CN102787126A - 一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法，属于生物技术领域。包括以下步骤：从感染马铃薯卷叶病毒的植物体内经提取总RNA、通过RT-PCR扩增和基因克隆工序得到卷叶病毒的一段保守序列,所述保守序列包括复制酶基因、基因间隔区和外壳蛋白基因，位于卷叶病毒基因组的第3422至3790个核苷酸之间；将保守序列以正向和反向分别连接到一个内含子的两侧，构建成一个反向重复序列，即基因RNAiNibIsCp，然后在基因两端分别连接启动子和终止子。本发明避免了常规抗病毒转基因方式可能引起病毒与转基因发生同源重组或异源包装的潜在生物风险；克隆的序列NibISCp在植物体内能同时沉默PLRV病毒的这3个基因，提高对PLRV病毒的抗性。

Description

一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因的构建方法，具体涉及一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法。 

背景技术

马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus，PLRV)是马铃薯生产中危害最重的病毒之一，在世界各马铃薯产区均有分布。PLRV靠蚜虫(主要是桃蚜(Myzus persicae))以持久、循环增殖型方式传播。马铃薯感染PLRV后，正常的生理功能受到破坏，叶片呈现卷曲、黄化，叶质厚而脆，枝条僵化，植株矮缩，块茎网状坏死，严重影响产量和品质。为了提高马铃薯对卷叶病毒的抗性，生产上采取茎尖脱毒组织培养措施生产病毒含量很低的种薯，但成本高、环节多、工作量大，需要专门的脱毒组培设施，脱毒后的种薯在栽培过程中会受耕作措施及蚜虫的侵染而重新感染病毒，种植两三年后产量又会严重下降；而马铃薯为同源四倍体作物，无性繁殖，以常规育种改良品种，过程复杂需时较长，利用基因工程培育抗病毒马铃薯是从根本上解决病毒侵染的有效途径。 

随着本领域技术的发展，人们把PLRV的基因转入马铃薯，发现能提高抗病性，如张鹤龄（1995）、南相日（2007）分别将PLRV的外壳蛋白基因CP转入马铃薯，Kaniewski等（1994）把PLRV的复制酶基因NIb转入马铃薯，董江丽等（1999）把PLRV的基因间隔序列IS转化马铃薯，都获得了抗病性比非转基因马铃薯提高的植株，但抗病株率较低，抗病水平也不高，难以用于生产。由于这些转基因在马铃薯体内转录的RNA是完整的，有可能与侵入马铃薯体内的其它病毒的RNA发生同源重组或异源包装，引发生物风险。 

RNA干扰是近年来发现的生物对病毒的重大抗性机制。将病毒的某一序列设计成反向重复结构，转入植物体后，转录出的RNA会形成双链结构，被植物体内的核酸酶切割成21-23nt 的小干扰RNA。如果供体病毒侵染植物体，这些小干扰RNA就会介导病毒mRNA与之同源的部分降解，阻断病毒的繁殖，赋予转基因植株稳定遗传的抗病毒性状。由于转基因表达的mRNA会降解，也就规避了与入侵病毒发生同源重组的潜在风险。RNA干扰已用于作物的抗病毒育种，但是，也有一些研究发现RNA干扰抗病效率不高甚至达不到抗病的效果。 

通过大量研究，人们发现RNA干扰的效率与形成的双链RNA的长度和同源性有密切关系。Wesley等(2001) 发现, 双链RNA的长度为 400-800 bp时,基因沉默的效率最为稳定。Helliwell等(2003) 发现, 50-1000 bp的基因片段均能诱发基因沉默,但基因片段越短,基因沉默的效率越低,并认为片段长度为 300-600 bp时是合适的,可以获得最高的基因沉默效率。较长的双链RNA可能诱发更高的沉默效率,但是在进行基因体外操作时将给基因的转化以及表达等产生不利的影响。RNA干扰效率也高度依赖于序列的同源性。植物病毒容易发生变异，形成不同的小种，因此选择病毒基因组中最为保守的区域进行基因沉默会提高抗病效率。也有研究表明，在同一载体中设计针对多个基因的靶位点的RNA干扰的途径对艾滋病毒具有很好的抑制效果。 

PLRV病毒是单链正义RNA病毒，属黄化病毒组(Luteovirus)，基因组全长6.0 kb，中间有一段197 bp的非编码区，也称之为基因间隔区IS。IS将基因组分为5’和3’两个编码区。IS序列在PLRV基因组中比较保守，可能为PLRV亚基因组启动子，控制其下游亚基因组的表达。IS的5’端连接复制酶基因Nib，3’端连接外壳蛋白基因CP。利用RNA干扰沉默PLRV病毒多个基因尚未见报道。本发明利用RT-PCR克隆PLRV病毒的一段序列，该序列包含复制酶基因3’端、基因间隔区和外壳蛋白基因5’端。将克隆是这段序列 构建成反向重复基因结构，以PLRV病毒的复制酶基因、基因间隔区序列和外壳蛋白基因为靶位点进行沉默，以期获得多基因沉默的抗PLRV病毒的马铃薯，提高抗病效率。 

发明内容

本发明是为了解决现有提高马铃薯抗卷叶病毒的方法中存在的问题，提供了一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法。 

本发明是采用如下技术方案实现的： 

一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法，包括以下步骤：

（1）从感染PLRV病毒的马铃薯植物体内提取总RNA，通过RT-PCR扩增和基因克隆工序得到PLRV病毒的一段序列NibIsCp，该序列包括复制酶基因NIB的3’端、基因间隔区IS和外壳蛋白基因CP的5’端，位于卷叶病毒基因组的第3422至3790个核苷酸之间；

（2）将序列NibISCp以正向和反向连接到一个内含子的两侧，构建成1个反向重复基因结构RNAiNibIsCp；

（3）反向重复基因结构RNAiNibIsCp两端分别连接启动子和终止子。

进一步地，所述的RT-PCR扩增，是取感染PLRV病毒的马铃薯块茎的RNA2μL，再加入10μM的反向引物 2μL，10mM dNTP 2μL, ddH2O 12μL,65℃水浴5min，冰浴2min，再加入5×RT缓冲液5μL，RNasin1μL(5U)，M-MLRV酶1μL（100U），混匀后，42℃ 60min，再85℃ 10min，终止反应。 

本发明所基于的理论基础是把源自病毒的基因构建成反向重复序列导入植物体，其转录产物会通过分子内序列互补形成双链RNA结构，这些双链RNA会被植物体内的核酸酶切割成小干扰RNA,如果供体病毒侵入植物体，这些小干扰RNA会介导病毒mRNA中与其同源的部分降解，阻止了病毒的复制和扩散，从而使转基因植物获得抗病性。 

将本发明构建好的抗PLRV病毒的基因RNAiNibIsCp通过DNA重组技术连接到可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的植物表达载体上，例如衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19，以及经过不同的修饰而造成不同的多克隆位点的一系列通称为pGEM的质粒载体（由Promega公司生产）和pBS-T载体（由天根公司生产），尤其是植物表达载体pCAMBIA3301、pBin19、pROKII和pBI121系统等，在本发明的一系列优选实施方案中，选用pBS-T、pCAMBIA3301等，后者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体；然后将植物表达载体转入并整合到马铃薯基因组中，而抗病基因RNAiNibIsCp在马铃薯中的表达可赋予该植物对PLRV病毒的抗性，同时马铃薯的后代及任何部分的组织均具有抗性。上述将携带外源基因的表达载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括a、农杆菌介导法、b、物理法，如基因枪法、电击融合法、显微注射法、超声波法等；c、化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等；d、种植系统转化法，如花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等；e、以花椰菜花叶病毒（CaMV）、双生病毒（Geminiviruses）或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点： 

（1）本发明所述的方法构建的多基因融合的反向重复序列的转录产物会形成一种序列自我互补的双链RNA结构，该结构会激发植株体内的RNAi机制，把该双链结构降解成小片段，因此转基因的mRNA不存在或存在量很少，也不会翻译成蛋白质,避免了常规抗病毒转基因方式可能引起病毒与转基因发生同源重组或异源包装的潜在生物风险；

（2）克隆的序列NibISCp由复制酶基因NIB的3’端序列、基因间隔区IS和外壳蛋白基因CP的5’端序列组成，在植物体内能同时沉默PLRV病毒的这3个基因，提高对PLRV病毒的抗性。

附图说明

图1为马铃薯卷叶病毒基因片段的RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳结果； 

图2为本发明所述的抗性基因RNAiNibIsCp的构建过程示意图。

具体实施方式

以下是本发明的一个具体实施例： 

步骤一：马铃薯卷叶病毒多基因融合序列的获得CCGACACGATCGTGAGCTCG

1、根据PLRV的基因组序列（Accession：NC-001747），设计PCR引物：

正向引物1：5’-GCATCGATTCCGACACGATCGTGAGCTCGT-3’，其5’端人工加有ClaI酶切位点；

反向引物1：5’-CGTGGTTACCTGAACTGTTAGCGCGCCT-3’，其5’端人工加有BstEII酶切位点；

正向引物2：5’-CTGGTACCGACACGATCGTGAGCTCGT-3’，其5’端人工加有KpnI酶切位点；

反向引物2：5’-TCAGATCTGAACTCTGTTAGCGCGCCT-3’，其5’端人工加有BglII酶切位点。

引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。 

2、cDNA第一链合成：提取感染PLRV病毒的马铃薯块茎的RNA，取2μL，再加入10μM的反向引物1 2μL，10mM dNTP 2μL, ddH2O 12μL,65℃水浴5min，冰浴2min，再加入5×RT缓冲液5μL，RNasin1μL(5U)，M-MLRV酶1μL（100U），混匀后，42℃ 60min，再85℃ 10min，终止反应。 

3、PCR扩增：以步骤2反转录合成的第一链cDNA为模板，在正向引物1和反向引物1的引导下，PCR扩增PLRV的融合基因片段。PCR扩增得到的多基因融合序列两侧分别含有人工加上的ClaI酶切位点和BstEII酶切位点，该序列命名为BsCl。 

以步骤2反转录合成的第一链cDNA为模板，在正向引物2和反向引物2的引导下，PCR扩增PLRV的一段序列，该序列是一段多基因融合序列，由复制酶基因、基因间隔区和外壳蛋白基因组成。PCR扩增得到的多基因融合序列两侧分别含有人工加上的KpnI酶切位点和BglII酶切位点，该序列命名为BgKp。 

PCR反应程序是：94℃变性5min ；94℃变性45s，58℃复性1min，72℃延伸1min,30个循环；然后70℃延伸10min。反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，用柱式回收试剂盒（博迈德）回收约370bp的扩增产物。 

图1为马铃薯卷叶病毒基因片段的RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳结果；图中M为DNA 分子量标准，1为利用正向引物1与反向引物1通过RT-PCR扩增的PLRV 基因；2为利用正向引物2和反向引物2通过RT-PCR扩增的PLRV基因。 

4、基因克隆：取步骤3回收的PCR产物与pBS-T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后提取质粒进行酶切鉴定，将阳性克隆送三博远志生物技术有限责任公司进行核苷酸序列测定。测序结果表明，融合基因片段已插入pBS-T载体，得到重组克隆载体。插入了BsCl序列的重组克隆载体命名为pBS-BsCl，插入了BgKp序列的重组克隆载体命名为pBS-BgKp 

表1是克隆的PLRV的一段序列所在的基因组信息

步骤二：构建反向重复基因结构表达载体

中间载体pKANNIBAL上有黄花菊PDK基因742 bp的内含子，内含子上游有KpnI酶切位点，下游有ClaI和BstEII酶切位点。将pBS-BsCl载体用ClaI和BstEII双酶切，把切下的PLRV多基因融合序列定向插入到pKANNIBAL载体上PDK内含子下游的ClaI和BstEII的切口处，使得PDK内含子和PLRV多基因融合序列连接，形成新的融合序列，命名为PDK-BsCl，形成的重组载体命名为pKAN-NibIsCp。

在植物表达载体pCAMBIA-3301的35S启动子下游有BglII和BstEII酶切位点，这2个酶切位点中间是GUS基因。用BglII和BstEII双酶切植物表达载体pCAMBIA-3301，回收去除了GUS基因的大片段；用BstEII和ClaI双酶切重组载体pKANPLRV，回收融合序列PDK-BsCl；用BglII和KpnI双酶切重组克隆载体pBS-BgKp，回收PLRV的融合序列BgKp。将上述回收的3个片段定向连接，构建成了反向重复结构，命名为RNAiNibIsCp，重组的植物表达载体命名为pRNAiNibIsCp。其质粒图谱及其构建过程见附图2。RNAiNibIsCp基因全长1543 bp，无蛋白表达产物，正向序列和反向序列均为369 bp，序列表见附图。 

步骤三、将抗病基因RNAiNibIsCp导入马铃薯： 

用农杆菌介导法将步骤二构建的抗病基因RNAiNibIsCp导入马铃薯，具体方法包括以下步骤：

1、制备农杆菌LBA4404感受态细胞

取28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5的农杆菌LBA4404的菌液于5000rpm离心5min后弃上清，然后加入10mL 0.15M的NaCl溶液悬浮细胞，再5000rpm离心5min后弃上清，用1mL预冷的20mM CaCl₂悬浮细胞，冰浴后分装，液氮中速冻1分钟，置-70℃保存备用；

2、通过冻融直接转化法将融合基因反向重复序列导入农杆菌LBA4404 

取200μL步骤1制备的农杆菌LBA4404的感受态细胞，加入1μg实施例2构建的RNAiNibIsCpi基因的植物表达载体pRNAiNibIsCp，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEB培养基，28℃慢速振荡培养4h后于1000 rpm离心30sec，弃上清，加入0.1mL YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/mL 卡那霉素（Kan）和125μg/mL链霉素（Sm）的YEB平板上，28℃培养48h后，挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养基(含有100μg/mL卡那霉素和125μg/mL Sm)中，28℃振荡培养过夜。对菌液进行PCR鉴定，得到重组农杆菌，命名为LBA4404／pRNAiNibIsCp。

进行PCR鉴定所用引物序列为： 

正向引物：5’-CCGACACGATCGTGAGCTCGT-3’；

反向引物：5’-CTGAACTGTTAGCGCGCCT-3’。

挑取农杆菌LBA4404／pRNAiNibIsCp 单菌落于5ml YEB液体培养基（含100mg/L Sm, 100mg/L Kan）,28℃,150rpm振荡培养16－20h按照1：100转接到YEB液体培养基中，振荡培养到OD₆₀₀0.5；6000rpm离心10min,弃上清。将30ml菌液离心所得沉淀用12ml 10 mM MgSO₄重新悬浮，6000rpm离心10min,弃上清。用高糖液体培养基(MS基本培养基＋1.6％葡萄糖＋5mg/l NAA+0.1mg/l 6-BA,pH5.3)重新悬浮，再重复一次除去抗生素，稀释菌液到OD₆₀₀为0.5，将稀释液倒入灭菌培养皿中。将培养在MS基本培养基上的马铃薯无菌苗的叶片沿叶基部剪下，垂直主脉横切2－3刀（每切口长0.1-1cm,切口间相距4－5mm），叶正面朝下漂浮于稀释的菌液里，轻轻摇动混匀后，静置30min，后转入高糖固体培养基（pH5.8）共培养4d。然后将外植体放入分化培养基(MS基本培养基＋0.02mg/l NAA+0.02mg GA₃+2.0mg/Zeatin+250mg/l Cef)光照培养，诱导生芽，每20d 继代1次，待芽长至1－1.5cm时，将其转入MS基本培养基中诱导生根。 

4、转基因马铃薯的分子检测 

从分化的马铃薯试管苗中切取少量叶片，用SDS法提取基因组DNA,取100ng，进行PCR扩增，同时以构建的载体pRNAiNibIsCp 的扩增产物作阳性对照；以同品种非转基因马铃薯植株的SDS法提取的基因组DNA的扩增产物作阴性对照。反应条件为：94℃变性5min；94℃变性1min；56℃复性1min，72℃延伸1min30s，循环30次；72℃补平8 min。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果表明有20株可扩增出约370 bp的特异性条带，阴性对照未扩增出该特异性条带。

PCR扩增所用引物序列为： 

PrimeF: 5'-CATGAAGGTGCCCACAGAC-3'；

PrimeR: 5'-CGGATTCACAGCAATCAGC-3'。

将PCR检测阳性、生长正常的转基因植株，随机选取8株及1株非转基因马铃薯采用SDS法提取植物基因组DNA,取20μg,用HindIII酶切过夜后，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，之后用毛细管转移法转移到带正电荷的尼龙膜上，以地高辛标记的融合片段为探针，按试剂盒说明（DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit I）进行Southern杂交，结果表明8株转基因植株均有阳性带出现，而非转基因植株则没有相应的阳性带出现。 

步骤四、转基因马铃薯对PLRV病毒的抗性鉴定： 

将经过PCR检测和Southern杂交为阳性的8个植株定为转基因植株。对这8个转基因植株进行无性繁殖，形成8个转基因无性系。在防虫网室，每个无性系种植5株，出苗2周后，用预先饲毒的桃蚜接种PLRV病毒到转基因植株上。接种1个月后，采集接种植株的叶片，每株取0.5g液氮研磨，加5ml样品提取缓冲液（137mM NaCl,1.5mM KH²PO₄,8.1mM KH₂PO₄,2.7mM KCl和3.1mM NaCl₂,Ph7.4,并附加0.2%脱脂奶粉，0.05％Tween20,2%PVP(M44000)匀浆），用双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）方法测定PLRV病毒的含量。有5个转基因无性系的病毒相对含量仅为非转基因对照植株的5%-12%。

<110> 山西省农业科学院作物科学研究所

<120> 一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法

<160> 1

<210> 1

<211> 1543

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum）

<400> 1

CTGAACTCTGTTAGCGCGCCTGCGGAGGGATTGCCTTCTTCGCCTTCTTGGTTGTTGTACACCACCATTGACATTTCCTTTAACCACGACCGTACTCATTAACAATTGACCGCACGTGGGAGGAAATCTTTAGGTAAACAAAATATAAACCGGCTCCTGAAAATGGGATTGCGGATGAGAATCCTAAAGCAAATCCCGCTAAGAATTTATAATCTATTTTGTCCGGTTGATGTAACGAGGCTTGAACTTCCAATGCTTGCAACTCGCGTATGCTTGGCTAGTTTTAGTGAGCTCCTTCAGTGTTCTTTTGTGGTGGCACTCGGAACCAACCACTGGTGGAGCTTGGCAACGAGCTCACGATCGTGTCGGGGTACCCCAATTGGTAAGGAAATAATTATTTTCTTTTTTCCTTTTAGTATAAAATAGTTAAGTGATGTTAATTAGTATGATTATAATAATATAGTTGTTATAATTGTGAAAAAATAATTTATAAATATATTGTTTACATAAACAACATAGTAATGTAAAAAAATATGACAAGTGATGTGTAAGACGAAGAAGATAAAAGTTGAGAGTAAGTATATTATTTTTAATGAATTTGATCGAACATGTAAGATGATATACTAGCATTAATATTTGTTTTAATCATAATAGTAATTCTAGCTGGTTTGATGAATTAAATATCAATGATAAAATACTATAGTAAAAATAAGAATAAATAAATTAAAATAATATTTTTTTATGATTAATAGTTTATTATATAATTAAATATCTATACCATTACTAAATATTTTAGTTTAAAAGTTAATAAATATTTTGTTAGAAATTCCAATCTGCTTGTAATTTATCAATAAACAAAATATTAAATAACAAGCTAAAGTAACAAATAATATCAAACTAATAGAAACAGTAATCTAATGTAACAAAACATAATCTAATGCTAATATAACAAAGCGCAAGATCTATCATTTTATATAGTATTATTTTCAATCAACATTCTTATTAATTTCTAAATAATACTTGTAGTTTTATTAACTTCTAAATGGATTGACTATTAATTAAATGAATTAGTCGAACATGAATAAACAAGGTAACATGATAGATCATGTCATTGTGTTATCATTGATCTTACATTTGGATTGATTACAGTTGGGAAATTGGGTTCGAAATCGATCCGACACGATCGTGAGCTCGTTGCCAAGCTCCACCAGTGGTTGGTTCCGAGTGCCACCACAAAAGAACACTGAAGGAGCTCACTAAAACTAGCCAAGCATACGCGAGTTGCAAGCATTGGAAGTTCAAGCCTCGTTACATCAACCGGACAAAATAGATTATAAATTCTTAGCGGGATTTGCTTTAGGATTCTCATCCGCAATCCCATTTTCAGGAGCCGGTTTATATTTTGTTTACCTAAAGATTTCCTCCCACGTGCGGTCAATTGTTAATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAATGTCAATGGTGGTGTACAACAACCAAGAAGGCGAAGAAGGCAATCCCTCCGCAGGCGCGCTAACAGAGTTCAG  

Claims (3)

1.一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因的构建方法，其特征是包括以下步骤：

（1）从感染马铃薯卷叶病毒的植物体内经提取总RNA、通过RT-PCR扩增和基因克隆工序得到卷叶病毒的一段保守序列, 所述保守序列包括复制酶基因、基因间隔区和外壳蛋白基因，位于卷叶病毒基因组的第3422至3790个核苷酸之间；

（2）将步骤（1）获得的卷叶病毒的保守序列以正向和反向分别连接到一个内含子的两侧，构建成一个反向重复序列，即为提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因RNAiNibIsCp；

（3）将基因RNAiNibIsCp两端分别连接启动子和终止子。

2.根据权利要求1所述的一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因的构建方法，其特征是所述的保守序列包括复制酶基因NIB的3’端、基因间隔区IS和外壳蛋白基因CP的5’端。

3.根据权利要求1或2所述的的一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因的构建方法，其特征是所述的RT-PCR扩增，是取感染PLRV病毒的马铃薯块茎的RNA2μL，再加入10μM的反向引物 2μL，10mM dNTP 2μL, ddH₂O 12μL,65℃水浴5min，冰浴2min，再加入5×RT缓冲液5μL，Rnasin 1μL(5U)，M-MLRV酶1μL（100U），混匀后，42℃ 60min，再85℃ 10min，终止反应。

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