CN111961126B - TaVQ25基因在调控小麦对白粉病和纹枯病抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TaVQ25基因在调控小麦对白粉病和纹枯病抗性中的应用，所述基因为茉莉酸信号传导相关的基因TaVQ25，编码TaVQ25蛋白。本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除了小麦TaVQ25基因，获得了白粉病和纹枯病抗性明显提高的小麦新种质。本发明提高了小麦抗白粉病和纹枯病的能力，创新了小麦抗病种质资源，对新品种培育、环境卫生和粮食安全具有重要意义，具有重大的应用推广价值。

Description

TaVQ25基因在调控小麦对白粉病和纹枯病抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中TaVQ25基因在调控小麦对白粉病和纹枯病抗性中的应用。

背景技术

VQ蛋白是一类植物特异性蛋白，都有一个保守的VQ-motif:FxxxVQx(L/V/F)TG，其中x是任意氨基酸。2002年，VQ蛋白在拟南芥中被首次发现，目前该类蛋白已在小麦、棉花、玉米、葡萄、大豆等植物中被发现并鉴定。对VQ功能的研究发现，其不仅参与调控植物的多种生命过程，还参与植物对生物和非生物胁迫的应答。由于小麦基因组庞大和异源六倍体原因，小麦VQ成员的鉴定和生物学功能有待进一步研究。

小麦白粉病是由小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)引起的一种流行性病害，在苗期和成株期均可发生并产生危害，小麦白粉病侵害小麦植株地上部各器官，以叶片为主，发病严重时还可危害茎秆和穗部，在流行年份可造成5％～34％的产量损失。

小麦纹枯病是主要由丝核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染小麦茎秆基部引起，造成茎秆基部腐烂，小麦抗倒伏能力下降，严重时发生死苗和枯白穗，导致产量损失。

大量的研究表明，培育和种植抗病品种是防治小麦白粉病和纹枯病最经济、有效和安全可靠的途径，而品种的抗病性鉴定、抗源的筛选和抗病新基因挖掘是提高小麦抗病性研究的基础。传统杂交育种耗时长、工作量大，且难以做到状定向改良；物理、化学、生物等诱变手段很难做到精确定点突变。而近年来，以CRISPR/Cas9技术为代表的基因组定点编辑技术成为了植物育种和直接研究基因功能的新手段，基本原理是利用设计的一段sgRNA(single-guide RNA)介导Cas9核酸酶对靶标位点进行特异性识别和靶向切割，并利用胞内易错修复机制引入突变。操作简单，实验周期短，费用低，后期还可以甩掉载体序列得到不含转基因的新型种质资源，已经成为高效、便捷获得特定基因突变体的技术，对种质资源创新和基因功能研究具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高小麦对白粉病和/或纹枯病的抗性。

为了解决以上技术问题，本发明提供了TaVQ25基因在调控小麦对白粉病和纹枯病抗性中的应用，所述TaVQ25基因编码TaVQ25蛋白，所述TaVQ25蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：

A1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一种所示的氨基酸序列的蛋白质；

A2、将序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一种所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物白粉病抗性和/或纹枯病抗性相关的蛋白质；

A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上述应用中，序列表中的SEQ ID NO：3由212个氨基酸残基组成，序列表中的SEQID NO：5由206个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID NO：7由205个氨基酸残基组成。

上述应用中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述应用中，所述TaVQ25蛋白可来源于小麦。

上述应用中，所述TaVQ25基因具体可为如下D1或D2所示的基因：

D1、编码链的编码序列(ORF)是序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6中任一种的DNA分子；

D2、核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6中任一种的DNA分子。

上述应用中，所述调控可通过抑制或降低所述TaVQ25基因的表达进行。具体可为通过CRISPR-Cas9敲除所述TaVQ25基因实现。

为了解决上述技术问题，本发明提供了抗白粉病和/或纹枯病的试剂，所述试剂的活性成分为抑制编码所述TaVQ25蛋白的基因的表达、降低所述TaVQ25蛋白的丰度、和/或敲除编码所述TaVQ25蛋白的基因的物质。

上述抗白粉病和/或纹枯病的试剂中，所述物质含有下述F1、F2或F3：

F1、靶向所述基因的sgRNA、siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA；

F2、产生靶向所述基因的sgRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的siRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的shRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的miRNA的DNA分子或产生靶向所述基因的反义RNA的DNA分子；

F3、产生靶向所述基因的sgRNA的表达载体、产生靶向所述基因的siRNA的表达载体、产生靶向所述基因的shRNA的表达载体、产生靶向所述基因的miRNA的表达载体或产生靶向所述基因的反义RNA的表达载体。

上述抗白粉病和/或纹枯病的试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的抗病效果确定。

为了解决上述技术问题，本发明的还提供一种提高小麦抗病性的方法，包括如下步骤：抑制受体小麦中所述TaVQ25蛋白的表达、降低所述TaVQ25蛋白的丰度、和/或敲除编码所述TaVQ25蛋白的基因，得到抗病性高于所述受体小麦的目的小麦；所述抗病性为对白粉病和/或纹枯病的抗性。

上述方法中，所述抑制受体小麦所述TaVQ25蛋白的表达、降低所述TaVQ25蛋白的丰度、和/或敲除编码所述TaVQ25蛋白的基因可通过CRISPR/Cas9系统实现，所述CRISPR/Cas9系统包括表达含有Cas9和sgRNA质粒，所述sgRNA的靶序列可为序列表中SEQ ID NO：8的第1-20位。

上述方法中，所述sgRNA的编码DNA为序列表中SEQ ID NO：1的第6915-7017位。

在本发明的具体的实施方式中，CRISPR/Cas9系统的重组载体包括重组载体pCXUN-Cas9-gRNA；重组载体pCXUN-Cas9-gRNA具有103个核苷酸组成的sgRNA的编码DNA，对应所述的DNA分子为序列表中SEQ ID NO：1的第6915-7017位。

上述方法中，所述目的小麦为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组其中一个或者两个或者三个在靶点区域发生突变。

本发明还提供蛋白质，为TaVQ25蛋白，是如下A1、A2或A3的蛋白质：

A1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一种所示的氨基酸序列的蛋白质；

A2、将序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一种所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物白粉病抗性和/或纹枯病抗性相关的蛋白质；

A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

本发明还提供所述蛋白质的核酸分子，所述核酸分子具体为如下D1或D2所示的核酸分子：

D1、编码序列是序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6中任一种的DNA分子；

D2、核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6中任一种的DNA分子。

本发明提供调控基因表达的物质在调控小麦对白粉病和/或纹枯病的抗性中的应用或在制备调控小麦对白粉病和/或纹枯病的抗性产品中的应用，所述基因编码TaVQ25蛋白，为茉莉酸信号传导相关的基因TaVQ25。本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除了小麦TaVQ25基因，获得了白粉病和纹枯病抗性明显提高的小麦新种质。本发明提高了小麦抗白粉病和纹枯病的能力，创新了小麦抗病种质资源，对新品种培育、环境卫生和粮食安全具有重要意义，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中部分T₀代转TaVQ25基因植株测序结果图，其中TaVQ25-WT-A是野生型郑麦7698的TaVQ25基因的A基因组序列；TaVQ25-WT-B是野生型郑麦7698的TaVQ25基因的B基因组序列；TaVQ25-WT-D是野生型郑麦7698的TaVQ25基因的D基因组序列；TaVQ25-15-A是T₀代TaVQ25-15的TaVQ25基因的A基因组序列；TaVQ25-15-B是T₀代TaVQ25-15的TaVQ25基因的B基因组序列；TaVQ25-15-D是T₀代TaVQ25-15的TaVQ25基因的D基因组序列；TaVQ25-67-A是T₀代TaVQ25-67的TaVQ25基因的A基因组序列；TaVQ25-67-B是T₀代TaVQ25-67的TaVQ25基因的B基因组序列；TaVQ25-67-D是T₀代TaVQ25-67的TaVQ25基因的D基因组序列；TaVQ25-283-A是T₀代TaVQ25-283的TaVQ25基因的A基因组序列；TaVQ25-283-B是T₀代TaVQ25-283的TaVQ25基因的B基因组序列；TaVQ25-283-D是T₀代TaVQ25-283的TaVQ25基因的D基因组序列。下划线表示gRNA靶标序列；加粗下划线表示插入的碱基；“－”表示删除一个碱基；“+1”表示增加了一个碱基；“-2”表示删除了2个碱基，“wt”表示与野生型郑麦7698相同。

图2为本发明实施例1中部分T₁代转TaVQ25基因植株检测Cas9/gRNA/hptII电泳图，其中M为2K marker，wt为野生型郑麦7698，1-20是随机挑选的20个T₁代TaVQ25-15植株，“+”是阳性对照，“-”是空白对照。

图3为本发明实施例1中T₃代转TaVQ25基因植株测序结果图。下划线表示gRNA靶标序列；加粗下划线表示插入的碱基；“－”表示删除一个碱基；“+1”表示增加了一个碱基；“-2”表示删除了2个碱基。TaVQ25-WT-A是野生型郑麦7698的TaVQ25基因的A基因组序列；TaVQ25-15-5-5-A是TaVQ25-15-5-5(属于T₃代TaVQ25-15)的TaVQ25基因的A基因组序列，以此类推。

图4为本发明实施例1中T₃代转TaVQ25基因植株小麦纹枯病的抗性鉴定结果，其中，CK是对照野生型郑麦7698；以t-test分析各植株与CK相比的显著性分析结果，*表示0.01<P<0.05；**表示0.001<P<0.01；***表示P<0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的小麦品种郑麦7698，中感白粉病，记载于非专利文献“Guo G,LeiM,Wang Y,Song B,Yang J，et al.Accumulation of As,Cd,and Pb in sixteen wheatcultivars grown in contaminated soils and associated health risk assessment[J].Journal of Environmental Research and Public Health,2018,15(11):2601.”，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

实施例1

一、制备重组质粒

人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA为环形质粒。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。SEQ ID NO：1中自5’端起，第115-367位核苷酸与NOS终止子反向互补，第392-4522位核苷酸与Cas9蛋白的编码基因反向互补，第4544-6533位核苷酸与Ubi启动子反向互补，第6552-6914位核苷酸为U6启动子，第6915-7017位核苷酸为sgRNA的编码基因(其中第6915-6934位核苷酸为靶序列识别区)。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA表达sgRNA，sgRNA的靶序列位于小麦TaVQ25基因中，具体标靶序列如SEQ ID NO：8所示。

小麦cDNA中：A基因组(对应A染色体组)中的TaVQ25基因的编码区如序列表的序列SEQ ID NO：2所示(编码序列表的SEQ ID NO：3所示的蛋白质)；B基因组(对应B染色体组)中的TaVQ25基因的编码区如序列表的SEQ ID NO：4所示(编码序列表的序列SEQ ID NO：5所示的蛋白质)；D基因组(对应D染色体组)中的TaVQ25基因的编码区如序列表的序列SEQ IDNO：6所示(编码序列表的序列SEQ ID NO：7所示的蛋白质)。

二、利用sgRNA通过基因枪法获得基因编辑小麦

1、基因枪介导的小麦遗传转化

1.1、取授粉后14天左右的小麦品种郑麦7698的幼胚，作为外植体。将外植体接种于高渗培养基，22-25℃暗培养1-2天。

高渗培养基：MS基本培养基添加了蔗糖，蔗糖浓度是180g/L。

1.2、以重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA作为待转化DNA，采用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪对完成步骤1的幼胚进行轰击(Psi900，27.5cmHg柱)，轰击后的幼胚转移到新的诱导培养基上，22-25℃暗培养2-3周。

诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，添加了Vc(维生素C)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和蔗糖的培养基，诱导培养基中Vc的浓度为100mg/L、2,4-D的浓度为0.5mg/L，蔗糖浓度是120g/L。PH＝5.8。

1.3、取完成步骤1.2的外植体，依次进行再生和壮苗培养，得到T₀代植株415株。具体的方法如下：

再生培养：将诱导培养后的抗性愈伤转移到再生培养基上，光照培养3-6周，16hday/8h night，24℃。

再生培养基以MS培养基为基本培养基，添加了2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和CuSO₄和Zeatin，其中2,4-D的浓度为0.05mg/L，CuSO₄的浓度为5mmol/L，Zeatin浓度是5mg/L。培养基含15mg/L浓度的潮霉素Hpt，该培养基的pH值为5.8。

壮苗培养：将绿色幼苗转移到壮苗培养基上，光照培养3周，16hday/8h night，24℃。

壮苗培养基以1/2MS培养基为基本培养基，添加了25g蔗糖，该培养基的pH值为5.8。

2、定点编辑的检测

2.1、对T₀代植株的鉴定

供试植株为：415株步骤一得到的T₀代植株、郑麦7698(作为参照植株)。

(1)分别提取415株供试植株的叶片的基因组DNA为模板，在载体序列Cas9基因上设计特异扩增引物，进行转基因阳性植株初步鉴定。

(2)将上述初步鉴定出的阳性植物的基因组DNA为模板，用TaVQ25的A，B，D基因组特异引物进行PCR扩增。这三对基因组特异引物分别为：

AF1和AR1组成的引物对(A基因组特异性引物)

AF1：5’-GACGCAAGAAGAGCTGAGCTG-3’；

AR1：5’-CGAAGCTGATGACCGGCGTG-3’；

BF1和BR1组成的引物对(B基因组特异性引物)

BF1：5’-CTCCCACGCAGCAAGCAGAG-3’；

BR1：5’-CGAAGTTGATGACGGGCGCC-3’；

DF1和DR1组成的引物对(D基因组特异性引物)

DF1：5’-CGACCTGTACCGCTACGACG-3’；

DR1：5’-GGGAGTGCTGCAGGTGGTTC-3’。

TaVQ25基因PCR反应体系：Fast Pfu buffer 5μL、PCR stimulant 5μL、dNTP 2μL、上下游引物(10μM)各0.5μL、Pfu 0.5μL、DNA模板约200ng、ddH₂O补足至25μL。反应条件如下：95℃2min、95℃20s、A基因组69℃20s/B基因组67℃20s/D基因组62℃20s、72℃20s，进行35个循环。

(3)完成步骤(2)后，将PCR扩增产物送样测序。

如果植株DNA的PCR扩增产物只有一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，该植株为野生型。如果植株DNA的PCR扩增产物为两种，一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，另一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该植株为杂合型。如果植株DNA的PCR扩增产物为两种，均与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该植株为双等位突变型。如果植株DNA的PCR扩增产物为一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该植株为纯合突变型。如果植株DNA的PCR扩增产物核苷酸序列为三种以上，该植株为嵌合型。杂合型、双等位突变型、纯合突变型、嵌合型的植株统称为编辑植株。

415株植株(T₀代转TaVQ25基因植株)中，初步鉴定结果为53株Cas9阳性植株，进一步测序结果表明其中19株为编辑植株(4.6％)。部分植株TaVQ25的A、B、D基因组序列的测序结果见图1。

(4)以上述19株编辑植株的基因组DNA为模板，进行如下鉴定：

采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因；

Cas9-F：5’-TCGACAAGAAGTACTCCATCGGC-3’；

Cas9-R：5’-CAAGAGAGAGGGCGATCAGGTTG-3’。

采用TaU6-F和TaU6-R组成的引物对鉴定sgRNA基因；

TaU6-F：5’-CTGACAGTTCTGGTGCTCAAC-3’；

TaU6-R：5’-AAAGCACCGACTCGGTGCCA-3’。

采用Hpt-F和Hpt-R组成的引物对鉴定hptII基因。

Hpt-F：5’-GAGGGCGTGGATATGTCCTG-3’；

Hpt-R：5’-ATTGACCGATTCCTTGCGGT-3’。

PCR反应体系：Fast Pfu buffer 5μL、PCR stimulant 5μL、dNTP 2μL、上下游引物(10μM)各0.5μL、Pfu 0.5μL、DNA模板约200ng、ddH₂O补足至25μL。反应条件如下：95℃2min、95℃20s、56℃20s、72℃20s，进行35个循环。

部分T₀代编辑植株(T₀代转TaVQ25基因植株)基于靶序列A，B，D基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带sgRNA基因的情况和携带hptII基因的情况见表1。

表1

注：i代表插入，i1代表插入1个核苷酸，依次类推；d代表缺失，d2代表缺失2个核苷酸，依次类推；wt代表野生型；“/”的前和后分别代表两条染色体；例如，i1/wt代表对于D基因组中的靶序列来说，一条染色体为i1，另一条染色体为野生型。Y代表鉴定结果为阳性性。

2.2、对T₁代植株的鉴定

取T₀代植株TaVQ25-15、T₀代植株TaVQ25-67、T₀代植株TaVQ25-283，分别进行自交并收获T₁代种子，培育T₁代种子获得T₁代植株。

部分T₁代植株按照上述2.1中步骤(4)的方法检测Cas9/gRNA/hptII，结果见图2，各项鉴定的结果见表2。

表2

注：相关符号的含义同表1。6i1代表6株为i1纯合突变，10i1/wt代表10株为i1/wt杂合突变，以此类推。

结果表明，T₀代TaVQ25被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T₁代，对于定点编辑的TaVQ25的双等位突变株系通过严格的自交，T₁分离情况符合孟德尔遗传规律，在T₁代株系中没有发现新的变异类型。在T₁代可获得靶区域发生突变且不携带载体序列的编辑株系。

2.3、CRISPR/Cas9的脱靶分析

根据网上预测软件(http://crispr.dbcls.jp/)，输入TaVQ25基因序列，选择Wheat(Triticum aestivum L)genome,IWGSC1.0+popseq(Nov,2014)库，对gRNA可能存在的脱靶位点进行预测，结果显示所选的gRNA并未预测到脱靶位点存在。

三、性状的检测

1、材料获取

供试编辑植株：步骤二得到的TaVQ25-15、TaVQ25-67、TaVQ25-283自交得到T₁代植株，将选择的该T₁代植株自交，获得T₂代种子，按照步骤二的方法对各个T₂代植株进行鉴定，从T₂代植株中选择基于靶序列的纯合突变类型，并且不携带载体序列的植株(TaVQ25-15-1-1，TaVQ25-15-1-5，TaVQ25-15-1-15，TaVQ25-15-5-5，TaVQ25-67-2-7，TaVQ25-67-2-18，TaVQ25-283-7-4)自交得到T₃代种子即为T₃代不携带载体序列的植株。将起源于T₀代植株TaVQ25-15的T₃代不携带载体序列的植株命名为T₃代TaVQ25-15、将起源于T₀代植株TaVQ25-67的T₃代不携带载体序列的植株命名为T₃代TaVQ25-67、将起源于T₀代植株TaVQ25-283的T₃代不携带载体序列的植株命名为T₃代TaVQ25-283。T₃代TaVQ25-15、T₃代TaVQ25-67、T₃代TaVQ25-283的植株基因型见图3。以T₃代TaVQ25-15、T₃代TaVQ25-67、T₃代TaVQ25-283作为供试编辑植株进行下一步的抗病性鉴定。

2、性状的检测

供试植株为T₃代TaVQ25-15、T₃代TaVQ25-67、T₃代TaVQ25-283，以郑麦7698作为供野生型对照植株。

白粉病菌E09记载于非专利文献“程天灵.山西省小麦品种对白粉病的抗性鉴定与评价.2019.江苏农业科学”，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

2.1、小麦白粉病抗性分析

(1)在大田条件下，每个株系正常培育50株供试植株。同时种植诱发行和对照植株。

(2)待供试植株生长至拔节期，在诱发行上采用扫抹接种白粉病菌E09。

(3)在小麦灌浆期，采用0～9级标准调查记载病情，小麦白粉病病级标准(参见程天灵.山西省小麦品种对白粉病的抗性鉴定与评价.2019.江苏农业科学)，具体见表3。

表3

其中，0级为免疫，1～2级为高抗，3～4级为中抗，5～6级为中感，7～8级为高感，9级为极感。鉴定结果见表4。

表4

注：CK是野生型郑麦7698。

鉴定结果表明，野生型郑麦7698植株表现为中感白粉病，T₃代TaVQ25-15、T₃代TaVQ25-67、T₃代TaVQ25-283植株均表现为中抗白粉病，表明敲除TaVQ25基因小麦抗白粉病能力获得了一定水平的提高。

2.2、小麦纹枯病抗性分析

纹枯病菌R0301记载于非专利文献“余蓬勃.小麦苗期抗纹枯病鉴定方法的改良及抗病品种筛选.2019.植物病理学报”，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

(1)在大田条件下，每个株系正常培育50株供试植株。同时种植对照植株。

(2)待供试植株生长拔节期，采用牙签接种法接种纹枯病菌R0301。

(3)在小麦灌浆期，采用5级病情分级标准进行病情分级，小麦纹枯病病级标准(王福玉.山东省小麦主栽品种对纹枯病的抗性鉴定及评价.2016.现代农业科学)具体见表5，并计算病情指数。

表5.小麦纹枯病病级标准

小麦纹枯病病级(IT)	小麦纹枯病病症
		0级	叶鞘、茎秆均无病斑；
1级	为叶鞘发病，但不侵入茎秆
		2级	为病斑侵入茎秆不足茎周的1/4
3级	病斑侵入茎秆茎周的1/4～1/2
		4级	植病斑侵入茎秆茎周的1/2～3/4
5级	病斑侵入茎秆茎周的3/4以上并出现枯白穗

病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×相应病级)/(总株数×最高病级)]×100。

鉴定结果见图4，表明，相比于野生型郑麦7698植株，TaVQ25基因敲除突变体T₃代TaVQ25-15、T₃代TaVQ25-67、T₃代TaVQ25-283植株对小麦纹枯病的抗性显著提高，表明敲除TaVQ25基因小麦纹枯病能力获得了一定水平的提高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> TaVQ25基因在调控小麦对白粉病和纹枯病抗性中的应用

<130> GNCSY201698

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcgagc tcggtacccc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt 60

aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcccgatcta 120

gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt 180

ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata 240

acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga aattatatga 300

taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc caaatgtttg 360

aacgatcggg gaaattcgga tccccaatac ttcaatcgcc gccgagttgt gagaggtcga 420

tgcgtgtctc gtagaggcct gtgatagact ggtggatgag ggtggcgtcg agaacctcct 480

tggtagaggt gtagcgcttg cggtcgatgg tggtgtcgaa gtacttgaag gcggctggag 540

cgccgaggtt ggtgagggtg aagaggtgga tgatgttctc ggcctgctcg cgaattggct 600

tatcgcggtg cttgttgtag gcgctgagca ccttatcgag gttggcatcg gcgaggatca 660

cgcgcttgga gaactcggag atctgctcga tgatctcgtc gaggtagtgc ttgtgctgct 720

cgacgaacag ctgcttttgc tcgttgtcct ctggggagcc cttgagcttc tcgtagtggg 780

aggcgaggta gaggaagttc acgtacttgg acgggagagc aagctcgttg cccttctgaa 840

gctcgccagc agaggcgagc attctcttgc ggccgttctc aagctcgaag aggctgtact 900

tcgggagctt gatgatgagg tccttcttca cctccttgta gcccttggcc tcgaggaagt 960

cgattgggtt cttctcgaag ctgctgcgct ccatgatcgt gatgcccagc agctccttga 1020

cggacttgag cttcttgctc ttgcccttct cgaccttggc aaccacgagc acagagtagg 1080

ccacggtcgg agaatcgaag ccgccatact tcttcgggtc ccagtccttc ttgcgggcga 1140

tcagcttgtc ggagttgcgc tttgggagga tggactcctt ggagaagccg ccggtctgaa 1200

cctcggtctt cttcacgatg ttcacttgcg gcatggagag caccttgcgc actgtggcga 1260

aatccctgcc cttgtcccac acgatctcgc ctgtctcgcc gtttgtctcg atgagcggcc 1320

tcttcctaat ctcgccgttg gcgagcgtga tctcggtctt gaagaaattc atgatgttgg 1380

agtagaagaa gtacttggcg gtcgccttgc cgatctcttg ctcggacttg gcgatcatct 1440

tgcgcacgtc gtacaccttg tagtcgccgt acacgaactc ggactcgagc tttgggtact 1500

tcttgatgag ggctgtgccc accacggcat tgaggtaggc gtcgtgggcg tggtggtagt 1560

tgttgatctc gcgcaccttg tagaactgga agtccttgcg gaagtcggac acgagcttgg 1620

acttgagggt gatgaccttc acctcgcgga tgagcttgtc gttctcgtcg tacttggtgt 1680

tcatgcggga gtcgaggatc tgggccacgt gctttgtgat ctggcgtgtc tcgacgagct 1740

ggcgcttgat gaagccggcc ttatcaagct cggaaaggcc gcctctctcg gccttggtga 1800

ggttgtcgaa cttcctctgg gtgatgagct tggcgttgag gagctggcgc cagtagttct 1860

tcatcttctt gacgacctct tcggacggca cgttatcgga cttgcccctg ttcttgtcgg 1920

agcgggtgag caccttgttg tcgatggagt cgtccttcag gaaggactgc ggcacaatat 1980

ggtccacgtc gtagtcggag aggcggttga tgtccagctc ttggtccacg tacatgtcgc 2040

ggccgttctg gaggtagtag aggtagagct tctcgttctg gagctgggtg ttctcgactg 2100

ggtgctcctt gaggatctgg gagcccagct ccttaatgcc ctcctcgatc ctcttcatgc 2160

gctcgcggga gttcttttgg cccttctgtg tggtctggtt ctcgcgggcc atctcgatca 2220

cgatgttctc tggcttgtgc ctgcccatca ccttcaccag ctcgtccacc accttcacgg 2280

tctggagaat gcccttcttg atagccgggg agccggcgag attggcgata tgctcatgga 2340

gggaatcgcc ttggccggac acctgggcct tttggatgtc ctccttgaag gtgagggagt 2400

cgtcgtggat gagctgcatg aagttgcggt tggcgaagcc gtcggacttg aggaagtcga 2460

ggatcgtctt gccggactgc ttgtcgcgga tgccgttgat gagcttccta gagagcctgc 2520

cccagccggt atagcgcctg cgcttcagct gcttcatcac cttgtcgtcg aagaggtggg 2580

cgtatgtctt gaggcgctcc tcgatcatct cgcggtcctc gaagagggtg agggtgagca 2640

cgatgtcctc gaggatgtcc tcgttctcct cgttgtcgag gaagtccttg tccttgataa 2700

tcttgaggag gtcgtggtag gtcccgaggg aggcattgaa cctatcctcg acgccggaga 2760

tctcgacgga gtcgaagcac tcgattttct tgaagtagtc ctccttgagc tgcttcacgg 2820

tcaccttgcg gttggtcttg aacagcaggt cgacgatggc cttcttttgc tcgccgctaa 2880

ggaaagctgg cttcctcatc ccctcggtca cgtacttcac cttggtcagc tcgttgtaca 2940

cggtgaagta ctcgtagagg agtgagtgct tcgggagcac cttctcgttc gggaggttct 3000

tgtcgaagtt ggtcatgcgc tcgatgaaag actgggcaga ggcgccctta tccaccacct 3060

cctcgaagtt ccagggggtg attgtctcct cggactttct ggtcatccag gcgaacctgg 3120

agttgcccct ggcgagcggg cccacgtagt acgggatgcg gaaggtgagg atcttctcaa 3180

tcttctcgcg gttgtccttg aggaacgggt agaagtcctc ttgcctgcgg aggatagcat 3240

gaagctcgcc gaggtggatc tggtgcggga tggagccatt atcgaaggtg cgctgcttgc 3300

ggaggaggtc ctctctattg agcttcacga gcagctcctc ggtgccgtcc atcttctcga 3360

ggatcggctt gatgaacttg tagaactcct cttgagaagc gccgccatcg atgtagccgg 3420

cgtagccgtt cttggactgg tcgaagaaga tctccttgta cttctctggg agctgctgtc 3480

tcacgagggc cttgaggagt gtgaggtcct ggtggtgctc gtcgtacctc ttgatcatgg 3540

aggcggagag tggggccttg gtgatctcgg tgttcaccct gaggatgtcg ctgaggagga 3600

tggcgtcgga gagattcttg gcggcgagga acagatcggc gtactgatcg ccaatctggg 3660

cgaggagatt gtcgaggtcg tcgtcgtagg tgtccttgga aagctggagc ttggcgtcct 3720

cggcgaggtc gaagttggac ttgaagttcg gggtgaggcc aagagagagg gcgatcaggt 3780

tgccgaagag gccattcttc ttctcgcccg gaagttgggc gatcagattc tcgagcctgc 3840

gggacttaga gagcctggca gagagaatag ccttggcgtc aacgccagag gcgttgatcg 3900

ggttctcctc gaacagctgg ttgtaggtct gcacgagctg gatgaacagc ttgtccacat 3960

cggagttgtc cgggttgagg tcgccctcga tgaggaagtg gcccctgaac ttgatcatgt 4020

gggcgagggc gaggtagatg agcctgaggt cggccttatc ggtggagtcg acgagcttct 4080

tgcggaggtg gtagatggtc gggtacttct cgtggtaggc cacctcatcc acgatgttgc 4140

cgaagatcgg atggcgctcg tgcttcttgt cctcctcgac gaggaagctc tcctcgagcc 4200

tgtggaagaa gctgtcgtcc accttggcca tctcgttgga gaagatctct tggaggtagc 4260

agatgcggtt cttgcgcctg gtgtacctgc gtctagcggt cctcttgagc cttgtagcct 4320

cggctgtctc gccagagtcg aacagcaggg cgccgatgag attcttcttg atggagtggc 4380

ggtcggtgtt gccgaggacc ttgaacttct tggacggcac cttgtactcg tcggtgatca 4440

cggcccagcc aacagaattg gtgccgatgt cgaggccgat ggagtacttc ttgtcgacct 4500

tgcgcttctt ctttggggcc atagtattgg ggatcccccg ggctgcagaa gtaacaccaa 4560

acaacagggt gagcatcgac aaaagaaaca gtaccaagca aataaatagc gtatgaaggc 4620

agggctaaaa aaatccacat atagctgctg catatgccat catccaagta tatcaagatc 4680

aaaataatta taaaacatac ttgtttatta taatagatag gtactcaagg ttagagcata 4740

tgaatagatg ctgcatatgc catcatgtat atgcatcagt aaaacccaca tcaacatgta 4800

tacctatcct agatcgatat ttccatccat cttaaactcg taactatgaa gatgtatgac 4860

acacacatac agttccaaaa ttaataaata caccaggtag tttgaaacag tattctactc 4920

cgatctagaa cgaatgaacg accgcccaac cacaccacat catcacaacc aagcgaacaa 4980

aaagcatctc tgtatatgca tcagtaaaac ccgcatcaac atgtatacct atcctagatc 5040

gatatttcca tccatcatct tcaattcgta actatgaata tgtatggcac acacatacag 5100

atccaaaatt aataaatcca ccaggtagtt tgaaacagaa ttctactccg atctagaacg 5160

accgcccaac cagaccacat catcacaacc aagacaaaaa aaagcatgaa aagatgaccc 5220

gacaaacaag tgcacggcat atattgaaat aaaggaaaag ggcaaaccaa accctatgca 5280

acgaaacaaa aaaaatcatg aaatcgatcc cgtctgcgga acggctagag ccatcccagg 5340

attccccaaa gagaaacact ggcaagttag caatcagaac gtgtctgacg tacaggtcgc 5400

atccgtgtac gaacgctagc agcacggatc taacacaaac acggatctaa cacaaacatg 5460

aacagaagta gaactaccgg gccctaacca tggaccggaa cgccgatcta gagaaggtag 5520

agaggggggg ggggggagga cgagcggcgt accttgaagc ggaggtgccg acgggtggat 5580

ttgggggaga tctggttgtg tgtgtgtgcg ctccgaacaa cacgaggttg gggaaagagg 5640

gtgtggaggg ggtgtctatt tattacggcg ggcgaggaag ggaaagcgaa ggagcggtgg 5700

gaaaggaatc ccccgtagct gccgtgccgt gagaggagga ggaggccgcc tgccgtgccg 5760

gctcacgtct gccgctccgc cacgcatttc tggatgccga cagcggagca agtccaacgg 5820

tggagcggaa ctctcgagag gggtccagag gcagcgacag agatgccgtg ccgtctgctt 5880

cgcttggccc gacgcgacgc tgctggttcg ctggttggtg tccgttagac tcgtcgacgg 5940

cgtttaacag gctggcatta tctactcgaa acaagaaaaa tgtttcctta gtttttttaa 6000

tttcttaaag ggtatttgtt taatttttag tcactttatt ttattctatt ttatatctaa 6060

attattaaat aaaaaaacta aaatagagtt ttagttttct taatttagag gctaaaatag 6120

aataaaatag atgtactaaa aaaattagtc tataaaaacc attaacccta aaccctaaat 6180

ggatgtacta ataaaatgga tgaagtatta tataggtgaa gctatttgca aaaaaaaagg 6240

agaacacatg cacactaaaa agataaaact gtagagtcct gttgtcaaaa tactcaattg 6300

tcctttagac catgtctaac tgttcattta tatgattctc taaaacactg atattattgt 6360

agtactatag attatattat tcgtagagta aagtttaaat atatgtataa agatagataa 6420

actgcacttc aaacaagtgt gacaaaaaaa atatgtggta attttttata acttagacat 6480

gcaatgctca ttatctctag agaggggcac gaccgggtca cgctgcactg caggaattcg 6540

atatcaagct tgaccaagcc cgttattctg acagttctgg tgctcaacac atttatattt 6600

atcaaggagc acattgttac tcactgctag gagggaatcg aactaggaat attgatcaga 6660

ggaactacga gagagctgaa gataactgcc ctctagctct cactgatctg ggtcgcatag 6720

tgagatgcag cccacgtgag ttcagcaacg gtctagcgct gggcttttag gcccgcatga 6780

tcgggctttt gtcgggtggt cgacgtgttc acgattgggg agagcaacgc agcagttcct 6840

cttagtttag tcccacctcg cctgtccagc agagttctga ccggtttata aactcgcttg 6900

ctgcatcaga cttgtccgtg ttgagcagcg tcacgtttta gagctagaaa tagcaagtta 6960

aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttggt 7020

accctgcatg ggagaggcgg tttgcgtatt ggtttaaaca tagctaaact atcagtgttt 7080

gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taacggatat 7140

ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc caaccacagg 7200

gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg ctgctatagt gcagtcggct 7260

tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc taagttacgc 7320

gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt agtcgcataa 7380

agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat gaacaagagc gccgccgctg 7440

gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac caacgggccg 7500

aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc accaggcgcg 7560

accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctagccct ggcgacgttg tgacagtgac 7620

caggctagac cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg gacattgccg agcgcatcca 7680

ggaggccggc gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc 7740

cggccgcatg gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat 7800

cgaccgcacc cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg 7860

ccctaccctc accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg 7920

caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact 7980

tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga 8040

cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc 8100

atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg 8160

gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg 8220

catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc 8280

gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg 8340

cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac 8400

gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa 8460

cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc 8520

cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg 8580

gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag 8640

tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact 8700

tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg ggcaaccgcc gacctggtgg 8760

agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt 8820

cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg 8880

agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg 8940

ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc 9000

tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa 9060

aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt 9120

ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga 9180

tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc 9240

tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt 9300

tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat 9360

gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc 9420

cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc 9480

ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg 9540

caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg 9600

gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt 9660

aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg 9720

ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac 9780

cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca 9840

gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat 9900

ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc 9960

cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa 10020

gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg 10080

aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc 10140

tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat 10200

tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat 10260

tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca 10320

ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga 10380

gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag 10440

tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac 10500

ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt 10560

gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg 10620

aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt 10680

gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc 10740

taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct 10800

ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta 10860

cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta 10920

cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc 10980

ccacatcaag gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 11040

gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 11100

tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag 11160

cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 11220

caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc 11280

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 11340

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 11400

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 11460

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 11520

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 11580

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 11640

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 11700

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 11760

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 11820

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 11880

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 11940

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 12000

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 12060

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 12120

gtcatgcatt ctaggtacta aaacaattca tccagtaaaa tataatattt tattttctcc 12180

caatcaggct tgatccccag taagtcaaaa aatagctcga catactgttc ttccccgata 12240

tcctccctga tcgaccggac gcagaaggca atgtcatacc acttgtccgc cctgccgctt 12300

ctcccaagat caataaagcc acttactttg ccatctttca caaagatgtt gctgtctccc 12360

aggtcgccgt gggaaaagac aagttcctct tcgggctttt ccgtctttaa aaaatcatac 12420

agctcgcgcg gatctttaaa tggagtgtct tcttcccagt tttcgcaatc cacatcggcc 12480

agatcgttat tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct attcgtatag 12540

ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata cagctcgata 12600

atcttttcag ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc atcggcctca 12660

ctcatgagca gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt tggaacaggc 12720

agctttcctt ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt caacatcata ggtggtccct 12780

ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac cagcttatat 12840

accttagcag gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt 12900

ttcaattccg gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct tttctacagt 12960

atttaaagat accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg 13020

cattctaaaa ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt 13080

ataacatagt atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct 13140

gtcatcgtta caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag 13200

cttagttgcc gttcttccga atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac 13260

ggctctcccg ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt 13320

gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa 13380

caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt actgaattaa 13440

cgccgaatta attcggggga tctggatttt agtactggat tttggtttta ggaattagaa 13500

attttattga tagaagtatt ttacaaatac aaatacatac taagggtttc ttatatgctc 13560

aacacatgag cgaaacccta taggaaccct aattccctta tctgggaact actcacacat 13620

tattatggag aaactcgagc ttgtcgatcg acagatccgg tcggcatcta ctctatttct 13680

ttgccctcgg acgagtgctg gggcgtcggt ttccactatc ggcgagtact tctacacagc 13740

catcggtcca gacggccgcg cttctgcggg cgatttgtgt acgcccgaca gtcccggctc 13800

cggatcggac gattgcgtcg catcgaccct gcgcccaagc tgcatcatcg aaattgccgt 13860

caaccaagct ctgatagagt tggtcaagac caatgcggag catatacgcc cggagtcgtg 13920

gcgatcctgc aagctccgga tgcctccgct cgaagtagcg cgtctgctgc tccatacaag 13980

ccaaccacgg cctccagaag aagatgttgg cgacctcgta ttgggaatcc ccgaacatcg 14040

cctcgctcca gtcaatgacc gctgttatgc ggccattgtc cgtcaggaca ttgttggagc 14100

cgaaatccgc gtgcacgagg tgccggactt cggggcagtc ctcggcccaa agcatcagct 14160

catcgagagc ctgcgcgacg gacgcactga cggtgtcgtc catcacagtt tgccagtgat 14220

acacatgggg atcagcaatc gcgcatatga aatcacgcca tgtagtgtat tgaccgattc 14280

cttgcggtcc gaatgggccg aacccgctcg tctggctaag atcggccgca gcgatcgcat 14340

ccatagcctc cgcgaccggt tgtagaacag cgggcagttc ggtttcaggc aggtcttgca 14400

acgtgacacc ctgtgcacgg cgggagatgc aataggtcag gctctcgcta aactccccaa 14460

tgtcaagcac ttccggaatc gggagcgcgg ccgatgcaaa gtgccgataa acataacgat 14520

ctttgtagaa accatcggcg cagctattta cccgcaggac atatccacgc cctcctacat 14580

cgaagctgaa agcacgagat tcttcgccct ccgagagctg catcaggtcg gagacgctgt 14640

cgaacttttc gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt gagttcaggc tttttcatat 14700

ctcattgccc cccggatctg cgaaagctcg agagagatag atttgtagag agagactggt 14760

gatttcagcg tgtcctctcc aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa ggtcttgcga 14820

aggatagtgg gattgtgcgt catcccttac gtcagtggag atatcacatc aatccacttg 14880

ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc 14940

atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg 15000

atggcatttg taggtgccac cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc 15060

tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc 15120

cctttggtct tctgagactg tatctttgat attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc 15180

caccatgtta tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc 15240

cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg 15300

aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac 15360

tgtccttttg atgaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat 15420

taccctttgt tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt 15480

cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac catgttggca agctgctcta gccaatacgc 15540

aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 15600

gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 15660

ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 15720

caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattac 15756

<210> 2

<211> 639

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 2

atgagtgaca ctggctcgag cttcgccaac tggaccgacg acctctaccg ctacgacacg 60

cccagcctgg gcggcgccgc ggcggactcg acgatcgtcg ccgcctccgc gacgccgacg 120

agcccggcgt cggcggggtc cggcgacggg agcccgtccc gggcggcggg cggggccctg 180

ggcccgcggg tggcgggcaa gccggcggcg aggaagcggg cccgggcgtc gcgccgggcg 240

cccgtgacgc tgctcaacac ggacgccagc aacttccgcg ccatggtgca gcagttcacc 300

ggcatcccct ccgcccccgc cggcccgttc tccggcacgc cggtcatcag cttcggcggg 360

gcatccggct acggcttcgc gccgccgccg cagcagcagc agcagcagcc ggcggccgcc 420

ctgtccttcg accaccacca cctccaccag cggcagcagt acaccggcgc ggcattcggc 480

tacggcggca gccacctgca gcactccctc tccggcggcg acgcgttcgc gcacgggctc 540

ggcgccgcgg aggaccggat gctcctccag agcatgcagg cggcgcagat gcccggggcg 600

cgcgccgctc acaacagcgc caatggctac tttgcttga 639

<210> 3

<211> 212

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 3

Met Ser Asp Thr Gly Ser Ser Phe Ala Asn Trp Thr Asp Asp Leu Tyr

1 5 10 15

Arg Tyr Asp Thr Pro Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Asp Ser Thr Ile

20 25 30

Val Ala Ala Ser Ala Thr Pro Thr Ser Pro Ala Ser Ala Gly Ser Gly

35 40 45

Asp Gly Ser Pro Ser Arg Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gly Pro Arg Val

50 55 60

Ala Gly Lys Pro Ala Ala Arg Lys Arg Ala Arg Ala Ser Arg Arg Ala

65 70 75 80

Pro Val Thr Leu Leu Asn Thr Asp Ala Ser Asn Phe Arg Ala Met Val

85 90 95

Gln Gln Phe Thr Gly Ile Pro Ser Ala Pro Ala Gly Pro Phe Ser Gly

100 105 110

Thr Pro Val Ile Ser Phe Gly Gly Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Ala Pro

115 120 125

Pro Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ala Ala Ala Leu Ser Phe Asp

130 135 140

His His His Leu His Gln Arg Gln Gln Tyr Thr Gly Ala Ala Phe Gly

145 150 155 160

Tyr Gly Gly Ser His Leu Gln His Ser Leu Ser Gly Gly Asp Ala Phe

165 170 175

Ala His Gly Leu Gly Ala Ala Glu Asp Arg Met Leu Leu Gln Ser Met

180 185 190

Gln Ala Ala Gln Met Pro Gly Ala Arg Ala Ala His Asn Ser Ala Asn

195 200 205

Gly Tyr Phe Ala

210

<210> 4

<211> 621

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 4

atgagtgaca ctggctcgag cttcgccacc tggactgacg acctctaccg ctacgacact 60

ccgagcctgg gcgccgcggc ggactcgacg atcgtcgccg cctccgcgac gccgacgagc 120

ccggcgtcgg cggggtccgg cgacgggagc ccgtcccggg cggcgggcgg ggccctgggc 180

ccgcgggtgg cgggcaagcc ggcggcgagg aagcgggccc gcgcgtcgcg ccgcgcgccc 240

gtgacgctgc tcaacacgga cgccagcaac ttccgcgcca tggtgcagca gttcaccggc 300

atcccctccg cccccggcgg cccgttctcc ggggcgcccg tcatcaactt cggcggggcc 360

tccggctacg gcttcgcgcc gcagcagcag ccggcgcccg ccctgtcctt cgaccaccac 420

cacctccacc agcggcagca gtacaccggc gcgccattcg gctacggcgg ccacctgcag 480

cactccctcg ccggcggcga cgcgttcgcg cacgggctcg tcggcgctgc ggaggaccgg 540

atgctcctcc agagcatgca ggcggcgcag atgccggggg cgcgcgccgc tcacaacagc 600

gctaatggct acttcgcttg a 621

<210> 5

<211> 206

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 5

Met Ser Asp Thr Gly Ser Ser Phe Ala Thr Trp Thr Asp Asp Leu Tyr

1 5 10 15

Arg Tyr Asp Thr Pro Ser Leu Gly Ala Ala Ala Asp Ser Thr Ile Val

20 25 30

Ala Ala Ser Ala Thr Pro Thr Ser Pro Ala Ser Ala Gly Ser Gly Asp

35 40 45

Gly Ser Pro Ser Arg Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gly Pro Arg Val Ala

50 55 60

Gly Lys Pro Ala Ala Arg Lys Arg Ala Arg Ala Ser Arg Arg Ala Pro

65 70 75 80

Val Thr Leu Leu Asn Thr Asp Ala Ser Asn Phe Arg Ala Met Val Gln

85 90 95

Gln Phe Thr Gly Ile Pro Ser Ala Pro Gly Gly Pro Phe Ser Gly Ala

100 105 110

Pro Val Ile Asn Phe Gly Gly Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Ala Pro Gln

115 120 125

Gln Gln Pro Ala Pro Ala Leu Ser Phe Asp His His His Leu His Gln

130 135 140

Arg Gln Gln Tyr Thr Gly Ala Pro Phe Gly Tyr Gly Gly His Leu Gln

145 150 155 160

His Ser Leu Ala Gly Gly Asp Ala Phe Ala His Gly Leu Val Gly Ala

165 170 175

Ala Glu Asp Arg Met Leu Leu Gln Ser Met Gln Ala Ala Gln Met Pro

180 185 190

Gly Ala Arg Ala Ala His Asn Ser Ala Asn Gly Tyr Phe Ala

195 200 205

<210> 6

<211> 618

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 6

atgagtgaca ctggctcgag cttcgccaac tggaccgacg acctgtaccg ctacgacgct 60

ccgtgcctgg gcggcgctgc ggcggactcg acgatcgtcg cctccgcgac gccgacgagc 120

ccggcgtcgg cggggtccgg cgacgggagc ccgtcccggg cggcgggcgg ggccctgggc 180

ccgcgggtgg cgggcaagcc ggcggcgagg aagcgggccc gcgcgtcgcg ccgcgcgcca 240

gtgacgctgc tcaacacgga cgccagcaac ttccgcgcca tggtgcagca gttcaccggc 300

atcccctcgg cccccgccgg cccgttctcc ggcgctcccg tcatcaactt cggcggggcc 360

tccggctacg gcttcgcgcc gcagcagcag ccggcggccg ccgtgtcctt cgaccaccac 420

ctccaccagc agcggcagca gtacaccggc gcggcattcg gctacgggaa ccacctgcag 480

cactccctct ccggcggcga cgcgttcgcc cacgggctcg gcgcggcgga ggaccggatg 540

ctcctgcaga gcatgcaggc ggcgcagatg cccggggcgc gcgccgctca caacagcgcc 600

aatggctact tcgcttga 618

<210> 7

<211> 205

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 7

Met Ser Asp Thr Gly Ser Ser Phe Ala Asn Trp Thr Asp Asp Leu Tyr

1 5 10 15

Arg Tyr Asp Ala Pro Cys Leu Gly Gly Ala Ala Ala Asp Ser Thr Ile

20 25 30

Val Ala Ser Ala Thr Pro Thr Ser Pro Ala Ser Ala Gly Ser Gly Asp

35 40 45

Gly Ser Pro Ser Arg Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gly Pro Arg Val Ala

50 55 60

Gly Lys Pro Ala Ala Arg Lys Arg Ala Arg Ala Ser Arg Arg Ala Pro

65 70 75 80

Val Thr Leu Leu Asn Thr Asp Ala Ser Asn Phe Arg Ala Met Val Gln

85 90 95

Gln Phe Thr Gly Ile Pro Ser Ala Pro Ala Gly Pro Phe Ser Gly Ala

100 105 110

Pro Val Ile Asn Phe Gly Gly Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Ala Pro Gln

115 120 125

Gln Gln Pro Ala Ala Ala Val Ser Phe Asp His His Leu His Gln Gln

130 135 140

Arg Gln Gln Tyr Thr Gly Ala Ala Phe Gly Tyr Gly Asn His Leu Gln

145 150 155 160

His Ser Leu Ser Gly Gly Asp Ala Phe Ala His Gly Leu Gly Ala Ala

165 170 175

Glu Asp Arg Met Leu Leu Gln Ser Met Gln Ala Ala Gln Met Pro Gly

180 185 190

Ala Arg Ala Ala His Asn Ser Ala Asn Gly Tyr Phe Ala

195 200 205

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 8

gtgacgctgc tcaacacgga 20

Claims (10)

1.TaVQ25基因在调控小麦对白粉病和纹枯病抗性中的应用，所述TaVQ25基因编码TaVQ25蛋白，所述TaVQ25蛋白是氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQID NO：7中任一种所示的氨基酸序列的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TaVQ25基因具体为如下D1或D2所示的基因：

D1、编码链的编码序列是序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6中任一种的DNA分子；

D2、核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6中任一种的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控通过抑制或降低所述TaVQ25基因的表达进行。

4.抗白粉病和/或纹枯病的试剂，其特征在于：所述试剂的活性成分为抑制编码权利要求1中所述TaVQ25蛋白的基因的表达、降低所述TaVQ25蛋白的丰度、和/或敲除编码所述TaVQ25蛋白的基因的物质。

5.权利要求4所述的试剂，其特征在于：所述物质含有下述F1、F2或F3：

F1、靶向所述基因的sgRNA、siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA；

F2、产生靶向所述基因的sgRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的siRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的shRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的miRNA的DNA分子或产生靶向所述基因的反义RNA的DNA分子；

F3、产生靶向所述基因的sgRNA的表达载体、产生靶向所述基因的siRNA的表达载体、产生靶向所述基因的shRNA的表达载体、产生靶向所述基因的miRNA的表达载体或产生靶向所述基因的反义RNA的表达载体。

6.一种提高小麦抗病性的方法，其特征在于：包括如下步骤：抑制受体小麦中权利要求1中所述TaVQ25蛋白的表达、降低权利要求1中所述TaVQ25蛋白的丰度、和/或敲除编码权利要求1中所述TaVQ25蛋白的基因，得到抗病性高于所述受体小麦的目的小麦；所述抗病性为对白粉病和/或纹枯病的抗性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述抑制受体小麦中权利要求1中所述TaVQ25蛋白的表达、降低权利要求1中所述TaVQ25蛋白的丰度、和/或敲除编码权利要求1中所述TaVQ25蛋白的基因通过CRISPR/Cas9系统实现，所述CRISPR/Cas9系统包括表达含有sgRNA和Cas9的质粒，所述sgRNA的靶序列为序列表中SEQ ID NO：8的第1-20位。

8.权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述目的小麦为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组其中一个或者两个或者三个在靶点区域发生突变。

9.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质是氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7中任一种所示的氨基酸序列的蛋白质。

10.编码权利要求9所述蛋白质的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子具体为如下D1或D2所示的核酸分子：

D1、编码序列是序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6中任一种的DNA分子；

D2、核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6中任一种的DNA分子。

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