CN101892259B - 一种siRNA植物基因表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种siRNA植物基因表达载体及其构建方法和应用。本发明siRNA植物基因表达载体的序列如SEQ ID NO：1所示。本发明siRNA植物基因表达载体是将高粱花叶病毒复制酶基因、甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因和甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因序列串联，再以水稻糯性α基因内含子为中间连接序列，将上述串联体连接为反向重复序列，插入植物表达载体pCAMBIA-1300的多克隆位点，得到一个由35S启动子驱动的表达上述三种病毒siRNA的植物基因表达载体。利用本发明siRNA植物基因表达载体转化植物受体材料，可以获得同时抗高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒的转基因植株或材料，应用于农业生产中，可以提高植株的抗病毒能力和生存能力。

Description

一种siRNA植物基因表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及siRNA基因表达载体构建领域，具体涉及一种可使转基因植株或材料同时具备高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒的抗性的siRNA植物基因表达载体及其构建方法和应用。 

背景技术

病毒是威胁植物生产的主要因素之一，由于现有的植物特别是甘蔗的品种及育种材料缺乏抗病性，因此可以通过转基因抗病毒育种来解决病毒病的问题。甘蔗是最重要的糖料作物和最具潜力的能源作物，甘蔗糖占我国食糖总量的90％以上，占全球食糖总量的75％以上，巴西有1/3左右的甘蔗直接用于生产燃料乙醇。作为无性繁殖作物，甘蔗的生物体经加工后才为人类所食用或仅作为能源材料，因此转基因甘蔗具有较高的环境及食品安全性。 

RNA干扰(RNA interference，RNAi)，又称RNA沉默(RNA silencing)，是一种高效基因沉默技术。细胞中出现的双链RNA会被核酸酶识别并切割成一种小分子干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)，siRNA与细胞内蛋白形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，进而降解与siRNA序列互补的mRNA。利用RNAi原理，构建与病毒同源的反向重复序列基因，将其转入植物基因组中进行表达，可生成靶向于病毒的siRNA，进而获得抗病毒作物材料或品种。 

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中存在的植物对常见病毒的抗性不足的问 题，针对siRNA作用靶标具有严格的序列专一性特点，提供一种可以获得抗病毒植株或材料的siRNA植物基因表达载体。 

本发明另一目的在于提供上述siRNA植物基因表达载体的构建方法。 

本发明还有一个目的在于提供上述siRNA植物基因表达载体的应用。 

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 

一种siRNA植物基因表达载体，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明siRNA植物基因表达载体的构建方法是将高粱花叶病毒复制酶基因(SrMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)外壳蛋白基因和甘蔗黄叶病毒(SCYLV)外壳蛋白基因序列串联形成串联体，再以水稻糯性α基因内含子为中间连接序列，将上述串联体连接为反向重复序列，插入植物表达载体Pcambia-1300的多克隆位点，得到一个由35S启动子驱动的表达上述三种病毒siRNA的植物基因表达载体。 

具体地，本发明构建方法包括如下步骤：通过RT-PCR，从感染有高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒或甘蔗黄叶病毒的甘蔗叶组织总RNA抽提物中扩增出上述三种病毒靶序列，如SEQ ID NO：2~4所示；将三段病毒靶序列经酶切、连接后形成串联体，再分别正向和反向插入到植物表达载体pMCG161(GenBank数据库序列号：AY572837)CaMV 35S启动子和水稻糯性α基因内含子下游的多克隆位点，得到反向重复序列，再将该反向重复序列亚克隆到双源载体Pcambia-1300(GenBank数据库序列号：AF234296)的多克隆位点，得到表达高粱花叶病毒复制酶基因、甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因和甘蔗黄叶病毒基因siRNA的植物基因表达载体。 

本发明siRNA植物基因表达载体通过转化植物受体材料，可得到相应的转 基因植株或材料，该转基因植株或材料同时具备对高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒的病毒抗性。 

特别地，将本发明植物基因表达载体转化甘蔗受体材料时，也可得到具有抗病毒特性的甘蔗。 

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 

本发明利用了RNA干扰技术，针对siRNA的作用靶标具有严格的序列专一性的特点，选取了三种病毒最为保守的序列片段作为靶标，将靶标序列串联，得到了siRNA植物基因表达载体，将该载体转化植物受体材料特别是甘蔗时，获得的转基因植株或材料对高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒具有最广谱的病毒抗性，从而提高了植株特别是甘蔗的抗病毒能力，为农业生产带来了极大的便利和收益，避免了因病毒影响导致植株的减产或品质降低，获得的转基因甘蔗具备较高的食品安全性，具有良好的市场前景。 

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例 

1病毒靶标基因序列的扩增及克隆 

1.1PCR引物设计 

根据GenBank中公布的病毒序列，设计SrMV复制酶基因、SCMV外壳蛋白基因和SCYLV外壳蛋白基因序列PCR扩增引物如SEQ ID NO：5~10所示。 

1.2靶标片段RT-PCR扩增 

以感染SrMV、SCMV和SCYLV的甘蔗植株为材料，用总RNA提取试剂(TaKaRa RNAiso Reagent)抽提甘蔗发病叶组织总RNA。以提取的总RNA为模板，用PrimeScriptOne Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd)和1.1中所述的引物分别扩增目的基因片段(方法参照试剂盒说明书)。RT-PCR反应程序为：50℃反转录30min；95℃变性5min；紧接95℃30s，55℃30s，72℃20s 30个循环；72℃延伸5min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段，与pDM18-T载体连接(TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.，Ltd)，连接产物转化大肠杆菌JM109，经Amp^r和蓝白筛选，PCR鉴定、酶切鉴定和测序验证，获得含目的片段的重组质粒克隆。分别命名为SrMVnib/pMD18-T、SCMVcp/pMD18-T和SCYLVcp/pMD18-T。 

2病毒靶标基因序列的串联及克隆 

SrMVnib/pMD18-T用PstI和XbaI双酶切，SCMVcp/pMD18-T用XbaI和SalI双酶切，SCYLVcp/pMD18-T用SalI和BamHI双酶切，pUC18(TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.，Ltd)用PstI和BamHI双酶切，电泳回收目的片段 (240bp、220bp、210bp和2690bp)，上述回收产物分别以碱性磷酸酶(TaKaRa，Shrimp)37℃处理2小时，65℃处理30分钟灭活碱性磷酸酶后，按3∶3∶3∶1混合并用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，经Amp^r和蓝白筛选，PCR鉴定、酶切鉴定和测序验证，获得含SrMVnib-SCMVcp-SCYLVcp串联序列的重组质粒克隆。重组质粒命名为pSVCB。 

3病毒靶标基因反向重复序列构建 

3.1基础质粒构建 

从pMCG161(GenBank序列号：AY572837)中，PCR扩增出35S启动子-MCS-水稻糯性α基因内含子1-MCS-0CS 3′序列。引物序列如SEQ IDNO：11~12所示。 

扩增片段长2980bp。将PCR产物克隆至pMD18-T载体，测序验证，重组质粒命名为IRMCS-T。 

3.2串联重复序列构建 

设计SrMVnib-SCMVcp-SCYLVcp串联序列PCR扩增引物，并在上游引物5′端加Spe I和Asc I酶切位点，下游引物5′端加Sgf I和Avr II酶切位点，引物序列如SEQ ID NO：13~14所示。 

以重组质粒pSVCB为模板，扩增病毒靶标基因串联序列，以Asc I和Avr II分别双酶切PCR产物和质粒IRMCS-T，电泳回收PCR产物(约600bp)和质粒主干(约5500bp)，碱性磷酸酶处理脱5′磷酸基团，65℃处理30分钟灭活碱性磷酸酶后，再用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109，扩繁阳性克隆并以PCR和酶切鉴定重组质粒，该重组质粒命名为pMV-1。 

以Spe I和SgfI分别双酶切PCR产物和质粒pMV-1，电泳回收PCR产物(约 600bp)和质粒主干(约6100bp)，碱性磷酸酶处理脱5′磷酸基团，65℃处理30分钟灭活碱性磷酸酶后，再用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌，扩繁阳性克隆，以PCR和酶切鉴定重组质粒，并对PCR产物进行测序验证。该重组质粒命名为pVIR-1。 

4siRNA植物表达载体构建 

重组质粒pVIR-1和植物表达载体Pcambia1300分别用Hind III和BamHI双酶切。电泳回收VIR目的片段(约4kb)和Pcambia1300主干(约9kb)，按前述方法脱磷，T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，扩繁阳性克隆并以PCR和酶切鉴定重组质粒，得到siRNA植物表达载体，命名为pMRSVD。 

5农杆菌介导的甘蔗胚性愈伤组织转化 

5.1农杆菌工程菌制备 

将siRNA植物表达载体pMRSVD用电击法转化农杆菌EHA105，获得转化用工程菌株pMRSVD/EHA105。 

5.2甘蔗胚性愈伤组织诱导及培养 

分别采用粤糖93-159和粤糖00-236幼叶为外植体，诱导培养形成胚性愈伤组织，胚性愈伤组织继代扩繁2~3代，作为转化受体材料。 

5.3农杆菌工程菌侵染甘蔗胚性愈伤组织 

将受体胚性愈伤组织分割成大小均一的小块，置于无菌滤纸上在超净工作台上风干处理2h，至组织表面干燥，稍有收缩。将小块愈伤组织浸于农杆菌工程菌液中约20min，取出后滤纸吸去余液，接种到含有100μmol/L乙酰丁香酮的胚性愈伤诱导培养基中，在28℃避光共培养48h。 

5.4转化愈伤组织筛选及植株再生 

经过共培养的外植体先用无菌水洗涤4次，再用MS液体培养基洗一次，置虑纸上，在超净工作台上吹干，转移到附加有潮霉素和头孢霉素的分化培养基上，在光照为1200Lux、28℃条件下进行选择培养。选择培养3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入附加有潮霉素的培养基中令其生长。待分化芽长到3~5cm以上时，将其接种到生根培养基上进行生根培养，20d左右长出不定根。待再生苗的根系长得较粗壮，发达时，即可进行炼苗和假植。获得可能的转基因甘蔗植株。 

5.5转基因植株分子鉴定 

可能的转基因植株采用PCR、Southern blot进行鉴定，阳获植株无性繁殖，形成转基因株系。 

5.6转基因植株抗病性鉴定 

转基因株系材料，温室条件下生长至拔节初期，机械摩擦接种高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒，甘蔗绵蚜介体传毒接种甘蔗黄叶病毒，2~3周后，观察接种植株的症状表现，并采用血清学和RT-PCR技术检测植株体内的病毒，鉴定其抗病性。 

本发明采用上述方法获得了32个转基因甘蔗株系，其中19个株系接种病毒后无症状表现，并且血清学和RT-PCR检测三种病毒均为阴性。表明本发明可赋予转基因甘蔗高水平抗病能力。 

一种siRNA植物基因表达载体及其构建方法和应用 序列表

<110>华南农业大学

<120>一种siRNA植物基因表达载体及其构建方法和应用

<130>

<160>14

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>14254

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

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cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga  7020

ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc  7080

cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa  7140

ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag  7200

ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc  7260

aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa  7320

aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga  7380

tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga  7440

aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg  7500

gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg  7560

tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg  7620

tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact  7680

tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt  7740

acgacatatg ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg  7800

atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg  7860

gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc  7920

agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg  7980

agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca aaactcattt  8040

gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc  8100

gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa  8160

gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg  8220

ccaaggcaag accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat  8280

gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc  8340

aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc  8400

caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg  8460

aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt  8520

gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg catcgaggca  8580

gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg  8640

caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca  8700

gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac  8760

gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag  8820

cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat  8880

tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa  8940

gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc  9000

tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta  9060

aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg  9120

gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg  9180

ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag  9240

aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt  9300

tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag  9360

acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc  9420

aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct  9480

ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc  9540

taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt  9600

ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac  9660

ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta agtgactgat  9720

ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat taaaactctt  9780

aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa  9840

gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg  9900

gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa  9960

gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag gcaccctgcc tcgcgcgttt 10020

cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct 10080

gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg 10140

tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat 10200

gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga 10260

tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 10320

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 10380

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 10440

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 10500

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 10560

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 10620

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 10680

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 10740

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 10800

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 10860

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 10920

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 10980

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 11040

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 11100

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgcatt ctaggtacta aaacaattca 11160

tccagtaaaa tataatattt tattttctcc caatcaggct tgatccccag taagtcaaaa 11220

aatagctcga catactgttc ttccccgata tcctccctga tcgaccggac gcagaaggca 11280

atgtcatacc acttgtccgc cctgccgctt ctcccaagat caataaagcc acttactttg 11340

ccatctttca caaagatgtt gctgtctccc aggtcgccgt gggaaaagac aagttcctct 11400

tcgggctttt ccgtctttaa aaaatcatac agctcgcgcg gatctttaaa tggagtgtct 11460

tcttcccagt tttcgcaatc cacatcggcc agatcgttat tcagtaagta atccaattcg 11520

gctaagcggc tgtctaagct attcgtatag ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag 11580

agcctgatgc actccgcata cagctcgata atcttttcag ggctttgttc atcttcatac 11640

tcttccgagc aaaggacgcc atcggcctca ctcatgagca gattgctcca gccatcatgc 11700

cgttcaaagt gcaggacctt tggaacaggc agctttcctt ccagccatag catcatgtcc 11760

ttttcccgtt ccacatcata ggtggtccct ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat 11820

aggttttcat tttctcccac cagcttatat accttagcag gagacattcc ttccgtatct 11880

tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt ttcaattccg gtgatattct cattttagcc 11940

atttattatt tccttcctct tttctacagt atttaaagat accccaagaa gctaattata 12000

acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa ccttaaatac cagaaaacag 12060

ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt ataacatagt atcgacggag ccgattttga 12120

aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta caatcaacat gctaccctcc 12180

gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc gttcttccga atagcatcgg 12240

taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg ctgacgccgt cccggactga 12300

tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct 12360

ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac 12420

attgcggacg tttttaatgt actgaattaa cgccgaatta attcggggga tctggatttt 12480

agtactggat tttggtttta ggaattagaa attttattga tagaagtatt ttacaaatac 12540

aaatacatac taagggtttc ttatatgctc aacacatgag cgaaacccta taggaaccct 12600

aattccctta tctgggaact actcacacat tattatggag aaactcgagc ttgtcgatcg 12660

acagatccgg tcggcatcta ctctatttct ttgccctcgg acgagtgctg gggcgtcggt 12720

ttccactatc ggcgagtact tctacacagc catcggtcca gacggccgcg cttctgcggg 12780

cgatttgtgt acgcccgaca gtcccggctc cggatcggac gattgcgtcg catcgaccct 12840

gcgcccaagc tgcatcatcg aaattgccgt caaccaagct ctgatagagt tggtcaagac 12900

caatgcggag catatacgcc cggagtcgtg gcgatcctgc aagctccgga tgcctccgct 12960

cgaagtagcg cgtctgctgc tccatacaag ccaaccacgg cctccagaag aagatgttgg 13020

cgacctcgta ttgggaatcc ccgaacatcg cctcgctcca gtcaatgacc gctgttatgc 13080

ggccattgtc cgtcaggaca ttgttggagc cgaaatccgc gtgcacgagg tgccggactt 13140

cggggcagtc ctcggcccaa agcatcagct catcgagagc ctgcgcgacg gacgcactga 13200

cggtgtcgtc catcacagtt tgccagtgat acacatgggg atcagcaatc gcgcatatga 13260

aatcacgcca tgtagtgtat tgaccgattc cttgcggtcc gaatgggccg aacccgctcg 13320

tctggctaag atcggccgca gcgatcgcat ccatagcctc cgcgaccggt tgtagaacag 13380

cgggcagttc ggtttcaggc aggtcttgca acgtgacacc ctgtgcacgg cgggagatgc 13440

aataggtcag gctctcgcta aactccccaa tgtcaagcac ttccggaatc gggagcgcgg 13500

ccgatgcaaa gtgccgataa acataacgat ctttgtagaa accatcggcg cagctattta 13560

cccgcaggac atatccacgc cctcctacat cgaagctgaa agcacgagat tcttcgccct 13620

ccgagagctg catcaggtcg gagacgctgt cgaacttttc gatcagaaac ttctcgacag 13680

acgtcgcggt gagttcaggc tttttcatat ctcattgccc cccgggatct gcgaaagctc 13740

gagagagata gatttgtaga gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat 13800

gaacttcctt atatagagga aggtcttgcg aaggatagtg ggattgtgcg tcatccctta 13860

cgtcagtgga gatatcacat caatccactt gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt 13920

tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg accactgtcg gcagaggcat 13980

cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt 14040

ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg 14100

atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact gtatctttga 14160

tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt atcacatcaa tccacttgct 14220

ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccac                             14254

<210>2

<211>240

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gcacatatcg cttccagtct atattgtggt agtgatgatc tatcccattc taaaatggcg    60

acaattcttt cctgttccaa ttttgggatg tacatgttgt cgattttaat gcctcgtgtc   120

gacataaacc acaattccgt tctatctctt gtgcgtgatg taaaatcgaa gttgagaccc   180

agatcagaaa agtgttttga aagattgtcc agtagatgtt cgtaatctgg ccgtattgct   240

<210>3

<211>220

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

catctccaac attccggcaa ataatgcatc atttcagtga tgcagctgaa gcatatatcg    60

agtacagaaa ctctacagag cgatacatgc cacgatatgg acttcagcga aatctcaccg   120

actatagctt agcgcggtat gcatttgact tttatgaaat gaattcaagg acaccagcta   180

gagctaagga agcccacatg cagatgaagg ccgcagcagt                         220

<210>4

<211>211

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcggaccgaa cttatctcag tacgcagcgt tcaacaatgg cttactcaaa gcctaccatg    60

agtataaaat cacaagtctc actattcagt ataactcatg ctcctccgac gcaactccag   120

gtgcaatcgc acttgaagtg gatacatcct gctcccaaac aacaacaggc tccaagatta   180

ctagcttccc cgtcaagagg aacgccaaga a                                  211

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

agcaatacgg ccagattacg a                                              21

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcacatatcg cttccagtct                                                20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

catctccaac attccggcaa                                                20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

actgctgcgg ccttcatctg                                                20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tcggaccgaa cttatctcag                                                20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ttcttggcgt tcctcttgac                                                20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gcaattgatt gacaacatgc                                                20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ctgcaaggcg attaagttgg                                                20

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gcactagtgg cgcgccgcac atatcgcttc cagtct                              36

<210>14

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cggcgatcgc ctaggttctt ggcgttcctc ttgac                               35

Claims (3)

1.一种siRNA植物基因表达载体，其特征在于所述表达载体的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述siRNA植物基因表达载体的构建方法，其特征在于所述构建方法包括如下步骤：

(1)病毒靶标基因序列的扩增及克隆：

(a)PCR引物设计：根据GenBank中公布的病毒序列，设计SrMV复制酶基因、SCMV外壳蛋白基因和SCYLV外壳蛋白基因序列PCR扩增引物如SEQ IDNO：5～10所示；

(b)靶标片段RT-PCR扩增：以感染SrMV、SCMV和SCYLV的甘蔗植株为材料，用总RNA提取试剂抽提甘蔗发病叶组织总RNA，以提取的总RNA为模板，用

One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒和引物分别扩增目的基因片段；RT-PCR反应程序为：50℃反转录30min；95℃变性5min；紧接95℃30s，55℃30s，72℃20s 30个循环；72℃延伸5min；反应产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段，与pDM18-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，经Ampr和蓝白筛选，PCR鉴定、酶切鉴定和测序验证，获得含目的片段的重组质粒克隆，分别命名为SrMVnib/pMD18-T、SCMVcp/pMD18-T和SCYLVcp/pMD18-T；

(2)病毒靶标基因序列的串联及克隆：

SrMVnib/pMD18-T用PstI和XbaI双酶切，SCMVcp/pMD18-T用XbaI和SalI双酶切，SCYLVcp/pMD18-T用SalI和BamHI双酶切，pUC18用PstI和BamHI双酶切，电泳回收目的片段，上述回收产物分别以碱性磷酸酶37℃处理2小时，65℃处理30分钟灭活碱性磷酸酶后，按3∶3∶3∶1混合并用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，经Amp^r和蓝白筛选，PCR鉴定、酶切鉴定和测序验证，获得含SrMVnib-SCMVcp-SCYLVcp串联序列的重组质粒克隆，重组质粒命名为pSVCB；

(3)病毒靶标基因反向重复序列构建：

(a)基础质粒构建：从pMCG161中，PCR扩增出35S启动子-MCS-水稻糯性α基因内含子1-MCS-0CS 3′序列，引物序列如SEQ ID NO：11～12所示，扩增片段长2980bp，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，测序验证，重组质粒命名为IRMCS-T；

(b)串联重复序列构建：设计SrMVnib-SCMVcp-SCYLVcp串联序列PCR扩增引物，并在上游引物5′端加Spe I和Asc I酶切位点，下游引物5′端加SgfI和Avr II酶切位点，引物序列如SEQ ID NO：13～14所示；以重组质粒pSVCB为模板，扩增病毒靶标基因串联序列，以Asc I和Avr II分别双酶切PCR产物和质粒IRMCS-T，电泳回收PCR产物和质粒主干，碱性磷酸酶处理脱5′磷酸基团，65℃处理30分钟灭活碱性磷酸酶后，再用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109，扩繁阳性克隆并以PCR和酶切鉴定重组质粒，该重组质粒命名为pMV-1；以Spe I和SgfI分别双酶切PCR产物和质粒pMV-1，电泳回收PCR产物和质粒主干，碱性磷酸酶处理脱5′磷酸基团，65℃处理30分钟灭活碱性磷酸酶后，再用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌，扩繁阳性克隆，以PCR和酶切鉴定重组质粒，并对PCR产物进行测序验证，该重组质粒命名为pVIR-1；

(4)siRNA植物表达载体构建：重组质粒pVIR-1和植物表达载体Pcambia1300分别用Hind III和BamHI双酶切，电泳回收VIR目的片段和Pcambia1300主干，按前述方法脱磷，T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，扩繁阳性克隆并以PCR和酶切鉴定重组质粒，得到siRNA植物表达载体，命名为pMRSVD。

3.权利要求1所述siRNA植物基因表达载体的应用，其特征在于将所述siRNA植物基因表达载体转化甘蔗受体材料，用于提高转基因甘蔗对高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒的抗性。