160
Ile Val Arg Asp Lys Gly Ile Ala Glu Ala Phe Arg Asp Ser Asn Asp
                165                 170                 175
Glu Asp Tyr Asn Asp Met Leu Phe Glu Asp Arg Val Phe Leu Tyr Ala
            180                 185                 190
Ser Thr Lys Ser Ala Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ile Val Val Pro Trp
        195                 200                 205
Val Leu Asp Leu Leu Val His Asp Tyr Val Met Met Pro Phe Leu Asp
    210                 215                 220
Arg Tyr Val Glu Lys Val Pro Leu Ala Ala Glu Met Leu Asp Val Arg
225                 230                 235                 240
Arg Ser Gln Lys Ile Gln Met Ile Lys Asp Leu Asn Ile Glu Lys Ala
                245                 250                 255
Arg Phe Arg Phe Glu Val Glu Ile Gly Lys Ser Pro Pro Leu Ser Asp
            260                 265                 270
Glu Glu Phe Trp Ser Glu Leu Arg Glu Lys Ala Val Glu Leu Arg Asp
        275                 280                 285
Glu Trp Arg Leu Glu Asn Arg Gln Ala Phe Ala Asn Ile Trp Ser Asp
    290                 295                 300
Met Val Tyr Gly Val Ala Leu Phe Leu Leu Met Tyr Phe Asn Gln Ser
305                 310                 315                 320
Lys Val Ala Ile Ile Lys Phe Thr Gly Tyr Lys Leu Leu Asn Asn Ile
                325                 330                 335
Ser Asp Ser Gly Lys Ala Phe Leu Ile Ile Leu Val Ser Asp Ile Leu
            340                 345                 350
Leu Gly Tyr His Ser Glu Ala Gly Trp His Ser Leu Val Glu Ile Ile
        355                 360                 365
Leu Asp His Tyr Gly Leu Glu Thr Asp Gln Ala Ala Val Thr Phe Phe
    370                 375                 380
Val Cys Leu Val Pro Val Ala Leu Asp Val Phe Ile Lys Phe Trp Val
385                 390                 395                 400
Tyr Lys Tyr Leu Pro Arg Leu Ser Pro Ser Val Gly Asn Ile Leu Asp
                405                 410                 415
Glu Ile Arg Arg His
            420
<210>  5
<211>  8023
<212>  DNA
<213>  小麦(Triticum aestivum)
<400>  5
atgagttgct acgtggtcag ctctagcggc gttgcgatct ggttcgccgt agaggagagg  60
atcgggcacc ggaggttttg cgcatgcaag atgttcgatg tcggtcccca gaggagaagg 120
gtggggaggc gcctggtggg ttttgccaag aagaggaggc gttccaagag gcagcagcca 180
tggtggaagg cgtggttctc tgattggaac gatgaggaag agagcctcgc cggctggagg 240
gaggatgatg aattgctcca gcaggttgtt agcaacgaag acctgtcgga ggatgacaag 300
tttcagacgt ggaagagcaa ggcagaggcg attgtcgacc tgcgggaagc ccagcagggt 360
gccgaaaatg cagaagggcg gtcatgggag gattggatag gttggggcag cacgtccggc 420
gatggtgatt ggggcggggg tgggagcttg tcggaccaga taactgatga tccgacggag 480
atagtgaggg acaagggcat cgctgaagct tttagggact ctaatgatga agattacaac 540
gacatgttgt ttgaggaccg ggtttttcta tacgcttcga cgaaatcggt acttctagca 600
ctagttacaa gatataattt tctcatcatc tttcctacca attgtgcacc gctttccaat 660
gcggtctact attataccta gtactataac aataactcaa accttattac cgtgcaacat 720
tgctcaagat ccttttcgat gaagtcatac agatgttggg gaactggatc taacaagaaa 780
attgtactct gcaggccaaa ttcctagcat tgttgatcgt tgttccatgg gtgttggatc 840
ttctagtaca tgactatgtt atgatgccat ttctagacag gtaagtcatc ttactgctat 900
ggcgttccat atcttccctt tcctctgttt tcttttttgt tgaaagaatc gattatgctg 960
gtcattgtac aataacaggt atgtcgagaa ggtaccactc gccgctgaaa tgcttgatgt      1020
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ttttgaagta gagattggta aatctcctcc actttccgat gaggagttct ggtcagagtt      1140
gcgggaaaaa gcgtgaggct attattcttt cttgccaagt tgttgcttat attagtgccc      1200
ttgcaatttt gacatgaaca ttcatcttct cctctgtgaa aatgatagtc aggaacatcg      1260
ttttgcggcc cgataaattt atctggttaa ctgtaacggg tctgctctgt tactttaaca      1320
gggtagagct gagggatgaa tggagattag aaaaccgaca agcatttgca aatatctggt      1380
ctgatatggt ttatggggtt gccctattcc ttcttatgta ctttaaccag agtaaagtaa      1440
gtacatacat catataagca gcttcttatt tttttgatta tgttcaattg tgaaagtgtg      1500
ccattaagtt cgtatagcat tcctcttgat ggcgtgtacc atgtggatct gtgttttttt      1560
ttctctgtaa agtaaatcag aagtcatcaa aattgctgcg ctattaggcc tagcgaataa      1620
ctaattacct ttggcggtta agactaatgg tgtgtcaaat attcgaagag gtgaactgat      1680
ctaaagtttt tcctgatctg ttcatacttg ataatgtttt gttttaaggt agtgtcgtat      1740
taacatcacc tcaatttcaa tgataccttt tattttacta tcatcagtaa aagtgtgcgg      1800
gtgtctgtaa aacgtgatgg aagcgtctca acccccaaca gggagcccac gttgtgttat      1860
attgatcgag cgagagagag cctctcaaga gatacaggag ggttcggttg gcaaacaacc      1920
gtacagagat cttacagaga gaaatagaga taagaagtta aaacagaaaa tatcatcatg      1980
aaggtattga caaactttat ttactgcaaa ggaaatatca ggcctggtga gagtcaagta      2040
ctgaagtgca cctaccaaac ttctggactt agtaccatcc tcttgattca agagttctcc      2100
ttcagcaagt gagagcttct ctgaactgga caagggtgtt ggagagggtt tacaaccctg      2160
taagacaact ctgctcaaaa ggtcagtggc atatttttcc tgagagagat gaaggccacc      2220
ttctctattt ctcttaacct caataccaag aaagaaatgc aagtcaccta gatccttgag      2280
agcaaattct gagttcaaat ctgatcaaga gagctttgac tgcttcattt gacgagcttg      2340
tgacaatgat atcattaaca tagataggta caaaaattga agtatttgac ttattgtaaa      2400
tgaacagaga tttatcagat tttgaaggag tgaagccaag ttgttgcaac ttcgcactta      2460
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atatgtgaga cagtttgttt ttatctacaa acccaggagg ttgcttcata tatacttcct      2580
cttccagaac accatgaagg aacgcattct gcacatctag ctgtctgaga ctccatcctc      2640
tggacacagc aatagataga acaagacgaa tagtagcagc cttaacaaca ggactgaaag      2700
tgtcttcata atctatgcca tacctctgtt tgaaaccttt agccacaagc ctggctttat      2760
atcaatctat cgtaccatca gaccttcttt ttatcctgaa aacccacttg caatcaatca      2820
catttttacc ttgctgtgag ggaactaaat gccacgtgtt atttccctga agagcctgat      2880
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gttctcccgt ggaagcagcc aaaccatatt taattttgta atttgtaggc tgaataacac      3000
ctgctcgaag acatgtgtat ggtggtgtag cagcgcatgg ctgcgcagaa gatccgagcc      3060
ctgctgcgga agaatcagcg gcaacagctt cctcggacga agctgcggat cccaaagaaa      3120
catcgcccac acccgccgga tcctctgtgg ccgaggacat cacagaggat tcgagagacg      3180
gtgcagatgg tctgggcgct gcaggcgaag ccgactcgga tcgggtgccc acacgtgaca      3240
gggacggggc ccgccgggtg taaaccggtg gctcgggcgg gaagcgcgtg gtcgacgggg      3300
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tggcgtgggt cggaggaggg cgcctgacta gacgacacct gttgggaagt ggatcccgaa      3480
gcagatcctg ccggctttga cgcggtcagg gccgcggatc ccgaaggcga tcgcggcagc      3540
tctagcgtga cagctaccgg tgcaacaccg tttttgtccc aaattgcacc attatgacca      3600
ccattttcag cggtgtttgc acctgtatca tcagactcaa aaggcggatt agaagcatta      3660
gtcaatattt ggatcattac aatcatcact acccacatga tcaactccag agagatgaga      3720
aggaaggaga agaatctcct tgcgaaggag agcaccgaca ttgggatgaa gtttggaaaa      3780
aggaaactga gtttcaacga acacaacatc atgagagata tacacacggc cagaggaaac      3840
atcaaggcac ttaacaccct tgtgttgtgc actgtaacca aggaagacac attgttgaga      3900
tcgaaacata agcttgcgag aattgtaagg atgaagtttt gaccaacaag cacaaccaaa      3960
aacacgaagt gtagtataat caggtatgac ctgtagaagg cgttcagtgg gagtttcatt      4020
ggctatggtg tgactaggcc acatattgat aagatgagcg gccgtaagaa acactttgtc      4080
ccaaaatttt aaaggcatgg aagctgaagc tagaacctag aagggcaaga cctacttcaa      4140
caatgtgacg atgtgttcct ctctgcagaa ccgttttgtt gatgagcatg gaggcaagac      4200
acgtgatgag aatacctatc ttttgaaaaa aagaatttag cttctcatat tcaccacccc      4260
agtccgattg cggcaatgat tttgctatca aacttacgtt caacaagagc ttgaaagtta      4320
tgaaagactt ggaacactcc agaacgtgtt ttaagaaggt atatccatgt gtacttgcta      4380
taatcatcaa caaaacttac ataataagaa tgcccaccaa cagaagtggg cgctggaccc      4440
caaacattag aaaaaataag ttgcaatggt ttggtagaca cactagtaga aataggatat      4500
gccaattgat gactttttgc tctttggcat gaatcacaaa tagtttctga atttccctca      4560
ccaacaacta cgagtttatt tttgctaaga atttgatgaa cggtagcaaa caagggatgg      4620
cctaaacagt tgtgccacct ttcagcagga tgcttgatgg caccagactt gtttattgag      4680
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cgccaccaga gtagccacca ttagggttgt tgtagccgcc gccagatcgt gatccgccgc      5400
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cttcttatgt tctgttattt ttatcatgtg catgtaaacg agggctacta ttattttgtt      7320
ttaccatctg tccttgttta attaccgcct gtgatcttgt cgactatatg aacagcatct      7380
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ttgaccacta tggactggaa accgatcaag ctgcagtcac ctttttcgtt tgtctggttc      7500
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gctacaaggg acatgccact atatttaata acataaagaa aaccatattt gctgttagaa      7620
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acctagtgtg ggaaacatct tggatgaaat aaggcgtcac tag                  8289
<210>  6
<211>  421
<212>  PRT
<213>  小麦(Triticum aestivum)
<400>  6
Met Ser Cys Tyr Val Val Ser Ser Ser Gly Val Ala Phe Trp Phe Ala
1               5                   10                  15
Val Glu Glu Arg Ile Gly His Arg Arg Val Cys Ala Cys Lys Met Phe
            20                  25                  30
Asp Val Gly Pro Gln Arg Arg Arg Val Gly Arg Arg Leu Val Gly Phe
        35                  40                  45
Ala Lys Lys Arg Arg Arg Ser Lys Arg Gln Gln Pro Trp Trp Lys Ala
    50                  55                  60
Trp Phe Ser Asp Trp Asn Asp Glu Glu Glu Ser Leu Ala Gly Trp Arg
65                  70                  75                  80
Glu Asp Asp Glu Leu Leu Gln Gln Val Val Ser Asn Glu Asp Leu Ser
                85                  90                  95
Glu Asp Asp Lys Phe Gln Thr Trp Lys Ser Lys Ala Glu Ala Ile Val
            100                 105                 110
Asp Leu Arg Glu Ala Gln Gln Asp Ala Glu Asn Ala Glu Gly Arg Ser
        115                 120                 125
Trp Glu Asp Trp Ile Gly Trp Gly Ser Thr Ser Gly Asp Gly Asp Trp
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Asp Gln Ile Thr Asp Asp Pro Thr Glu
145                 150                 155                 160
Ile Val Arg Asp Lys Gly Ile Ala Glu Ala Phe Arg Asp Ser Ile Asp
                165                 170                 175
Glu Asp Tyr Asn Asp Met Leu Phe Glu Asp Arg Val Phe Leu Tyr Ala
            180                 185                 190
Ser Thr Lys Ser Ala Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ile Val Val Pro Trp
        195                 200                 205
Val Leu Asp Leu Leu Val His Asp Tyr Val Met Met Pro Phe Leu Asp
    210                 215                 220
Arg Tyr Val Glu Lys Val Pro Leu Ala Ala Glu Met Leu Asp Val Arg
225                 230                 235                 240
Arg Ser Gln Lys Ile Gln Met Ile Lys Asp Leu Asn Ile Glu Lys Ala
                245                 250                 255
Arg Phe Arg Phe Glu Val Glu Ile Gly Lys Ser Pro Pro Leu Ser Asp
            260                 265                 270
Glu Glu Phe Trp Ser Glu Leu Arg Glu Lys Ala Val Glu Leu Arg Asp
        275                 280                 285
Glu Trp Arg Leu Glu Asn Arg Gln Ala Phe Ala Asn Ile Trp Ser Asp
    290                 295                 300
Met Val Tyr Gly Val Ala Leu Phe Leu Leu Met Tyr Phe Asn Gln Ser
305                 310                 315                 320
Lys Val Ala Met Ile Lys Phe Thr Gly Tyr Lys Leu Leu Asn Asn Ile
                325                 330                 335
Ser Asp Ser Gly Lys Ala Phe Leu Ile Ile Leu Val Ser Asp Ile Leu
            340                 345                 350
Leu Gly Tyr His Ser Glu Ala Gly Trp His Ser Leu Val Glu Ile Ile
        355                 360                 365
Leu Asp His Tyr Gly Leu Glu Thr Asp Gln Ala Ala Val Thr Phe Phe
    370                 375                 380
Val Cys Leu Val Pro Val Ala Leu Asp Val Phe Ile Lys Phe Trp Val
385                 390                 395                 400
Tyr Lys Tyr Leu Pro Arg Leu Ser Pro Ser Val Gly Asn Ile Leu Asp
                405                 410                 415
Glu Ile Arg Arg His
            420
<210>  7
<211>  7656
<212>  DNA
<213>  小麦(Triticum aestivum)
<400>  7
atgagttgct acgtggtcag ctctagcggc gttgcgttct ggttcgccgt agaggagagg  60
atcgggcacc ggagggtttg cgcatgcaag atgttcgatg tcggtcccca gaggaggagg 120
gtggggaggc gcctggtggg ttttgccaag aagaggaggc gttccaagag gcagcagcca 180
tggtggaagg cgtggttctc tgattggaac gatgaggaag agagcctcgc cggctggagg 240
gaggatgatg aattgctcca gcaggttgtt agcaacgaag acctgtcgga ggatgacaag 300
tttcagacat ggaagagcaa ggccgaggcg attgtcgacc tgcgggaagc ccagcaggat 360
gccgaaaatg cagaagggcg gtcatgggag gattggatag gttggggcag cacatccggc 420
gatggtgact ggggcggggg tgggagcttg tcggaccaga taactgatga tccgacggag 480
atagtgaggg acaagggcat cgctgaagct tttagggact ctattgatga agattacaac 540
gacatgttgt ttgaggaccg ggtttttcta tacgcttcga cgaaatcggt actcttctag 600
cactagttat aagatataat tttctcatca tctttactac caatcatgca ccgctttcca 660
atgcggtcta ctattatact acctctgtcc tggtttatta gtccctttag tattttgtgc 720
aaaactttga ccttagattt aattaaaaaa tgttaatgca tgtaaccaaa aataatatct 780
ctcaaaacta tgttcaaata cgaatccagg gatataattt ttgctaacat gcattattat 840
ttacttaatt aaatctatgg tcaaagtttg gcacaaaata ctatggggac caataaacca 900
ggacggaggt agtacctagt actataacaa taacttaaac cttattaccg tgcaacattg 960
ctctagatcc ttttcgatgt agtcatacag atgttgggga actggatcta acaagaaaat      1020
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ctagtacatg actatgttat gatgccattt ctagacaggt aattcatctt actgctatgg      1140
cgttccatat cttccctttc ctctgttttc ttttttgttg aaagaatcga ttacgttggt      1200
cattgtacaa taacaggtat gtcgagaagg taccactcgc cgctgaaatg cttgatgtaa      1260
gacgcagcca gaagattcag atgataaagg acctaaatat tgagaaagca agattccgtt      1320
ttgaagtaga gatcggtaaa tctcctccac tttctgatga ggagttctgg tcagagttgc      1380
gggaaaaagc gtgaggctat tattctttct tgccaagttg ttgcttatat tagcgccctt      1440
gcaattttga catgaacatt catcttctcc tctgtgaaaa tgatagtcag gaacatcgtt      1500
tcgcggcccg ataaatttat ctggttaact gtaacgggtc tgctctgtta ctttaacagg      1560
gtagagctga gggatgaatg gagattagaa aaccgacaag catttgcaaa tatctggtct      1620
gatatggttt atggggttgc cctattcctt cttatgtact ttaaccagag taaagtaagt      1680
acatacatca tataagcagc ttcttatttt tttgattata ttcaattgta aaagtgtgca      1740
attaagttcg tatagcattc ctcttgatgg cgtgtaccac gtggatctgt gtttttttct      1800
ctgtaaagta aatcagaagt catcaaaatt gctgcgctgt taggcctagc gaataactaa      1860
ttaacgttgg cggttaagac taatgttgtg tcaaatattt gaagaggtca actgatctaa      1920
gttttccctg atctgttcat acttgataat gttttgtttt aagatagtgt tgtattaaca      1980
tcacctcaat ttcaatgata ccttttattt tactatcatc agtaaaagtg tgcgggtgtc      2040
tgtaaaacgt gatggaagcg tctgaacccc caacagggag cccatgttgt gttatattga      2100
tcgagcgaga gagagcctct cgaaagatat aggagggttc ggttggcaaa caaccgtaca      2160
gagatcttac agagagaaat agagataaga agttaaaaca gaaaagacta tctctatggc      2220
gcaagacaag tccttggcgc ctgctacatc tctacaatat ctcatgatta acaccctccc      2280
ttaatctgaa cttcgtaagt ttagattacg tttaaactct tcaaagggtc ctgtagctag      2340
tgcctttgtg aagccatccg caatttggtc cttggagtga acaaaccgaa tatccaattc      2400
tttatttgca acttgttccc tcacaaaatg ataatcaatc tcaatatgct tggtacgagc      2460
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tgtttgagtg tgatatattc caagttcctt gagcatggac tttacccaga taatttctgc      2580
tgttgcattc gccagtgcct tgtattctgc ctcagtactg gatctagaaa ctgtggcatg      2640
tttctttgca cactaggaga tcaagttagg accaaagaaa actgcaaaac caccagttga      2700
ccttctgtca tctaagcaac ctgcccagtc agaatcagaa aaagcactaa caagtgtaga      2760
tgttgacttg ctgaaagtta acccaacact caatgtgtgt ctaacatatc tcaatatgcg      2820
ttttgcgaca gtccaatgag cagtggttgg tgcatgaagg tattgacaag ctttatttac      2880
tgcaaaggaa atatcaggcc tggtgagagt caagtactga agtgcaccta ccaaacttct      2940
gtacttagtc aagagttctc cttcagcaag tgagagcttc tctgaactgg acaagggtgt      3000
tggagagggt ttacaaccct gtaagccaag tctgctcaaa aggtcagtgg catatttttc      3060
ctgagagaga tgaagaccac cttctctagt tctcttaacc tcaataccaa gaaagaaatg      3120
caagtcatct agatccttga gagcaaattc tgagttcaaa tctgataaga gagctctaac      3180
tgcttcattt gacgagcttg tgacaatgat atcatcaaca tagataggta caaaaattga      3240
agtatttgac ttattgtaaa tgaacaaaga tgtatcagat tttgaaggag tgaagccaag      3300
ttgttgcaac tttgcactta ggcgagaata gcatgctctg ggagcttgtt tcagtccata      3360
aaaagatctg tcaagcctgc gtatgtgaga cagtttgttt ttatctacaa acccaggagg      3420
ttgcttcata tatacttcct cttccagaac accatgaagg aacgcattct gtacatctag      3480
ctgtctgaga ctccatcctc tagacacaac aatagataga acaagacgaa tagtagcagc      3540
cttaacaaca tgactgaaag tgtcttcata atctatgcca tatctctgtt tgaaaccttt      3600
agcctcaagc ctggctttat attgacttat cgtaccatca taccttcttt ttatcctgaa      3660
aacccacttg caatcaatca catttttacc ttgccgtgag ggaactaaat gccacgtgtt      3720
atttctatga agaacctaat actcatcctc catagcttgc ttccaatttg gaccagcgag      3780
ggcctcctga tatgtacggg gttctcccgt ggaagcagcc aaaccatatt taattttcta      3840
atttgtaggc tgaataacac ctgctcgaag acgtgtgtat ggtggtgtag cagcgcatgg      3900
ctgcgcagaa gatccgagcc ctactacgga agaaccagcg gcagtagctt cctcggacga      3960
agctgcggat cccgaagaaa catcacgcac acctgccgga tcctctgtgg ccgaggacaa      4020
cacaggggaa gtgggcgcta gaccccaaac attagaaaaa ataagttgca attgtttggt      4080
agacacacta gtagaaatag gatatgccaa ttgatgaatt tttgctcttt ggcatgaatc      4140
acaaacagtt tctgaatttc tctcaccaac aaccgggagt ttatttttgc taagaatttg      4200
atgaacggta gcaaacgagg gatggcctaa acggctgtgc cacctttcag cagaaagctt      4260
gatggcacca tagacttgtt tactgagttg acaatactga ggaagcaatg catagagccc      4320
ttgcacacat gtgcccctat ggagaacttt cttcgtgacc tgatccttga tcaaaagaaa      4380
aaagggtgaa actcaagaaa gacattgtta tcaagggcaa tatgatgaac gaaaagaagt      4440
gtttttgaag cattaggaac atgcaatatt ccgttaagaa ctagactttt atgtggggtt      4500
ttgataatta attgaccaat atgactaatc tccatacctg caccattggc tgcggtgtag      4560
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gtgggaaaca tcttggatga aataaggcgt cactag                          7910
<210>  8
<211>  421
<212>  PRT
<213>  小麦(Triticum aestivum)
<400>  8
Met Ser Cys Tyr Val Val Ser Ser Ser Gly Val Ala Val Trp Phe Ala
1               5                   10                  15
Val Glu Glu Arg Ile Gly His Arg Arg Val Cys Ala Cys Lys Met Phe
            20                  25                  30
Asp Val Gly Pro Gln Arg Arg Arg Val Gly Arg Arg Leu Val Gly Phe
        35                  40                  45
Ala Lys Lys Arg Arg Arg Ser Lys Arg Gln Gln Pro Trp Trp Lys Ala
    50                  55                  60
Trp Phe Ser Asp Trp Asn Asp Glu Glu Glu Ser Leu Ala Gly Trp Arg
65                  70                  75                  80
Glu Asp Asp Glu Leu Leu Gln Gln Val Val Ser Asn Glu Asp Leu Ser
                85                  90                  95
Glu Asp Asp Lys Phe Gln Thr Trp Lys Ser Lys Ala Glu Ala Ile Val
            100                 105                 110
Asp Leu Arg Glu Ala Gln Gln Asp Ala Glu Asn Ala Glu Gly Arg Ser
        115                 120                 125
Trp Glu Asp Trp Ile Gly Trp Gly Ser Thr Ser Gly Asp Gly Asp Trp
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Asp Gln Ile Thr Asp Asp Pro Thr Glu
145                 150                 155                 160
Ile Val Arg Asp Lys Gly Ile Ala Glu Ala Phe Arg Asp Ser Ile Asp
                165                 170                 175
Glu Asp Tyr Asn Asp Met Leu Phe Glu Asp Arg Val Phe Leu Tyr Ala
            180                 185                 190
Ser Thr Lys Ser Ala Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ile Val Val Pro Trp
        195                 200                 205
Val Leu Asp Leu Leu Val His Asp Tyr Val Met Met Pro Phe Leu Asp
    210                 215                 220
Arg Tyr Val Glu Lys Val Pro Leu Ala Ala Glu Met Leu Asp Val Arg
225                 230                 235                 240
Arg Ser Gln Lys Ile Gln Met Ile Lys Asp Leu Asn Ile Glu Lys Ala
                245                 250                 255
Arg Phe Arg Phe Glu Val Glu Ile Gly Lys Ser Pro Pro Leu Ser Asp
            260                 265                 270
Glu Glu Phe Trp Ser Glu Leu Arg Glu Lys Ala Val Glu Leu Arg Asp
        275                 280                 285
Glu Trp Arg Leu Glu Asn Arg Gln Ala Phe Ala Asn Ile Trp Ser Asp
    290                 295                 300
Met Val Tyr Gly Val Ala Leu Phe Leu Leu Met Tyr Phe Asn Gln Ser
305                 310                 315                 320
Lys Val Ala Met Ile Lys Phe Thr Gly Tyr Lys Leu Leu Asn Asn Ile
                325                 330                 335
Ser Asp Ser Gly Lys Ala Phe Leu Ile Ile Leu Val Ser Asp Ile Leu
            340                 345                 350
Leu Gly Tyr His Ser Glu Ala Gly Trp His Ser Leu Val Glu Ile Ile
        355                 360                 365
Leu Asp His Tyr Gly Leu Glu Thr Asp Gln Ala Ala Val Thr Phe Phe
    370                 375                 380
Val Cys Leu Val Pro Val Ala Leu Asp Val Phe Ile Lys Phe Trp Val
385                 390                 395                 400
Tyr Lys Tyr Leu Pro Arg Leu Ser Pro Ser Val Gly Asn Ile Leu Asp
                405                 410                 415
Glu Ile Arg Arg His
            420
<210>  9
<211>  10527
<212>  DNA
<213>  小麦(Triticum aestivum)
<400>  9
atgagttgct acgtggtcag ctctagcggc gttgcggtct ggttcgccgt agaggagagg  60
atcgggcacc ggagggtttg cgcatgcaag atgttcgatg tcggtcccca gaggaggagg 120
gtggggaggc gcctggtggg ttttgccaag aagaggaggc gttccaagag gcagcagcca 180
tggtggaagg cgtggttctc tgattggaac gatgaggaag agagcctcgc cggctggagg 240
gaggatgatg aattgctcca gcaggttgtt agcaacgaag acctgtcgga ggatgacaag 300
tttcagacgt ggaagagcaa ggccgaggcg attgtcgacc tgcgggaagc ccagcaggat 360
gccgaaaatg cagaagggcg gtcatgggag gattggatag gttggggcag cacgtccggc 420
gatggtgatt ggggcggggg tgggagcttg tcggaccaga taacggatga tccgacggag 480
atagtgaggg acaagggcat cgctgaagct tttagggact ctattgatga agattacaac 540
gacatgttgt ttgaggaccg ggtttttcta tacgcttcga cgaaatcggt acttctagca 600
ctaattataa gatataattt tctcatcatc tttactacca aacgtgcacc gctttccaat 660
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cagcttctta ttatttttta tggtattcaa ttgtaaaagt gtgccattaa gttcgtatag      1500
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gctggagcat aaattcaaca gtgtccacgt tttctgtgca tgataatggc tttttttctc      8940
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atcttggatg aaataaggcg tcactag                                   10877

Claims (9)

1.制备转基因小麦的方法，其特征在于：包括使受体小麦基因组的ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低，获得所述转基因小麦，
所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：
（1）与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的产量提高；
（2）与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的衰老延缓；
（3）与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的氮素利用率提高；
采用基因编辑的方式使所述受体小麦基因组的ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低；
所述基因编辑具体采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统中的gRNA的靶序列为序列1第6915-6934位核苷酸所示和/或序列2第1-20位核苷酸所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述CRISPR/Cas9系统为如下任一种：
（b1）包括特异gRNA和Cas9蛋白；所述特异gRNA中的靶序列识别区如序列表的序列1中第6915-6934位核苷酸所示和/或序列表的序列2中第1-20位核苷酸所示；
（b2）包括特异DNA分子和Cas9蛋白的编码基因，所述特异DNA分子转录得到（b1）中所述特异gRNA；
（b3）包括具有（b2）中所述特异DNA分子的质粒和具有Cas9蛋白的编码基因的质粒；
（b4）包括特异重组质粒，所述特异重组质粒表达（b2）中所述特异DNA分子和Cas9蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述特异gRNA为核苷酸序列如序列表中序列1的第6915-7017位核苷酸所示DNA分子和/或如序列表中序列2所示DNA分子转录获得的gRNA；
或，所述特异DNA分子为所述特异gRNA的编码基因或表达所述特异gRNA的表达盒。
4.制备转基因小麦的方法，其特征在于：为如下1）或2）：
1）采用权利要求1-3任一项中的CRISPR/Cas9系统对受体小麦进行基因编辑，得到转基因小麦；
2）将权利要求2中所述特异重组质粒导入受体小麦，得到转基因小麦；
所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：
（1）与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的产量提高；
（2）与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的衰老延缓；
（3）与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的氮素利用率提高。
5.一种制备无转基因的基因编辑小麦的方法，其特征在于：包括
1）按照权利要求1-3的方法制备所述转基因小麦或按照权利要求4的方法制备转基因小麦；
2）将所述转基因小麦自交，得到自交后代；
3）从所述自交后代中筛选无转基因的基因编辑小麦；
所述无转基因的基因编辑小麦具有下述至少一种特性的：
（1）与受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的产量提高；
（2）与受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的衰老延缓；
（3）与受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的氮素利用率提高。
6.DNA分子，其特征在于：
所述DNA分子为在序列表中序列5所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第444-448位核苷酸缺失、第1311-1358位核苷酸缺失、第448位核苷酸缺失和第1338-1347位核苷酸缺失；
所述DNA分子为在序列表中序列7所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第441-473位核苷酸缺失、第1575位插入1个核苷酸、第448位核苷酸缺失和第1568-1578位核苷酸缺失；
所述DNA分子为在序列表中序列9所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第435-459位核苷酸缺失、第1319位T替换为A和第425-1360位核苷酸缺失。
7.权利要求2或3中所述的特异gRNA或权利要求2或3中所述的特异DNA分子。
8.用于基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统如权利要求1-3任一项中所述的CRISPR/Cas9系统。
9.权利要求1-5任一项所述的方法、权利要求6所述的DNA分子、权利要求7所述的特异gRNA、权利要求7所述的特异DNA分子和/或权利要求8所述的CRISPR/Cas9系统的应用，其特征在于：所述应用为如下任一种应用：
（1）在提高小麦产量中的应用；
（2）在延缓小麦衰老中的应用；
（3）在提高小麦氮素利用率中的应用
（4）在小麦育种中的应用。
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