CN113564177A - 通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的方法。本发明提供了一种制备基因编辑小麦的方法，包括使受体小麦基因组ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低，获得所述基因编辑小麦，所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：(1)与所述受体小麦相比，所述基因编辑小麦的产量提高；(2)与所述受体小麦相比，所述基因编辑小麦的衰老延缓；(3)与所述受体小麦相比，所述基因编辑小麦的氮素利用率提高。本发明实施例利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑小麦氮素利用效率相关基因ARE1基因，通过造成移码突变，敲除了小麦ARE1基因，获得了产量明显提高的新一代小麦新种质。

Description

通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的方法。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.，2n＝42，AABBDD)是最重要的粮食作物之一，养活了世界三分之一以上的人口。氮素是植物生长的基本营养元素，也是植物尤其是农作物生长发育的主要限制因素。氮素不足会严重影响作物产量，因此农业生产上一般需大量施用氮肥促进农作物生长，从而达到粮食增产的目的。然而，小麦、玉米、大米、大麦和高粱等谷物对氮肥的利用效率不足40％。不能被充分利用的氮肥会通过浸出和挥发而流失到环境中，从而导致包括气候变化、土壤酸化及水体富营养化等一系列的环境问题。因此，提高氮素利用率(NUE)是农业可持续发展的有效策略，不仅可以降低化肥使用成本，还可以促进作物高产稳产。

CRISPR/Cas9系统是目前已经发展成熟的第三代基因编辑器，该系统因其简便性、多功能性、稳定性和成本低等优势广泛应用于各种生物的基因工程，也迅速成为作物品种遗传改良的有效工具。

发明内容

本发明提供了一种制备转基因小麦的方法，包括使所述受体小麦基因组的ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低，获得所述转基因小麦，

所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：

(1)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的产量提高；

(2)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的衰老延缓；

(3)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的氮素利用率提高。

所述ARE1蛋白活性和/或丰度降低具体可通过抑制或降低ARE1基因表达实现。

可选地，根据上述的方法，所述使受体小麦基因组的ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低采用基因编辑的方式。所述基因编辑具体采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统中的gRNA的靶序列为序列1第6915-6934位核苷酸所示和/或序列2第1-20位核苷酸所示。

例如所述CRISPR/Cas9系统为如下任一种：

(b1)包括特异gRNA和Cas9蛋白；所述特异gRNA中的靶序列识别区如序列表的序列1中第6915-6934位核苷酸所示和/或序列表的序列2中第1-20位核苷酸所示；

(b2)包括特异DNA分子和Cas9蛋白的编码基因，所述特异DNA分子转录得到所述特异gRNA；

(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒和具有所述Cas9蛋白的编码基因的质粒；

(b4)包括特异重组质粒，所述特异重组质粒表达所述特异DNA分子和所述Cas9蛋白的编码基因。

所述特异gRNA可为核苷酸序列如序列表中序列1的第6915-7017位核苷酸所示DNA分子和/或如序列表中序列2所示DNA分子转录获得的gRNA。

所述特异DNA分子可为所述特异gRNA的编码基因，例如其核苷酸序列如序列表中序列1的第6915-7017位核苷酸所示和/或如序列表中序列2所示；也可为表达所述特异gRNA的表达盒，例如其核苷酸序列如序列表中序列1的第6552-7017位核苷酸所示和/或所述特异DNA分子的核苷酸序列与序列表中序列3的第49-514位核苷酸序列反向互补。

所述Cas9蛋白的编码基因的核苷酸序列可与序列表中序列1的第392-4522位核苷酸反向互补。

所述特异重组质粒例如为下述实施例制备的重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos、重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos或重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos。

可选地，根据上述的方法，所述基因编辑为将上述CRISPR/Cas9系统导入所述受体小麦。

可选地，所述突变为如下至少一种突变：

核苷酸序列如序列5所示的ARE1基因第444-448位核苷酸缺失、第1311-1358位核苷酸缺失、第448位核苷酸缺失和/或第1338-1347位核苷酸缺失；

核苷酸序列如序列7所示的ARE1基因第441-473位核苷酸缺失、第1575位插入1个核苷酸、第448位核苷酸缺失和/或第1568-1578位核苷酸缺失；

核苷酸序列如序列9所示的ARE1基因第435-459位核苷酸缺失、第1319位T替换为A和/或第425-1360位核苷酸缺失。

本发明还提供了一种制备转基因小麦的方法，为如下1)或2)：

1)采用上述CRISPR/Cas9系统对受体小麦进行基因编辑，得到转基因小麦；

2)将上述特异重组质粒导入受体小麦，得到转基因小麦；

所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：

(1)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的产量提高；

(2)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的衰老延缓；

(3)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的氮素利用率提高。

本发明还提供了一种制备无转基因的基因编辑小麦的方法，包括1)按照上述方法制备转基因小麦；2)将所述转基因小麦自交，得到自交后代；3)从所述自交后代中筛选无转基因的基因编辑小麦；

所述无转基因的基因编辑小麦具有下述至少一种特性的：

(1)与所述受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的产量提高；

(2)与所述受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的衰老延缓；

(3)与所述受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的氮素利用率提高。

所述基因编辑小麦可为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组至少一基因组在靶序列区域发生突变，且为纯合突变型。所述无转基因可为不携带上述特异重组质粒序列。

所述无转基因的基因编辑小麦可为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组至少一基因组在靶序列区域发生突变，且为纯合突变型；不携带上述特异重组质粒序列。

所述无转基因的基因编辑小麦具体可为：实施例2得到的T₀代植株T1-44自交得到T₁代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组wt野生型且B基因组d33纯合突变型且D基因组d25纯合突变型”并且不携带载体序列的T₁代植株。

所述无转基因的基因编辑小麦具体可为：实施例2得到的T₀代植株T1-44自交得到T₁代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d5纯合突变型且B基因组d33纯合突变型且D基因组d25纯合突变型”并且不携带载体序列的T₁代植株。

所述无转基因的基因编辑小麦具体可为：实施例3得到的T₀代植株T2-5自交得到T1代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d37纯合突变型且B基因组i1纯合突变型且D基因组s1纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株。

所述无转基因的基因编辑小麦具体可为：实施例4得到的T₀代植株T12-23自交得到T₁代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d1-d10纯合突变型且B基因组d1-d11纯合突变型且D基因组d481纯合突变型”并且不携带载体序列的T₁代植株。

本发明还提供了DNA分子。所述DNA分子可为在序列表中序列5所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第444-448位核苷酸缺失和第1311-1358位核苷酸缺失、第448位核苷酸缺失和第1338-1347位核苷酸缺失。所述DNA分子也可为在序列表中序列7所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第441-473位核苷酸缺失、第1575位插入1个核苷酸、第448位核苷酸缺失和第1568-1578位核苷酸缺失。所述DNA分子也为在序列表中序列9所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第435-459位核苷酸缺失、第1319位T替换为A和第425-1360位核苷酸缺失。

上述的特异gRNA、上述的特异DNA分子和上述CRISPR/Cas9系统也属于本发明的保护范围之内。

本发明还提供了上述的方法、上述的DNA分子、上述的特异gRNA、上述的特异DNA分子、上述的CRISPR/Cas9系统、ARE1基因、ARE1蛋白或降低ARE1蛋白活性和/或丰度的物质的应用，所述应用为如下任一种应用：

(1)在提高小麦产量中的应用；

(2)在延缓小麦衰老中的应用；

(3)在提高小麦氮素利用率中的应用

(4)在小麦育种中的应用。

上述应用中，降低ARE1蛋白活性和/或丰度的物质可为抑制或降低ARE1蛋白的编码基因(即ARE1基因)表达的物质。所述抑制或降低ARE1基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。例如，所述抑制或降低ARE1基因表达的物质可为上述CRISPR/Cas9系统。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

上文中，所述ARE1基因可为如下1)或2)或3)或4)或5)或6)或7)或8)的DNA分子：

1)DNA分子包含第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子、第六外显子和第七外显子，第一外显子序列如序列5的第1-588位核苷酸所示，第二外显子序列如序列5的第795-880位核苷酸所示，第三外显子序列如序列5的第979-1152位核苷酸所示，第四外显子序列如序列5的第1322-1436位核苷酸所示，第五外显子序列如序列5的第6619-6716位核苷酸所示，第六外显子序列如序列5的第7397-7532位核苷酸所示，第七外显子序列如序列5的第7955-8023位核苷酸所示；

2)DNA分子包含第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子、第六外显子和第七外显子，第一外显子序列如序列7的第1-588位核苷酸所示，第二外显子序列如序列7的第1022-1118位核苷酸所示，第三外显子序列如序列7的第1217-1390位核苷酸所示，第四外显子序列如序列7的第1560-1674位核苷酸所示，第五外显子序列如序列7的第6251-6348位核苷酸所示，第六外显子序列如序列7的第7032-7167位核苷酸所示，第七外显子序列如序列7的第7588-7656位核苷酸所示；

3)DNA分子包含第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子、第六外显子和第七外显子，第一外显子序列如序列9的第1-588位核苷酸所示，第二外显子序列如序列9的第780-865位核苷酸所示，第三外显子序列如序列9的第964-1137位核苷酸所示，第四外显子序列如序列9的第1304-1418位核苷酸所示，第五外显子序列如序列9的第9014-9111位核苷酸所示，第六外显子序列如序列9的第9789-9924位核苷酸所示，第七外显子序列如序列9的第10459-10527位核苷酸所示；

4)序列表中序列5所示的DNA分子；

5)序列表中序列7所示的DNA分子；

6)序列表中序列9所示的DNA分子；

7)在严格条件下与1)至6)中任一限定的DNA序列杂交且编码所述ARE1蛋白的DNA分子；

8)来源于小麦且与1)至6)中任一限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且编码所述ARE1蛋白的DNA分子。

上文中，所述ARE1基因编码的ARE1蛋白可为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列4或序列6或序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质；

(a3)来源于小麦且与(a1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

上文中，提高小麦产量可为提高小麦分蘖数、籽粒的千粒重、粒长和/或粒宽。

上文中，所述受体小麦具体可为小麦品种郑麦7698。

上文中，术语“同一性”指与天然序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明实施例以ARE1基因为研究对象，在郑麦7698品种中分离克隆小麦的ARE1同源基因，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除载体，利用基因枪的方法对该基因进行定向敲除，获得不同编辑类型的无转基因小麦株系。

本发明实施例利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑小麦氮素利用效率相关基因ARE1基因，通过造成移码突变，敲除了小麦ARE1基因，获得了产量明显提高的新一代小麦新种质。在田间试验中，所有不含转基因的突变体系对氮饥饿的耐受性增强，衰老延迟和产量增加。与野生型对照相比，AABBdd和aabbDD突变系表现出显著增强的NUE、延迟衰老、增加产量并且没有生长缺陷。本发明对于减少氮肥使用，增加小麦产量，确保粮食安全和农业可持续发展具有重要意义。

附图说明

图1为实施例2中1株再生植株进行酶切后的电泳图。

图2为实施例2中1株再生植株进行测序后的结果。

图3为实施例2中部分T₁代植株进行步骤(4)的鉴定结果。

图4为实施例3中1株再生植株进行酶切后的电泳图。

图5为实施例3中1株再生植株进行测序后的结果。

图6为实施例3中部分T₁代植株进行步骤(4)的鉴定结果。

图7为实施例4中1株再生植株进行PCR扩增后的电泳图。

图8为实施例4中1株再生植株进行酶切后的电泳图。

图9为实施例4中1株再生植株进行测序后的结果。

图10为实施例4部分T₁代植株进行步骤(4)的鉴定结果。

图11为实施例2，实施例3和实施例4中T2代植株在不同浓度氮素处理溶液中的根尖表型及横切结构结果。

图12为实施例2，实施例3和实施例4中T2代植株田间表型结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小麦品种郑麦7698。提及“郑麦7698”的文献(在文献中称为“Zhengmai7698”)：GuoG，LeiM，Wang Y，Song B，Yang J，et al.Accumulation ofAs，Cd，and Pb in sixteenwheat cultivars grownin contaminated soils and associated health riskassessment[J].Journal of Environmental Research andPublic Health，2018，15(11)：2601.。郑麦7698用WT表示，A基因组中的相应序列用WT-A表示，B基因组中的相应序列用WT-B表示，D基因组中的相应序列用WT-D表示。

实施例1、制备重组质粒

人工合成重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos、重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos和重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos。重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos、重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos和重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos均为环形质粒。

重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，第115-367位核苷酸与NOS终止子反向互补，第392-4522位核苷酸与Cas9蛋白的编码基因反向互补，第4544-6533位核苷酸与Ubi启动子反向互补，第6552-6914位核苷酸为U6启动子，第6915-7017位核苷酸为gRNA1的编码基因(其中第6915-6934位核苷酸为靶序列识别区，第6935-7010位核苷酸为Cas9结合区(scaffold)，第7011-7017位核苷酸为polyT)。重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos表达gRNA1，gRNA1的靶序列位于小麦ARE1基因的第一外显子中。

重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos是将重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos序列中的第6915-7017位核苷酸(即gRNA1的编码基因)替换为gRNA2的编码基因序列(如序列2所示)所获得的重组质粒。序列2中第1-20位核苷酸为靶序列识别区，第21-96位核苷酸为Cas9结合区(scafford)，第97-103位核苷酸为polyT。重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos表达gRNA2，gRNA2的靶序列位于小麦ARE1基因的第四外显子中。

重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos是在重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos序列中的第6位核苷酸后插入重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos序列中的第6539-7065位核苷酸的反向互补序列(即U6启动子、gRNA2的编码基因及其旁侧序列的反向互补序列，如序列3所示)所获得的重组质粒。序列3中，第1-48位核苷酸与序列1中的第7018-7065位核苷酸反向互补，第49-151位核苷酸与gRNA2的编码基因反向互补(其中第132-151位核苷酸为靶序列识别区的反向互补)，第152-514位核苷酸与U6启动子反向互补，第515-527位核苷酸与序列1中的第6539-6551位核苷酸反向互补。重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos表达gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的靶序列位于小麦ARE1基因的第一外显子和第四外显子中。

小麦基因组中，A基因组(对应A染色体组)中的ARE1基因的核苷酸序列如序列表的序列5所示(编码序列表的序列4所示的蛋白质)，序列5中第1-588位核苷酸为基因组DNA中该基因的第一外显子，第795-880位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子，第979-1152位核苷酸为基因组DNA中该基因的第三外显子，第1322-1436位核苷酸为基因组DNA中该基因的第四外显子，第6619-6716位核苷酸为基因组DNA中该基因的第五外显子，第7397-7532位核苷酸为基因组DNA中该基因的第六外显子，第7955-8023位核苷酸为基因组DNA中该基因的第七外显子；B基因组(对应B染色体组)中的ARE1基因的核苷酸序列如序列表的序列7所示(编码序列表的序列6所示的蛋白质)，序列7中第1-588位核苷酸为基因组DNA中该基因的第一外显子，第1022-1118位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子，第1217-1390位核苷酸为基因组DNA中该基因的第三外显子，第1560-1674位核苷酸为基因组DNA中该基因的第四外显子，第6251-6348位核苷酸为基因组DNA中该基因的第五外显子，第7032-7167位核苷酸为基因组DNA中该基因的第六外显子，第7588-7656位核苷酸为基因组DNA中该基因的第七外显子；D基因组(对应D染色体组)中的ARE1基因的核苷酸序列如序列表的序列9所示(编码序列表的序列8所示的蛋白质)，序列8中第1-588位核苷酸为基因组DNA中该基因的第一外显子，第780-865位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子，第964-1137位核苷酸为基因组DNA中该基因的第三外显子，第1304-1418位核苷酸为基因组DNA中该基因的第四外显子，第9014-9111位核苷酸为基因组DNA中该基因的第五外显子，第9789-9924位核苷酸为基因组DNA中该基因的第六外显子，第10459-10527位核苷酸为基因组DNA中该基因的第七外显子。

实施例2、利用gRNA1通过基因枪法获得基因编辑小麦

一、基因枪介导的小麦遗传转化

1、取授粉后12-14天的小麦品种郑麦7698的幼胚，作为外植体。将外植体接种于诱导培养基(MS+1mg/L VB1+150mg/L ASP+2mg/L 2，4-D)，22-25℃暗培养1-2天。

2、以重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos作为待转化DNA，采用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪对完成步骤1的幼胚进行轰击(Psi900，27.5cm Hg柱)，轰击后的幼胚转移到新的诱导培养基上，22-25℃暗培养2-3周。

3、取完成步骤2的外植体，依次进行再生、筛选和壮苗，得到T0代再生植株。

二、定点编辑的检测

1、对T₀代再生植株的鉴定

供试植株为：112株步骤一得到的T₀代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。

(1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，利用Cas9引物(Cas9-F和Cas9-R)进行PCR扩增检测小麦遗传转化是否成功。将检测到Cas9的成簇小麦分单株剪取叶片，提取DNA作为模板，使用ABD三个基因组特异性扩增引物进行扩增。三个基因组特异引物对分别为：TaARE1-A-F和TaARE1-A-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的扩增序列如序列5中的第304-1504位所示，小麦A基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)，TaARE1-B1-F和TaARE1-B1-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的扩增序列如序列7中的第21-665位所示，小麦B基因组中ARE1基因的部分第一外显子位于其中)，TaARE1-D1-F和TaARE1-D1-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的扩增序列如序列9中的第21-661位所示，小麦D基因组中ARE1基因的部分第一外显子位于其中)。

Cas9-F：CGACCTCGACAATCTCCTCG；

Cas9-R：GTAGTACGGGATGCGGAAGG；

TaARE1-A-F：CAGACGTGGAAGAGCAAGGCA；

TaARE1-A-R：ATGGCACACTTTCACAATTGAAC；

TaARE1-B1-F：CTCTAGCGGCGTTGCGT；

TaARE1-B1-R：CGCATTGGAAAGCGGTGCAT；

TaARE1-D1-F：CTCTAGCGGCGTTGCGG；

TaARE1-D1-R：CATTGGAAAGCGGTGCACGT。

(2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，将PCR扩增产物与郑麦7698的PCR产物等量混匀，然后依次进行加热变性和退火复性，然后采用T7 endonuclease I(T7EI)进行单酶切，然后进行电泳。T7EI能识别并切割不完全配对DNA。

(3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。

如果再生植株的PCR扩增产物只有一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，该再生植株为野生型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，另一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为杂合型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，均与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为双等位突变型。如果再生植株的PCR扩增产物为一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为纯合突变型。如果再生植株的PCR扩增产物为三种以上，该再生植株为嵌合型。杂合型、双等位突变型、纯合突变型、嵌合型的植株统称为编辑植株。

112株再生植株中，1株为编辑植株(0.89％)，111株为野生型(99.11％)。将该编辑植株命名为T1-44。

T1-44进行步骤(2)酶切后的电泳图见图1。图1中，M代表DL2000Marker；A代表T₀代植株T1-44的A基因组酶切图，B代表T₀代植株T1-44的B基因组酶切图，D代表T₀代植株T1-44的D基因组酶切图，WT为Wild-type代表郑麦7698，+代表郑麦7698相应基因组进行步骤(2)酶切产物电泳，-代表郑麦7698相应基因组进行步骤(1)PCR扩增产物电泳。图中显示T1-44的A、B、D基因组经过步骤(1)获得的扩增产物均有与郑麦7698PCR产物不完全配对的DNA。

T1-44进行步骤(3)测序后的结果见图2。图2中：CCG为PAM位点，带下划线序列为靶序列，“d”表示碱基删除，“i”表示碱基插入，“s”表示碱基替换。

(4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因，采用TaU6-F和TaU6-R1组成的引物对鉴定gRNA1基因；采用Hpt-F和Hpt-R组成的引物对鉴定hptII基因。

TaU6-F：5’-GGAGCACATTGTTACTCACTGC-3’；TaU6-R1：5’-AACACAAGCTCCCACCCCC-3’。

Hpt-F：5’-CAATGACCGCTGTTATGCGG-3’；Hpt-R：5’-CTCGGAGGGCGAAGAATCTC-3’。

T1-44基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带gRNA1基因的情况和携带hptII基因的情况见表1。

表1为T1-44基因情况

注：d代表删除，d5代表删除5个核苷酸，依次类推；i代表插入，i133代表插入133个核苷酸，s代表替换，s1代表替换1个核苷酸，依次类推；wt代表野生型；“，”的前和后分别代表两条染色体；例如，wt，d5代表对于A基因组中的靶序列来说，一条染色体为wt，另一条染色体为d5。例如，d33代表对于B基因组中的靶序列来说，两条染色体均为d33。Y代表鉴定结果为阳性，N代表鉴定结果为阴性。

T1-44的A基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列5所示)，一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因删除第444-448位核苷酸(即序列5第444-448位)获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第441-473位核苷酸获得的突变基因，该突变基因未造成移码突变但删除了ARE1蛋白第147-156位氨基酸，D基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第435-459位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色体中的ARE1基因为第434位后插入133个核苷酸，删除第435-444位核苷酸，第448位核苷酸T替换为C获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失。

2、对T₁代植株的鉴定

取T₀代植株T1-44进行自交并收获T₁代种子，培育T₁代种子获得T₁代植株。

按照步骤1的方法，对各个T₁代植株进行鉴定。

部分T₁代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图3(Actin为内参基因)。图3中，-代表郑老7698作为阴性对照，+代表重组质粒oCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos作为阳性对照，1-34代表不同的T₁代植株。

各项鉴定的结果见表2。

表2为T1-44的T₁代植株基因情况

注：相关符号的含义同表1；“；”前后分别代表不同植株；25wt，d5代表25株为wt，d5杂合突变；5d5代表5株为d5纯合突变，以此类推。

结果表明，T₀代ARE1被定点突变的纯合株系B基因组可以稳定遗传T₁代，对于定点编辑的ARE1的杂合突变株系和双等位突变株系通过严格的自交，T₁分离情况不符合孟德尔遗传规律。在T1代可获得靶序列区域发生突变且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos)序列的编辑株系。

3、CRISPR/Cas9的脱靶分析

根据网上预测软件(https：//crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/)，对ARE1基因的gRNA1靶点可能存在的脱靶位点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物：T1-OFF1-F和T1-OFF1-R组成的引物对，T1-OFF2-F和T1-OFF2-R组成的引物对。

T1-OFF1-F：5’-CAAGGAAAGGCTATGAITTAGCG-3’；

T1-OFF1-R：5’-GCGTCACCAGACGTCAACGA-3’；

T1-OFF2-F：5’-GGAACACTCCAAGTAAGATGAGG-3’；

T1-OFF2-R：5’-CTTGCCCTGCTTCGACAC-3’。

以T1-44的基因组DNA为模板，分别采用T1-OFF1-F和T1-OFF1-R组成的引物对，T1-OFF2-F和T1-OFF2-R组成的引物对进行PCR扩增并测序。

脱靶位点的信息见表3。

表3为脱靶位点信息

结果表明，对于上述2个预测的可能脱靶位点，T1-44未检测到脱靶现象，即gRNA1在潜在脱靶位点未检测到脱靶现象。

实施例3、利用gRNA2通过基因枪法获得基因编辑小麦

一、基因枪介导的小麦遗传转化

用重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos代替重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos，按照实施例2的步骤一进行操作。

二、定点编辑的检测

1、对T₀代再生植株的鉴定

供试植株为：89株步骤一得到的T0代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。

(1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，利用Cas9引物(Cas9-F和Cas9-R)进行PCR扩增检测小麦遗传转化是否成功。将检测到Cas9的成簇小麦分单株剪取叶片，提取DNA作为模板，使用ABD三个基因组特异性扩增引物进行扩增。三个基因组特异引物对分别为：TaARE1-A-F和TaARE1-A-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列10所示，小麦A基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)、TaARE1-B2-F和TaARE1-B2-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列7中的第1331-1927位所示，小麦B基因组中ARE1基因的第四外显子位于其中)、TaARE1-D2-F和TaARE1-D2-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列9中的第885-1488位所示，小麦D基因组中ARE1基因的第四外显子位于其中)。

TaARE1-A-F：CAGACGTGGAAGAGCAAGGCA；

TaARE1-A-R：ATGGCACACTTTCACAATTGAAC；

TaARE1-B2-F：GATCGGTAAATCTCCTCCACTTTCT；

TaARE1-B2-R：GGAAAACTTAGATCAGTTGACCTCTTCA；

TaARE1-D2-F：TGGCGTTCCATATCTTCCCTTC；

TaARE1-D2-R：AATGGCACACTTTTACAATTGAATACC。

(2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，用限制性内切酶Bts CI进行单酶切，然后进行电泳。

(3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。

89株再生植株中，1株为编辑植株(1.12％)，88株为野生型(98.88％)。将该编辑植株命名为T2-5。

T2-5进行步骤(2)酶切后的电泳图见图4。图4中，M表示DL2000Marker；A代表T₀代植株T2-5的A基因组酶切图；B代表T₀代植株T2-5的B基因组酶切图；D代表T₀代植株T2-5的D基因组酶切图；WT为Wild-type代表郑麦7698，+代表郑麦7698进行步骤(2)酶切产物电泳，-代表郑麦7698进行步骤(1)PCR扩增产物电泳。图中显示T2-5的A、B、D基因组扩增产物均存在基因编辑现象。

T2-5进行测序后的结果见图5。图5中：CCG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“d”表示碱基删除，“i”表示碱基插入，“s”表示碱基替换。

(4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因，采用TaU6-F和TaU6-R2组成的引物对鉴定gRNA2基因；采用Hpt-F和Hpt-R组成的引物对鉴定hptII基因。

TaU6-F：5’-GGAGCACATTGTTACTCACTGC-3’；TaU6-R2：5’-TTCATCCCTCAGCTCTACCC-3’。

T2-5基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带gRNA2基因的情况和携带hptII基因的情况见表4。

表4为T2-5基因情况

注：相关符号的含义同表1和表2。

T2-5的A基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第1337位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因删除第1311-1358位核苷酸(其中外显子部分为第1322-1358位核苷酸)获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)第1575位插入1个核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；D基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)第1319位后插入1个核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因第1319位T替换为A获得的突变基因，该突变基因在翻译时导致此处天冬氨酸变为谷氨酸。

2、对T₁代植株的鉴定

取T₀代植株T2-5，进行自交并收获T₁代种子，培育T₁代种子获得T₁代植株。

按照步骤1的方法，对各个T₁代植株进行鉴定。

部分T₁代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图6(Actin为内参基因)。图6中，-代表郑麦7698作为阴性对照，+代表重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos作为阳性对照，1-20代表不同的T₁代植株。

各项鉴定的结果见表5。

表5为T2-5的T₁代植株基因情况

注：相关符号的含义同表1和表2。

结果表明，T₀代ARE1被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T₁代，对于定点编辑的ARE1的双等位突变株系通过严格的自交，T1分离情况符合孟德尔遗传规律，在T₁代株系中没有发现新的变异类型。在T₁代可获得靶序列区域发生突变且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos)序列的编辑株系。

3、CRISPR/Cas9的脱靶分析

根据网上预测软件(https：//crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/)，对ARE1基因的gRNA2靶点可能存在的脱靶位点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物：T2-OFF1-F和T2-OFF1-R组成的引物对，T2-OFF2-F和T2-OFF2-R组成的引物对，T2-OFF3-F和T3-OFF3-R组成的引物对。

T2-OFF1-F：5’-TCATACTCTGTTAGCACCATCATG-3’；

T2-OFF1-R：5’-CGTTGTTTAGTAAATGGAATATAGTGG-3’；

T2-OFF2-F：5’-GGAAGTGAGCCACTITGGAG-3’；

T2-OFF2-R：5’-TCAACATCTGCAACAACTGATCC-3’；

T2-OFF3-F：5’-GTCGCAACAGATGGCCAGAG-3’；

T2-OFF3-R：5’-TATAAAACCTTGTGCAGGGCAC-3’。

以T2-5的基因组DNA为模板，分别采用T2-OFF1-F和T2-OFF1-R组成的引物对，T2-OFF2-F和T2-OFF2-R组成的引物对，T2-OFF3-F和T3-OFF3-R组成的引物对进行PCR扩增并测序。

脱靶位点的信息见表6。

表6为脱靶位点信息

结果表明，对于上述3个预测可能脱靶位点，T2-5未检测到脱靶现象，即gRNA1在潜在脱靶位点未检测到脱靶现象。

实施例4、利用gRNA1和gRNA2通过基因枪法获得基因编辑小麦

一、基因枪介导的小麦遗传转化

用重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos代替重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos，按照实施例2的步骤一进行操作。

二、定点编辑的检测

1、对T₀代再生植株的鉴定

供试植株为：97株步骤一得到的T₀代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。

(1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，利用Cas9引物(Cas9-F和Cas9-R)进行PCR扩增检测小麦遗传转化是否成功。将检测到Cas9的成簇小麦分单株剪取叶片，提取DNA作为模板，使用ABD三个基因组特异性扩增引物进行扩增。三个基因组特异引物对分别为：TaARE1-A-F和TaARE1-A-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列10所示，小麦A基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)、TaARE1-B1-F和TaARE1-B2-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列7中的第21-1927位所示，小麦B基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)、TaARE1-D1-F和TaARE1-D2-R组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列9中的第21-1488位所示，小麦D基因组中ARE1基因的部分第一外显子和第二、三、四外显子位于其中)，三对引物用于检测大片段删除。

gRNA1和gRNA2分别检测的方法如实施例2和实施例3“二、(1)”中所示。

(2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，gRNA1和gRNA2分别检测的方法如实施例2和实施例3中“二、(2)”所示。

(3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。

97株再生植株中，1株为编辑植株(1.03％)，96株为野生型(98.97％)。将该编辑植株命名为T12-23。

T12-23用长片段引物进行PCR扩增检测大片段删除的电泳图见图7。图7中，M表示DL2000 Marker；A代表T₀代植株T12-23的A基因组PCR扩增产物电泳、B代表T₀代植株T12-23的B基因组PCR扩增产物电泳、D代表T₀代植株T12-23的D基因组PCR扩增产物电泳。WT为Wild-type代表郑麦7698相应基因组PCR扩增产物电泳。图中显示T12-23的D基因组出现大片段删除情况。

T12-23 A基因组和B基因组酶切电泳图见图8。图8中，M表示DL2000Marker；A1代表T₀代植株T12-23的A基因组gRNA1的酶切、B1代表T₀代植株T12-23的B基因组gRNA1的酶切；A2代表T₀代植株T12-23的A基因组gRNA2的酶切、B2代表T₀代植株T12-23的B基因组gRNA2的酶切。WT为Wild-type代表郑麦7698，+代表郑麦7698相应基因组进行步骤(2)酶切产物电泳，-代表郑麦7698相应基因组进行步骤(1)电泳产物电泳。

T12-23进行测序后的结果见图9。图9中：CCG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“d”表示碱基删除，“i”表示碱基插入。

(4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因；采用TaU6-F和TaU6-R1组成的引物对鉴定gRNA1基因；采用TaU6-F和TaU6-R2组成的引物对鉴定gRNA2基因；采用Hpt-F和Hpt-R组成的引物对鉴定hptII基因。

T12-23基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带gRNA基因的情况和携带hptII基因的情况见表7。

表7为T12-23基因情况

注：d代表删除，d8代表删除8个核苷酸，d8-d7代表gRNA1靶点删除8个核苷酸，gRNA2靶点删除7个核苷酸，依次类推；其他相关符号的含义同表1和表2。

T12-23的A基因组中一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第441-448位核苷酸，第1331-1337位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因删除第448位核苷酸，第1338-1347位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；B基因组中一条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第448位核苷酸，第1568-1578位核苷酸获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失，一条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第435-451位核苷酸，第1307-1319位获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第425-1360位核苷酸(其中外显子部分为第425-588位，第780-865位，第964-1137位，第1304-1360位)获得的突变基因，该突变基因造成移码突变导致ARE1蛋白功能缺失。

2、对T₁代植株的鉴定

取T₀代植株T12-23，进行自交并收获T₁代种子，培育T₁代种子获得T₁代植株。

按照步骤1的方法，对各个T₁代植株进行鉴定。

部分T₁代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图10(Actin为内参基因)。图10中，-代表郑麦7698作为阴性对照，+代表重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos作为阳性对照，1-15代表不同的T₁代植株。

各项鉴定的结果见表8。

表8为T12-23的T₁代植株基因情况

注：相关符号的含义同表1和表2。

结果表明，T₀代ARE1被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T₁代，对于定点编辑的ARR1的双等位突变株系通过严格的自交，B基因组T₁分离情况符合孟德尔遗传规律。在T₁代可获得靶序列区域发生突变且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos)序列的编辑株系。

3、CRISPR/Cas9的脱靶分析

根据网上预测软件(https：//crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/)，分别对ARE1基因的gRNA1和gRNA2靶点可能存在的脱靶位点进行预测及检测，步骤与实例2与实例3中相同。

T12-23的基因组DNA为模板，分别采用T1-OFF1-F和T1-OFF1-R组成的引物对，T1-OFF2-F和T1-OFF2-R组成的引物对，T2-OFF1-F和T2-OFF1-R组成的引物对，T2-OFF2-F和T2-OFF2-R组成的引物对，T2-OFF3-F和T3-OFF3-R组成的引物对进行PCR扩增并测序。

脱靶位点的信息见表9。

表9为靶点位点信息

结果表明，对于上述5个预测可能脱靶位点，T12-23未检测到脱靶现象，即gRNA1和gRNA2在潜在脱靶位点未检测到脱靶现象。

实施例5、不同浓度氮素处理溶液中的根尖表型及横切结构分析以及农艺性状统计

实施例2得到的T₀代植株T1-44自交得到T₁代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组wt野生型且B基因组d33纯合突变型且D基因组d25纯合突变型”并且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos)序列的T₁代植株，将选择的该T₁代植株自交，获得T₂代植株，该T₂代植株作为供试编辑植株。该T₂代植株的A基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列5所示)；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第441-473位核苷酸获得的突变基因；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第435-459位核苷酸获得的突变基因，该T₂代植株命名为AABBdd。

实施例2得到的T₀代植株T1-44自交得到T₁代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d5纯合突变型且B基因组d33纯合突变型且D基因组d25纯合突变型”并且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-35S-hptII-Nos)序列的T₁代植株，将选择的该T₁代植株自交，获得T₂代植株，该T₂代植株作为供试编辑植株。该T₂代植株的A基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第444-448位核苷酸获得的突变基因；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第441-473位核苷酸获得的突变基因；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第435-459位核苷酸获得的突变基因，该T₂代植株命名为aaBBdd。

实施例3得到的T₀代植株T2-5自交得到T₁代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d37纯合突变型且B基因组i1纯合突变型且D基因组s1纯合突变型”并且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos)序列的T₁代植株，将选择的该T₁代植株自交，获得T₂代植株，该T₂代植株作为供试编辑植株。该T2代植株A基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第1311-1358位核苷酸获得的突变基因；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)第1575位插入1个核苷酸获得的突变基因；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因第1319位T替换为A获得的突变基因，该T₂代植株命名为aabbDD。

实施例4得到的T₀代植株T12-23自交得到T₁代植株，从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d1-d10纯合突变型且B基因组d1-d11纯合突变型且D基因组d481纯合突变型”并且不携带载体(即重组质粒pCXUN-Ubi-Cas9-Nos-TaU6-gRNA1-TaU6-gRNA2-35S-hptII-Nos)序列的T₁代植株，将选择的该T₁代植株自交，获得T₂代植株，该T₂代植株作为供试编辑植株。该T₂代植株A基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为将野生型基因(如序列5所示)删除第448位核苷酸，第1338-1347位核苷酸获得的突变基因；B基因组中两条同源染色中ARE1基因为将野生型基因(如序列7所示)删除第448位核苷酸，第1568-1578位核苷酸获得的突变基因；D基因组中两条同源染色体中的ARE1基因为野生型基因(如序列9所示)删除第425-1360位核苷酸获得的突变基因，该T₂代植株命名为aabbdd。

郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株，命名为AABBDD。

一、根尖表型及横切结构分析

培育上述选择的T₁代植株，收获籽粒，该籽粒即为供试编辑植株种子和野生型对照植株种子。对籽粒进行消毒处理，萌发三天后，去除胚乳，分别在0mM，0.5mM，1.0mM和1.5mM的NH₄NO₃水培液中培养5天，截取不同类型的编辑供试植株和野生型幼苗的根尖1.0cm制片进行根尖结构观察；截取根尖上部0.5cm的区段用0.1％的亚甲基蓝溶液[w/v]染色1min后制作切片进行横切结构观察。

不同浓度氮素处理溶液中编辑供试植株与野生型的根尖表型及横切结构见图11。对于无氮供应(0mM NH₄NO₃)的野生型幼苗，根干细胞区的直径较小(图11中的A)。低浓度氮(0.5mM和1.0mM NH₄NO₃)处理可以促进根尖发育，增加根横截面直径(图11中的B、图11中的C)，但高浓度氮(1.5mM NH₄NO₃)对野生型根尖的发育没有影响或影响很小(图11中的D)。在氮饥饿条件下，突变株系根干细胞区的直径远大于野生型(图11中的A)。然而，不同品系对氮处理表现出不同的反应。在不同浓度的氮供应后，aaBBdd和aabbdd突变株系根干细胞区在氮饥饿(图11中的A-D)下保持相似的形态，而在低氮(0.5mMNH₄NO₃)处理下，与无氮供应的植物相比，来自AABBdd和aabbDD株系的主根显着增加(图11中的B)。与在氮饥饿或供应条件下的野生型相比，不同突变株系，尤其是AABBdd和aabbDD株系中的根皮质细胞显着增大，细胞数量增加(图11中的A-D)。说明与野生型对照植株相比，供试编辑植株对氮饥饿的耐受性增强，氮素利用率提高。

二、田间表型分析

对上述供试编辑植株与野生型蜡熟期的植株(图12中的A)、旗叶(图12中的B)、成熟期的植株(图12中的C)、田间植株表型(图12中的D)、成熟期的主穗(图12中的E)以及成熟期的籽粒的粒长和粒宽(图12中的F)表型进行观察，并对其主要农艺性状进行统计，统计结果见表10。

表10为农艺性状统计结果

注：表中数据为平均值±标准误(n＝10)，对于籽粒的粒长和粒宽，n＝20。使用双尾t检验将供试编辑植株每种基因型的表型数据与野生型AABBDD进行比较，*P＜0.05，差异显著；**P＜0.01差异极显著。

结果表明，供试编辑植株与野生型植株相比，不论是在蜡熟期还是成熟期，供试编辑植株叶片均比同等时期野生型植株绿色更明显，失绿明显延后，因此可以延缓植株衰老(图12中A-D)。供试编辑植株的千粒重有明显提高，其中野生型为47.6±0.3g，AABBdd、aabbDD、aaBBdd和aabbdd编辑株系的千粒重分别为54.1±0.4g、56.4±0.6g、53.6±0.6g和53.6±0.4g。对供试编辑植株与野生型成熟期的籽粒的粒长和粒宽进行观察(图12中F)，发现供试编辑植株的粒长显著增加，野生型粒长为6.7±0.1mm，AABBdd、aabbDD、aaBBdd和aabbdd编辑株系的粒长分别为7.1±0.1mm、7.3±0.2mm、7.1±0.2mm和7.0±0.1mm。AABBdd、aabbDD和aaBBdd株系的籽粒宽度显著增加，分别为4.0±0.1mm、4.1±0.1mm和3.9±0.1mm。AABBdd、aabbDD和aaBBdd株系的株高和分蘖数显著增加。对成熟期的主穗进行观察(图12中E)，发现AABBdd、aabbDD和aabbdd的主穗长度显著增加，分别为9.1±0.3cm、9.3±0.2cm和10.8±0.4cm。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 通过CRISPR/Cas9技术调控小麦ARE1基因提高作物产量的方法

<130> 212058

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcgagc tcggtacccc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt 60

aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcccgatcta 120

gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt 180

ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata 240

acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga aattatatga 300

taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc caaatgtttg 360

aacgatcggg gaaattcgga tccccaatac ttcaatcgcc gccgagttgt gagaggtcga 420

tgcgtgtctc gtagaggcct gtgatagact ggtggatgag ggtggcgtcg agaacctcct 480

tggtagaggt gtagcgcttg cggtcgatgg tggtgtcgaa gtacttgaag gcggctggag 540

cgccgaggtt ggtgagggtg aagaggtgga tgatgttctc ggcctgctcg cgaattggct 600

tatcgcggtg cttgttgtag gcgctgagca ccttatcgag gttggcatcg gcgaggatca 660

cgcgcttgga gaactcggag atctgctcga tgatctcgtc gaggtagtgc ttgtgctgct 720

cgacgaacag ctgcttttgc tcgttgtcct ctggggagcc cttgagcttc tcgtagtggg 780

aggcgaggta gaggaagttc acgtacttgg acgggagagc aagctcgttg cccttctgaa 840

gctcgccagc agaggcgagc attctcttgc ggccgttctc aagctcgaag aggctgtact 900

tcgggagctt gatgatgagg tccttcttca cctccttgta gcccttggcc tcgaggaagt 960

cgattgggtt cttctcgaag ctgctgcgct ccatgatcgt gatgcccagc agctccttga 1020

cggacttgag cttcttgctc ttgcccttct cgaccttggc aaccacgagc acagagtagg 1080

ccacggtcgg agaatcgaag ccgccatact tcttcgggtc ccagtccttc ttgcgggcga 1140

tcagcttgtc ggagttgcgc tttgggagga tggactcctt ggagaagccg ccggtctgaa 1200

cctcggtctt cttcacgatg ttcacttgcg gcatggagag caccttgcgc actgtggcga 1260

aatccctgcc cttgtcccac acgatctcgc ctgtctcgcc gtttgtctcg atgagcggcc 1320

tcttcctaat ctcgccgttg gcgagcgtga tctcggtctt gaagaaattc atgatgttgg 1380

agtagaagaa gtacttggcg gtcgccttgc cgatctcttg ctcggacttg gcgatcatct 1440

tgcgcacgtc gtacaccttg tagtcgccgt acacgaactc ggactcgagc tttgggtact 1500

tcttgatgag ggctgtgccc accacggcat tgaggtaggc gtcgtgggcg tggtggtagt 1560

tgttgatctc gcgcaccttg tagaactgga agtccttgcg gaagtcggac acgagcttgg 1620

acttgagggt gatgaccttc acctcgcgga tgagcttgtc gttctcgtcg tacttggtgt 1680

tcatgcggga gtcgaggatc tgggccacgt gctttgtgat ctggcgtgtc tcgacgagct 1740

ggcgcttgat gaagccggcc ttatcaagct cggaaaggcc gcctctctcg gccttggtga 1800

ggttgtcgaa cttcctctgg gtgatgagct tggcgttgag gagctggcgc cagtagttct 1860

tcatcttctt gacgacctct tcggacggca cgttatcgga cttgcccctg ttcttgtcgg 1920

agcgggtgag caccttgttg tcgatggagt cgtccttcag gaaggactgc ggcacaatat 1980

ggtccacgtc gtagtcggag aggcggttga tgtccagctc ttggtccacg tacatgtcgc 2040

ggccgttctg gaggtagtag aggtagagct tctcgttctg gagctgggtg ttctcgactg 2100

ggtgctcctt gaggatctgg gagcccagct ccttaatgcc ctcctcgatc ctcttcatgc 2160

gctcgcggga gttcttttgg cccttctgtg tggtctggtt ctcgcgggcc atctcgatca 2220

cgatgttctc tggcttgtgc ctgcccatca ccttcaccag ctcgtccacc accttcacgg 2280

tctggagaat gcccttcttg atagccgggg agccggcgag attggcgata tgctcatgga 2340

gggaatcgcc ttggccggac acctgggcct tttggatgtc ctccttgaag gtgagggagt 2400

cgtcgtggat gagctgcatg aagttgcggt tggcgaagcc gtcggacttg aggaagtcga 2460

ggatcgtctt gccggactgc ttgtcgcgga tgccgttgat gagcttccta gagagcctgc 2520

cccagccggt atagcgcctg cgcttcagct gcttcatcac cttgtcgtcg aagaggtggg 2580

cgtatgtctt gaggcgctcc tcgatcatct cgcggtcctc gaagagggtg agggtgagca 2640

cgatgtcctc gaggatgtcc tcgttctcct cgttgtcgag gaagtccttg tccttgataa 2700

tcttgaggag gtcgtggtag gtcccgaggg aggcattgaa cctatcctcg acgccggaga 2760

tctcgacgga gtcgaagcac tcgattttct tgaagtagtc ctccttgagc tgcttcacgg 2820

tcaccttgcg gttggtcttg aacagcaggt cgacgatggc cttcttttgc tcgccgctaa 2880

ggaaagctgg cttcctcatc ccctcggtca cgtacttcac cttggtcagc tcgttgtaca 2940

cggtgaagta ctcgtagagg agtgagtgct tcgggagcac cttctcgttc gggaggttct 3000

tgtcgaagtt ggtcatgcgc tcgatgaaag actgggcaga ggcgccctta tccaccacct 3060

cctcgaagtt ccagggggtg attgtctcct cggactttct ggtcatccag gcgaacctgg 3120

agttgcccct ggcgagcggg cccacgtagt acgggatgcg gaaggtgagg atcttctcaa 3180

tcttctcgcg gttgtccttg aggaacgggt agaagtcctc ttgcctgcgg aggatagcat 3240

gaagctcgcc gaggtggatc tggtgcggga tggagccatt atcgaaggtg cgctgcttgc 3300

ggaggaggtc ctctctattg agcttcacga gcagctcctc ggtgccgtcc atcttctcga 3360

ggatcggctt gatgaacttg tagaactcct cttgagaagc gccgccatcg atgtagccgg 3420

cgtagccgtt cttggactgg tcgaagaaga tctccttgta cttctctggg agctgctgtc 3480

tcacgagggc cttgaggagt gtgaggtcct ggtggtgctc gtcgtacctc ttgatcatgg 3540

aggcggagag tggggccttg gtgatctcgg tgttcaccct gaggatgtcg ctgaggagga 3600

tggcgtcgga gagattcttg gcggcgagga acagatcggc gtactgatcg ccaatctggg 3660

cgaggagatt gtcgaggtcg tcgtcgtagg tgtccttgga aagctggagc ttggcgtcct 3720

cggcgaggtc gaagttggac ttgaagttcg gggtgaggcc aagagagagg gcgatcaggt 3780

tgccgaagag gccattcttc ttctcgcccg gaagttgggc gatcagattc tcgagcctgc 3840

gggacttaga gagcctggca gagagaatag ccttggcgtc aacgccagag gcgttgatcg 3900

ggttctcctc gaacagctgg ttgtaggtct gcacgagctg gatgaacagc ttgtccacat 3960

cggagttgtc cgggttgagg tcgccctcga tgaggaagtg gcccctgaac ttgatcatgt 4020

gggcgagggc gaggtagatg agcctgaggt cggccttatc ggtggagtcg acgagcttct 4080

tgcggaggtg gtagatggtc gggtacttct cgtggtaggc cacctcatcc acgatgttgc 4140

cgaagatcgg atggcgctcg tgcttcttgt cctcctcgac gaggaagctc tcctcgagcc 4200

tgtggaagaa gctgtcgtcc accttggcca tctcgttgga gaagatctct tggaggtagc 4260

agatgcggtt cttgcgcctg gtgtacctgc gtctagcggt cctcttgagc cttgtagcct 4320

cggctgtctc gccagagtcg aacagcaggg cgccgatgag attcttcttg atggagtggc 4380

ggtcggtgtt gccgaggacc ttgaacttct tggacggcac cttgtactcg tcggtgatca 4440

cggcccagcc aacagaattg gtgccgatgt cgaggccgat ggagtacttc ttgtcgacct 4500

tgcgcttctt ctttggggcc atagtattgg ggatcccccg ggctgcagaa gtaacaccaa 4560

acaacagggt gagcatcgac aaaagaaaca gtaccaagca aataaatagc gtatgaaggc 4620

agggctaaaa aaatccacat atagctgctg catatgccat catccaagta tatcaagatc 4680

aaaataatta taaaacatac ttgtttatta taatagatag gtactcaagg ttagagcata 4740

tgaatagatg ctgcatatgc catcatgtat atgcatcagt aaaacccaca tcaacatgta 4800

tacctatcct agatcgatat ttccatccat cttaaactcg taactatgaa gatgtatgac 4860

acacacatac agttccaaaa ttaataaata caccaggtag tttgaaacag tattctactc 4920

cgatctagaa cgaatgaacg accgcccaac cacaccacat catcacaacc aagcgaacaa 4980

aaagcatctc tgtatatgca tcagtaaaac ccgcatcaac atgtatacct atcctagatc 5040

gatatttcca tccatcatct tcaattcgta actatgaata tgtatggcac acacatacag 5100

atccaaaatt aataaatcca ccaggtagtt tgaaacagaa ttctactccg atctagaacg 5160

accgcccaac cagaccacat catcacaacc aagacaaaaa aaagcatgaa aagatgaccc 5220

gacaaacaag tgcacggcat atattgaaat aaaggaaaag ggcaaaccaa accctatgca 5280

acgaaacaaa aaaaatcatg aaatcgatcc cgtctgcgga acggctagag ccatcccagg 5340

attccccaaa gagaaacact ggcaagttag caatcagaac gtgtctgacg tacaggtcgc 5400

atccgtgtac gaacgctagc agcacggatc taacacaaac acggatctaa cacaaacatg 5460

aacagaagta gaactaccgg gccctaacca tggaccggaa cgccgatcta gagaaggtag 5520

agaggggggg ggggggagga cgagcggcgt accttgaagc ggaggtgccg acgggtggat 5580

ttgggggaga tctggttgtg tgtgtgtgcg ctccgaacaa cacgaggttg gggaaagagg 5640

gtgtggaggg ggtgtctatt tattacggcg ggcgaggaag ggaaagcgaa ggagcggtgg 5700

gaaaggaatc ccccgtagct gccgtgccgt gagaggagga ggaggccgcc tgccgtgccg 5760

gctcacgtct gccgctccgc cacgcatttc tggatgccga cagcggagca agtccaacgg 5820

tggagcggaa ctctcgagag gggtccagag gcagcgacag agatgccgtg ccgtctgctt 5880

cgcttggccc gacgcgacgc tgctggttcg ctggttggtg tccgttagac tcgtcgacgg 5940

cgtttaacag gctggcatta tctactcgaa acaagaaaaa tgtttcctta gtttttttaa 6000

tttcttaaag ggtatttgtt taatttttag tcactttatt ttattctatt ttatatctaa 6060

attattaaat aaaaaaacta aaatagagtt ttagttttct taatttagag gctaaaatag 6120

aataaaatag atgtactaaa aaaattagtc tataaaaacc attaacccta aaccctaaat 6180

ggatgtacta ataaaatgga tgaagtatta tataggtgaa gctatttgca aaaaaaaagg 6240

agaacacatg cacactaaaa agataaaact gtagagtcct gttgtcaaaa tactcaattg 6300

tcctttagac catgtctaac tgttcattta tatgattctc taaaacactg atattattgt 6360

agtactatag attatattat tcgtagagta aagtttaaat atatgtataa agatagataa 6420

actgcacttc aaacaagtgt gacaaaaaaa atatgtggta attttttata acttagacat 6480

gcaatgctca ttatctctag agaggggcac gaccgggtca cgctgcactg caggaattcg 6540

atatcaagct tgaccaagcc cgttattctg acagttctgg tgctcaacac atttatattt 6600

atcaaggagc acattgttac tcactgctag gagggaatcg aactaggaat attgatcaga 6660

ggaactacga gagagctgaa gataactgcc ctctagctct cactgatctg ggtcgcatag 6720

tgagatgcag cccacgtgag ttcagcaacg gtctagcgct gggcttttag gcccgcatga 6780

tcgggctttt gtcgggtggt cgacgtgttc acgattgggg agagcaacgc agcagttcct 6840

cttagtttag tcccacctcg cctgtccagc agagttctga ccggtttata aactcgcttg 6900

ctgcatcaga cttggggcgg gggtgggagc ttgtgtttta gagctagaaa tagcaagtta 6960

aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttggt 7020

accctgcatg ggagaggcgg tttgcgtatt ggtttaaaca tagctaaact atcagtgttt 7080

gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taacggatat 7140

ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc caaccacagg 7200

gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg ctgctatagt gcagtcggct 7260

tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc taagttacgc 7320

gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt agtcgcataa 7380

agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat gaacaagagc gccgccgctg 7440

gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac caacgggccg 7500

aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc accaggcgcg 7560

accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctagccct ggcgacgttg tgacagtgac 7620

caggctagac cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg gacattgccg agcgcatcca 7680

ggaggccggc gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc 7740

cggccgcatg gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat 7800

cgaccgcacc cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg 7860

ccctaccctc accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg 7920

caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact 7980

tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga 8040

cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc 8100

atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg 8160

gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg 8220

catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc 8280

gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg 8340

cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac 8400

gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa 8460

cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc 8520

cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg 8580

gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag 8640

tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact 8700

tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg ggcaaccgcc gacctggtgg 8760

agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt 8820

cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg 8880

agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg 8940

ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc 9000

tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa 9060

aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt 9120

ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga 9180

tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc 9240

tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt 9300

tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat 9360

gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc 9420

cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc 9480

ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg 9540

caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg 9600

gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt 9660

aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg 9720

ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac 9780

cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca 9840

gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat 9900

ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc 9960

cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa 10020

gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg 10080

aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc 10140

tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat 10200

tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat 10260

tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca 10320

ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga 10380

gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag 10440

tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac 10500

ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt 10560

gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg 10620

aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt 10680

gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc 10740

taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct 10800

ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta 10860

cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta 10920

cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc 10980

ccacatcaag gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 11040

gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 11100

tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag 11160

cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 11220

caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc 11280

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 11340

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 11400

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 11460

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 11520

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 11580

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 11640

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 11700

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 11760

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 11820

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 11880

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 11940

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 12000

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 12060

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 12120

gtcatgcatt ctaggtacta aaacaattca tccagtaaaa tataatattt tattttctcc 12180

caatcaggct tgatccccag taagtcaaaa aatagctcga catactgttc ttccccgata 12240

tcctccctga tcgaccggac gcagaaggca atgtcatacc acttgtccgc cctgccgctt 12300

ctcccaagat caataaagcc acttactttg ccatctttca caaagatgtt gctgtctccc 12360

aggtcgccgt gggaaaagac aagttcctct tcgggctttt ccgtctttaa aaaatcatac 12420

agctcgcgcg gatctttaaa tggagtgtct tcttcccagt tttcgcaatc cacatcggcc 12480

agatcgttat tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct attcgtatag 12540

ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata cagctcgata 12600

atcttttcag ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc atcggcctca 12660

ctcatgagca gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt tggaacaggc 12720

agctttcctt ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt caacatcata ggtggtccct 12780

ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac cagcttatat 12840

accttagcag gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt 12900

ttcaattccg gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct tttctacagt 12960

atttaaagat accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg 13020

cattctaaaa ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt 13080

ataacatagt atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct 13140

gtcatcgtta caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag 13200

cttagttgcc gttcttccga atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac 13260

ggctctcccg ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt 13320

gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa 13380

caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt actgaattaa 13440

cgccgaatta attcggggga tctggatttt agtactggat tttggtttta ggaattagaa 13500

attttattga tagaagtatt ttacaaatac aaatacatac taagggtttc ttatatgctc 13560

aacacatgag cgaaacccta taggaaccct aattccctta tctgggaact actcacacat 13620

tattatggag aaactcgagc ttgtcgatcg acagatccgg tcggcatcta ctctatttct 13680

ttgccctcgg acgagtgctg gggcgtcggt ttccactatc ggcgagtact tctacacagc 13740

catcggtcca gacggccgcg cttctgcggg cgatttgtgt acgcccgaca gtcccggctc 13800

cggatcggac gattgcgtcg catcgaccct gcgcccaagc tgcatcatcg aaattgccgt 13860

caaccaagct ctgatagagt tggtcaagac caatgcggag catatacgcc cggagtcgtg 13920

gcgatcctgc aagctccgga tgcctccgct cgaagtagcg cgtctgctgc tccatacaag 13980

ccaaccacgg cctccagaag aagatgttgg cgacctcgta ttgggaatcc ccgaacatcg 14040

cctcgctcca gtcaatgacc gctgttatgc ggccattgtc cgtcaggaca ttgttggagc 14100

cgaaatccgc gtgcacgagg tgccggactt cggggcagtc ctcggcccaa agcatcagct 14160

catcgagagc ctgcgcgacg gacgcactga cggtgtcgtc catcacagtt tgccagtgat 14220

acacatgggg atcagcaatc gcgcatatga aatcacgcca tgtagtgtat tgaccgattc 14280

cttgcggtcc gaatgggccg aacccgctcg tctggctaag atcggccgca gcgatcgcat 14340

ccatagcctc cgcgaccggt tgtagaacag cgggcagttc ggtttcaggc aggtcttgca 14400

acgtgacacc ctgtgcacgg cgggagatgc aataggtcag gctctcgcta aactccccaa 14460

tgtcaagcac ttccggaatc gggagcgcgg ccgatgcaaa gtgccgataa acataacgat 14520

ctttgtagaa accatcggcg cagctattta cccgcaggac atatccacgc cctcctacat 14580

cgaagctgaa agcacgagat tcttcgccct ccgagagctg catcaggtcg gagacgctgt 14640

cgaacttttc gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt gagttcaggc tttttcatat 14700

ctcattgccc cccggatctg cgaaagctcg agagagatag atttgtagag agagactggt 14760

gatttcagcg tgtcctctcc aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa ggtcttgcga 14820

aggatagtgg gattgtgcgt catcccttac gtcagtggag atatcacatc aatccacttg 14880

ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc 14940

atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg 15000

atggcatttg taggtgccac cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc 15060

tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc 15120

cctttggtct tctgagactg tatctttgat attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc 15180

caccatgtta tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc 15240

cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg 15300

aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac 15360

tgtccttttg atgaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat 15420

taccctttgt tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt 15480

cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac catgttggca agctgctcta gccaatacgc 15540

aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 15600

gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 15660

ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 15720

caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattac 16280

<210> 2

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggtagagct gagggatgaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 105

<210> 3

<211> 527

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctatgttt aaaccaatac gcaaaccgcc tctcccatgc agggtaccaa aaaaagcacc 60

gactcggtgc cactttttca agttgataac ggactagcct tattttaact tgctatttct 120

agctctaaaa cttcatccct cagctctacc ccaagtctga tgcagcaagc gagtttataa 180

accggtcaga actctgctgg acaggcgagg tgggactaaa ctaagaggaa ctgctgcgtt 240

gctctcccca atcgtgaaca cgtcgaccac ccgacaaaag cccgatcatg cgggcctaaa 300

agcccagcgc tagaccgttg ctgaactcac gtgggctgca tctcactatg cgacccagat 360

cagtgagagc tagagggcag ttatcttcag ctctctcgta gttcctctga tcaatattcc 420

tagttcgatt ccctcctagc agtgagtaac aatgtgctcc ttgataaata taaatgtgtt 480

gagcaccaga actgtcagaa taacgggctt ggtcaagctt gatatcg 527

<210> 4

<211> 421

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 4

Met Ser Cys Tyr Val Val Ser Ser Ser Gly Val Ala Ile Trp Phe Ala

1 5 10 15

Val Glu Glu Arg Ile Gly His Arg Arg Phe Cys Ala Cys Lys Met Phe

20 25 30

Asp Val Gly Pro Gln Arg Arg Arg Val Gly Arg Arg Leu Val Gly Phe

35 40 45

Ala Lys Lys Arg Arg Arg Ser Lys Arg Gln Gln Pro Trp Trp Lys Ala

50 55 60

Trp Phe Ser Asp Trp Asn Asp Glu Glu Glu Ser Leu Ala Gly Trp Arg

65 70 75 80

Glu Asp Asp Glu Leu Leu Gln Gln Val Val Ser Asn Glu Asp Leu Ser

85 90 95

Glu Asp Asp Lys Phe Gln Thr Trp Lys Ser Lys Ala Glu Ala Ile Val

100 105 110

Asp Leu Arg Glu Ala Gln Gln Gly Ala Glu Asn Ala Glu Gly Arg Ser

115 120 125

Trp Glu Asp Trp Ile Gly Trp Gly Ser Thr Ser Gly Asp Gly Asp Trp

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Asp Gln Ile Thr Asp Asp Pro Thr Glu

145 150 155 160

Ile Val Arg Asp Lys Gly Ile Ala Glu Ala Phe Arg Asp Ser Asn Asp

165 170 175

Glu Asp Tyr Asn Asp Met Leu Phe Glu Asp Arg Val Phe Leu Tyr Ala

180 185 190

Ser Thr Lys Ser Ala Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ile Val Val Pro Trp

195 200 205

Val Leu Asp Leu Leu Val His Asp Tyr Val Met Met Pro Phe Leu Asp

210 215 220

Arg Tyr Val Glu Lys Val Pro Leu Ala Ala Glu Met Leu Asp Val Arg

225 230 235 240

Arg Ser Gln Lys Ile Gln Met Ile Lys Asp Leu Asn Ile Glu Lys Ala

245 250 255

Arg Phe Arg Phe Glu Val Glu Ile Gly Lys Ser Pro Pro Leu Ser Asp

260 265 270

Glu Glu Phe Trp Ser Glu Leu Arg Glu Lys Ala Val Glu Leu Arg Asp

275 280 285

Glu Trp Arg Leu Glu Asn Arg Gln Ala Phe Ala Asn Ile Trp Ser Asp

290 295 300

Met Val Tyr Gly Val Ala Leu Phe Leu Leu Met Tyr Phe Asn Gln Ser

305 310 315 320

Lys Val Ala Ile Ile Lys Phe Thr Gly Tyr Lys Leu Leu Asn Asn Ile

325 330 335

Ser Asp Ser Gly Lys Ala Phe Leu Ile Ile Leu Val Ser Asp Ile Leu

340 345 350

Leu Gly Tyr His Ser Glu Ala Gly Trp His Ser Leu Val Glu Ile Ile

355 360 365

Leu Asp His Tyr Gly Leu Glu Thr Asp Gln Ala Ala Val Thr Phe Phe

370 375 380

Val Cys Leu Val Pro Val Ala Leu Asp Val Phe Ile Lys Phe Trp Val

385 390 395 400

Tyr Lys Tyr Leu Pro Arg Leu Ser Pro Ser Val Gly Asn Ile Leu Asp

405 410 415

Glu Ile Arg Arg His

420

<210> 5

<211> 8023

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 5

atgagttgct acgtggtcag ctctagcggc gttgcgatct ggttcgccgt agaggagagg 60

atcgggcacc ggaggttttg cgcatgcaag atgttcgatg tcggtcccca gaggagaagg 120

gtggggaggc gcctggtggg ttttgccaag aagaggaggc gttccaagag gcagcagcca 180

tggtggaagg cgtggttctc tgattggaac gatgaggaag agagcctcgc cggctggagg 240

gaggatgatg aattgctcca gcaggttgtt agcaacgaag acctgtcgga ggatgacaag 300

tttcagacgt ggaagagcaa ggcagaggcg attgtcgacc tgcgggaagc ccagcagggt 360

gccgaaaatg cagaagggcg gtcatgggag gattggatag gttggggcag cacgtccggc 420

gatggtgatt ggggcggggg tgggagcttg tcggaccaga taactgatga tccgacggag 480

atagtgaggg acaagggcat cgctgaagct tttagggact ctaatgatga agattacaac 540

gacatgttgt ttgaggaccg ggtttttcta tacgcttcga cgaaatcggt acttctagca 600

ctagttacaa gatataattt tctcatcatc tttcctacca attgtgcacc gctttccaat 660

gcggtctact attataccta gtactataac aataactcaa accttattac cgtgcaacat 720

tgctcaagat ccttttcgat gaagtcatac agatgttggg gaactggatc taacaagaaa 780

attgtactct gcaggccaaa ttcctagcat tgttgatcgt tgttccatgg gtgttggatc 840

ttctagtaca tgactatgtt atgatgccat ttctagacag gtaagtcatc ttactgctat 900

ggcgttccat atcttccctt tcctctgttt tcttttttgt tgaaagaatc gattatgctg 960

gtcattgtac aataacaggt atgtcgagaa ggtaccactc gccgctgaaa tgcttgatgt 1020

aagacgcagc cagaagattc agatgataaa ggacctaaat attgagaaag caagattccg 1080

ttttgaagta gagattggta aatctcctcc actttccgat gaggagttct ggtcagagtt 1140

gcgggaaaaa gcgtgaggct attattcttt cttgccaagt tgttgcttat attagtgccc 1200

ttgcaatttt gacatgaaca ttcatcttct cctctgtgaa aatgatagtc aggaacatcg 1260

ttttgcggcc cgataaattt atctggttaa ctgtaacggg tctgctctgt tactttaaca 1320

gggtagagct gagggatgaa tggagattag aaaaccgaca agcatttgca aatatctggt 1380

ctgatatggt ttatggggtt gccctattcc ttcttatgta ctttaaccag agtaaagtaa 1440

gtacatacat catataagca gcttcttatt tttttgatta tgttcaattg tgaaagtgtg 1500

ccattaagtt cgtatagcat tcctcttgat ggcgtgtacc atgtggatct gtgttttttt 1560

ttctctgtaa agtaaatcag aagtcatcaa aattgctgcg ctattaggcc tagcgaataa 1620

ctaattacct ttggcggtta agactaatgg tgtgtcaaat attcgaagag gtgaactgat 1680

ctaaagtttt tcctgatctg ttcatacttg ataatgtttt gttttaaggt agtgtcgtat 1740

taacatcacc tcaatttcaa tgataccttt tattttacta tcatcagtaa aagtgtgcgg 1800

gtgtctgtaa aacgtgatgg aagcgtctca acccccaaca gggagcccac gttgtgttat 1860

attgatcgag cgagagagag cctctcaaga gatacaggag ggttcggttg gcaaacaacc 1920

gtacagagat cttacagaga gaaatagaga taagaagtta aaacagaaaa tatcatcatg 1980

aaggtattga caaactttat ttactgcaaa ggaaatatca ggcctggtga gagtcaagta 2040

ctgaagtgca cctaccaaac ttctggactt agtaccatcc tcttgattca agagttctcc 2100

ttcagcaagt gagagcttct ctgaactgga caagggtgtt ggagagggtt tacaaccctg 2160

taagacaact ctgctcaaaa ggtcagtggc atatttttcc tgagagagat gaaggccacc 2220

ttctctattt ctcttaacct caataccaag aaagaaatgc aagtcaccta gatccttgag 2280

agcaaattct gagttcaaat ctgatcaaga gagctttgac tgcttcattt gacgagcttg 2340

tgacaatgat atcattaaca tagataggta caaaaattga agtatttgac ttattgtaaa 2400

tgaacagaga tttatcagat tttgaaggag tgaagccaag ttgttgcaac ttcgcactta 2460

ggcgagaata ccatgctctg ggagcttgtt tcagtccata aagagatctg tcaagcctgc 2520

atatgtgaga cagtttgttt ttatctacaa acccaggagg ttgcttcata tatacttcct 2580

cttccagaac accatgaagg aacgcattct gcacatctag ctgtctgaga ctccatcctc 2640

tggacacagc aatagataga acaagacgaa tagtagcagc cttaacaaca ggactgaaag 2700

tgtcttcata atctatgcca tacctctgtt tgaaaccttt agccacaagc ctggctttat 2760

atcaatctat cgtaccatca gaccttcttt ttatcctgaa aacccacttg caatcaatca 2820

catttttacc ttgctgtgag ggaactaaat gccacgtgtt atttccctga agagcctgat 2880

actcatcctc catagcttgc ttccaatttg gaccagtgag ggcctcctga tatgtacggg 2940

gttctcccgt ggaagcagcc aaaccatatt taattttgta atttgtaggc tgaataacac 3000

ctgctcgaag acatgtgtat ggtggtgtag cagcgcatgg ctgcgcagaa gatccgagcc 3060

ctgctgcgga agaatcagcg gcaacagctt cctcggacga agctgcggat cccaaagaaa 3120

catcgcccac acccgccgga tcctctgtgg ccgaggacat cacagaggat tcgagagacg 3180

gtgcagatgg tctgggcgct gcaggcgaag ccgactcgga tcgggtgccc acacgtgaca 3240

gggacggggc ccgccgggtg taaaccggtg gctcgggcgg gaagcgcgtg gtcgacgggg 3300

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tggcgtgggt cggaggaggg cgcctgacta gacgacacct gttgggaagt ggatcccgaa 3480

gcagatcctg ccggctttga cgcggtcagg gccgcggatc ccgaaggcga tcgcggcagc 3540

tctagcgtga cagctaccgg tgcaacaccg tttttgtccc aaattgcacc attatgacca 3600

ccattttcag cggtgtttgc acctgtatca tcagactcaa aaggcggatt agaagcatta 3660

gtcaatattt ggatcattac aatcatcact acccacatga tcaactccag agagatgaga 3720

aggaaggaga agaatctcct tgcgaaggag agcaccgaca ttgggatgaa gtttggaaaa 3780

aggaaactga gtttcaacga acacaacatc atgagagata tacacacggc cagaggaaac 3840

atcaaggcac ttaacaccct tgtgttgtgc actgtaacca aggaagacac attgttgaga 3900

tcgaaacata agcttgcgag aattgtaagg atgaagtttt gaccaacaag cacaaccaaa 3960

aacacgaagt gtagtataat caggtatgac ctgtagaagg cgttcagtgg gagtttcatt 4020

ggctatggtg tgactaggcc acatattgat aagatgagcg gccgtaagaa acactttgtc 4080

ccaaaatttt aaaggcatgg aagctgaagc tagaacctag aagggcaaga cctacttcaa 4140

caatgtgacg atgtgttcct ctctgcagaa ccgttttgtt gatgagcatg gaggcaagac 4200

acgtgatgag aatacctatc ttttgaaaaa aagaatttag cttctcatat tcaccacccc 4260

agtccgattg cggcaatgat tttgctatca aacttacgtt caacaagagc ttgaaagtta 4320

tgaaagactt ggaacactcc agaacgtgtt ttaagaaggt atatccatgt gtacttgcta 4380

taatcatcaa caaaacttac ataataagaa tgcccaccaa cagaagtggg cgctggaccc 4440

caaacattag aaaaaataag ttgcaatggt ttggtagaca cactagtaga aataggatat 4500

gccaattgat gactttttgc tctttggcat gaatcacaaa tagtttctga atttccctca 4560

ccaacaacta cgagtttatt tttgctaaga atttgatgaa cggtagcaaa caagggatgg 4620

cctaaacagt tgtgccacct ttcagcagga tgcttgatgg caccagactt gtttattgag 4680

ttgaatatac tgaggaagca atgcatagag cccttgcaca catgtgcccc tatggagaac 4740

tttcttcgtg acctgatcct tgatcaaaag gaaaaagggg tgaaactcaa gaaagacatt 4800

attatcaagg gcaatacgat gaacggaaag aagtgttttt gaagcattag gaacatgcaa 4860

gattccgtta agaactagac ttttatgtgg ggtttcaata attgattgac caatatgact 4920

aatctccata cctgcaccat tggccgaggt gtagatctga tcatggccac ggtatttttc 4980

atgcagtcac cttcttgagt tcaccggtga tatgatttgt agcgcccatg tctcaatacc 5040

aattgctatc gacaccataa gaagcatcag ctgtagctgc ggtttttttc ttttgggaat 5100

tgtcatcggc ataacgccaa tcacagtctt tggcaaggtg gttagttttt ttacaaattt 5160

ggcacttgcc ttcgtacccc tgaaagttat tgcaccccct ggtgttgttg taggaggggt 5220

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tgtgatgacc accaccactg ttgtggtgat agccgccacc gtgaccacca ttggggccgc 5340

cgccaccaga gtagccacca ttagggttgt tgtagccgcc gccagatcgt gatccgccgc 5400

caccgcctcc cttctactgg ccgtgaaagc ccttgggagt tccttggcgg ccgccgcggg 5460

aagctgcgtt tcctgaagat ttgaagctgg agcacctgtc ccgtggaaca tctcgactct 5520

ctgatcgaag ttggccacca tggagaacaa gatctcgacg gtgatcggct cggtgcggat 5580

gtccaaggca gagatgatgg gttgatactc catatcaagc ccagccacga tgaaggaaac 5640

gagctcatcc tcccggattg gcttgcccgc cgccgtgagt ttgtcggagg gagcacgcat 5700

ggcgccaaag tatgctgctg ccgactggtt gcccttctgt gcgttggtga gggaggcacg 5760

gatgttgttg acgcgtgaga gggagacggc tgagaacatg gtgctcaaca tcgtccagat 5820

ggcatgcgag gtttccatcg atgcgacttg aacgagcacc tctttggaga gattgcaaag 5880

gaggtacacg atgatttgct gatcctggac gagccatggg gcataggcag ggctcgggat 5940

cacctggtcc ttgccctctt tatcttttgt ggtgatggtt ttgggaggct cctctaggat 6000

ttgatctata tagccataca agccagcgcc cattatttgg gatcccgctt gagctcacca 6060

gagaacatag ttcgtccggg agagtggctc ggaggtgttg tagttgaggc cggaggtgat 6120

gggggcggca gaggttgaca tggcggaagg tgggtggagg gagatcgaag gaggctagct 6180

agatgtgatg gaagggcccg ctctgtatac catgttgaat tcatgctcca gccaactcat 6240

ccaaaagtcc gaactgatgg agggagacgg gcaatatatt tcaacaagac gcttccatca 6300

cgttttacat ggtatcagag ccaagaggtc ttgagttcaa gaccgtgcca atgcagtatt 6360

agaaacaaat atactgcggc ctacataaaa cccatgtcta aggactaaat aagcctagac 6420

gtgagggggg tgttgaaata tattgcccgt ctccctccat cagttcagac ttttggatga 6480

gttggccgga gcataaattc aatagtgcca cgttttctgt gcatgataat ggcttgtttt 6540

ttctccccct aataataggt aagttatctt gttatcaatt gtcatgcatc ttgctcttac 6600

tgtcgcctat gcttccaggt tgcaataata aagttcacag gatataagtt gctaaacaat 6660

atctcagaca gtgggaaggc ttttcttatc attttagtgt cagatatcct tctagggtaa 6720

gttctatcaa ttcatttctg aaatgtgtct gtatttgtct tttagtgtca tgatatattt 6780

atctctagtt ctctgaattt tccatttaga acaatgcatt tatagttaca agtgatccta 6840

gaaatagaac tgagtaaaca tcatgttgac tttagcttta gtgttcttgt tatttctctc 6900

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tttttcgttc tttcctgcct tctatgagac gtttatagct tattttgtgt cagaatctta 7020

ataaaccaac gagttaggat atttaatctt ctttacaatc tggttaggaa atattgaatt 7080

ttacatacct tttagtttca tctaactgca gaactaggtt attttgtgcc ttagaagctg 7140

attaacacag aggtatctga actgctgtga gaaaaacggg aaccctacct gtacgagttt 7200

gtatttatgc ttcatgtgac atatttccac atttaacagc taacatgtag ttctgtaagt 7260

cttcttatgt tctgttattt ttatcatgtg catgtaaacg agggctacta ttattttgtt 7320

ttaccatctg tccttgttta attaccgcct gtgatcttgt cgactatatg aacagcatct 7380

agctgcaata tcacaggtac cattcagagg caggttggca ttcattagtg gaaattattc 7440

ttgaccacta tggactggaa accgatcaag ctgcagtcac ctttttcgtt tgtctggttc 7500

cagttgccct ggacgtattt ataaagtttt gggtaggtct actctctacc ttaaagtcaa 7560

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cattaaattt aatattcttg ttaagctcca acatttagta gctacatctt ttggatgatg 7800

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<210> 6

<211> 421

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Leu Asp His Tyr Gly Leu Glu Thr Asp Gln Ala Ala Val Thr Phe Phe

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<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

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atgagttgct acgtggtcag ctctagcggc gttgcgttct ggttcgccgt agaggagagg 60

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Glu Asp Asp Lys Phe Gln Thr Trp Lys Ser Lys Ala Glu Ala Ile Val

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gccttctcct cgtcggacgg ctgttggtct gcaccgcaga gagaagagtg gagggcttcc 2760

gatggagaat ggcgaggagg ggtgcgcccc ccaaccgccg atgttgcaga ctttgaggtc 2820

gctatccatg gggaaaacag catgcccgcc gcccgtgggg aaaaccgcat gcccaagatc 2880

cccgacgcag cggacgagat cgaggtcctt tgcgcagtga agcgcaactg ggaggagcga 2940

cagctgcaga ccacgcatct cccgcacacg ccgacgcgct aggaggccgc gcgcaacagc 3000

ctgcagcctc accgccgccg acacgtggcg gatagcgatc caagccggaa gcggtgacgg 3060

cgacataggg aacttgatct gttggatggg gacgccctgg gacggcggcg gcgctaatgg 3120

gaacgaggtc gtcgcagtcc cgtcgtaggg catcccatac tggtacgaga tgaccggcgc 3180

cgtggtcgcg tccaagggcg gcgtcggcgg gggtagctgc tgttggtgtg gcggcggagg 3240

aggtggctgc tggggatgcg gctggggcgc atagggcccg acgaggaagg ccctgatgcc 3300

cgccacggcc tgccgtaatt ccaggattgc gattgtcatc tgctccgggg tgaggacgag 3360

ggcggacggc gccggggcag agggtgcaat cgcccttgag aacgccagca cgcccaatgc 3420

cggcgcgcct gctgtgtggg gcagcagcgc cgatgaagac gctggtggcg gcgggtaggt 3480

gtgcggcggc ggcgggtggg aagaactcgg tgaagggctg gacaggatcg aatccgggaa 3540

agctgatacc agattgttat gtggccgcta gaaggagggc gcgagagggc atgcccacgg 3600

ccgggcaaga gggaagggat ttccttctta attgttgctt ggttagattg atacatctcc 3660

ttcccttata tagagaggtt tacttgactc cccagcaagg cttacttgac ccctaagcaa 3720

gcgaccctta tctctaatta accctaagac taacgggcta taccgccagc ccaggcccat 3780

taggcccatt acgtactcta acacgtgtag ctagtgcctt tgtgaagcca tccgcaattt 3840

ggtccttgga gtgaacaaac cgaatatcca attctttatt tgctactcgt tccctcacaa 3900

aatgataatc aatctcaata tgcttggtac gagcatgaaa gataggatta gctgacaaat 3960

atgtagcacc aaggttgtca caccaaagac atggtgtttg agtgtgatat gttccaagtt 4020

ccttgagcat ggactttacc cagataattt ctattgttgc attcgctagt gccttgtatt 4080

ctgcctcagt actggatcta gaaactgtgg catgtttctt tgcacacaag gagatcaagt 4140

taggaccaaa gaaaactgca aaaccaccag ttgaccttct atcatctaag caacctgccc 4200

agccagaatc agaaaaagca ctaacaagtg tagatgatga cttgctaaaa gttaacccaa 4260

cactcaatgt gtgtctcaca tatctcaata tgcgttttgc ggcagtccaa tgagcagtgg 4320

ttggtgcatg aaggtattga caaactttat ttactgcaaa ggaaatatca ggcctggtga 4380

gagtcaagta ctgaagtgca cctaccaaac ttctgtactt agtaccatcc tcttgattca 4440

agagttctcc ttcagcaagt gagagcttct ctgaactgga caagggtatt ggagagggtt 4500

tacaaccctg taagccaaat ctactcaaaa ggtcagtggc atatttttcc tgagagagat 4560

gaagatcacc ttctctattt ctcttaacct cggtaccaag aaagaaatgc aagtcaccta 4620

gatccttgag agcaaattct gaattcaaat ctgataagag agctttgact gcttcatttg 4680

acgagcttgt gacaatgata tcatcaacat agatatgtac aaaaattgaa gtatttgact 4740

tattgtaaat gaacagagat gtatcagatt ttggaggagt gaagccaagg tgttgcaact 4800

ttgcacttag gcgagaatac catgctctgg gagcttgttt cagtccatga agagatctgt 4860

caagcctgca tatgtgagac agtttgtttt tatctacaaa ctcaggaggt tgcttcatat 4920

atactttctc ttccagaaca ccatgaagga gcacattctg cacatctagc tgtctgagac 4980

tccatcctct ggacacaaca atagatagaa caagacgaat agtagcagcc ttaacaacag 5040

gactcaaagt atcttcataa tctatgccat acctctgttt aaaaccttta gccacaagcc 5100

tggctttata tcgatctatc gtaccatcag accttctttt tttcctgaaa acccacttgc 5160

aatcaatcac atttttacct tgccgtgagg gaactaaacg ccacgtgtta tttctctgaa 5220

gagcctgata ctcatcctcc atagcttgct tccaatttgg accagcgagg gcctcctgat 5280

atgtatgggg ttctcccgtg aaagcagcca aaccatattt aattttgtaa tttgtaggct 5340

gaataacacc tgctcgaaga cgtgtgtatg gtggtgtagc agcgcatggc tgcatagaag 5400

atccaagccc tgctgcggaa gaatcaatgg caacagcttc ctcggacgaa gctgccgatc 5460

ccgaagaaac atcgcccaca cccgtcggat cctctgcagc cgaggacaac acaggggatc 5520

caagagacgg cgcagatgat ctaggcactg caggcgaagc cggctcggat cgggcaccca 5580

cacatgatag ggacaggccc gccgggtgtg aaccggtggc tcaggcggga agcgcgtggt 5640

cgaggggccc gtgggaccgg ttggtggagc gcacccgcag gatcggtgcc agccgtggag 5700

cgacacgtgg ccggtggcgg ttggtgcggc gcagacgtcc ccatgcgccc agtggcgggc 5760

gaccgcgtgc tggcgggcga gtggcgcggg tcggaggagg gcgccggact ggacggcacc 5820

tgttgggaag tggatcccaa agcagatcct gtcggctctg acgcggtcag gggcgtggat 5880

cccgagagcg atcgcggcag ctctagtgtg acagctagag gatgcggtac aacaccgttt 5940

ttgtcccaaa ttgcaccatt atgaccatca ttttcagcgg tgtttgcacc tgtatcatca 6000

gactcaaaag gcggattaga agcattagtc aatatttgga tcattacaat catcactacc 6060

cacatgatca actccggaga gatgagaagg aaggagaaga atctccttgt gaaggagagc 6120

accggcattg ggatgaagtt tggaaaaagg aaactgagtt tcatcgaaca caacatcacg 6180

agagatatac acaccgccag aggaaacatc aaggcactta acacccttgt gttgtgcact 6240

gtaaccaagg aagacacatt gttgagattg aaacataagc ttgcgagaat tgtaaggatg 6300

aaggtttggc caacaagcac aaccaaaaac acgaagtgta gtataatcag gtgtgacctg 6360

tagaaggcgt tcagtgggag tttcattggc tatggtgcga ctaggccaca tattgataag 6420

atgagcggcc gtaagaaatg cttcgtccca aaattttaaa ggcatggaag ctgaagctag 6480

aacctagaag ggtaagacct acttcaacaa tgtgacgatg tttcctctct gcagaaccat 6540

tttgttgatg agcatggagg caagacacgt gatgagaaat acctatcttt tgagaaaaag 6600

aatttagctt ctcatattca ccaccccagt cggattgcgg caatgatttt gctatcaaac 6660

ttacgttcaa caagagcttg aaagttatga aagacttgga acacatcaga acgtttttta 6720

agaaggtata tccacgtgta cttgctataa tcatcaacaa aacttacaaa ataagaatgc 6780

ccaccaacag agtgggcgct ggaccccaaa cattagaaaa aataagttgc aatggtttgg 6840

tagacacact agtagaaata ggatatgcca attgatgact ttttgctctt tggcatgaat 6900

cacaaatagt ttttgaattt ctctcaccaa caactgggag tttatttttg ctaagaattt 6960

gatgaacggt agcaaacgag ggatggccta aaggactatg ccacctttta gcagaaagct 7020

tgatggcacc atagacttgt ttactgagtt gacaataccg aggaagcaat gcatagagcc 7080

cttaaacaca tatgccccta tggagaactt tcttcgtgac ctgatccttg atcaaaaaga 7140

aaaaggggtg aaactcaaga aagacattgt tatcaagggc aatgcgatga acggaaagaa 7200

gtgtttttga agcagtagga acatgcaaga ttccgttaag aactagactt ctatgtgggg 7260

tttcgataat tgattgacca atatgactaa tctccatacc tgcaccattg gctgcgatgt 7320

agatctgatc atggccacgg tatttttcag gcatagtcac cttctcgagt tcaccggtga 7380

tatgatttgt agcgcccgtg tctaaatacc aattggcatc gacaccataa gaagcatcag 7440

ctgtagctgc ggtttttttc ttttgggaat tgtcatcggc ataacgccaa tcacaatctt 7500

tggcaaggtg gttagttctt tttaccaatt tggcccctgc cttcgtagcc ttcgtacccc 7560

tgaaagttat tgcaccccct ggtgttgttg taggaggggc gcctagggtt gtagctgctg 7620

ccggagttac cctggggatg gtatagccgc cgccaccccc attgtgatga ccaccaccac 7680

tgttgtggtg atagtcgcca cagtgaccac cattggggcc gcccccacca gagtagccac 7740

cattagggtt gttgtagccg ccaccgtcgt ggccgccacc agatcgtgat ccgccgccac 7800

cgcctccctt ctgctggccg caaaagccct taggagttcc ttggcggccg ccgctggaaa 7860

ttgcgttttc tgaagatttg aagccggcaa cacctgtctc gtggaacatc tggactctct 7920

gattgaagtt ggccaccatg gagaacaaga tctcgacggt gatcggctcg gtgcggatgt 7980

ccaaggtaga gatgatgggt tgatactcca tatcaagccc tgccacgatg aaggaaacga 8040

gctcgtcctc ctggatcggc ttgcccgccg ccgcgagttc gtcggaggga gcacgcatgg 8100

cgccgaagta tgctgctgcc gactggttgc ccttctgtgc gttggtgagg gaggcacaga 8160

tgttgttgat gcgtgagagg gagacggctg agaacatggt gctcaacgcc gtccagatgg 8220

cacgcgaggt ttccatcgac gcgacctgaa cgagcgcctc tttggataga ttgcgaagga 8280

ggcacacgac gatttgctga tcttggacga gccatggggc ataggcaggg ttcgggatca 8340

cctagtcctt gccctcttta tcttttgtgg tgatggtttt gggaggctcc tctagggttt 8400

gatctatata gccatacaag ccagtgccca ttatctggga tcccgcttga gctcgccaga 8460

gaacataatt cgtccgggag agtggctcgg aggtgttgta gttgaggacg gaggtgatgg 8520

gggcggcaga ggttgacggc ggaaggtggt tggagggaga tcgaaggagg ctagctagat 8580

gtgatggaag ggcctgatct gaataccatg ttgaattcat gctccagcca actcatccag 8640

aagtccgaac tgatgaaggg agacaggcaa tatatttcaa caagacgttt ccatcacgtt 8700

ttacatggta tcagagccaa gatgtcttaa gttcaagatc gtgccaatgc agtattaaaa 8760

acaaatattc tgcggcctac ataaaaccca cgtctaagga ctaaataagc ctatacgtga 8820

ggggggtgtt gaaatatatt gcccgtctcc ctccatcagt tcggactttt ggatgagttg 8880

gctggagcat aaattcaaca gtgtccacgt tttctgtgca tgataatggc tttttttctc 8940

cccctaataa taggcaagtt atcttgttat caattgtcat gcatcttgct cttactgtcg 9000

cctatgcttc caggttgcaa tgataaagtt cacaggatat aagttgctaa acaatatctc 9060

ggacagtggg aaggcttttc ttatcatttt agtgtcagat atccttctag ggtaagttat 9120

atcaattcat ttctgaaatg tgtctgtatt tgtcttttgg tgtcatgata tatttatctc 9180

tctagttctc tgaattttcc atttagaaca atgcatttat agttacaagt gatcctagaa 9240

atagaactga gtaaacaaca tgttgtctta gtgttcttgt tatttctctc ggtgatgaag 9300

taaattgttc atttaaaaaa aatagaagtg accaaagtgc gcataagatt ttttttcgtt 9360

ctttcctgcc ttctatgaga cgtttataac ttattttatg tgttagaatc ttaataaacc 9420

aacgagttag gatatttaat cttctttaca atctggttag gaaatattga atttacatac 9480

cttttagttt catgtaactg cagaactagg ttattttgcg ccttagaagc tgattaacac 9540

agaggtatct gaactgctgt gagaaaaacg ggaaccctac ctgtccgagt ttgtatttat 9600

acttcatgtg acatatttcc acatttaaca gctaacatgc agttctgtaa ctctgcttat 9660

gttctgttat ttttgtcatg tgcatgtaag cgaaggctac tattattttg ttttaccatc 9720

tgtccttgtt taattaccgc ctgtgatctt gtcgactata tgaacagcat ctagctgcaa 9780

tatcacaggt accattcaga ggcaggttgg cattcattgg tggaaattat tcttgaccac 9840

tatggactgg aaaccgatca agctgcagtc acctttttcg tttgtctggt tccagttgcc 9900

ctggacgtat ttataaagtt ttgggtaggt ctactctcta ccttaaagtc aagctacaag 9960

ggacatcaca ctatatttat taatataaag aaaaccatat ttgctgttag aactcataat 10020

aattttgaaa gttcttttca taataaaacg tgtacgagat gtttgaacga atatgcttca 10080

gacttccctt cattccacat ttcagcaact ccggcactaa cacatcaaat tgcattaaat 10140

ttaatatttt tgttaaaccc taaaccctaa accctaaacc ctaaactata tttaatatta 10200

tgttagaact cataataatt taatatgacg tatttataaa attgcagtaa atttaatatt 10260

tttgttaagc tccaacattt agcagctata tcttttgcat gatgcaatgc aacttcattt 10320

tcctgaaact actctgtata agtgtcacta acaattcaca ttgtaatgta caagtaccaa 10380

tggctcacaa gtcataatta ggagtacctg ttcgctggat tagattggca tacttagttt 10440

agtttccata ttttgcaggt gtacaaatac cttccaagat tatcacctag tgtgggaaac 10500

atcttggatg aaataaggcg tcactag 10877

Claims (10)

1.制备转基因小麦的方法，其特征在于：包括使受体小麦基因组的ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低，获得所述转基因小麦，

所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：

(1)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的产量提高；

(2)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的衰老延缓；

(3)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的氮素利用率提高。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用基因编辑的方式使所述受体小麦基因组的ARE1基因发生突变导致ARE1蛋白活性和/或丰度降低；

所述基因编辑具体采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统中的gRNA的靶序列为序列1第6915-6934位核苷酸所示和/或序列2第1-20位核苷酸所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述CRISPR/Cas9系统为如下任一种：

(b1)包括特异gRNA和Cas9蛋白；所述特异gRNA中的靶序列识别区如序列表的序列1中第6915-6934位核苷酸所示和/或序列表的序列2中第1-20位核苷酸所示；

(b2)包括特异DNA分子和Cas9蛋白的编码基因，所述特异DNA分子转录得到所述特异gRNA；

(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒和具有所述Cas9蛋白的编码基因的质粒；

(b4)包括特异重组质粒，所述特异重组质粒表达所述特异DNA分子和所述Cas9蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述特异gRNA为核苷酸序列如序列表中序列1的第6915-7017位核苷酸所示DNA分子和/或如序列表中序列2所示DNA分子转录获得的gRNA；

或，所述特异DNA分子为所述特异gRNA的编码基因或表达所述特异gRNA的表达盒。

5.制备转基因小麦的方法，其特征在于：为如下1)或2)：

1)采用权利要求2-4任一项中的CRISPR/Cas9系统对受体小麦进行基因编辑，得到转基因小麦；

2)将权利要求3所述特异重组质粒导入受体小麦，得到转基因小麦；

所述转基因小麦具有下述至少一种特性的：

(1)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的产量提高；

(2)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的衰老延缓；

(3)与所述受体小麦相比，所述转基因小麦的氮素利用率提高。

6.一种制备无转基因的基因编辑小麦的方法，其特征在于：包括

1)按照权利要求1-4的方法制备所述转基因小麦或按照权利要求5的方法制备转基因小麦；

2)将所述转基因小麦自交，得到自交后代；

3)从所述自交后代中筛选无转基因的基因编辑小麦；

所述无转基因的基因编辑小麦具有下述至少一种特性的：

(1)与受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的产量提高；

(2)与受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的衰老延缓；

(3)与受体小麦相比，所述无转基因的基因编辑小麦的氮素利用率提高。

7.DNA分子，其特征在于：

所述DNA分子为在序列表中序列5所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第444-448位核苷酸缺失、第1311-1358位核苷酸缺失、第448位核苷酸缺失和第1338-1347位核苷酸缺失；

所述DNA分子为在序列表中序列7所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第441-473位核苷酸缺失、第1575位插入1个核苷酸、第448位核苷酸缺失和第1568-1578位核苷酸缺失；

所述DNA分子为在序列表中序列9所示的DNA分子发生如下至少一种突变形成的DNA分子：第435-459位核苷酸缺失、第1319位T替换为A和第425-1360位核苷酸缺失。

8.权利要求3或4中所述的特异gRNA或权利要求2-4任一项所述的特异DNA分子。

9.用于基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统如权利要求2-4任一项中所述的CRISPR/Cas9系统。

10.权利要求1-6任一项所述的方法、权利要求7所述的DNA分子、权利要求8所述的特异gRNA、权利要求8所述的特异DNA分子、权利要求9所述的CRISPR/Cas9系统、ARE1基因、ARE1蛋白或降低ARE1蛋白活性和/或丰度的物质的应用，其特征在于：所述应用为如下任一种应用：

(1)在提高小麦产量中的应用；

(2)在延缓小麦衰老中的应用；

(3)在提高小麦氮素利用率中的应用

(4)在小麦育种中的应用。

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