CN117202778A - 植物中可转化性和单倍体诱导的提高 - Google Patents
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Abstract
本文提供了高度可转化的玉米植物，称为HI‑NA植物，及其产生和使用方法。如本文所披露的，HI‑NA植物对于马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α(MATL)基因中的功能失去突变等位基因是纯合的，并且对于负责植物中提高的单倍体诱导和/或转化频率的一个或多个QTL和/或基因等位基因至少是杂合的。如本文所披露的，HI‑NA植物也可具有细胞型A背景，这可使其高度可转化。还提供了产生HI‑NA植物的方法和使用HI‑NA植物编辑植物基因组DNA的方法。
Description
技术领域
本披露涉及植物生物技术领域。特别地，本披露涉及植物转化和植物育种以及基因编辑，包括在难以接受外源转基因的植物中。
对作为文本文件通过EFS-WEB提交的序列表的引用
该序列表的官方副本是通过EFS-Web以ASCII格式的序列表以2022年3月25日生成的名为“82222_ST25.txt”的文件进行电子提交的，该序列表的大小为231KB并且与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式文件中的序列表是本说明书的一部分，并且通过引用以其全文并入本文。
背景技术
数十年来，植物转化(即，将外源DNA(“转基因”)稳定整合到植物基因组中)已经用于为农作物添加新的且有用的性状。虽然一些玉米系相对容易转化(即，接受转基因DNA)，但是大多数品系不容易转化。例如，大多数优良近交系(其是通过几代自花授粉产生的，以获得纯的或接近纯的纯合基因组，并用作亲本系以产生商业上有价值的杂交体)通常不能用外源DNA转化。因此，为了将转基因性状“移动”到近交系中，必须首先将转基因性状转化到可转化的玉米系中。该转化的玉米系很少适用于用作育种平台中的亲本系。因此，将转化的玉米系杂交到近交系中以产生子代植物，子代植物将以杂合方式包含近交亲本和转化亲本两者的基因组。然后，包含转基因的子代植物必须回交到近交系中大约6代或7代，以便尽可能地消除由转化亲本贡献的基因组、同时保留转基因性状。这种性状渐渗过程通常需要三至七年。
已知玉米具有至少五种不同的细胞型(基于线粒体基因组进行分类)：正常A(“NA”)、正常B(“NB”)、细胞质雄性不育C(“CMS-C”或“C”)、细胞质雄性不育S(“CMS-S”或“S”)和细胞质雄性不育T(“CMS-T”或“T”)。仍然可以发现其他细胞型。因此，相对而言，存在于这些不同细胞型中的线粒体和叶绿体通过其基因组可能对植物细胞的表型具有巨大的影响。这些影响现在才被确定。例如，最近发现在可转化性和细胞型之间存在关系。已知可转化的玉米系具有NA细胞型，而已知不可转化的(顽固)玉米系具有NB细胞型。
植物育种中的另一重要工具是单倍体诱导(“HI”)，这类植物现象的特征在于在受精期间或之后的某一时间(常常在早期胚发育期间)从胚中缺失了一个亲本的染色体组(单倍体诱导系亲本的染色体)。已经在多个植物物种中研究了单倍体诱导，例如高梁、大麦、小麦、玉米、拟南芥、和许多其他物种。在玉米中，单倍体种子或胚可以通过在单倍体诱导系雄性(即“单倍体诱导系花粉”)与人们选择的几乎任何穗之间进行杂交而产生。在母本HI系统(例如，基于母系的系统)的情况下，当单倍体诱导系花粉DNA未通过胚的第一次细胞分裂完全传递和/或维持时产生单倍体。所产生的籽粒具有仅含有母本DNA的单倍体胚加正常(受精)三倍体胚乳。在父本HI系统(例如，基于CENH3或基于ig1的系统)的情况下，单倍体在卵子被精细胞受精之后产生，并且母本染色体在细胞分裂时丢失。所产生的籽粒具有仅含有父本DNA的单倍体胚加正常(受精)三倍体胚乳。无论使用何种HI系统，所产生的表型均不完全外显，其中一些胚珠含有单倍体胚，并且其他含有二倍体胚、非整倍体胚、嵌合胚或败育胚。在单倍体诱导后，使用表型或遗传标记筛选典型地将单倍体胚或种子从二倍体和非整倍体同胞中分离出来，并使其生长或培养成单倍体植物。然后将这些植物自然地或经由化学操作(例如，使用抗微管剂例如秋水仙碱)转化成双单倍体(DH)植物，所述植物然后产生近交种子。
DH植物的产生使得植物育种者能够获得近交品系而无需多代近交，从而减少了产生纯合植物所需的时间。DH植物为植物育种者提供了宝贵的工具，特别是用于产生近交品系、数量性状基因座(QTL)定位、细胞质转换、性状基因渗入以及用于高通量性状改良的F2筛选。由于一代基本上产生了纯合品系，因此节约了大量的时间，否定了对多代单一种子血统(传统近交)的需要。特别地，因为DH植物是完全纯合的，它们非常适合于数量遗传学研究。单倍体种子的产生对于双单倍体育种过程至关重要。
发明内容
植物转化是具有挑战性的，特别是在玉米中。很少有植物品系是天然可转化的；绝大多数都不是。此外，单倍体诱导系品系很难育种，因为它们具有奇异的繁殖特征(例如，在繁殖期间DNA的自缺失)。本文提供了高度可转化的玉米植物(称为“HI-NA植物”)及其产生和使用方法。如本文所披露的，HI-NA植物对于马铃薯糖蛋白样磷脂酶(patatin-likephospholipase)A2α基因(其在多种出版物中也称为MATRILINEAL(母系)[MATL]，NOT LIKEDAD(不像父系)[NLD]和PHOSPHOLIPASE(磷脂酶)A1[PLA1]，并且由玉米B73_v4基因IDGRMZM2G471240指示)中的功能失去突变等位基因是纯合的，并且对于在植物中负责提高的单倍体诱导的QTL和/或基因的一个或多个等位基因至少是杂合的。例如，HI-NA植物对于功能丧失的matl突变等位基因可以是纯合的，并且对于在qhir8QTL处的HI等位基因至少是杂合的。此外，HI-NA植物具有细胞型正常A(“NA”)背景，这使其高度可转化。本文提供的HI-NA植物具有显著的单倍体诱导能力(具有至少12％、至少15％或至少18％的单倍体诱导率)以及优异的可转化性(转化率为至少2％、至少5％、至少8％、至少10％、至少12％或至少15％)。HI-NA系可以由来自多种杂种优势群(下文所定义的)的植物产生。
这些高度可转化的HI-NA植物可以用基因编辑机器转化以编辑目的植物品系的基因组DNA，从而改善植物性状。这样的方法描述于例如美国专利号10,285,348和10,519,456中，其各自通过引用以其全文并入。通过提供既是强单倍体诱导系又是高度可转化的容易转化的HI-NA植物，本披露提供了用于高效且有成本效益地编辑作物基因组以产生具有期望性状的植物品系的有用工具。
在一方面，本文提供了对于在马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α基因(MATL)中功能失去突变是纯合的并且对于在至少一个与提高的单倍体诱导相关的数量性状基因座(QTL)(HI-QTL)处的HI等位基因是至少杂合的玉米植物，其中所述玉米植物具有正常A(“NA”)细胞型。在一些实施例中，玉米植物对于在至少一个HI-QTL处的HI等位基因是纯合的。在一些实施例中，玉米植物对于在与提高的转化频率相关的至少一个QTL(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的。在一些实施例中，玉米植物能够表达DNA修饰酶和任选地至少一种指导核酸。
在另一个方面，本文提供了玉米植物，其对于在与提高的转化频率相关的至少一个数量性状基因座(QTL)(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的。在一些实施例中，玉米植物对于在与提高的转化频率相关的至少一个QTL(TF-QTL)处的TF等位基因是纯合的。
在另一个方面，本文提供了产生可转化的单倍体诱导系玉米植物的方法，该方法包括：a)提供来自第一玉米植物的花粉，其中该第一玉米植物是单倍体诱导系植物品系，该品系对于在马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α基因(MATL)的功能失去突变是纯合的，对于在第二基因座处的HI等位基因至少是杂合的，并且是转化顽固的；b)提供第二玉米植物，其中该第二玉米植物包含正常A(“NA”)细胞质，并且任选地，其中该第二玉米植物对于在与提高的转化频率相关的数量性状基因座(QTL)(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的；c)用来自该第一玉米植物的花粉为该第二玉米植物授粉，并从中获得至少一种二倍体子代植物；d)使该至少一种二倍体子代植物自交和/或使该至少一种二倍体子代植物与该第一玉米植物或该第二玉米植物回交至少一代；以及e)从步骤d的杂交中选择子代，其中所选择的子代包含NA细胞型，对于MATL基因中的功能失去突变是纯合的，对于第二基因座处的HI等位基因至少是杂合的，并且任选地，对于TF-QTL处的TF等位基因至少是杂合的。
在另一个方面，本文提供了产生可转化的单倍体诱导系玉米植物的方法，该方法包括：a)提供来自第一玉米植物的花粉，其中该第一玉米植物是单倍体诱导系植物品系，该品系对于在马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α基因(MATL)的功能失去突变是纯合的，对于在第二基因座处的HI等位基因至少是杂合的，并且是转化顽固的；b)提供第二玉米植物，其中该第二玉米植物在与提高的转化频率相关的数量性状基因座(QTL)(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的；c)用来自该第一玉米植物的花粉为该第二玉米植物授粉，并从中获得至少一种二倍体子代植物；d)使该至少一种二倍体子代植物自交和/或使该至少一种二倍体子代植物与该第一玉米植物或该第二玉米植物回交至少一代；以及e)从步骤d的杂交中选择子代，其中所选择的子代对于MATL基因中的功能失去突变是纯合的，对于第二基因座处的HI等位基因至少是杂合的，并且对于TF-QTL处的TF等位基因至少是杂合的。
在另一个方面，本文提供了产生可转化的单倍体诱导系玉米植物的方法，该方法包括：a)提供来自第一玉米植物的花粉，其中该第一玉米植物对于马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α基因(MATL)的野生型等位基因是纯合的，并且对于DUF679结构域膜蛋白7(DMP)基因的野生型等位基因是纯合的；b)提供第二玉米植物，其中该第二玉米植物包含正常A(“NA”)细胞质，并且任选地，其中该第二玉米植物对于在与提高的转化频率相关的数量性状基因座(QTL)(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的；c)用来自该第一玉米植物的花粉为该第二玉米植物授粉，并从中获得至少一种二倍体子代植物；d)使该至少一种二倍体子代植物自交和/或使该至少一种二倍体子代植物与该第一玉米植物或该第二玉米植物回交至少一代；e)从步骤d的杂交中选择子代，其中所选择的子代包含NA细胞型，并且任选地，对于在TF-QTL处的TF等位基因至少是杂合的；以及f)编辑至少一种子代植物，以引起野生型MATL基因和/或DMP基因的功能失去突变，从而获得可转化的单倍体诱导系玉米植物。
在另一个方面，本文提供了编辑植物基因组DNA的方法，该方法包括：a)提供靶植物，其中该靶植物包含待编辑的植物基因组DNA；b)用来自本文所述的玉米植物的花粉为靶植物授粉，其中该玉米植物能够表达DNA修饰酶和任选地至少一种指导核酸；以及c)选择由步骤c的产生的至少一种单倍体子代，其中该单倍体子代包含靶植物的基因组但是不包含玉米植物的基因组，并且单倍体子代的基因组通过由玉米植物递送的DNA修饰酶和任选的指导核酸修饰。
在一些实施例中，任何以上方面的HI-QTL是第9号染色体上的qhir8(HI-QTLqhir8)。在一些实施例中，任何以上方面的HI-QTL qhir8处的HI等位基因包含DUF679结构域膜蛋白7(DMP)基因中的功能失去突变。在一些实施例中，任何以上方面的TF-QTL是第3号染色体上的qCYTO-A_TF3.1(TF-QTL qCYTO-A_TF3.1)。
附图说明
图1显示了根据本披露的各方面的产生HI-NA植物的过程的示例性步骤。
图2显示了构建体26258中遗传元件的图。
图3显示了构建体24288中遗传元件的图。
序列简述
具体实施方式
I.术语
除非下文中另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。对本文采用的技术的提及旨在是指本领域中通常所理解的技术，包括对本领域普通技术人员而言很清楚的那些技术的变型和/或等效技术的替代物。虽然认为以下术语将被本领域普通技术人员很好地理解，还是阐述以下定义以促进对本发明所披露的主题的解释。
除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“一种抗体”任选地包括两种或更多种此类分子的组合等。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围(例如±20％、±10％或±5％)在所列举值的预期含义内。
如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprise)”是开放式的。当与主题核酸(或氨基酸序列)结合使用时，它是指包括主题序列作为一部分或作为其整个序列的核酸序列(或氨基酸序列)。
术语“多个”是指多于一个实体。因此，“多个个体”是指至少两个个体。在一些实施例中，术语多数是指多于整体的一半。例如，在一些实施例中，“群体中的多数”是指多于那个群体的成员的一半。
“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。特别地，在本披露的上下文中，植物是指玉米植物。
“植物细胞”是植物的结构和生理单元，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单一细胞或经培养的细胞的形式，或作为高等组织化单元(如例如，植物组织、植物器官或全株植物)的一部分。
“植物细胞培养物”意指植物单元(例如像原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如本文所用，“植物组织”是指被组织化成结构和功能单元的植物细胞群组。包括植物中或培养中的任何植物组织。此术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。该术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何特定类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
术语“植物部分”是指植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下的单细胞和组织：花粉、胚珠、接合子、叶、胚、根、根尖、花药、花、花器部分、果实、茎、芽、插条和种子；以及花粉、胚珠、卵细胞、接合子、叶、胚、根、根尖、花药、花、花器部分、果实、茎、芽、插条、接穗、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。
术语“品种”和“栽培品种”是指可以通过结构或遗传特点和/或表现与相同物种内的其他品种区别开的一组相似的植物。
术语“群体”意指共享一个常见遗传衍生的植物的遗传上异质的集合。
术语“子代”是指特定杂交的一个或多个后裔。典型地，子代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自体受精(即，同一个植物充当雄性和雌性配子两者的供体)。该一个或多个后裔可以是例如F1、F2或任何后续世代。
术语“后代”植物是指作为一种或多种亲本植物或其后裔的营养或有性繁殖的子代的任何植物。例如，后代植物可以通过亲本植物的克隆或自交或者通过两个亲本植物的杂交而获得，并且包括自交体以及F1或F2或甚至更远的世代。F1是由亲本(其中至少一方是首次用作性状的供体)产生的第一代后代，而第二代(F2)或随后世代(F3、F4等)的后代是由F1、F2等的自交产生的样本。因此，F1可以是由两个真育种亲本(真育种对于性状是纯合的)之间杂交产生的杂种，而F2可以是由所述F1杂种自花授粉产生的后代。
如短语“有性杂交的”和“有性生殖”在本披露的主题的上下文中是指配子融合以产生子代(例如，通过受精，如在植物中通过授粉产生种子)。在一些实施例中，“有性杂交”或“异体受精”是一个个体被另一个体受精(例如，植物中的异花授粉)。在一些实施例中，术语“自交”是指通过自体受精或自花授粉产生种子；即，花粉和胚珠来自同一株植物。
“选择性育种”在本披露的范围内应理解为是指使用具有或显示令人希望的性状的植物作为亲本的育种程序。
在植物育种的上下文中，术语“杂种”、“杂种植物”和“杂种子代”是指植物，该植物是通过杂交不同系或品种或物种的植物(包括但不限于两个近交系(例如，基因杂合的或大部分杂合的个体)之间的杂交)而产生的基因上不同的亲本的后代。短语“单次杂交FI杂种”是指由两个近交系之间的杂交产生的FI杂种。
短语“近交系”是指在基因上是纯合的或近乎纯合的群体。例如，近交系可以通过若干循环的兄弟/姐妹育种或自体受精来获得。在一些实施例中，近交系针对一个或多个感兴趣的表型性状进行纯育。“近交”、“近交个体”或“近交子代”是来自一个近交系的单独的样品。术语“近交”是指基本上纯合的个体或系。当用于育种计划时，近交系也可称为“亲本系”。
术语“回交”在本披露的范围内应理解为是指使杂种子代与亲本之一重复往回杂交的方法。
术语“渐渗(introgression)”，“渐渗的(introgressed)”和“进行渐渗(introgressing)”是指自然过程和人工过程，其中通过将一个物种、品种或栽培品种与另一个物种、品种或栽培品种杂交来将基因组区域从所述一个物种、品种或栽培品种移至该另一个物种、品种或栽培品种。该过程可以任选地通过回交到回交亲本来完成。
本文中称为“单倍体”的植物在单倍体植物中具有减少数量的染色体(n)，并且它的染色体组等于配子的染色体组。在单倍体生物中，仅存在正常染色体数量的一半。因此，二倍体(2n)生物(例如，玉米)的单倍体展示出单倍性(1n)；四倍体(4n)生物(例如，黑麦草)的单倍体展示出二倍性(2n)；六倍体(6n)生物(例如，小麦)的单倍体展示出三倍性(3n)；等。如本文所用，被称为“双单倍体”的植物通过使单倍体染色体组加倍而被开发。从自交到任何数量的世代的双单倍体植物获得的植物或种子仍然可以被鉴定为双单倍体植物。双单倍体植物被认为是纯合植物。如果植物是可育的，即使该植物的整个营养部分不是由具有加倍的染色体组的细胞组成的，该植物也被认为是双单倍体；也就是说，如果植物含有活的配子，即使该植物在营养组织中是嵌合的，该植物也将被认为是双单倍体。
“重组”是交换DNA链以产生新的核苷酸序列排列。该术语可以是指在双链DNA断裂修复中发生的同源重组过程，其中多核苷酸用作模板以修复同源多核苷酸。该术语还可以是指减数分裂期间两个同源染色体之间的信息交换。双重重组的频率是单一重组体的频率的乘积。例如，在10cM区域中发现的重组体的频率为10％，并且双重重组体的频率发现为10％x 10％＝1％(1厘摩被定义为测交中1％的重组体子代)。
“测交种植物(tester plant)”在本披露的范围内应理解为是指用于在基因上表征待测植物中的性状的植物。典型地，使待测植物与“测交种”植物杂交，并且对杂交子代中的性状的分离比率进行评分。
术语“测交种”是指具有标准基因型，已知特征和已建立的性能的系或个体。“测交种亲本”是指来自测交种品系的个体，其在有性杂交中被用作亲本。通常，测交种亲本与其所杂交的个体无关并且在基因上不同。当与个体或近交系杂交以进行表型评估时，通常使用测交种来产生FI子代。
术语“杂种优势群”和“杂种优势库”可互换使用，并且是指当与来自其他遗传上不同的种质群的基因型或近交系杂交时，表现出相似杂种优势响应的一组基因型或近交系。相对于杂种优势群之间比较的较远程度遗传关系的品系，包含在杂种优势群内的品系存在更近程度遗传关系。一般而言，同一杂种优势群内的两个近交系一起杂交的杂种比来自一个杂种优势群的近交系与来自不同杂种优势群的近交系杂交的杂种表现出少得多的杂种优势。特定的杂种优势群可以包括具有不同遗传的多个品系。表7中描述了示例性的杂种优势群和每个个体杂种优势群内的专有种质系。在本披露中，整个杂种优势群的全部基因型也可以称为杂种优势群的种质。概括地说，杂种优势库的主要名称是：坚秆(“Stiff Stalk(SS)”，也称为衣阿华坚秆综合种(Iowa Stiff Stalk Synthetic)或“BSSS”)、非坚秆(NonStiff Stalk)(“NSS”)、热带、和非坚秆Iodent(“IDT”)。参见J.Hweerwaarden,等人,Historical genomics of North American maize[北美玉米的历史基因组学],PROC.NAT’L ACAD.SCI.U.S.A.[美国国家科学院学报]109(31):12420-25(2012)。然而，这些不是排他性的，并且其他名称是已知的，例如，Lancaster Sure Crop(“LSC”)。参见，例如，C.Livini等人,Genetic diversity of maize inbred lines with and among heterotic groupsrevealed by RFLPs[通过RFLP揭示的具有杂种优势群和杂优势群之间的玉米自交系的遗传多样性]，THEOR.APPL.GENET[理论与应用遗传学].84:17-25(1992)。
术语“杂种优势”是指杂交优势，即在杂交后代中相对于其亲本的任何生物质量(例如大小、生长速率、生育力、产量等)改善或提高的功能。例如，如上所述的，来自不同杂种优势群的近交植物品系之间的杂交后代可能比其亲本品系表现出更多的杂种优势。这种杂交的第一代后代通常在更大程度上表现出亲本双方所期望的特征。如果第一代杂种在一起交配，则这种杂种优势可在随后的世代中减少。
术语“结实率(seed set)”是指产生胚(即，籽粒或种子)的玉米穗部分的量度。结实率可以定性地(例如，低、好或高)或定量地表示。在定量测量中，测量值可给定为每穗种子的百分比或数量。该术语通常指正常籽粒(即，未败育的、有胚乳活力的籽粒)的百分比或数量。对于正常的玉米品系(即不是单倍体诱导系品系)，80％以上(或每穗300粒以上)的结实率被认为是好的结实率。对于单倍体诱导系品系，结实率往往较低，因此每穗50％以上(例如60％以上、70％以上或80％以上)或180粒以上(例如200粒以上、220粒以上、260粒以上或280粒以上)的结实率通常被认为是高的结实率。
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用并且如本文所用，是指RNA、cDNA、基因组DNA、线粒体DNA的有义链和反义链两者以及以上项的合成形式和混合聚合物。在特定实施例中，核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式及其组合。该术语还包括但不限于单链和双链形式的DNA和/或RNA。此外，本文披露的多核苷酸(例如，环状DNA模板)、本文披露的核酸多联体可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键联连接在一起的天然存在的核苷酸和修饰的核苷酸中的任一者或两者。核酸分子可以经化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然或衍生化的核苷酸碱基，如本领域技术人员将容易了解的。此类修饰包括例如标签、甲基化、以类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰诸如不带电键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧基部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂以及修饰的键联(例如，α异头核酸等)。以上术语还旨在包括任何拓扑构象，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的、圆形的和挂锁形的构象。除非另有说明，否则对核酸序列的提及涵盖其互补体。因此，对具有特定序列的核酸分子的提及应理解为涵盖具有其互补序列的其互补链。当核苷酸序列在溶液中特异性杂交时，这些核苷酸序列是“互补的”(例如，根据沃森-克里克碱基配对原则)。该术语还包括编码相同多肽序列的密码子优化的核酸。还应当理解，核酸可以是未纯化的、纯化的或附接至例如合成材料(诸如珠或柱基质)上。
在核酸序列的上下文中，术语“对应于”意指当某些序列的核酸序列与彼此比对时，“对应于”在本发明中某些枚举的位置的核酸是与参考序列中的这些位置比对的那些，但相对于本发明的特定核酸序列而言并不一定位于这些精确的数字位置中。可以通过已知算法的计算机化实施方式或者通过目视检查进行用于比较的序列的最佳比对。易于获得的序列比较和多重序列比对算法分别是可在因特网(例如，EMBL-EBI的网站)上获得的基本局部比对搜索工具(BLAST)和ClustalW/ClustalW2/Clustal Omega程序。其他合适的程序包括但不限于GAP、BestFit、Plot Similarity和FASTA，它们是可从Accelrys公司(美国加利福尼亚州圣地亚哥)获得的Accelrys GCG软件包的一部分。还参见Smith和Waterman,1981；Needleman和Wunsch,1970；Pearson和Lipman,1988；Ausubel等人,1988；以及Sambrook和Russell,2001。
术语“基因”是指包括DNA序列的遗传单位，该遗传单位占据染色体上的特定位置并且含有生物体中的具体特征或性状的遗传指令。
术语“数量性状基因座”或“QTL”是指与特定表型性状相关的DNA区域，即可以用数字测量且在程度上变化的表型，并且其可归因于多基因效应，即两个或更多个基因及其环境的产物。通常，QTL是连续性状(那些连续变化的性状，例如单倍体诱导率)的基础，而不是定性(即离散)性状。
术语“一个或多个等位基因”是指基因的一各或多个替代形式中的任一个，所有等位基因均涉及至少一个性状或特征。在二倍体细胞中，给定基因的两个等位基因占有同源染色体对上相应的基因座。在某些情况下(例如，对于QTL)，用“单倍型”(即染色体片段的等位基因)代替“等位基因”更为准确，但是，在这些情况下，术语“等位基因”应理解为包含术语“单倍型”。如果两个个体(例如，两种植物)在特定基因座处拥有相同的等位基因，则如果等位基因是从一个共同祖先遗传的(即，等位基因是同一亲本等位基因的拷贝)，则所述等位基因被称为“由于继承而相同”。可替代的是等位基因“按状态相同”(即，等位基因看起来是相同的，但来源于等位基因的两个不同拷贝)。世代信息鉴定对连锁研究很有用；世代鉴定和状态信息鉴定都可以用于关联研究，尽管血统信息鉴定可能特别有用。
术语“单倍型”可以指从一个亲本那里继承的个体的等位基因集。因此，二倍体个体具有两个单倍型。术语“单倍型”可以在更有限的意义上使用，以指代与表型性状相关的物理连锁的和/或不连锁的遗传标记(例如，序列多态性)。短语“单倍型区块”(有时在文献中也简称为单倍型)是指在单个染色体(或其一部分)上物理连锁的一组两个或更多个遗传标记。通常，每个区块具有若干个常见的单倍型，并且可以选择遗传标记的子集(即“单倍型标签”)来唯一地鉴定这些单倍型中的每一个。
术语“基因型”及其变体是指生物体的遗传组分，包括，例如，二倍体生物体对于一个或多个基因或基因座(例如，SNP、单倍型、基因突变、插入缺失)是杂合的(即，对于给定的基因或QTL具有两个不同的等位基因)还是纯合的(即，对于给定的基因或QTL具有相同的等位基因)。如本文所用，术语对于特定等位基因“至少杂合的”表示存在该等位基因的至少一个拷贝。例如，对于基因的HI等位基因至少是杂合的玉米植物具有一个或两个拷贝(即，是杂合或纯合的)的HI等位基因。
“表型”在本披露的范围内应理解为是指在基因上控制的性状的一个或多个可区分的特征。短语“表型性状”是指个体中由个体的基因组与环境的相互作用产生的外观或其他可检测的特征。
短语“质量性状”是指由一个或几个表现出主要表型效应的基因控制的表型性状，其可被描述为具有两个或更多个特征值的类别。因此，质量性状通常被简单地遗传。植物中的实例包括但不限于花色、穗轴色和疾病抗性，例如北方玉米叶枯萎病抗性。
术语“多态性”及其变体是指在群体中出现两种或多种遗传决定的替代序列或等位基因。“多态性位点”是指在其处发生差异的基因座。优选的多态性位点具有至少两个等位基因，其各自在群体中以特定的频率出现。多态性基因座可与一个碱基对一样小。多态性的等位基因中的一者被任意指定为参考等位基因，并且其他等位基因被指定为替代等位基因、“变异等位基因”或“变异”。在所选择的群体中出现最频繁的等位基因有时被称为“野生型”等位基因。二倍体生物对于变异等位基因可以是纯合的或杂合的。在携带变异等位基因的个体中，变异等位基因可以或不可以产生可观察到的物理或生物化学特征(表型)。例如，变异等位基因可改变由目的基因编码的蛋白质的酶活性，或者在可替代情况下,变异等位基因可对编码的蛋白质的酶活性没有影响。
如本文所用，术语“标记”、“多态性标记”或“遗传标记”是指表示等位基因的存在或不存在的具有已知染色体基因座的基因或DNA序列。标记可在用于基因分型的基因内或与其连接。标记可以来源于基因组核苷酸序列或来源于其编码的产物(例如，mRNA转录物、非编码RNA转录物或蛋白质)。该术语也指与标记序列互补或与位于其侧翼的核苷酸序列，例如，用作能够扩增标记序列的探针和/或引物的核苷酸序列。该术语也可指缺乏与多态性互补或位于多态性侧翼的核苷酸序列。标记可包括但不限于，单核苷酸多态性(SNP)、单核苷酸变异(SNV)、小的插入或缺失(indel)、限制性片段长度多态性(RFLP)、可变数目串联重复(VNTR)、高变区、小卫星、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复和插入元件如转座子。
术语“功能失去突变”是导致突变的基因产物缺乏野生型基因的分子功能的基因的DNA序列的变化(即“突变”)。存在四种主要的可导致功能失去突变的遗传变异：1)导致过早终止密码子产生截短的蛋白质序列的突变；2)发生在影响剪接的规范剪接位点的突变(导致在mRNA转录物中包含内含子或排除外显子)；3)位于基因编码区的非整数倍的插入缺失变体，其通过破坏全长转录物而引起移码；以及4)导致起始密码子(转录起始密码子，例如ATG)丧失的突变，如果突变附近没有可选择的起始密码子，这将阻止基因转录。此外，基因启动子或非翻译区(UTR)的突变可以降低或消除基因表达，导致功能的丧失。
术语“基于标记的选择”在本披露的范围内被理解为是指使用基因标记从植物中检测一个或多个核酸，其中该核酸与所希望的性状相关，以鉴别出携带令人希望的(或不希望的)性状的基因的植物，使得在例如转化程序或选择性育种程序中可以使用(或避免)那些植物。如本文所使用的，指示正常A细胞质的标记将区分具有正常B细胞质的非CMS植物与不具有正常B细胞质(即，具有正常A细胞质)的那些植物。标记可以是基因组的基因座内的突变(例如，单核苷酸多态性(“SNP”))或一个等位基因内的突变。
如本文所用，术语“标记探针”和“探针”是指可用于检测较大序列内序列(例如本文披露的标记)的存在或不存在的核苷酸序列或核酸分子。在一些实施例中，核酸探针与标记或标记基因座的全部或部分互补，并且可以通过例如核酸杂交检测标记的存在或不存在。标记探针的长度可以变化。在一些实施例中，标记探针的长度范围为8-200个核苷酸(例如，10至100个核苷酸，或者15至60个核苷酸)。在一些实施例中，探针的约8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个连续核苷酸与标记互补，并且可用于核酸杂交。
如本文所用，术语“引物”是指如下寡核苷酸，当置于诱导引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和用于聚合的试剂(如DNA聚合酶)的存在下以及在合适的温度和pH下)时，其能够与核酸靶退火(在一些实施例中，特异性地与核酸靶退火)，以允许DNA聚合酶和/或逆转录酶与其附接，从而用作DNA合成的起始点。在一些实施例中，采用一个或多个引物来扩增植物核酸(例如，使用聚合酶链式反应；PCR)。
如本文所用的术语“与……相关”是指两个实体之间可识别和/或可测定的关系。例如，短语“与单倍体诱导(HI)相关”是指性状、基因座、基因、等位基因、标记、表型等或其表达产物，它们的存在或不存在可以影响植物或其子代表现HI的范围和/或程度。因此，当标记与性状连锁并且当标记的存在指明了所希望的性状或性状形式是否会和/或会以什么程度发生在包含标记的植物/种质中时，则该标记与该性状“相关”。类似地，当标记与等位基因连锁并且当标记的存在(或不存在)指明了等位基因是否存在(或不存在)于包含标记的植物、种质或群体中时，该标记与该等位基因“相关”。例如，“与HI相关的标记”是指其存在或不存在可以用于预测植物是否会和/或会以什么程度展现HI的标记。
如本文所用，术语“植物材料”是指来自玉米单个穗或一组穗或由其生长的植物的种子、胚或其他再生组织。
如本文所用，术语“植物品系”指单一植物材料或遗传上相同的一组材料。
术语“种质”是指一个群体或其他的个体组(例如，物种或品系)的基因型的总体。短语“适应的种质”是指已证实具有遗传优势的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域，短语“未适应的种质”、“原始种质”和“外来种质”是指遗传价值未知或未经证实的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域；这样，短语“未适应的种质”在一些实施例中是指不属于已建立的育种群体并且与已建立的育种群体的成员没有已知关系的植物材料。
术语“细胞型”是指细胞质的分类，包括与植物品系相关的线粒体和叶绿体的遗传贡献。目前已知的细胞型包括正常A(“NA”)和正常B(“NB”)细胞质，但是也包括细胞质雄性不育细胞型：细胞质雄性不育C(“C”或“CMS-C”)细胞质、细胞质雄性不育S(“S”或“CMS-S”)细胞质和细胞质雄性不育T(“T”或“CMS-T”)细胞质。术语细胞型和细胞质可互换地使用。
“可转化的”、“可转化性”等指更容易接受外源DNA并可以将外源DNA稳定地整合到其基因组中的植物、植物品系或植物细胞(诸如愈伤组织或原生质体)。
“转化频率”、“TF”、“转化效率”和“转化率”意指成功转化的植物数量除以试图转化的总植物(例如，胚)数目的量度。该量度可以定量地表示，例如表示为百分比、原始数字，或者定性地表示，例如“低”或“高”。
术语“TF等位基因”是指基因或基因座的等位基因，其与相同基因或基因座的替代等位基因相比在植物(例如，玉米植物)中的存在与增加的TF相关。在一些情况下，TF等位基因是基因、QTL或QTL基因座的等位基因。
术语“TF-QTL”是指与提高的转化频率(TF)相关的QTL。与当非TF等位基因存在于TF-QTL处相比，TF-QTL处TF等位基因的存在导致TF增加。
如本文所使用的，“顽固”指不可转化或基本上不可转化的植物品系。换句话说，其转化效率为0％或基本上为0％。术语顽固与“不可转化”同义，并且这些术语可互换使用。
术语“单倍体诱导率”或“HIR”是指在用单倍体诱导系花粉对穗进行授粉后存活的单倍体籽粒的数量除以籽粒的总数。
术语“HI等位基因”是指基因或基因座的等位基因，与相同基因或基因座的替代等位基因相比，该HI等位基因在植物(例如，玉米植物)中的存在与增加的HI相关。在一些情况下，HI等位基因是基因的等位基因、QTL或QTL中的基因座。
术语“HI-QTL”是指与单倍体诱导(HI)相关的QTL。与HI-QTL处非HI等位基因的存在相比，HI-QTL处的HI等位基因的存在使得单倍体诱导率(HIR)提高。示例性HI-QTL是qhir8，位于B73v5参考基因组中第9号染色体的第3,444,422位与第11,360,090位之间。
II.HI-NA玉米植物
在一方面，本文提供了具有至少两个特征的玉米植物：1)有效诱导单倍体诱导的能力；以及2)高水平的可转换性。在一些实施例中，玉米植物对于在马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α(MATL)基因中的功能失去突变是纯合的，并且对于在至少一个HI-QTL处的HI等位基因至少是杂合的。在一些实施例中，HI-QTL可以是qhir8(位于B73v5参考基因组中第9号染色体上的第3,444,422位与第11,360,090位之间)。本文提供的玉米植物还具有正常A(“NA”)细胞型，在一些实施例中，这有助于提高可转换性。在一些实施例中，玉米植物对于在至少一个与提高的可转化性相关的基因或QTL处的TF等位基因至少是杂合的。在一些实施例中，玉米植物还表现出高花粉负载和/或雄穗重量。
A.单倍体诱导
普遍地是，在单倍体诱导育种期间，在诱导杂交中使用的亲本品系均是二倍体，因此它们的配子(即，卵细胞和精细胞)是单倍体。单倍体诱导通常是降低诱导系品系的外显性状的媒介，因此所产生的子代，依赖于物种或情形，可以是二倍体(如果没有发生基因组消除)或单倍体(如果发生了基因组消除)。因此，如本文所使用的，“单倍体”具有亲本一半的染色体数量；因此二倍体生物(例如，玉米)的单倍体示出单倍性；四倍体生物(例如，黑麦草)的单倍体示出二倍性；六倍体生物(例如，小麦)的单倍体示出三倍性，等等。
在一些实施例中，通过将单倍体诱导系雄性品系与另一品系杂交来实现单倍体诱导，这导致诱导来自单倍体诱导系品系染色体组的丢失并产生单倍体胚(即，有效的单倍体诱导)。单倍体诱导效率可以以单倍体诱导率(“HIR”)来表示，该单倍体诱导率是总子代胚(单倍体诱导系品系与另一品系之间杂交产生的单倍体)的百分比。确定HIR的示例性方法描述于在第II.B节中，并且还描述于在本披露的实例中。如本文所述，数个基因组座处的变异HI等位基因可以促进有效的单倍体诱导(例如，至少5％、至少10％、至少12％或至少15％的HIR)。在一些实施例中，HI等位基因是马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α基因的等位基因(PLPA2α，第1号染色体上的玉米B73基因ID GRMZM2G471240[该基因ID来自B73_v4基因组]，也称为Zm00001d029412[B73_v5]，也称为MATRILINEAL[MATL]，NOT LIKE DAD1[NLD1]和PHOSPHOLIPASE A1[PLA1])。还如本文所述，不同HI-QTL处的HI等位基因也可以促进单倍体诱导。在一些实施例中，HI等位基因可处于第9号染色体上的qhir8HI-QTL。
在一些实施例中，本文披露的玉米植物在MATL基因处包含HI等位基因。在一些实施例中，HI等位基因是MATL(通常称为matl)中的功能失去突变。在一些实施例中，变异等位基因在MATL编码序列中包含4个碱基对的插入移码突变。在一些实施例中，四个碱基对插入对应于SEQ ID NO:125的第1146-1149位处的四个核苷酸。在一些实施例中，变异等位基因包含不同的突变(即，除了四个碱基对插入突变之外)或导致由MATL编码的蛋白质产物功能丧失的不同突变。任何能够鉴定MATL中功能失去突变的测定都可以用于鉴定本文所述的植物。在一些实施例中，该测定可包含以下第II.E部分中描述的基因分型方法中的一者。在一些实施例中，可以基于该基因的野生型cDNA序列(SEQ ID NO:124)开发用于鉴定MATL中功能失去突变的测定。
在一些实施例中，鉴定MATL中功能失去突变的测定包含在一种或多种标记SM7246、SM7252、测定2826和测定2827处对个体进行基因分型。在一些实施例中，可以使用实时PCR测定(例如，根据在本文的第II.E节中或实例1中详述的方法)检测这些标记的基因型。根据一些实施例，表1列出了这些标记中每一种的预期基因型和序列背景，以及可用于TaqMan实时PCR基因分型测定的示例引物和探针。表1中描述的标记SM7246和SM7252的TaqMan测定各自包含两种可以区分所列的基因型的具有不同荧光团的探针。表1中描述的用于测定2826和测定2827的TaqMan测定各自参与MATL基因组座位的扩增和基于荧光探针的部分检测，以及用于比较的对照。在一些实施例中，测定2826中的MATL特异性探针检测野生型MATL序列(即，未检测到突变序列)。在一些实施例中，测定2827中的matl特异性探针检测具有4bp插入的功能失去突变体matl序列(即，未检测到野生型序列)。
表1.用于对MATL中功能失去突变进行基因分型的示例性标记。
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C/C：标记处胞嘧啶的纯合子；G/G：标记处鸟嘌呤的纯合子；I/I：标记处4bp插入突变等位基因的纯合子；D/D：标记处没有4bp插入情况下WT等位基因的纯合子。
在一些实施例中，用于鉴定MATL中功能失去突变的测定可以是表型测定。例如，由突变的MATL序列编码的蛋白质的水平可以通过本领域技术人员已知的多种方法中的任一种(例如，蛋白质印迹、免疫荧光、质谱等)来检测。在一些实施例中，功能测定可用于确定由突变的MATL序列编码的蛋白质是否能够执行其通常的功能。例如，可以将包含推定的MATL突变的植物与测交种植物杂交，以评估与由MATL编码的蛋白质的正常功能相关的性状(例如，结实率或单倍体诱导率，如以下实例中所详述的)。
在一些实施例中，本文披露的玉米植物包含在至少一个与提高的单倍体诱导相关的数量性状基因座(QTL)(HI-QTL)等位基因处的HI等位基因。在一些实施例中，玉米植物对于在至少一个HI-QTL处的HI等位基因至少是杂合的(例如，杂合的或纯合的)。在一些实施例中，玉米植物对于在至少一个HI-QTL处的HI等位基因是纯合的。在一些实施例中，与对于在HI-QTL处的HI等位基因是杂合的玉米植物相比，对于在HI-QTL处的HI等位基因是纯合的玉米植物显示出更有效的单倍体诱导。在一些实施例中，玉米植物包含在第9号染色体上的qhir8HI-QTL处的HI等位基因。如本文所述，任何能够鉴定QTL或对其进行基因分型的测定都可以用于鉴定包含在qhir8HI-QTL处的HI等位基因的植物。在一些实施例中，用于鉴定qhir8HI-QTL处的HI等位基因的测定可包含以下第II.E部分中描述的基因分型方法中的一者。在一些实施例中，用于鉴定qhir8HI-QTL处的HI等位基因的测定可以基于任何已知的qhir8HI-QTL标记来开发。在一些实施例中，用于鉴定qhir8HI-QTL处的HI等位基因的测定可以基于该基因座的野生型序列和与提高的单倍体诱导相关的该基因座的变异等位基因的序列之间的任何差异来开发。
在一些实施例中，鉴定qhir8HI-QTL处的HI等位基因的测定包含在一种或多种标记SM4849、SM8047、SM8133、SM8029、SM4257和SM0956BQ处对个体进行基因分型。在一些实施例中，这些标记处的基因型可以使用TaqMan实时PCR测定(例如，根据本文第E节或实例1中所详述的方法)来检测。根据一些实施例，表2列出了这些标记中每一种的预期基因型和序列背景，以及可用于TaqMan实时PCR基因分型测定的示例引物和探针。
表2.用于对qhir8HI-QTL基因分型的示例性标记。
A/A：标记处腺嘌呤的纯合子；T/T：标记处胸腺嘧啶的纯合子；C/C：标记处胞嘧啶的纯合子；G/G：标记处鸟嘌呤的纯合子。
在一些实施例中，在qhir8HI-QTL处的HI等位基因包含位于qhir8HI-QTL内的DUF679结构域膜蛋白7(DMP)基因(B73v5参考基因组中的Zm00001d044822)的变异等位基因。参见，例如，Zhong,等人,2019,“Mutation of ZmDMP enhances haploid induction inmaize[ZmDMP的突变增强了玉米中的单倍体诱导],”Nature Plants[自然植物]5:575-580。在一些实施例中，玉米植物对于DMP基因处的HI变异等位基因至少是杂合的(例如，杂合的或纯合的)。在一些实施例中，变异等位基因是DMP中的功能失去突变。任何能够鉴定DMP中功能失去突变的测定都可以用于鉴定本文所述的植物。在一些实施例中，该测定可包含下文第E节中所述的基因分型方法中的一者。在一些实施例中，用于鉴定DMP中功能失去突变的测定可以基于该基因的野生型序列(SEQ ID NO:126)来开发。
在一些实施例中，用于鉴定DMP中功能失去突变的测定可以是表型测定。例如，由DMP编码的蛋白质的水平可以通过本领域技术人员已知的多种方法中的任一种(例如，蛋白质印迹、免疫荧光、质谱等)来检测。在一些实施例中，功能测定可用于确定由DMP编码的蛋白质是否能够执行其通常的功能。例如，可以将包含推定的DMP突变的植物与测交种植物杂交，以评估与由DMP编码的蛋白质的正常功能相关的性状(例如，结实率或单倍体诱导率，如以下实例中所详述的)。
在一些实施例中，本文所述的玉米植物包含至少一种选择性标记，以促进筛选和选择目的后代(例如，已变成单倍体的后代籽粒)。如本文所用，术语选择性标记涵盖筛选或报道标记(例如，可用于对目的后代视觉筛选的颜色指示剂)和选择性标记(例如，可用于目的后代的抗生素介导的富集的抗生素抗性基因)。在一些实施例中，植物包含选择性标记基因。选择性标记基因可以是，例如，内源性基因或转基因的突变。在一些实施例中，选择性标记基因编码可检测的蛋白质产物。在一些实施例中，植物对于选择性标记是杂合的。在一些实施例中，植物对于选择性标记是纯合的。在一些实施例中，选择性标记基因编码将仅存在于二倍体胚中的色素或其他可检测产物，有助于单倍体胚的选择，如下文和实例中所详述的。在一些实施例中，选择性标记可包括GUS、PMI、PAT、GFP、RFP、CFP、B1、CI、NPTII、HPT、ACC3、AADA、高油含量(参见，例如，Melchinger等人2013.Sci.Reports[科学报导]3:2129和Chaikam等人2019.Theor.and Appl.Genet.[理论与应用遗传学]132:3227-3243)、R-navajo(R-nj)、R1-盾片(R1-SCM2)和/或花色素苷色素中的任何一种。其他选择性标记基因是本领域技术人员已知的(参见，例如Ziemienowicz.2001.Acta Physiologiae Plantarum[植物生理学学报]23:363-374)。在一些实施例中，选择性标记包含抗生素抗性基因。
在一些实施例中，选择性标记包含处于第10号染色体上R1基因座处的R-navajo(“R-nj”)或R1-盾片(“R1-SCM2”)变异等位基因(在B73v5参考基因组中约第139Mb至约140Mb位处)。这些等位基因赋予将在种子的胚和胚乳二者中表达紫色或红色的显性花色素苷性状。R-nj等位基因与糊粉层(胚乳的最外层)中非常强的花色素苷表达和胚中较弱的表达相关。R1-SCM2等位基因与胚的盾片中的强花色素苷表达和糊粉层中的弱表达相关。由包含这些显性表达等位基因的单倍体诱导系品系与另一品系之间杂交产生的二倍体胚将显示紫色或红色。已经失去单倍体诱导系品系的亲本染色体组的胚将不显示颜色。
能够区分野生型R1基因座与变异等位基因R-nj和/或R1-SCM2之间的任何测定均可用于鉴定本文所述的植物。在一些实施例中，该测定可包含下文第E节中所述的基因分型方法中的一种。在一些实施例中，该测定可基于该基因座的野生型序列和/或变异等位基因R-nj和/或R1-SCM2的序列来开发。
在一些实施例中，鉴定包含在R1基因座处的变体R1-SCM2等位基因的植物的测定包含在一种或多种标记SM0954、SM0954HQ、SM6568、SM0953BQ和SM6604处对个体进行基因分型。在一些实施例中，这些标记处的基因型可以使用TaqMan实时PCR测定(例如，根据本文第E节或实例1中所详述的方法)来检测。根据一些实施例，表3列出了这些标记中每一种的预期基因型和序列背景，以及可用于TaqMan实时PCR基因分型测定的示例引物和探针。
表3.用于对R1基因座进行基因分型的示例性标记。
A/A：标记处腺嘌呤的纯合子；T/T：标记处胸腺嘧啶的纯合子；C/C：标记处胞嘧啶的纯合子；G/G：标记处鸟嘌呤的纯合子。
在一些实施例中，本文所述的玉米植物包含在位于B73v5参考基因组中第8Mb位与第10Mb位之间的第9号染色体上的颜色抑制基因座处的野生型等位基因。在一些实施例中，植物对于颜色抑制基因座处的野生型等位基因至少是杂合的(例如，杂合的或纯合的)。该颜色抑制基因座处的变异等位基因可以减少在R1基因座处包含R1-SCM2等位基因的玉米品系胚中的紫色和/或红色色素沉着。减少的色素沉着使得区分紫色或红色胚(即二倍体胚)与白色或奶油色胚(即单倍体胚)更加困难。在一些实施例中，选择在颜色抑制基因座上不具有这种变异等位基因的玉米植物可以确保所述植物的二倍体后代将显示强烈的紫色或红色，使它们易于与白色或奶油色单倍体胚区分开来。在一些实施例中，这种选择通过选择在颜色抑制基因座处具有野生型等位基因的植物来实现。任何能够区分野生型颜色抑制基因座和变异等位基因的测定都可以用于鉴定本文所述的植物。在一些实施例中，该测定可包含下文第E节中所述的基因分型方法中的一者。在一些实施例中，该测定可以基于该基因座的野生型序列和/或变异颜色抑制基因等位基因的序列来开发。
在一些实施例中，鉴定第9号染色体上的颜色抑制基因座的野生型等位基因的测定包括在标记SM8040和SM8091之一或两者上对个体进行基因分型。在一些实施例中，这些标记处的基因型可以使用TaqMan实时PCR测定(例如，根据本文第E节或实例1中所详述的方法)来检测。根据一些实施例，表4列出了这些标记中每一种的预期基因型和序列背景，以及可用于TaqMan实时PCR基因分型测定的示例引物和探针。
表4.用于对第9号染色体颜色抑制基因座进行基因分型的示例性标记。
A/A：标记处腺嘌呤的纯合子；C/C：标记处胞嘧啶的纯合子；G/G：标记处鸟嘌呤的纯合子。
B.确定单倍体诱导率(HIR)的方法
单倍体诱导率可通过在授粉之后(例如，在授粉之后约15至20天)收获经测交的穗来确定。可以将来自籽粒的胚分离出来，并在适合于维持胚生存力的适当培养基(称为胚拯救培养基)中孵育。在一个实施例中，用于HIR测定的拯救培养基包含4.43克含维生素的Murashige和Skoog基础培养基、30克蔗糖和70mg水杨酸。可将拯救培养基中的胚置于允许颜色指示基因(例如，R1-SCM2)表达的条件下。在示例性实施例中，将胚在22℃-31℃下置于100-400微摩尔光下16-24小时，直到胚中的一些由于R1-SCM2基因的表达而变成紫色。参见方案，例如，如WO 2015/104358中所述的。紫色(二倍体)和奶油色(单倍体)胚可从每个穗计数。单倍体的频率(称为单倍体诱导率)可以根据总胚中单倍体的数目来确定。
C.植物可转化性
本文提供的玉米植物具有高水平的可转化性。可转化性可通过本领域技术人员已知的多种方法来测量。例如，如以下实例1中所述的，可通过转化测试载体并检测成功转化的胚的百分比(即转化率)来测试胚的可转化性。如本文所用的转化可以指将外源DNA引入玉米基因组的任何方法(例如，农杆菌介导的转化、粒子轰击等)。玉米转化的示例方法描述于下文第IV节中。在一些实施例中，本文提供的玉米植物显示出至少2％、至少5％、至少8％、至少10％、至少12％或至少15％的转化率。在一些实施例中，本文提供的具有高水平可转化性的玉米植物具有正常A细胞型。在一些实施例中，本文提供的具有高水平可转化性的玉米植物对于在至少一个TF-QTL(例如，第3号染色体上的qCYTO-A_TF3.1TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的(即，杂合的或纯合的)。在一些实施例中，玉米植物对于在至少一个TF-QTL(例如，qCYTO-A_TF3.1TF-QTL)处的TF等位基因是纯合的。在一些实施例中，对于TF-QTL处的TF等位基因是纯合的玉米植物比对于在TF-QTL处的TF等位基因是杂合的玉米植物具有更高水平的可转化性。在一些实施例中，本文提供的具有高水平可转化性的玉米植物包含正常A细胞型和在至少一个TF-QTL(例如，第3号染色体上的qCYTO-A_TF3.1TF-QTL)处的TF等位基因两者。包含在TF-QTL处的TF等位基因的玉米植物可以使用任何已知的基因分型策略(包括本文所述的那些)来鉴定。
在一些实施例中，本文所述的植物和方法包括具有正常A(NA)细胞型的植物。植物的细胞型可以通过多种已知的方法来确定。可以使用能够将NA细胞型与其他已知细胞型(包括正常B(NB)和细胞质雄性不育(CMS)细胞型)区分开来的任何测定。在一些实施例中，该测定可包含以下第II.E部分中描述的基因分型方法中的一者。在一些实施例中，用于区分NA细胞型的测定可以基于由以下文献中披露的NA和NB线粒体基因组来开发：Allen,等人,2007,“Comparisons among two fertile and three male-sterile mitochondrialgenomes of maize[玉米的两个可育和三个雄性不育线粒体基因组的比较],”Genetics[遗传学]177:1173-1192。
在一些实施例中，区分NA细胞型与其他细胞型的测定包括在一种或多种标记SM2918、SM4813、SM2914和SM4812处对个体进行基因分型。在一些实施例中，这些标记的基因型可以使用TaqMan实时PCR测定(例如，根据本文第II.E节中或实例1中所详述的方法)来检测。在一些实施例中，标记SM2918和SM4813中的一种或两种用于区分正常细胞型(即，NA或NB)与CMS细胞型。在一些实施例中，标记SM2914和SM4812中的一种或两种用于区分NA细胞型与NB细胞型。根据一些实施例，表5列出了这些标记中每一种的预期基因型和序列背景，以及可用于TaqMan实时PCR基因分型测定的示例引物和探针。
表5.用于区分正常A细胞型与正常B细胞型和CMS细胞型个体的示例性标记。
C/C：标记处胞嘧啶的纯合子；A/A：标记处腺嘌呤的纯合子；I/I：标记处6bp插入等位基因的纯合子；D/D：标记处6bp缺失等位基因的纯合子。
在一些实施例中，本文披露的玉米植物包含在至少一个与提高的可转化性相关的数量性状基因座(QTL)(TF-QTL)处的TF等位基因。在一些实施例中，玉米植物包含在位于B73v5参考基因组中第3号染色体第14,742,407和70,562,070位之间的qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因。任何能够鉴定QTL或对其进行基因分型的测定都可以用于鉴定包含在如本文所述的qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因的植物。在一些实施例中，qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因与玉米SYN-INBC34品系的TF等位基因相匹配。在一些实施例中，包含在TF-QTL处的不同等位基因的植物(例如，玉米RWKS/Z21S//RWKS系的等位基因)不太容易转化。在一些实施例中，用于鉴定qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因的测定可包括在以下第II.E节中描述的基因分型方法中的一者。在一些实施例中，用于鉴定qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因的测定可包括在本文所述的任何标记(例如，下文实例1中所述的和在表6、表19和/或表20中所列的那些标记)处对玉米植物进行基因分型。在一些实施例中，用于鉴定qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因的测定可基于该基因座处的RWKS等位基因(即，与提高的可转化性不相关的TF-QTL等位基因)的序列和该基因座处的SYN-INBC34等位基因(即，TF-QTL处的TF等位基因)的序列之间的任何差异来开发。
在一些实施例中，鉴定qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因的测定包括在一种或多种标记SM3158、SM4787、SM3814、SM3362、SM0634AQ和SM4586处对个体进行基因分型。在一些实施例中，这些标记的基因型可以使用TaqMan实时PCR测定(例如，根据本文第II.E节中或实例1中所详述的方法)来检测。根据一些实施例，表6列出了这些标记中每一种的预期基因型和序列背景，以及可用于TaqMan实时PCR基因分型测定的示例引物和探针。
表6.用于对qCYTO-A_TF3.1TF-QTL进行基因分型的示例性标记。
A/A：标记处腺嘌呤的纯合子；C/C：标记处胞嘧啶的纯合子；G/G：标记处鸟嘌呤的纯合子。
D.确定转换频率(TF)的方法
转化频率(TF)可使用本领域公知的方法来确定。例如，可使用下文第IV节中描述的方法将包含一种或多种目的基因的构建体引入到植物、植物的品系或植物细胞中。计算试图转化的植物或植物部分(例如胚)的数量中表达转基因的植物的数量，其等于TF。在一些实施例中，一种或多种目的转基因包含指示转基因，其的表达产生可在植物中容易观察到的表型。因此，植物中的表型的观察表明成功的转化。
E.基因分型的方法
多种手段可用于在目的多态性位点，例如基因(例如，MATL、DMP)，QTL(例如，qhir8、qCYTO-A_TF3.1第3号染色体QTL)，或线粒体基因组基因座处对个体(例如，植物)进行基因分型。在一些实施例中，基因分型测定用于确定样品(例如，核酸样品)是否含有特定的变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型。例如，来自个体的核酸的酶促扩增可方便地用于获得用于后续分析的核酸。在一个或多个目的基因座中特定变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型的存在或不存在也可以在没有酶促扩增的情况下直接从个体的核酸中确定。在某些实施例中，在一个、两个、三个、四个、五个或更多个多态性位点(例如在一个或多个目的基因座中的单核苷酸多态性(SNP))处对个体进行基因分型。在一些实施例中，在线粒体基因组中的一个或多个目的基因座中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个多态性位点处对个体进行基因分型(例如，以将NA细胞型个体与其他细胞型个体区分开)。
可使用各种技术中的任一种对来自个体的核酸(无论是否扩增)进行基因分型。有用的技术包括但不限于测定，例如基于聚合酶链式反应(PCR)的分析测定、序列分析测定、电泳分析测定、限制性长度多态性分析测定、杂交分析测定、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接等位基因特异性延伸/连接、等位基因特异性扩增、单碱基延伸、分子倒置探针、侵入性切割、选择性终止、限制性长度多态性、测序、单链构象多态性(SSCP)、单链链多态性、错配切割和变性梯度凝胶电泳，所有这些技术都可以单独使用或组合使用。
含有核酸的材料常规地从个体中获得。这种材料是可以从中制备核酸的任何生物物质。作为非限制性实例，材料可以是植物部分(例如，叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物)或包含核酸的任何植物组织或其他植物部分。在一个实施例中，用来自幼苗的叶片穿孔实践本披露的方法，幼苗可通过非侵入性手段容易地获得并用于制备基因组和/或线粒体DNA。在另一个实施例中，基因分型涉及使用聚合酶链式反应(PCR)扩增个体的核酸。
多种不同引物中的任一种可用于通过PCR扩增个体的核酸，以便确定本披露的植物或方法中存在或不存在变异等位基因(例如，突变或QTL标记)。如本领域技术人员所理解的，用于PCR分析的引物可以基于目的基因中目的多态性位点侧翼的序列来设计。作为非限制性实例，序列引物可以包含在目的基因或基因座中目的多态性位点上游或下游的约15至约30个核苷酸的序列。这样的引物通常被设计成具有足够的鸟嘌呤和胞嘧啶含量以获得高的解链温度，这使得在扩增反应中的退火步骤稳定。数个计算机程序(如引物选择)可用于帮助设计PCR引物。
等位基因鉴别测定(例如，可从应用生物系统公司获得的测定)可用于在多态性位点处对个体进行基因分型，从而确定特定变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型在目的基因或基因座中的存在或不存在。在/>等位基因鉴别测定中，为每个等位基因构建特异性荧光染料标记的探针。该探针包含不同的荧光报告染料(例如FAM和TET)以辨别每个等位基因的扩增。此外，每个探针在一端具有通过荧光共振能量转移来猝灭荧光的猝灭染料。在PCR期间，每个探针与来自个体的核酸中的互补序列特异性退火。Taq聚合酶的5’核酸酶活性仅用于切割与等位基因杂交的探针。切割将报告染料与淬灭染料分开，导致通过报告染料的荧光增强。因此，由PCR扩增产生的荧光信号表明样品中存在哪些等位基因。探针和等位基因之间的错配降低了探针杂交和通过Taq聚合酶切割的效率，导致几乎没有荧光信号。本领域技术人员理解，可以通过将DNA小沟结合物(MGB)基团与DNA探针缀合来实现等位基因鉴别测定中提高的特异性，如例如在Kutyavin等人,Nuc.AcidsResearch[核酸研究]28:655-661(2000)中所述的。小沟结合物包括但不限于化合物，例如二氢环吡咯并吲哚三肽(DPI3)。
序列分析也可用于根据本文所述的方法对个体进行基因分型以确定目的基因或基因座中特定变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型的存在或不存在。如本领域技术人员所已知的，目的变异等位基因可以使用合适的引物通过序列分析来检测，所述引物是基于目的基因或基因座中目的多态性位点侧翼的序列设计的。例如，目的基因或基因座中的变异等位基因可通过使用本领域技术人员设计的引物进行序列分析来检测。另外的或替代的序列引物可包含约15至约30个核苷酸的序列，其对应于目的基因或基因座中目的多态性位点上游或下游约40至约400个碱基对的序列。这样的引物通常被设计成具有足够的鸟嘌呤和胞嘧啶含量以获得高的解链温度，这允许测序反应中稳定的退火步骤。如本文所用，术语“序列分析”包括确定核酸中核苷酸顺序的任何手动或自动方法，并包括但不限于化学和酶促方法。
电泳分析也可用于根据本披露的方法对个体进行基因分型，以确定目的基因或基因座中特定变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型的存在或不存在。如本文所用的涉及一种或多种核酸(例如扩增片段)的“电泳分析”包括带电分子在电场影响下移动通过静止介质的过程。电泳分析的方法及其变化在本领域中是公知的，如在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南]第2章(增刊45)JohnWiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子出版公司]纽约(1999)中所述的。
限制性片段长度多态性(RFLP)分析也可用于根据本披露的方法对个体进行基因分型以确定在目的基因或基因座中的特定变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型的存在或不存在(Jarcho等人在Dracopoli等人,Current Protocols in Human Genetics[人类遗传学实验指南]第2.7.1-2.7.5页,John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版公司],纽约；Innis等人,(编辑),PCR Protocols[PCR实验指南],San Diego:Academic Press,Inc.[圣地亚哥：学术出版社](1990))。可以对PCR扩增产物进行RFLP分析。
此外，等位基因特异性寡核苷酸杂交可用于对植物中的个体进行基因分型或本文所述的方法，以确定目的基因或基因座中特定变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型的存在或不存在。等位基因特异性寡核苷酸杂交是基于使用标记的具有例如与涵盖变异等位基因的序列完全互补的序列的寡核苷酸探针。在适当的条件下，变异等位基因特异性探针与含有变异等位基因的核酸杂交，但不与一个或多个其他等位基因杂交，该其他等位基因与探针相比具有一个或多个核苷酸错配。如果需要的话，也可以使用与替代(例如，野生型)等位基因匹配的第二等位基因特异性寡核苷酸探针。类似地，等位基因特异性寡核苷酸扩增的技术可用于选择性扩增例如，变异等位基因，通过使用与变异等位基因的核苷酸序列完全互补但与其他等位基因相比具有一个或多个错配的等位基因特异性寡核苷酸引物(Mulli等人,同上)。本领域技术人员理解的是，区分变异等位基因和其他等位基因的一个或多个核苷酸错配通常位于等位基因特异性寡核苷酸杂交中使用的等位基因特异性寡核苷酸引物的中心。相反，用于PCR扩增的等位基因特异性寡核苷酸引物通常含有区分引物3’端处的变体与其他等位基因的一个或多个核苷酸错配。
异源双链体迁移率测定(HMA)是另一种公知的测定，其可用于在本披露的植物或方法中进行基因分型，以确定在目的基因或基因座中的特定变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型的存在或不存在。HMA可用于检测变异等位基因的存在，因为与完全碱基配对的双链体的迁移率相比，携带错配的DNA双链体在聚丙烯酰胺凝胶中具有降低的迁移率(参见Delwart等人,Science[科学],262:1257-1261(1993)；White等人,Genomics[基因组学],12:301-306(1992))。
单链构象多态性(SSCP)的技术也可用于在本文所述的植物或方法中进行基因分型，以确定在目的基因或基因座中的特定变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型的存在或不存在(参见，Hayashi,Methods Applic.[方法与应用],1:34-38(1991))。该技术用于检测基于单链DNA的二级结构中差异的变异等位基因，其在非变性凝胶电泳时产生改变的电泳迁移率。变异等位基因通过将测试片段的电泳图谱与含有已知等位基因的相应标准片段进行比较来检测。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)也可用于本披露的植物或方法中，以确定目的基因或基因座中特定变异等位基因(例如，突变或QTL标记)或单倍型的存在或不存在。在DGGE中，双链DNA在含有浓度递增的变性剂的凝胶中电泳；由错配等位基因制成的双链片段具有解链更快的片段，导致这样的片段与完全互补的序列相比迁移不同(参见，Sheffield等人,“Identifying DNA Polymorphisms by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis[通过变性梯度凝胶电泳鉴定DNA多态性]”在Innis等人,同上,1990中)。
用于个体基因分型的其他分子方法是本领域已知的，并且可用于本披露的植物或方法中。这种公知的基因分型方法包括但不限于自动测序和RNA酶错配技术(参见Winter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊],82:7575-7579(1985))。此外，本领域技术人员理解，当要确定多个变异等位基因的存在或不存在时，单个变异等位基因可以通过分子方法的任何组合来检测。一般而言，参见Birren等人(编辑.)Genome Analysis:ALaboratory Manual Volume 1[基因组分析：实验室手册第1卷](分析DNA)纽约,ColdSpring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](1997)。此外，本领域技术人员理解，多个变异等位基因可以在单独的反应或单个反应(“多重”测定)中检测。
F.DNA修饰酶
在一些实施例中，本披露的HI-NA玉米植物能够表达DNA修饰酶。在一些实施例中，这样的植物任选地还能够表达至少一种指导核酸(例如，指导RNA)。在一些实施例中，DNA修饰是选自由以下组成的组的定点核酸酶：Cas9核酸酶、Cas12a核酸酶、兆核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、dCas9-Fokl、dCas12a-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9-腺嘌呤脱氨酶、嵌合FENl-FokI、MegaTAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9非Fokl核酸酶、dCas12a非Fokl核酸酶、嵌合Cas12a-胞苷脱氨酶和嵌合Cas12a-腺嘌呤脱氨酶。用于获得这样的植物的方法在下文第III节中更详细地描述。
G.植物杂种优势群
有利地，本披露的玉米植物(包括在育种中使用以产生本文所讨论的HI-NA植物的HI植物和NA植物)可来源于任何已知的杂种优势群。除了性状渗入，植物育种的目标是在品种品系和杂交亲本系中进行遗传改良。一个有效的杂交育种计划在杂交种的母本异源群和杂交种的父本异源群两者中对亲本品系进行遗传改良。因此，在育种计划中使用的所有杂种优势群中进行遗传改良是有利的。表7显示了不同种质所属的普通杂种优势群。HI-NA植物也可用于与来自任何杂种优势群的玉米植物杂交以编辑其基因组并改善其性状。在一些实施例中，本披露的玉米植物属于表7中的任何杂种优势群。在一些实施例中，玉米植物包含坚秆种质、非坚秆种质、非坚秆Iodent种质、热带种质或亚热带种质。在其他实施例中，玉米植物包含被分类到本领域技术人员已知的任何其他杂种优势群的种质(参见，例如，L.Reid,等人,2011,“Genetic diversity analysis of 119Canadian maize inbredlines based on pedigree and simple sequence repeat markers,[基于谱系和简单序列重复标记的119个加拿大玉米自交系的遗传多样性分析]”Can.J.Plant Sci[加拿大植物科学杂志].91:651-661以及M.Mikel和J.Dudley,2006,“Evolution of North AmericanDent Corn from Public to Proprietary Germplasm,[北美凹痕玉米从公有到私有种质的演变]”Crop Sci.[作物学报]46:1193-1205，其各自都通过引用整体并入本文)。本披露的玉米植物也可以来源于任何公众已知的或专有品系。在一些实施例中，玉米植物来源于Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和/或NP2222中的任何品系。在其他实施例中，玉米植物来源于任何其他目的品系。
表7.杂种优势群和示例种质系。
III.HI-NA植物的产生
另一个方面，本文提供了产生可转化单倍体诱导系玉米植物(HI-NA植物)的方法。在一些实施例中，HI-NA植物的产生涉及将作为花粉供体的HI植物品系(具有在如上所披露的任何基因或HI-QTL处的HI等位基因的组合)与作为受体的NA植物品系杂交。在一些实施例中，受体植物品系还包含如上所述的一个或多个TF-QTL处的TF等位基因。在一些实施例中，受体植物系包含在第3号染色体上qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因。在一些实施例中，花粉供体植品系和/或受体植品系表现出高花粉载量和/或雄穗重量。在一些实施例中，野生型等位基因被修饰以在一个或多个基因和/或HI-QTL处形成相应的HI等位基因。在一些实施例中，用于编辑所有HI等位基因和HI-QTL的基因编辑器在同一靶植物中(例如通过共转化过程)被递送。在一些实施例中，HI-QTL/HI等位基因的编辑顺序地发生。例如，可以首先递送用于编辑野生型等位基因以产生第一HI等位基因(例如，在qhir8QTL处)的基因编辑器，并选择包含第一HI等位基因的植物。随后，将靶向第二HI等位基因(例如，在MATL基因处)的基因编辑器引入已经包含第一HI等位基因的相同植物或相同植物的随后世代中，等等。在一些实施例中，同时编辑两种或多种HI-QTL/HI等位基因，随后编辑另外的HI-QTL/HI等位基因。上述转化方案的各种替代方案也被考虑和涵盖在本披露中。HI植物产生的示例性实施例披露于美国专利号10,285,348中，其全部披露通过引用并入本文。
A.育种策略
在本披露中，各种方法可用于产生HI-NA植物。图1示出了该方法的一个示例性实施例。在一些实施例中，HI植物可以充当为花粉供体亲本(父本),并与作为母本的NA植物杂交以产生F1植物。在一些实施例中，花粉供体亲本对于MATL基因中的功能失去突变是纯合的，并且对于第二基因座处的HI等位基因至少是杂合的(例如，杂合的或纯合的)。在一些实施例中，HI等位基因包括qhir8HI-QTL处的HI等位基因。在一些实施例中，HI等位基因包含qhir8HI-QTL内DMP基因的功能失去突变。在一些实施例中，花粉供体亲本是转化顽固性的。在一些实施例中，母本玉米植物对于在第三基因座(例如，在TF-QTL处)处的TF等位基因至少是杂合的(例如，杂合的或纯合的)。在一些实施例中，母本对于第3号染色体上qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因至少是杂合的。在一些实施例中，来自花粉供体亲本的花粉用于对母本玉米植物授粉。
在一些实施例中，由于母本细胞质遗传，来自上述杂交的F1子代植物将全部具有NA细胞质。在一些实施例中，F1子代植物将对于TF等位基因至少是杂合的。在一些实施例中，如上所述，花粉供体HI植物携带选择性标记的等位基因，以允许在单倍体和二倍体子代胚之间进行区分。在一些实施例中，花粉供体HI植物对于选择性标记是纯合的。在一些实施例中，选择性标记可包括GUS、PMI、PAT、GFP、RFP、CFP、B1、CI、NPTII、HPT、ACC3、AADA、高油含量、R-navajo(R-nj)、R1盾片(R1-SCM2)和/或花色素苷色素中的任何一种。在一些实施例中，选择性标记是在第10号染色体上R1基因座处的R1-SCM2等位基因。在一些实施例中，如上所述，包含R1-SCM2等位基因的花粉供体HI植物对于第9号染色体上的颜色抑制基因座处的野生型等位基因也至少是杂合的。对于R1-SCM2等位基因是杂合或纯合的二倍体胚将呈现紫色，而不具有R1-SCM2等位基因的单倍体胚将呈现奶油色。由于颜色指示基因与HI等位基因来自同一亲本，胚的颜色可表明其是否携带HI等位基因。在一些实施例中，紫色的胚是二倍体。
在一些实施例中，选择二倍体F1植物并自花授粉以产生F2代的胚。在其他实施例中，二倍体F1植物与NA亲本植物品系回交以产生BC1代。在一些实施例中，使用选择性标记来鉴定二倍体F1植物。在一些实施例中，具有选择性标记产物的那些(例如，在R1-SCM2等位基因的情况下具有紫色的那些)也携带HI等位基因。可以使用如上所述的方法对F2植物和BC1植物进行基因分型以确认HI等位基因的存在。在一些实施例中，选择对于如上所述HI等位基因是纯合或杂合的F2和/或BC1植物用于进一步育种。在一些实施例中，选择F2和/或BC1子代植物中对于MATL基因中的功能失去突变是纯合的，并且对于另外的HI等位基因(例如，在qhir8HI-QTL处)至少是杂合的NA细胞型植物。在一些实施例中，选择F2和/或BC1子代植物中对于TF等位基因(例如，在第3号染色体上的qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处)至少是杂合的植物。
在一些实施例中，所选择的F2植物自花授粉以产生F3植物。在一些实施例中，所选择的BC1植物自花授粉以产生BC1F2植物。F3植物和/或BC1F2植物可以针对HI等位基因、TF等位基因和/或选择性标记的存在进行基因分型。在一些实施例中，还使用本文披露的方法测试这些植物的HIR。如果合适的F3植物和/或BC1F2植物对于期望的HI等位基因组合至少是杂合的，并且还具有至少5％、至少6％、至少7％或至少10％的HIR，则可以选择它们用于进一步育种。
所选择的F3植物和/或BC1F2植物可以以类似的方式自花授粉以产生F4植物和/或BC1F3植物。在一些实施例中，确定这些植物的HIR和转化频率(TF)。在一些实施例中，表现出足够高的HIR(例如，至少10％、至少12％或至少15％)以及高TF(例如，至少2％、至少5％、至少7％、至少9％、至少10％、至少15％、至少40％、至少50％或至少60％)的植物被选择作为HI-NA植物。
在一些实施例中，表现出足够高HIR的F4植物和/或BC1F3植物通过自花授粉进一步育种以产生更多代的植物，例如F5、F6、F7、BC1F4、BC1F5、BC1F6。可以对这些植物进行测试以确认其具有期望的HIR和TF比率。
本文还考虑了上述育种策略的另外的实施例。例如，上述BC1植物可以与NA亲本系回交以产生BC2植物。在一些实施例中，每一代与亲本系重复回交(例如，以产生BC3植物、BC4植物、BC5植物等)。在一些实施例中，自花授粉杂交在一个或多个回交世代之后进行(例如，以产生BC2F2植物、BC2F3植物、BC3F2植物、BC2F3植物等)。在一些实施例中，可以在每一代中对HI等位基因进行一种或多种基因分型、对TF等位基因进行基因型分型、对HIR和/或TF进行表型分型等。
在一些实施例中，上述方法的父本和/或母本属于表7中的任何杂种优势群。在一些实施例中，父本与母本属于不同的杂种优势群。在一些实施例中，父本和/或母本包括坚秆种质、非坚秆种质、非坚秆Iodent种质、热带种质或亚热带种质。在其他实施例中，父本和/或母本包含被分类到本领域技术人员已知的任何其他杂种优势群的种质(参见，例如，L.Reid,等人,2011,“Genetic diversity analysis of 119Canadian maize inbredlines based on pedigree and simple sequence repeat markers,[基于谱系和简单序列重复标记的119个加拿大玉米自交系的遗传多样性分析]”Can.J.Plant Sci.[加拿大植物科学杂志]91:651-661以及M.Mikel和J.Dudley,2006,“Evolution of North AmericanDent Corn from Public to Proprietary Germplasm,[北美凹痕玉米从公有到私有种质的演变]”Crop Sci.[作物学报]46:1193-1205，其各自都通过引用整体并入本文)。父本和/或母本还可来源于任何公众已知的或专有的品系。在一些实施例中，父本和/或母本来源于品系Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和/或NP2222中的任一种。
B.育种和突变靶向
在另一个方面，产生本文所述的可转化单倍体诱导系玉米植物的方法包括通过育种和基因的直接突变靶向的性状渐渗的组合。在一些实施例中，野生型等位基因经修饰以形成HI等位基因。在一些实施例中，MATL和/或DMP基因的突变靶向用于产生HI等位基因(例如，功能失去突变matl和/或dmp)。在一些实施例中，突变靶向是经由基因编辑来实现的。在一些实施例中，用于编辑所有HI等位基因的基因编辑器在相同的靶植物中被递送，例如，通过指导RNA多路复用或通过共转化过程。在一些实施例中，HI等位基因的编辑顺序地发生。例如，可以首先递送用于编辑野生型等位基因以产生第一HI等位基因(例如，DMP中的功能失去突变)的基因编辑器，并选择稳定表达第一HI等位基因的植物。随后，将靶向第二HI等位基因(例如，MATL中的功能失去突变)的基因编辑器引入已经表达第一HI等位基因的相同植物或相同植物的后续世代中，等等。在一些实施例中，同时编辑两个或更多个HI等位基因，随后编辑另外的HI等位基因。上述转化方案的各种替代方案也被考虑和涵盖在本披露中。HI植物产生的示例性实施例披露于美国专利号10,285,348中，其全部披露通过引用并入本文。
在一些实施例中，包含MATL和DMP基因的野生型等位基因的玉米植物在与另一玉米植物(即，母本植物)的杂交中用作花粉供体(即，父本植物)。在一些实施例中，母本植物包含NA细胞质。在一些实施例中，母本植物对于在TF-QTL(例如，在第3号染色体上的qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处)处的TF等位基因至少是杂合的(例如，杂合的或纯合的)。在一些实施例中，如上所述，花粉供体植物携带选择性标记基因等位基因以允许单倍体和二倍体子代胚之间的区分。在一些实施例中，花粉供体植物对于选择性标记基因等位基因至少是杂合的。在一些实施例中，选择性标记基因等位基因可包括GUS、PMI、PAT、GFP、RFP、CFP、B1、CI、NPTII、HPT、ACC3、AADA、高油含量、R-navajo(R-nj)、R1盾片(R1-SCM2)和/或花色素苷色素中的任何一种。在一些实施例中，选择性标记基因等位基因是在第10号染色体上R1基因座处的R1-SCM2等位基因。在一些实施例中，如上所述，包含R1-SCM2等位基因的花粉供体植物对于在第9号染色体上的颜色抑制基因座处的野生型等位基因也至少是杂合的。
在一些实施例中，F1植物自花授粉以产生F2代的胚。在其他实施例中，F1植物与母本或父本植物品系回交以产生BC1代。使用如上所述的基因分型方法，可以针对NA细胞质、TF-QTL处的TF等位基因、选择性标记基因等位基因和/或第9号染色体上颜色抑制基因座处的野生型等位基因的存在来选择F2植物和/或BC1植物。如上所述，所选择的F2和/或BC1植物可自花授粉和/或回交一代或数代。在一些实施例中，如上文和下文第V节中所述的，编辑所选择的F2和/或BC1植物或其子代以在MATL基因和/或DMP基因中引起功能失去突变，从而获得可转化的单倍体诱导系植物。在一些实施例中，可转化的单倍体诱导系植物自花授粉和/或回交一代或数代。可以如上所述对可转化单倍体诱导系植物或其子代进行基因型分析和/或表型分析，以选择具有高的可转化性和高单倍体诱导的植物。
在一些实施例中，上述方法的父本和/或母本属于表7中的任何杂种优势群。在一些实施例中，父本与母本属于不同的杂种优势群。在一些实施例中，父本和/或母本包括坚秆种质、非坚秆种质、非坚秆Iodent种质、热带种质或亚热带种质。在其他实施例中，父本和/或母本包含被分类到本领域技术人员已知的任何其他杂种优势群的种质(参见，例如，L.Reid,等人,2011,“Genetic diversity analysis of 119 Canadian maize inbredlines based on pedigree and simple sequence repeat markers,[基于谱系和简单序列重复标记的119个加拿大玉米自交系的遗传多样性分析]”Can.J.Plant Sci.[加拿大植物科学杂志]91:651-661以及M.Mikel和J.Dudley,2006,“Evolution of North AmericanDent Corn from Public to Proprietary Germplasm,[北美凹痕玉米从公有到私有种质的演变]”Crop Sci.[作物学报]46:1193-1205，其各自都通过引用整体并入本文)。父本和/或母本还可来源于任何公众已知的或专有的品系。在一些实施例中，父本和/或母本来源于品系Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和/或NP2222中的任一种。
IV.HI-NA玉米植物的转化
在另一个方面，本文提供了用于转化上述HI-NA植物的方法。在一些实施例中，可以将目的基因(例如，编码如上披露的DNA修饰酶的基因和一种或多种指导RNA)引入到上述HI-NA玉米植物中。用于转化植物的合适方法是通过聚乙二醇诱导的DNA摄取的原生质体转化、使用基因枪的生物射弹法—“粒子轰击”法、细胞穿透肽(CPP)介导的转化、乙二醇介导的转化、电穿孔、显微注射和以上所述的由农杆菌介导的基因转移。例如，提到的方法描述于B.Jenes等人,Techniques for Gene Transfer,in:Transgenic Plants[转基因植物的基因转移技术],第1卷,Engineering and Utilization[工程与利用],由S.D.Kung和R.Wu,Academic Press[学术出版社]编辑的(1993),128-143以及描述于Potrykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol[植物生理学和植物分子生物学年评].42(1991),205-225。
在一个实施例中，将目的基因克隆到适合在根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中转化的载体中。使用这种载体转化的农杆菌然后可以以已知的方式用于植物(特别是作物植物)的转化，例如通过将损伤的叶子或叶子碎片浸泡在农杆菌溶液中，并后续在合适的培养基中培养。
在一些实施例中，将已知具有提高可转化性的能力的一种或多种基因与目的基因共转化到HI-NA植物中。在本申请中，这些基因被称为形态发生因子或增强基因(boostergene)。形态发生因子的类别包括BABY BOOM(BBM)、BBM样、EMBRYOMAKER(EMK)、AINTEGUMENTA(ANT)、AINTEGUMENTA样(AIL)、PLETHORA(PLT)、WUSCHEL(WUS)或WUS同源框(Wox)、GRF(生长调节因子)、SHOOT MERISTEMLESS(STM)、AGAMOUS样(AGL)、MYB115、MYB118、体细胞胚胎发生受体样激酶(SERK)、体细胞胚相关因子(SERF)和含有核定位的AT-HOOK基序(AHL)。增强基因的非限制性实例包括胚珠发育肽(ODP)、BABY BOOM(BBM)、WUSCHEL2(WUS2)、WUSCHEL相关同源框5(WOX5)、生长调节因子5(GRF5)或结合生长调节因子4(GRF4)及其辅因子GRF相互作用因子1(GIF1)的嵌合蛋白。进行增强基因与目的基因的共转化以增强转化效率的方法是已知的，例如,如在以下文献中所述的：Lowe等人(2016)“MorphogenicRegulators Baby boom and Wuschel Improve Monocot Transformation[形态发生调节剂Baby boom和Wuschel改善单子叶转化]”,Plant Cell[植物细胞]28,1998-2015；Hoerster,等人(2020)“Use of non-integrating ZmWus2vectors to enhance maizetransformation[增强玉米转化的非整合型ZmWus2载体的使用]”,In Vitro Cellular&Developmental Biology[体外细胞与发育生物学]；Mookkan等人,(2017)“Selectablemarker independent transformation of recalcitrant maize inbred B73and sorghumP898012mediated by morphogenic regulators BABY BOOM and WUSCHEL2”[形态发生调节剂BABY BOOM和WUSCHEL2介导的玉米自交系B73和高粱P898012的选择性标记非依赖性转化],Plant Cell Reports[植物细胞报告]36:1477-1491；Kong等人(2020)“Overexpression of Transcription Factor Growth Regulating Factor5ImprovesTransformation of Monocot and Dicot Species[转录因子生长调节因子5的过度表达提高了单子叶植物和双子叶物种的转化]”,Front.in Plant Sci[植物科学前沿],10.3389/fpls.2020.572319)，或通过利用GRF4-GIF1如描述于Debernardi,J.M.等人(2020),“AGRF–GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenicplants[GRF-GIF嵌合蛋白提高转基因植物的再生效率]”,Nature Biotechnology[自然·生物技术]38:1274-1279中。上述参考文献的全部内容通过引用并入本文。还参见美国专利第7,151,170号；美国专利第7,579,529号；美国专利第7,256,322号；美国专利第7,700,829号；WO 2018/224001；WO 2018/098420；和PCT/US2020/45573；所有这些专利的内容通过引用其整体并入本文。
在一些实施例中，用于共转化的增强基因位于与目的基因不同的载体中。在一些实施例中，增强基因与目的基因在同一载体中。下文的实例2和7显示了将一个或多个增强基因与目的基因共转化到本文披露的HI-NA植物中的说明性示例性实施例中。
V.靶植物的基因编辑
本文所述的方法的各种实施例使用基因编辑。在一些实施例中，基因编辑用于诱变植物的基因组以产生具有一个或多个HI等位基因(例如，基因的HI等位基因和/或在HI-QTL处的HI等位基因)和/或一个或多个TF等位基因(例如，在TF-QTL处)的植物。
在一些实施例中，本文提供了用如上所述的基因编辑机制转化并对其表达的HI-NA植物，这些植物当与靶植物杂交时，使得在靶植物中发生基因编辑。
通常，基因编辑可能涉及基因编辑组分或系统的瞬时、诱导型或组成型表达。基因编辑可能涉及基因编辑组分或系统的基因组整合或游离体存在。
基因编辑通常是指使用定点核酸酶(包括但不限于CRISPR/Cas、锌指、兆核酸酶等)在期望的位置处剪短核苷酸序列。这可能导致插入/缺失(“indel”)突变(即，“SDN1”)、碱基编辑(即，“SDN2”)或等位基因插入或替代(即，“SDN3”)。SDN2或SDN3基因编辑可以包括提供一个或多个重组模板(例如，在载体中)，该模板包含可用于植物内同源定向修复(HDR)的目的基因序列(即，待引入到植物基因组中)。在一些实施例中，目的基因可以是将待引入到植物基因组以产生HI植物或HI-NA植物的HI等位基因(例如，matl或dmp)。在一些实施例中，目的基因或等位基因是能够赋予植物改善的性状(例如，提高的产率)的基因或等位基因。可以将重组模板引入到植物中，利用包含重组模板的供体植物通过转化或通过育种进行编辑。可以将植物基因组中的断裂引入到靶序列的内部、上游和/或下游。在一些实施例中，在靶序列基因座内部或附近产生双链DNA断裂。在一些实施例中，在靶序列基因座的上游和下游产生断裂，这可以导致其从基因组中切除。在一些实施例中，在靶序列内部、上游和/或下游产生一个或多个单链DNA断裂(切口)(例如，使用切口酶Cas9变体)。这些DNA断裂中的任一个以及经由本领域技术人员已知的其他方法引入的那些DNA断裂都可以诱导HDR。通过HDR，靶序列被所提供的重组模板的序列替代。在某些实施例中，如本文所述的目的基因序列(例如，matl或dmp等位基因序列)可以/作为模板提供。通过设计该系统，使得一个或多个单链或双链断裂被引入到不包含目的基因序列的植物基因组中相应区域的内部、上游和/或下游，该区域可以用包含目的基因序列的模板替代。以这种方式，在植物中引入目的基因序列不需要参与多次回交，特别是在特定遗传背景的植物中。类似地，突变的目的基因序列(例如，matl或dmp)可以作为模板提供。
在一些实施例中，可以在不使用重组模板的情况下经由靶向引入DNA双链断裂来产生本文所述的目的基因(例如，matl或dmp)中的突变。这样的断裂可以通过非同源末端连接(NHEJ)过程进行修复，这可能导致在修复位点产生小的插入或缺失(indel)。这样的indel可能导致移码突变，从而引起靶向基因中过早终止密码子或其他类型的功能失去突变。
在一些实施例中，基因编辑可能涉及靶植物中基因编辑组分或系统的瞬时、诱导型或组成型表达。基因编辑还可能涉及靶植物中基因编辑组分或系统的基因组整合或游离体存在。
在某些实施例中，核酸修饰或突变由(经修饰的)锌指核酸酶(ZFN)系统实现。ZFN系统使用人工限制性内切酶，该人工限制性内切酶通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而生成，该DNA切割结构域可以被工程化以靶向期望的DNA序列。使用ZFN进行基因组编辑的示例性方法可以在例如以下中发现：美国专利号6,534,261；6,607,882；6,746,838；6,794,136；6,824,978；6,866,997；6,933,113；和6,979,539。
在某些实施例中，核酸修饰由(经修饰的)兆核酸酶实现，兆核酸酶是脱氧核糖核酸内切酶，其特征在于大的识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)。使用兆核酸酶的示例性方法可以在美国专利号：8,163,514；8,133,697；8,021,867；8,119,361；8,119,381；8,124,369；和8,129,134中找到，这些文献特别地通过引用并入。
在某些实施例中，核酸修饰由(经修饰的)CRISPR/Cas复合物或系统实现。在某些实施例中，CRISPR/Cas系统或复合物是2类CRISPR/Cas系统。在某些实施例中，所述CRISPR/Cas系统或复合物是II型、V型或VI型CRISPR/Cas系统或复合物。CRISPR/Cas系统不需要生成定制的蛋白质来靶向特定序列，而是可以通过RNA指导序列(gRNA)对单一Cas蛋白进行编程以识别特定的核酸靶标，换句话说，可以使用所述短RNA指导序列将Cas酶蛋白募集到目的特定核酸靶标基因座(该基因座可能包含RNA和/或DNA或由其组成)。
通常，CRISPR/Cas或CRISPR系统如本文上述文献所用，统指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列以及以下中的一个或多个：tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-配对序列(在内源CRISPR系统的上下文中包含“直接重复序列”和tracrRNA处理的部分直接重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的上下文中也称为“间隔子”)、或一种或多种如本文中使用的术语“RNA”(例如，用于指导Cas例如Cas9的一种或多种RNA，例如CRISPRRNA以及在适用的情况下的反式激活(tracr)RNA或单指导RNA(sgRNA)(嵌合RNA))或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。通常，CRISPR系统特征在于在靶序列的位点处促进CRISPR复合物形成的元件(在内源CRISPR系统的上下文中也称为原型间隔子)。在形成CRISPR复合物的情况下，“靶序列”是指指导序列被设计为与其具有互补性的序列，其中靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。
在某些实施例中，gRNA是嵌合指导RNA或单一指导RNA(sgRNA)。在某些实施例中，gRNA包含指导序列和tracr配对序列(或直接重复序列)。在某些实施例中，gRNA包含指导序列、tracr配对序列(或直接重复序列)和tracr序列。在某些实施例中，如本文所述的CRISPR/Cas系统或复合物不包含和/或不依赖于tracr序列的存在(例如，如果Cas蛋白是Cas12a)。
如本文提及的Cas蛋白，例如但不限于Cas9、Cas12a(以前称为Cpf1)、Cas12b(以前称为C2c1)、Cas13a(以前称为C2c2)、C2c3、Cas13b蛋白，可来源于任何合适的来源，因此可以包括来自多种(原核)生物体的不同直系同源物，如在本领域中被充分记载的。在某些实施例中，Cas蛋白是(经修饰的)Cas9，优选(经修饰的)金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)或(经修饰的)化脓性链球菌Cas9(SpCas9)。在某些实施例中，Cas蛋白是Cas12a，任选地来自氨基酸球菌属物种，例如氨基酸球菌属物种BV3L6Cpf1(AsCas12a)，或毛螺菌科细菌Cas12a，例如毛螺菌科细菌MA2020或毛螺菌科细菌MD2006(LBCas12a)。参见美国专利号10,669,540，通过引用以其全文并入本文。可替代地，Cas12a蛋白可以来自牛眼莫拉菌(Moraxellabovoculi)AAX08_00205[Mb2Cas12a]或牛眼莫拉菌AAX11_00205[Mb3Cas12a]。参见，WO2017/189308，通过引用以其全文并入本文。在某些实施例中，Cas蛋白是(经修饰的)C2c2，优选瓦氏纤毛菌(Leptotrichia wadei)C2c2(LwC2c2)或纽约李斯特菌(Listerianewyorkensis)FSL M6-0635C2c2(LbFSLC2c2)。在某些实施例中，(经修饰的)Cas蛋白是C2c1。在某些实施例中，(经修饰的)Cas蛋白是C2c3。在某些实施例中，(经修饰的)Cas蛋白是Cas13b。本领域技术人员可以获得其他Cas酶。
引入植物(例如，HI-NA植物)中的基因编辑机制(例如，DNA修饰酶)可以由能够驱动重组基因在玉米中表达的任何启动子控制。在一些实施例中，启动子是组成型启动子。在一些实施例中，启动子是组织特异性启动子，例如花粉特异性启动子或精细胞特异性启动子，接合子特异性启动子，或在精子、卵子和接合子中高度表达的启动子(例如，prOsActin1)。合适的启动子披露于美国专利号10,519,456中，其全部内容通过引用并入本文。示例性启动子在下表8中示出。
表8.驱动编辑机制在植物中表达的合适启动子列表。
在另一个方面，本文提供了编辑植物基因组DNA的方法。在一些实施例中，该方法包括使用表达DNA修饰酶和至少一种任选的如上所述的指导核酸的HI-NA玉米植物来对包含待编辑的基因组DNA的靶植物进行授粉。在一些实施例中，选择来自杂交中的至少一个单倍体子代。在一些实施例中，单倍体子代包含目植物的基因组，但不包含HI-NA玉米植物的基因组。在一些实施例中，单倍体子代不表达DNA修饰酶。在一些实施例中，单倍体子代的基因组已经被由HI-NA玉米植物递送的DNA修饰酶和任选的指导核酸修饰。该过程(称为HI-编辑)描述于美国专利号10,519,456和10,285,348中。然后可以鉴定编辑的单倍体植物并用加倍剂处理，从而产生经编辑的加倍单倍体子代。染色体加倍剂的非限制性实例包括秋水仙碱、拿草特、滴停平、氟乐灵、或另一种已知的抗微管剂。然后使二倍体植物生长成熟并自花授粉以产生编辑的二倍体种子，其将可用于另外的育种和种子产生过程。任选地，可以评估所有二倍体世代系以确认纯合靶位点编辑的存在和基因编辑机制的缺乏。
实例
实例1.育种可转化的单倍体诱导系
玉米品系和基因分型标记
可转化的单倍体诱导系品系可通过将单倍体诱导系品系和可转化的品系杂交在一起来育种。优选使用具有“正常A”细胞型(即，如上所述的具有标记SM2918和/或SM4813和SM2914的C/C基因型，和/或标记SM4812的I/I基因型)的可转化品系作为母本，并且单倍体诱导系品系花粉供体作为父本，因为这确保将正常A细胞型传递至所有子代。这种细胞型将赋予可转化性的优势。还优选从高性能(>15％单倍体诱导率)诱导系和高度可转化的品种(转化频率>15％)开始。其对选择高花粉负载或雄穗重量也是有帮助的。
在该实施例中，单倍体诱导系BC1材料“RWKS/Z21S//RWKS”(BC1意指回交1代＝75％RWKS和25％Z21S)与两个可转化的品种杂交。单倍体诱导系具有15％-18％的单倍体诱导率(非常好)和0％的转化率。将该诱导系用作雄性花粉供体，并杂交到来自两个商业上重要的可转化玉米品系穗上：i)SYN-INBB23(非坚秆品系)，其具有5％的转化频率、高花粉负载和0％的单倍体诱导率；以及ii)SYN-INBC34(坚秆品系)，其具有50％的转化频率、高花粉负载和0％的单倍体诱导率。这些杂交是2018年春天在北卡罗来纳州研究站的RTP处进行。SYN-INBB23和SYN-INBC34品系都被鉴定为“正常A”细胞型，而RWKS/Z21S//RWKS品系具有“正常B”细胞型。在表9所示的测定中，SM2918和SM4813将CMS细胞质(A/A)与正常A或B细胞质(C/C)区分开来；用于开始育种过程的所有三个品系都具有正常的细胞质(标记SM2918和SM4813的C/C)。SM2914和SM4812区分正常B细胞质(分别为A/A和D/D)与正常A细胞质(分别为C/C和I/I)。正常的A细胞质在玉米中与被转化和再生转基因植物的能力相关(参见，例如，由Skibbe等人的WO 2020/205334)，而正常B细胞质对转化是更顽固的。
表9.用于检测玉米品系的细胞质类型的测定
测定SM4812中的“I”：插入等位基因；测定SM4812中的“D”：缺失等位基因。
RWKS/Z21S//RWKS被鉴定为单倍体诱导系材料。重要的是，这种单倍体诱导系具有天然的母系突变(matl；4bp插入)。MATRILINEAL中的突变(也称为NOT LIKE DAD和PLA1；第1号染色体上的玉米B73基因ID GRMZM2G471240)已描述于例如，由Kelliher等人的美国专利第10,448,588号和Kelliher,等人,Nature[自然],2017中。MATRILINEAL中的突变单独地赋予1％至7％的母本单倍体诱导率(HIR)(即，在没有qhir8HI等位基因的情况下，参见下文)。HIR是指杂交后代中单倍体的比例；另外93％至99％是二倍体。这一比率会受到环境条件以及诱导系品系和与之杂交的雌性品系两者的遗传背景的影响。以下显示的单倍体诱导率结果对于单倍体诱导系品系(例如，RWKS/Z21S//RWKS)和非诱导系品系(例如，SYN-INBB23或SYN-INBC34)是典型的。RWKS/Z21S//RWKS具有较高的诱导率，因为其在其他QTL(例如qhir8，参见下文)或与matl组合赋予较高HIR的基因处具有HI等位基因。4bp插入matl等位基因可使用如下文和表10中所述的位点特异性SNP标记(SM7246和SM7252)或等位基因特异性TaqMan标记(测定2826和2827)来检测。测定2826检测到野生型等位基因；测定2827检测到4bp插入(引发单倍体诱导的突变等位基因)。注意，测定SM7252中的“I”基因型是指单倍体诱导系品系中母系基因的四个碱基对插入等位基因(这导致基因的敲除)，并且“D”基因型是指其中没有插入的等位基因。“D”等位基因是该基因的野生型版本，其中存在功能性蛋白质产物。
表10.用于检测MATRILINEAL基因的诱导系和非诱导系等位基因的测定和标记。
此外，RWKS/Z21S//RWKS在先前工作中称为qhir8的基因座处具有单倍体诱导增强子等位基因(HI等位基因),其位于第9号染色体上。该等位基因提高了单倍体诱导率。与matl突变等位基因组合，单倍体诱导率被该QTL等位基因提高至约10％至20％，这取决于一系列其他因素，例如其他QTL/基因、环境条件、雌性种质遗传组和潜在的其他因素。表11中的标记可用于区分具有qhir8HI等位基因的品系和没有qhir 8HI等位基因的品系。qhir8的位置已被定位在标记SM4849和SM0956BQ之间。精细定位和基因组编辑指明，负责qhir8HI等位基因的基因是GRMZM2G465053(B73_v4)或Zm00001d044822(B73v5)，被称为DUF679结构域膜蛋白7(简称DMP)，并且其位于B73v5基因组中第3,919,235和3,919,852位之间。测定SM8133位于DMP基因中。
表11.用于对qhir8区域进行基因分型的测定。
空位指示基因型未知或无法使用这些测定来确定。
在基于matl的单倍体诱导杂交中，绝大多数产生的胚是二倍体(通常在65％至99％之间)，并且大约1％至35％是单倍体(对于“好的”单倍体诱导系，平均可能是15％-20％)。对于双单倍体育种管道重要的是具有遗传控制的视觉形状，以鉴定那些缺乏诱导系染色体组或DNA(单倍体)的胚，并将它们与那些具有诱导系染色体组或DNA(二倍体)的胚进行分类。在玉米中，大多数双单倍体育种管道利用携带R1基因等位基因的诱导系品系，该R1基因的等位基因赋予显性花色素苷性状，该性状将在种子的胚和胚乳中表达紫色或红色。存在至少有两种选择：R-navajo(R-nj)(与糊粉层(胚乳的最外层)中非常强的表达和胚中较弱的表达相关的等位基因)和R1-盾片(R1-SCM2)(与不成熟胚中强表达和胚乳糊粉中较弱的表达相关的等位基因)。这两个等位基因都与R1基因座相关，该R1基因座处于第10号染色体上，在玉米B73近交基因组第5版(B73v5)中约第139Mb位至约第140Mb位处。本实例中用于育种的诱导系RWKS/Z21S//RWKS具有R1-SCM2。像大多数玉米优良种质一样，SYN-INBB23和SYN-INBC34植物品系在R1基因座不具有该等位基因或R-nj等位基因(这些品系是R1的野生型，并在种子或籽粒中不具有任何颜色诱导)。关键的是，R-nj和R1-SCM2颜色诱导等位基因对野生型是显性的。可以使用以下3个连锁标记(如表12所示)测定玉米种质，以区分R1-SCM2(RWKS/Z21S//RWKS)等位基因与野生型SYN-INBB23和SYN-INBC34等位基因。对于SM0953BQ、SM6568和SM0954BQ，R1-SCM2基因型分别为A/A、T/T和C/C，而野生型基因型分别为G/G、A/A和A/A。
此外，在9号染色体上的SYN-INBC34种质中在第8Mb位与第10Mb位之间存在颜色抑制基因座。在该位点的颜色抑制基因等位基因阻止由R1-SCM2引发的胚色素的积聚。虽然机制尚不清楚，但如果这种等位基因存在于R1-SCM2中，胚颜色可能不如正常的那么强烈。在用SYN-INBB23育种新的诱导系期间，选择来自RWKS/Z21S//RWKS亲本的颜色诱导R1-SCM2等位基因；在用SYN-INBC34育种新的诱导系期间，除了第9号染色体上的颜色抑制基因的野生型等位基因(即，不是颜色抑制基因等位基因)之外，还选择了相同的等位基因(使用表12所示的测定)，因此所得的诱导剂物具有强的颜色潜力。
表12.用于对颜色标记和颜色抑制基因等位基因进行基因分型的测定。
空位指示基因型未知或无法使用这些测定来确定。
育种HI-NA品系
育种新的可转化单倍体诱导系的第一步是关键的：将可转化品系(例如，SYN-INBB23或SYN-INBC34)用作与单倍体诱导系品系(例如，RWKS/Z21S//RWKS)杂交的雌性。由于母本细胞质遗传，这样的杂交会自动将正常A-细胞质赋予F1后代——也就是说，雌性卵细胞将其线粒体(因此线粒体基因组)供给其子代，而雄性生殖细胞(在花粉粒中发现的精细胞)不会将线粒体传递给子代。大约20株F1植物生长并自花授粉，并且少数其他F1植物与RWKS/Z21S/RWKS回交以产生总共大约7000株F2或“BC1”(回交第1代)子代。这些子代种子也自动继承了正常A细胞质。通过选择紫色的种子，针对R1-SCM2性状对SYN-INBB23和SYN-INBC34种子进行分类。黄色的种子被丢弃。由于显性R1-SCM2等位基因的孟德尔分离，黄色种子占总种子的约1/4(3/4为紫色)。如下所述，从约5200株紫籽BC1或F2植物中取出幼苗并进行叶片穿孔，并对上述单倍体诱导系标记进行基因分型。
SYN-INBB23x RWKS/Z21S/RWKS F2和BC1代于2018/2019年冬季在北卡罗来纳州RTP温室中生长。对所有发芽的植物(总共5219株)进行取样—从幼苗叶片上获得四个叶片穿孔。提取DNA并在上述测定中运行TaqMan。特别地，在多重TaqMan反应中建立实时PCR以同时扩增靶基因和内源对照基因。对于每个样品，通过将提取的基因组DNA样品与TaqMan PCR主混合液(包含补充有引物和探针的Jumpstart Taq ReadyMix(西格玛公司(Sigma)))组合来建立测定。使用以下参数在实时PCR机中进行实时PCR：95℃持续5分钟，95℃持续5秒和60℃持续30秒进行40个循环。根据制造商的说明进行运行后数据分析。对于另外的TaqMan程序细节，参见例如美国专利申请公开第2011/0300544号(2009年12月7日提交)，其通过引用整体并入本文。
在对基因分型鉴定进行评分后，从5000+株植物中，选择基因分型为具有有利的单倍体诱导系基因型组合的117株植物(参见表13中经选择的和未经选择的植物及其基因型的总结)，将其移植到大盆中并自花授粉以产生下一代的种子，尽管一些是单倍体并且由于不育而不能自花授粉。发现许多个体对于所有单倍体诱导系基因座是固定纯合的，尽管由于针对matl和qhir8HI等位基因的分离畸变，但为了在F3/BC1F2家族中维持更大的遗传多样性，保留了对于R1-SCM2或qhir8HI等位基因杂合的另外植物。来自这些植物的子代是分离的，因此在如下所述的HIR表型分析(测交)之前，需要将其基因分型为F3/BC1F2代。颜色抑制基因对SYN-INBB23背景中的颜色诱导的影响是未知的，在这组117株植物中，对于单倍体诱导系等位基因(即野生型等位基因)是一致固定的，以确保颜色诱导。所选择的F3或BC1F2穗于2019年夏天送往威斯康星州简斯维尔(Janesville,Wisconsin)(如下所述)。
表13.用于下一代的SYN-INBB23F2和BC1植物的选择。
测定SM7252中的“II”是指负责单倍体诱导的突变型四碱基对插入突变型母系等位基因的纯合性。
在SYN-INBC34F2群体中，194个个体被鉴定为具有有利的单倍体诱导系基因型组合(参见表14对经选择和未经选择的植物及其基因型的汇总)。这些被选择并自花授粉以产生下一代的种子，尽管有些是单倍体，并且由于不育而不能自花授粉。对于所有单倍体诱导系基因座，有数个是固定的(纯合的)。由于针对matl和qhir8HI等位基因的分离畸变，保留了被发现对于R1-SCM2、matl或qhir8HI等位基因加第9号染色体上靠近qhir8的颜色抑制基因等位基因是杂合的其他植物，以便在F3家族中保持更大的遗传多样性。来自这些植物的子代是分离的，因此在对任何HIR表型分析(测交)(如下所示的)之前，它们需要在F3代中进行基因分型。在SYN-INBC34x RWKS/Z21S//RWKS F2中，还针对第9号染色体上的颜色抑制剂基因的RWKS/Z21S/RWKS等位基因的杂合性或纯合性来选择植物，以避免引入充当颜色积累抑制剂的SYN-INBC34等位基因。该SYN-INBC34x RWKS/Z21S//RWKS F2群体于2019年夏天在威斯康星州简斯维尔生长。然后将所选择的F3穗(来自自花授粉的F2)送到智利的格拉内罗斯进行如下所述的表型分析。
表14.用于下一代的SYN-INBC34F2植物的选择。
对于下一个SYN-INBB23x RWKS/Z21S//RWKS世代，2019年夏天在威斯康辛州的简斯维尔育种站种植520行，其包含以一式四份种植的95个F3和35个BC1F2亚家族加对照。对于每一行，将一行或多行雌性测交种并排种植。对于SYN-INBC34x RWKS/Z21S//RWKS，代表大约187个F3亚家族的699行(以一式两份或四份种植的)在智利格拉内罗斯育种站与雌性测交种行一起种植。对于大多数亚家族，获得叶样品用于对单倍体诱导系基因座qhir8和/或R1-SCM2(和对于SYN-INBC34，对于颜色抑制基因座)基因分型。所选择的对于RWKS/Z21S//RWKS等位基因是纯合的个体被提名作为雄性在雌性测交种的数个穗上进行杂交测试。从SYN-INBB23F3代开始，总共对777株个体加上数株对照进行了测交。类似地，813株个体(包括对照)从SYN-INBC34F3代开始杂交。田间团队将阴性表型(例如低花粉产量或长雌雄穗开花间隔)筛选出去。单倍体诱导率通过在授粉后约15至20天收获经测交的穗，并随后在含有胚拯救培养基(4.43克含维生素的Murashige和Skoog基础培养基，30克蔗糖和70毫克水杨酸)的培养皿上从籽粒中分离出胚来确定。将培养皿暴露于光下(参见，例如，如WO2015/104358中所述的)。从每个穗计数紫色(二倍体)和奶油色(单倍体)胚的数目，以发现单倍体的频率(称为单倍体诱导率(HIR))和每个穗的总胚数。可用于测交的植物也是自花授粉的植物；从来自F3或BC1F2植物的该选择组的自花授粉穗中收集种子以产生F4或BC1F3种子。在表15(SYN-INBC34)和表16(SYN-INBB23)中，显示了来自代表性地块的单倍体诱导率、标记基因型和总胚(分成单倍体胚和二倍体胚),以及一些在没有固定matl和qhir8HI等位基因情况下的中等和低的表现品系。表15显示了对于所有HI等位基因固定的F3SYN-INBC34x RWKS/Z21S//RWKS品系，以及对于qhir8HI等位基因和/或matl是纯合野生型或杂合的品系。所有品系都固定了颜色抑制基因等位基因和R1-SCM2基因，该基因在二倍体中产生紫色胚。对于所有诱导系等位基因固定的品系范围为10％-19％HIR，与对照(RWKS/Z21S//RWKS)类似，而其他品系具有较低的单倍体诱导率。表16显示了对于所有HI等位基因固定的F3SYN-INBB23x RWKS/Z21S//RWKS品系。所有品系都固定了R1-SCM2基因，该R1-SCM2基因在二倍体中产生紫色胚。
从SYN-INBB23x RWKS/Z21S//RWKS中的F3代开始，鉴定了来源于47个不同F2来源的家族的63株个体植物，其针对matl、qhir8和R1-SCM2的单倍体诱导系等位基因是固定的，并且具有至少10％的单倍体诱导率和至少70粒/穗结实率。收获来自这些个体的具有至少20个籽粒的那些自花授粉的穗并转递给下一代，以及用于种植一个或多个雄性行用于另外的测交(F4世代测试杂交以确定单倍体诱导率)，并且另外在大多数情况下，将一些种子转递给F4世代转化率测试。同样，来自SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS群体中F3代的数据用于鉴定来源于41个F3家族的71株个体，其针对诱导系基因是固定的，并具有>10％的单倍体诱导率和高结实率，并且其中存在至少20个籽粒/自花授粉穗。这些被转递给F4代。
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对SYN-INBB23x RWKS/Z21S//RWKS F4代(来自81个不同植物品系的140个雄性行基于来自在智利格拉内罗斯2019/2020季节各自使用一个或通常两行x 2个雄性测交种的F4HIR表型分析的数据)没有进行基因分型，因为所有品系现在都完全固定了单倍体诱导率基因/基因座。单倍体诱导率表型分析在智利格拉内罗斯育种和加倍单倍体设施中进行，并且转化测试在北卡罗来纳研究中心RTP处对约60种相同F4植物材料的子集进行。为了测试转化率，使用菌株LBA4404(pAL4404，pVGW7)，通过农杆菌介导的转化将二元载体#12672递送至由3至10个自花授粉的F4穗汇集的胚中。关于pAL4404和pVGW7辅助质粒和毒力区的详细信息由以下参考文献描述：Teruyuki Imayama,T.等人,日本专利申请第20160083737号，JAPAN TOBACCO INC.[日本烟草公司],日本,2016；Ishida,Y.,High efficiencytransformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens[由根瘤农杆菌介导的玉米(玉蜀黍)的高效率转化].Nat.Biotechnol[自然生物技术].14,745-750(1996)；以及Negrotto,D.,等人,The use of phosphomannose-isomerase as aselectable marker to recover transgenic maize plants(Zea mays L.)viaAgrobacterium transformation[利用磷酸甘露糖异构酶作为选择性标记通过农杆菌转化回收转基因玉米植物(玉米)].Plant Cell Rep[植物细胞杂志].19,798-803(2000)。如由上文所引用的Negrotto等人(2000)所述制备含有二元载体和测试构建体的农杆菌菌株。对于玉米转化，根据以下文献将来自温室生长的玉米自交系NP2222的未成熟胚用作外植体：Heng Zhong等人,Advances in Agrobacterium-mediated Maize Transformation[农杆菌介导的玉米转化的进展].Methods Mol Biol[方法分子生物学]1676,41-59(2018)。不成熟胚分离、农杆菌接种和农杆菌与不成熟胚的共培养如上文所引用的Zhong等人所述的进行。如前所述(Negrotto等人(2000))，使用甘露糖选择在培养基上产生转化的组织和推定的转基因事件。表15中汇总了F4植物品系(植物材料)的表型结果。
表15.来自SYN-INBB23 x RWKS/Z21S//RWKS群体的F4植物材料的单倍体诱导率(HIR)和转化频率(TF)。
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大多数事件不能用测试的构建体和方案转化，但是许多事件具有很强的单倍体诱导率。这是有意义的，因为在F2和F3代中选择了单倍体诱导率基因，并且在F3代中选择了表型，而在可转化性上没有选择(并且在SYN-INBB23中起始转化频率仅为约5％，以及在RWKS/Z21S//RWKS中为0％)。注意，单倍体诱导率是基于两个测交种品系的数个经测交的穗。胚总数(即，结实率)受切口和授粉穗数的强烈影响。胚总数不用作选择标准；其仅仅意味着显示单倍体诱导率所基于的胚数目。三种植物材料被鉴定具有10％+的转化率：19BD915147、19BD915875和19BD915158。前两者也有希望>15％HIR。
使用进一步的HIR测试缩小也可转化的最佳诱导系的范围。在2020年夏天，在威斯康辛州的简斯维尔育种站，将来预来源于10个F3代家族和数个F4亚家族的41株SYN-INBB23x RWKS/Z21S//RWKS F5代雄性行与三行雌性测交种一起种植用于测交以评估单倍体诱导率。来自这些品系中的一些的种子也被送至北卡罗来纳州设施以重新测试转化频率。一组所选的F4和F5代试验结果在表16中示出。这些五个品系是F5代中高性能的单倍体诱导系品系；在前三个品系中存在一些可转换性的证据(来自F4或F5转换率测试)。如下所述，所示的品系是那些被选择用于转递至F6代中的HI-编辑实验的品系。
表16.在SYN-INBB23x RWKS/Z21S//RWKS F4和F5代中的单倍体诱导率(HIR)和转化频率(TF)测试。
从这些植物的自花授粉穗中收获F6代种子，并转交给下一代用于HI-编辑测试。对于CRISPR-Cas转化和HI-编辑测试，参见实例2。在之前的测试中，使用BBM提高了亲本植物材料的转化频率(参见表17)。
表17.BBM介导的转化提高了亲本植物材料的转化效率。
对于SYN-INBC34x RWKS/Z21S//RWKS F4代，2020年夏天在威斯康星州简斯维尔育种站进行了单倍体诱导试验。将上述71份所选的材料种植，并通过三组雌性测交种穗进行测交；在授粉后15至20天时，再次将穗运送至RTP，NC站点进行HIR评价。同时，使用与上述相同的转化方法，在RTP位点测定品系子集的转化率，并从所选择的自花授粉植物子集获得F5代种子并转递给下一代。结果示于表18中。
表18.来自SYN-INBC34x RWKS/Z21S//RWKS群体的F4植物材料的单倍体诱导率(HIR)和转化频率(TF)。
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在该实验中，少数品系表现出高转化频率，但大多数品系具有非常高的单倍体诱导率(大多数超过10％，并且一些超过15％)。这一结果与F2和F3代中单倍体诱导基因(标记)的选择以及F3代中高HIR表型的选择一致。因此，该群体富集了单倍体诱导率遗传。相比之下，除了在创建杂交中使用正常A细胞型母本(SYN-INBC34)之外，在这一点上没有对可转化表型或基因(标记)进行选择。HIR是基于跨两个测交种品系的数个经测交的穗，并且提供了穗的总数。结实率可受雌雄穗开花间隔(诱导系雄花粉散落窗口和测交种雌穗吐丝日期的同步)的影响。在该实验中，雌雄穗开花间隔低于F3代(即，花粉散落和测交种穗吐丝之间的时间减少)中的雌雄穗开花间隔。因此，除了单倍体诱导率和转化率之外，结实率还被用作选择度量以鉴定最佳品系用于转递给下一轮的评价(F5代)。结实率平均数通过将正常(未败育的、由胚乳活力的)籽粒的总数除以组合两个测交种的穗数来得到。
两株F4品系显示出有希望的性能。首先存在品系19SN952196，其具有58％的转化频率(TF)(高于任何其他已知的玉米品系转化率)，超过13％的有希望的HIR，以及良好的结实率。其次存在品系19SN952454，其TF为13.7％，HIR为15％以上，以及良好的结实率。这两个品系平均每穗分别有27和33个单倍体。测交种穗的照片显示，雄性和雌性之间并没有完全同步—穗可能授粉早一些，因为穗的顶部1/3没有授粉。因此，每穗的结实率和单倍体度量甚至可能会更高。来自这两种植物材料的数株个体植物自花授粉以产生F5种子批用于进一步评价，包括单倍体诱导率性能测试以及使用CRISPR-Cas构建体的转化，以评价跨不同玉米品种的HI-编辑率(HI-编辑谱测试)。使用简单的基于农杆菌的方法(如上文对F4代所概述的)转化来自19SN952196的F5品系，但是这次使用CRISPR-Cas构建体。来自19SN952454的F5品系也使用简单的基于农杆菌的方法(如上文对F4代所概述的)转化，但是这次使用CRISPR-Cas构建体。此外，使用BBM辅助转化方法转化来自19SN952454的F5品系，其中将BBM构建体和CRISPR-Cas构建体共转化在一起，以提高CRISPR-Cas构建体的转化频率。参见实例2中的转化。
此外，存在少数具有强单倍体诱导率性能但没有良好转化频率(例如，19SN951924)或没有转化率数据(由于缺乏可用于测试的种子，例如，19SN951958、19SN952019和19SN952072)的品系。这些品系平均每穗有35至40个单倍体。来自这四种F4植物材料的数株个体自花授粉，以产生F5种子批用于进一步评价，包括另外的单倍体诱导率性能测试以及使用CRISPR-Cas构建体的转化，以评价不同玉米品种的HI-编辑率(HI-编辑谱测试)。来源于19SN951924、19SN951958、19SN952019和19SN952072的F5品系通过BBM辅助转化进行转化，其中将BBM构建体和CRISPR-Cas构建体共转化在一起以提高转化频率(参见实例2)。
为了鉴定对在SYN-INBC34背景中可转化性负责的遗传因子，使用均匀分布在玉米基因组中的480个多态性SNP标记对用于产生上述研究的F4品系(在表18中)的亲本植物进行基因分型。表18中进行转化测试的品系的GWAS分析导致在第3号染色体上鉴定了标记SM3158(SYN-INBC34的基因型为GG，标记处于B73v5的第14,742,407位)与SM4586(SYN-INBC34的基因型是GG，标记处于B73v 5的第70,562,070位)之间的QTL。标记SM4787(GG的SYN-INBC34基因型)、SM3814(CC的SYN-INBC34基因型)、SM3362(GG基因型的SYN-INBC34)和SM0634AQ(GG的SYN-INBC34基因型)位于SM3158与SM4586之间，并且也可用于鉴定QTL。将转换频率>5％的品系组与转换频率为0％的品系组进行比较，SM4787的GWAS log10值为1.7，并且p值<0.02。以及SM4586的log10值为0.57，并且SM3362的log10为0.90。将>5％TF的品系组与<5％TF的品系组进行比较，SM3814的GWAS log10值为1.6，并且SM4787和SM3158为1.3。在下表21中，显示了所有TF测试的植物品系的基因型。具有最高转化率的前十个可转化品系中的七个具有有利的SYN-INBC34基因型(带下划线的)。大量<1％TF或不可转化的品系具有不利的(RWKS)等位基因。
基于该信息，在F2、F3或任何其他代中选择在该QTL处具有SYN-INBC34等位基因(本文称为qCYTO-A_TF3.1)的植物，或者可以与正常A细胞型组合或单独富集所产生的可转化性的品系(即，其可导致更高的转化频率)。这种高转化率QTL等位基因在玉米转化的先前工作中没有被鉴定。在不受任何特定理论约束的情况下，通过正常A细胞型(线粒体或叶绿体)中的一个或多个基因座与该QTL中的一种或多种基因座组合(结合以产生高转化率)来促进的核质相互作用或交流是可能的。
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为了验证该QTL在玉米可转化性中的重要性，对具有正常A细胞型的多组植物材料的转化性能进行评价，并对该QTL进行基因分型。五个可转化性最低的品系(TF<0.5％)对所有这些标记都不具有有利的基因型。相反，TF高于13％的所有品系对所有标记都具有有利的基因型，或者没有足够的数据(参见表19)。显示的所有品系对于标记都是纯合的，这并不出人意料，因为这些品系是近交植物品系。
在第3号染色体QTL间隔中评价了172个标记，并基于存在的SNP是否与来自SYN-INBC34的SNP一致进行了基因分型鉴定。表20列出了在第3号染色体QTL间隔中评价的另外的标记，以及B73v5参考基因组中的基因组坐标和SYN-INBC34(即，在qCYTO-A_TF3.1TF-QTL处的TF等位基因中)中每个标记的基因型。对给定品种和SYN-INBC34之间的任何错配进行计数，并且QTL区的错配总数列于表19中。根据该数据，做出解释说明(“有利的”是指与SYN-INBC34至少85％或至少95％的一致性)。注意到高度可转化的品种全都具有有利的等位基因，而非可转化的品种往往不具有有利的等位基因。
表19.来自非坚秆和坚秆种质两者的正常A变种玉米品系的多样性的第3号染色体QTL的转化率测试和基因分型数据。
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表20.在第3号染色体TF-QTL间隔中评价的另外标记。
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实例2.转化率和HI-编辑测试
2020年12月，在位于北卡罗莱纳州三角研究园(Research Triangle Park,NorthCarolina)的先正达生物技术创新中心(Syngenta Biotechnology Innovation Center)的温室中，种植来自表21中所示的SYN-INBB23 x RWKS来源的植物材料的F6代穗部种子批次中的至少40粒种子用于转化。
表21.种植SYN-INBB23x RWKS/Z21S//RWKS来源的植物材料用于转化率测试。
分别地，在2021年1月，在同一设施的温室中种植来自表22中所示的SYN-INBC34xRWKS植物材料的四个F5代穗的约40粒积聚的种子用于转化。
表22.种植SYN-INBC34x RWKS/Z21S//RWKS来源的植物材料用于转化率测试。
构建了二元构建体，载体ID#26258(图2；SEQ ID NO:171)用于从这些植物材料转化F7代不成熟胚。该载体包含磷酸甘露糖异构酶(PMI)选择性标记盒，以及成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)-Cas12a盒，和含有Cas12a指导RNA的两个盒，所述指导RNA被设计为靶向下列基因和序列：第7号染色体上的Opaque2(Zm00001d018971，CTGTATCTCGAGCGTCTGGCTGA；SEQ ID NO:172)，第9号染色体上的waxy 1(Zm00001d045462，GGGAAAGACCGAGGAGAAGATCT；SEQ ID NO:173)，第6号染色体上的黄胚乳1(Zm00001d036345，CTATCTTATCCTAAA GATGGTGG；SEQ ID NO:174)，第2号染色体上的E3泛素连接酶2(Zm00001d004139，GGAGGGAAAAGGTGTCTGAGGC；SEQ ID NO:175)，和第5号染色体上推定的泛素-蛋白连接酶(Zm00001d014920，GGAAGGAAAAGGTATCTGAAGG；SEQ ID NO:176)。CRISPR/LbCas12a指导RNA包括对毛螺科菌ND2006LbCrRNA的直接重复。注意到，也可以使用Cas9盒(需要使用不同的指导RNA和多重方法)代替Cas12a(事实上，在授予Q.Que和T.Kelliher的美国专利号10519456、授予Q.Que和T.Kelleher的美国专利号10285348以及Kelliher,T.等人,One step genome editing of elite crop germplasm[优良作物种质的一步基因组编辑](2019)Nature Biotechnology[自然生物技术]第37卷,第287-292页Cas9载体可用于基于HI编辑的基因组编辑中)。除了使用标准转化方案(以上在实例1中所概述的)用该载体转化4种可转化植物材料(19SN952821、19SN952822、19SN952871和19SN952196)之外，将来自这些品系的前三个加具有高HIR和结实率的七个其他品系(19SN952763、19SN953098、19SN952454、19SN952019、19SN951958、19SN951924、19SN952072)的胚与载体24288(图3；SEQ ID NO:177)共转化，该载体携带高粱双色WUSCHEL盒(cSbWUS-01；SEQ ID NO:178)和甘蓝型油菜BABYBOOM1盒(cBnBBM1-02；SEQ ID NO:179)以增加某些品种(能够在生根后去除WUS、CRE和BBM1盒的干旱诱导型CRE-LOX切除系统)中转化体的数量。所有这些实验的转化频率都记录在表24和25中。
以下发育性其他基因也可用于提高转化频率：BBM、BBM-WOX5、WOX5(参见，例如，PCT/US2020/045573，其通过引用并入本文)。作为参考，已经在玉米中验证了BBM、WUS2或BBM-WUS2辅助的转化(Lowe等人(2016)Morphogenic Regulators Baby boom and WuschelImprove Monocot Transformation[形态发生调节子Baby boom和Wuschel改善单子叶植物转化],Plant Cell[植物细胞]28,1998-2015；Hoerster,等人(2020)Use of non-integrating ZmWus2vectors to enhance maize transformation[增强玉米转化的非整合型ZmWus2载体的使用],In Vitro Cellular&Developmental Biology[体外细胞和发育生物学]；Mookkan等人,(2017)Selectable marker independent transformation ofrecalcitrant maize inbred B73and sorghum P898012mediated by morphogenicregulators BABY BOOM and WUSCHEL2[由形态发生调节子BABY BOOM和WUSCHEL2介导的顽拗性玉米近交系B73和高粱P898012的选择性标记非依赖性转化],Plant Cell Reports[植物细胞报告]36:1477-1491)。可替代地，可以使用GRF5系统(Kong等人(2020)Overexpression of Transcription Factor Growth Regulating Factor5ImprovesTransformation of Monocot and Dicot Species[转录因子生长调节因子5的过表达改善单子叶和双子叶物种的转化],Front.in Plant Sci[植物科学前沿],第11卷,Art.572319)或通过利用GRF4-GIF1(J.M.Debernardi,等人(2020),A GRF-GIF chimeric proteinimproves the regeneration efficiency of transgenic plants[GRF-GIF嵌合蛋白提高了转基因植物的再生效率].Nature Biotechnology[自然·生物技术]38:1274-1279)促进转化。
在表24和表25中的转化实验的同时，在2021年夏天，对进入转化的亲本系也进行了单倍体诱导性能特征的重新测试(基于来自两个测交种品系各自的3个穗的平均HIR和结实率)，并且对于提交到Cas12a 26258转化的所有品系，通常都确认了高诱导率和结实率。在2021年工作后，来自SYN-INBC23x RWKS(Iodent背景)的最高品系是20BD917233(来自19SN952822)，其保持了非常强的单倍体诱导率和结实率特性(2021年，诱导率为15.8％，其中每穗207粒种子(每穗共32.3个单倍体))，并且其在田间试验中具有优异的性能和农艺性状，以及具有低但稳定的转化率(1.5％)，该转化率通过经由农杆菌与载体24288(cSbWUS-01和cBnBBM1-02增强物)的共递送提高至8.0％(表24)。在一个单独的实验中，20BD917233经由农杆菌介导的Cas12a基因组编辑载体的转染的转化率为1.0％(196个胚中有两个Cas12a阳性事件)，并且这一转化率使用由玉米Ubi1启动子(SEQ ID NO:182)驱动的农杆菌与载体25072(SEQ ID NO:180)的共递送来增强至7.0％(242个胚中有17个Cas12a阳性事件)，该载体25072包含来自二穗短柄草(Bradi2g55270)的WUSCHEL同源框基因BdWOX5/7(SEQ ID NO:181)。
对于SYN-INBC34x RWKS家族，最高品系尚不清楚。20ALL1134VG_MM是强的诱导系，并在BBM/WUS存在下具有7％的转化率，但是田间记录指示的变黄和其他农艺问题。最可转化的种质是20ALL1134VK_MM(20.7％TF)，但其在2021年具有中等至低的(约6％)的单倍体诱导率(表26)。为了从SYN-INBC34x RWKS家族中鉴定出优良品系(即，新的具有高TF率和强HIR的坚秆HI-编辑品系)，我们使用2021年HIR的数据选择了一组新的优良诱导系，这些优良诱导系与我们测试的最初来源于19SN952454和19SN952196(它们是F5至F7代的表系/亲系，来源于同一F4家族)的可转化诱导系密切相关。在表26中以粗体显示的那些在最终提交本文时处于转化和再生愈伤组织中。
表26.来自SYN-INBC34x RWKS/Z21S//RWKS的前两种F4来源的可转化诱导系19SN952454和19SN952196的F5至F7衍生物的2021单倍体诱导率性能的结果。那些粗体字是在进行转化测试以评价TF比率。
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使用TaqMan测定2723(扩增PMI-14基因)和3633(扩增LbCas12a转基因)产生事件并测试T-DNA插入。T0事件被送至温室，生长至开花并自花授粉以产生T1种子。对T0代植物进行编辑测试，以确定哪些T1事件具有高CRISPR活性用于HI-编辑试验。为了评估靶位点编辑，将使用天然等位基因TaqMan测定，该TaqMan测定为未经编辑的“野生型”等位基因提供高PCR拷贝数，但对经编辑的等位基因没有那么强的扩增或探测。因为我们使用Cas12a，我们预计典型的编辑将是小的缺失(通常，Cas12a编辑导致长度为6至18个核苷酸的缺失，从PAM位点下游大约8bp开始)。因此，测定将具有覆盖该区域的探针序列，该区域被Cas12a缺失。例如，测定3686(TQ2817)可用于Waxy1：探针GGTTTCAGGTTTGGGGAAAGA(SEQ ID NO:127)与gRNA靶序列GGGAAAGACCGAGGAGAAGATCT(SEQ ID NO:128)重叠。表27显示了其他测定引物。
表27.编辑靶基因、gRNA序列和测定ID、引物和探针序列的载体26258 Cas12a基因组。
产生了数个T0事件，其具有Cas12a载体T-DNA插入的单个拷贝并且是无骨架的，并且这些事件与具有包括一些骨架的多个拷贝的其他事件一起自花授粉以产生Tl种子。选择对于CRISPR T-DNA是纯合的T1植物(即，使用TaqMan测定对其进行基因型分析以确定基因组编辑转基因的合子型，并且在单个或多个插入事件存在的情况下，其具有稳定转化的至少两个拷贝的Cas12a和指导RNA编辑机制)进行自花授粉以产生T2种子(表28)。
表28.优良HI-编辑诱导系品系中的代表性事件及其Taqman数据。
名为“BB”的列是指农杆菌骨架；“O2”是指Opaque2；“UPL”是指第5号染色体上的假定的泛素蛋白连接酶；“UPL2”是指第2号染色体上的E3泛素连接酶2。
所得的T2植物对于编辑器(T-DNA)是固定纯合的(同样，这些可以是单拷贝，或者任选地是多拷贝)。在T0或T1或T2代中任一代时，T-DNA+植物都可以异交到任何玉米自交系上以进行“HI-编辑”。在该实验中，T2种子将被异交到多种玉米品种上，包括坚秆品系，例如NP2222和SYN-INBD45(非坚秆iodent品系)、SYN-INBE56(非坚秆品系)、SYN-INBF67(坚秆品系)、SYN-INBG78(非坚秆iodent品系)、SYN-INBH89(非坚秆iodent品系)、SYN-INBI90(非坚秆iodent品系)、SYN-INBJ13(非坚秆Mo17样品系)和SYN-INBK14(热带品系)。单倍体将根据在(美国专利号10,285,348；Kelliher,T.等人,One step genome editing of elite cropgermplasm[优良作物种质的一步基因组编辑](2019)Nature Biotechnology[自然·生物技术]37(3):287-292)中概述的方法进行鉴定和对编辑测试。然后，来自温带、热带、亚热带或其他种质的经编辑的单倍体植物将被鉴定、加倍并生长至成熟，并自花授粉以产生经编辑的DH种子(纯近交编辑的品系)，其将用于另外的育种和种子产生方法。将评估所有DH和DH1代品系和植物，以确认纯合靶位点编辑的存在和CRISPR转基因的缺乏(其应已在单倍体诱导过程期间中被消除)。
因为这些事件都来源于至少固定了matl、qhir8HI等位基因和R1-SCM2的新单倍体诱导系品系，它们应该具有稳健的单倍体诱导率，并且随着转基因的添加，应该能够在许多玉米品系中实现有效水平的HI-编辑。在该实验中，使用来自T0事件的花粉进行HI-编辑是可行的。然而，在纯合的T1和T2植物中进行HI-编辑可以是优选的，因为在这些植物中，每个花粉粒都将携带HI-编辑的能力：所有的花粉粒都具有基因/QTL的单倍体诱导系等位基因，并且都将携带CRISPR转基因。如果使用T0花粉，尽管单倍体诱导系基因座将存在于每个花粉粒中，但CRISPR机制将不会存在：对于单拷贝T0事件，只有50％的花粉将具有CRISPR转基因，而对于双拷贝或更高的事件，可能超过50％的花粉将具有转基因，这取决于分离。
在HI-编辑授粉期间，待编辑的雌性品系是非单倍体诱导系品系(它们具有MATL和qhir8以及R1-SCM2基因座的纯合野生型等位基因，并且缺乏CRISPR-Cas基因组编辑转基因)。在实验室中，子代胚将从异花授粉的穗中提取到培养皿中，并随后将进行数项测定以确定哪些是经编辑的单倍体。子代种子也可以生长至成熟，此时可以通过检查胚的颜色来鉴定单倍体，并随后在土壤中发芽。在计划的基于实验室的方法中，胚将被提取、铺板，并随后如果它们表现出紫色(来自R1-SCM2等位基因的作用)，则被评分为二倍体杂交体，或者如果它们是奶油色，则被评分为单倍体。在替代方案中，可以使用其他颜色标记，例如R1-nj。参见例如，Vijay Chaikam,等人(2015),“Analysis of effectiveness of R1-njanthocyanin marker for in vivo haploid identification in maize and molecularmarkers for predicting the inhibition of R1-nj expression,[R1-nj花色素苷标记用于玉米中的体内单倍体鉴定和分子标记用于预测R1-nj表达的抑制的有效性的分析]”Theor.Appl.Genet[理论与应用遗传学].128(1):159-171。这是因为二倍体杂交种携带来自雄性单倍体诱导花粉供体品系的显性R1-SCM2等位基因，而单倍体仅由母本基因组构成，因此没有来自诱导系品系的R1-SCM2等位基因(即，雄性基因组缺失)。因为R1-SCM2性状在种子中表达，并且甚至在植物的一些部分中表达，所以单倍体也可以通过在成熟阶段或幼苗阶段的胚中缺乏颜色来鉴定。在许多情况下，根据在授粉后早期种子成熟阶段期间穗和发育中的籽粒接受的光量，二倍体杂交胚在提取后不是紫色的，但需要在其变成紫色之前暴露于光下2至36小时(光激活花色素苷途径)。将在授粉后13-22天(DAP)提取胚，尽管理论上在10-25DAP之间提取是可能的，但暴露于光下16-24小时，单倍体将被保留；并且二倍体将被遗弃。在光处理期间，胚将与染色体加倍剂(例如秋水仙碱(优选的)、氟乐灵或另一种染色体加倍剂)接触。参见，例如，由C.L.Armstrong等人的美国专利申请公开号US2004/0210959，其通过引用并入本文。可替代地，可以将染色体加倍剂施加于萌发期间的分离胚或在土壤中萌发的单倍体幼苗。在计划的实验中，推定的单倍体胚(奶油色)将在植物托盘中发芽并产生根和叶。在生长6至14天后，将采集小叶子样品以确定哪些推定的单倍体被编辑。同样，TaqMan测定或典型的PCR测定将用于评估这些推定单倍体中的靶位点是否被编辑。可以通过序列分析(DNA测序)、通过标记分析或通过视觉表型来检查在靶位点处的突变的存在，这取决于基因靶点。因为在单倍体植物中只有一个DNA拷贝可以突变，所以应该呈现隐性表型，从而这可能是用来鉴定经编辑的单倍体的另一种方式。在对靶位点进行TaqMan测定的同时，通过旨在检测CRISPR-Cas编辑转基因和来自父本的单倍体诱导系标记—真正的单倍体将缺乏所有这些基因或等位基因(标记将显示为野生型或不存在)的TaqMan测定，推定的单倍体将被确认为真正的单倍体。表29显示了经编辑的单倍体标记结果的实例。
表29.显示单倍体、编辑单倍体和假单倍体基因分型结果的示例编辑结果。
推定的经编辑的单倍体将通过靶位点测定来鉴定，该靶位点测定不像未经编辑的对照那样强烈地扩增WT等位基因，即推定的经编辑的单倍体与未经编辑的对照的“2个拷贝”读数相比将给出“野生型”等位基因的“0”或“1”结果。同时，预期所有单倍体对于MATL、qhir8和R1-SCM2(至少TaqMan标记测定SM7252和SM4849)将具有纯合的野生型基因型，并且对于转基因Cas12a测定3633将是“无效的”，这意味着它们不具有由父本提供的诱导系等位基因或编辑器，并且如果编辑它们，则其在雄性基因组消除和单倍体诱导之前被编辑。
在该实验中，还预期我们萌发并取样用于TaqMan的一些奶油色胚是假单倍体，这是由于颜色抑制(即R1-SCM2标记不表达或紫色不显现)、部分(不完全)雄性基因组消除(即胚是部分缺乏诱导系DNA的嵌合体或非整倍体)或花粉污染(来自雌性自花授粉或其他花粉)。由花粉污染产生的胚将不会被编辑。如果假阳性单倍体被编辑(基于靶位点测定)，假阳性单倍体将具有用于其他测定(MATL、qhir8、R1-SCM2或CRISPR T-DNA转基因的诱导系等位基因将被扩增)的独特模式，并因此可以将假阳性单倍体从真正编辑的单倍体中鉴定和分选出来。
还将使用倍性分析仪中的叶组织对任何推定的经编辑的单倍体幼苗进行通过流式细胞术的倍性分析，以确认作为单倍体的植物状态。此时，植物可潜在地是加倍的单倍体(由于自发或诱导的基因组加倍)，在流式细胞术结果中，其读数将与二倍体相同：因此遗传标记对于阐明哪些推定的单倍体(奶油色胚)萌发成经编辑的但缺乏诱导系基因组和编辑机制的年轻植物是至关重要的：这些是真正的经编辑的单倍体。
预期在通过HI-编辑花粉从杂交的每个雌性“优良”品系中分离的一千个胚中，大约100至200个将是单倍体，并且在这些单倍体中，0至100个将在指导RNA靶位点处被编辑。通常，编辑单倍体的效率低于典型的转化植物，因为CRISPR转基因和Cas蛋白-指导RNA复合物仅在受精后但在单倍体诱导期间自然消除单倍体诱导系DNA之前的短时间内处于与雌性“优良”基因组相同的核中：雄性基因组消除可发生在受精之前、受精期间或受精之后数小时或数天内。在过去的HI-编辑努力中(参见Q.Que和T.Kellihe的美国专利号10519456，Q.Que和T.Kelliher的美国专利号10285348，以及Kelliher,T.等人2019.One Step GenomeEditing of Elite Crop Germplasm[优良作物种质的一步基因组编辑],NatureBiotechnology[自然生物技术]第37卷,第287-292页)，观察到玉米中单倍体编辑频率为0-10％。
为了确定在每个靶基因的指导RNA靶位点发生的编辑的性质，将通过使用可商购的TOPO Blunt IV试剂盒亚克隆来自TaqMan测定的PCR片段，并将使用正向和反向引物桑格测序对每个亚克隆反应的至少四个菌落进行测序。与野生型序列相比，预期将在来自推定编辑的植物的PCR产物中在Cas12a指导RNA切割位点(从PAM位点的下游约8至10个碱基对开始)鉴定出小的缺失。对于目的指导RNA靶位点，也可以预期在植物中产生“0个拷贝”TaqMan结果(即没有或非常少的PCR产物扩增)的编辑。可以看到具有多于一个的目靶位点编辑的一些单倍体(参见美国专利号10,285,348和Kelliher,T.等人2019)。将分析该编辑对预测的蛋白质序列的影响。
实例3.使用回交策略育种HI-NA品系
将使用与实例1中相同的方法，除了在该方法的一个或多个步骤中将使用与可转化背景(例如，SYN-INBC34或SYN-INBB23)的回交，而不是对每一代(F2、F3、F4至F5)进行自交以增加这些基因组在繁殖群体中的比例之外。在回交期间，将在这些近交系(将它们用作雄性或雌性植物)之间进行回交，以育种在每个关键单倍体诱导系基因座(matl、qhir8、R1-SCM2和任选的颜色抑制基因)携带至少一个拷贝的HI等位基因的群体植物。标记辅助选择(基因分型)将用于选择对于那些等位基因杂合的植物(在杂交之前或之后)。在回交一次或多次后，将再次筛选所得品系的这些等位基因的基因型，并且对于所有基因座杂合的植物将自花授粉，并随后将再次使用基因型以鉴定那些对于大多数或所有这些基因座的单倍体诱导系等位基因是纯合的植物。将进行任选的另外一轮自花授粉，以使所有这些基因座纯合，并随后将所得品系(例如BC2F3)用于转化率和单倍体诱导率测试。在两种表型评价中表现良好的品系将用于HI-编辑(例如转化率>5％和HIR>12％的品系)。
实例4.育种热带或亚热带HI-NA品系
如实例1和实例3中所概述的相同方法将用于选择可转化的热带单倍体诱导系品系。即，可转化的细胞型A热带或亚热带品系(例如SYN-INBA12)将作为雌株与捐赠自RWKS/Z21S//RWKS或另一单倍体诱导系品系的花粉杂交。然后F2或BC1群体(与热带细胞型A品系回交)将从原始杂交中产生的F1植物中产生。然后将采用标记辅助选择，利用表10、表11和表12中的测定(或来自那些相同基因组区域的其他测定)来鉴定和选择F2和/或BC1、BC2、F3或后续世代植物，该后续世代植物包含来自单倍体诱导系品系的matl、qhir8HI等位基因和R1-SCM2等位基因，并任选地鉴定和选择第9号染色体颜色抑制基因座的野生型等位基因。在后续世代(例如，F4、F5、或BC1F3、或BC2F3等)在固定了诱导系等位基因后，将测试转化率和单倍体诱导率，并将鉴定在两种表型评价中表现良好的品系(例如转化率>5％和HIR>12％的品系)。然后将这些品系用于Cas9或Cas12基因组编辑盒的HI-编辑转化；所得T0、T1、T2或后续世代转化品系将用于与其他热带、亚热带或温带(坚秆或非坚秆)品系杂交以诱导如实例2中所概述的单倍体诱导和同步基因组编辑(HI-编辑)，例如SYN-INBD45(非坚秆iodent品系)、SYN-INBE56(非坚秆品系)、SYN-INBF67(坚秆品系)、SYN-INBG78(非坚秆iodent品系)、SYN-INBH89(非坚秆iodent品系)、SYN-INBI90(iodent品系)、SYN-INBJ13(非坚秆Mo17样品系)、SYN-INBK14(热带品系)。然后经编辑的单倍体热带或亚热带或其他种质植物将被鉴定、加倍并生长至成熟期进行自授粉以产生将用于另外的育种和种子产生过程的经编辑的DH种子(纯自交编辑的品系)。
实例5.在没有选择R1-SCM2或第9号染色体颜色抑制基因的情况下育种HI-NA品系
将遵循实例1、3和4中所概述的相同过程，除了在这种情况下，R1-SCM2基因(和第9号染色体颜色抑制基因)将不使用标记辅助选择来选择；将只选择matl和qhir8HI等位基因标记。F4、F5、F6或BC3F2、BC4F2或后续后代的所选品系将如实例2中那样用Cas9或Cas12或其他基因组编辑盒转化以用于HI-编辑(用针对性状靶标设计的指导RNA),并将包含编码在种子或胚中表达的可见或荧光标记的盒：这将用于鉴定单倍体。标记基因的一个实例是在例如玉米蛋白启动子控制之下的绿色荧光蛋白或任何其他荧光蛋白或可见标记(例如GUS)(其将在种子中赋予高特异性表达，如在例如Y.Wu和J.Messing,2012,Rapid Divergenceof Prolamin Gene Promoters of Maize After Gene Amplification and Dispersal[玉米Prolamin基因启动子在基因扩增和分散之后的快速发散],Genetics[遗传学],第192卷,507-519中所述)。
应注意的是，促进稳定转化的编辑蛋白质系统表达的启动子的选择可能对单倍体中的编辑比率有很大影响。例如，在没有其他环境影响的情况下，弱启动子或诱导型启动子可能不足以驱动编辑系统的表达，因此在这些情况下，单倍体中的编辑速率可能较低。将使用组成型甘蔗启动子(prSoUbi4)，但在胚囊中、在花粉中或在精细胞中驱动高表达或特异性表达的其他启动子可能更有效(参见以上表8和随附描述)。
实例6.通过直接突变靶向MATL和DMP来育种HI-NA品系
将使用与实例1、3和4中所概述的相同方法，除了在这种情况下，仅R1-SCM2基因(和任选的第9号染色体颜色抑制基因)将使用标记辅助选择来选择，并随后使用靶向MATL和DMP基因的CRISPR盒转化并基因组编辑所选择的品系，这可赋予更高(>7％)的HIR。因此，育种被大大简化了——育种目标只是将颜色标记渗入可转化的背景中，并且在大多数渗入的植物材料中可能能够获得高转化率。优点为，这是更快且更便宜的育种方法。在BC3F2、BC4F2或后续世代产生后，用Cas9或Cas12或其他含有指导RNA的基因组编辑盒转化所选择的品系，所述指导RNA被设计为使用表30中的指导RNA之一(有在此起作用的其他指导RNA)在MATL和DMP基因中诱导敲除突变。鉴定在两个靶基因中都具有编辑的T0植物并使其自花授粉。鉴定T1或T2或后续世代子代(缺乏Cas转基因但对于编辑的matl和dmp等位基因是纯合的)并将其用于证实高(7％-25％)HIR(用利用R1-SCM2颜色变化的单倍体选择性标记)。随后，高诱导率和高度可转化的品系然后用新的CRISPR基因组编辑盒转化以用于HI-编辑(用针对性状靶标设计的指导RNA)，如实例2中。
表30.设计用于敲除DMP和MATL基因的指导RNA。
实例7.在没有育种的情况下产生HI-NA品系
RWKS/Z21S//RWKS BC1单倍体诱导系或任何其他高性能单倍体诱导系品系将使用如实施例2中所概述的BBM或相关优良品系转化技术进行转化，以递送CRISPR转基因用于HI-编辑的目的。HI-编辑中的所有其他步骤将如实例2所示进行。这里的优点是不存在育种需求—并且表现最好的单倍体诱导系品系(带有所有的诱导系基因和颜色标记)可以直接用于HI-编辑。在该实例中，待转化的单倍体诱导系品系不具有正常A细胞型，并且其具有低于1％的基线转化频率。因此，将需要BBM技术或另一种转化促进技术(参见实例2)来实现高效单倍体诱导系品系的充分转化。
实例8.通过直接突变靶向MATL和DMP而不选择R1-SCM2或第9号染色体颜色抑制基因来产生HI-NA品系
任何品系(不是单倍体诱导系品系，并且也没有颜色标记)将用第一构建体转化，所述第一构建体包含Cas9或Cas12基因组编辑盒和设计用于靶向MATRILINEAL和DMP基因的指导RNA盒(如实例6所述)。该品系将被用作新的HI-编辑品系。可用于HI-编辑的第一构建体中将包括另外的指导，或者，优选地，将在不含CRISPR的matl和dmp突变体T1或T2品系上进行新的转化(如实例5中)以引入用于HI-编辑目的的新基因组编辑构建体。无论哪种方式，HI-编辑构建体将包含编码可见或荧光标记的盒，该标记在种子或胚中表达：这将用于鉴定单倍体。该方法的优点是任何可转化的品系都可以用于HI-编辑，只要进行了matl和dmp编辑，并且只要包含转基因标记，以便可以容易地鉴定单倍体。标记基因的一个实例是如实例5中所述的在玉米蛋白启动子控制下的绿色荧光蛋白(其将赋予种子中的高且特异性表达)。
本披露中讨论的所有专利、专利公布、专利申请、期刊文章、书籍、技术参考文献等都出于所有目的通过援引以其全文并入本文。
应当理解，本披露的图和描述已被简化来说明与清楚理解本披露相关的要素。应理解，图是出于说明性目的而不是作为结构图而呈现的。省略的细节和修改或替代性实施例在本领域普通技术人员的知识范围内。
可以理解，在本披露的某些方面，单一组分可以被多个组分置换，并且多个组分可以被单一组件置换，以提供要素或结构或执行给定的一个或多个功能。除非这种取代将不能操作来实施本披露的某些实施例，否则这种取代被认为是在本披露的范围内。
本文呈现的实例旨在说明本披露的潜在和具体实施。可以理解，这些实例主要旨在出于对本领域技术人员说明本披露的目的。在不脱离本披露的精神的情况下，可以对这些图或本文所述的操作进行变化。例如，在某些情况下，可以以不同的顺序进行或执行方法步骤或操作，或者可以添加、删除或修改操作。
在提供数值范围的情况中，应当理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值(至下限的个位的最小小数，除非上下文另有明确规定)也被具体披露。涵盖了在所陈述范围中的任何陈述值或非陈述中间值与该陈述范围中的任何其他陈述值或中间值之间的任何较小范围。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括或排除于该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个极限值被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本技术内，但依据所陈述范围中的任何被具体排除的限值而定。在所陈述范围包括限值中的一个或两个的情况下，还包括了将那些所包括的限值中的一个或两个排除在外的范围。
在前述描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更透彻的理解。然而，对本领域技术人员而言将清楚的是，本披露中所述的本发明可以在不用这些具体细节中的一个或多个的情况下来实践。在其他情况下，没有描述本领域技术人员熟知的特征和程序，以避免使本发明模糊。出于说明性而非限制性目的，已描述了本披露的实施例。尽管本发明主要参考具体实施例描述，但还设想了在阅读本披露后，对于本领域技术人员将变得清楚的其他实施例，并且此类实施例旨在包含在本发明方法内。因此，本披露不限于上述或附图中描绘的实施例，并且可以在不偏离以下权利要求范围的情况下进行各种实施例和修改。
序列表
<110> 先正达作物保护公司（Syngenta Crop Protection AG）
Kelliher, Timothy
Delzer, Brent
Nichols, Jason
Skibbe, David
<120> 植物中可转化性和单倍体诱导的提高
<130> 82222-WO-REG-ORG-NAT-1
<150> 63/169316
<151> 2021-04-01
<160> 197
<170> PatentIn 3.5版
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nnnnctccct gtctccacgt tgaccctgga cacccnctgt gccagcatcc gctccccgat 660
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<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (401)..(401)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (434)..(434)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (482)..(482)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (485)..(485)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (532)..(532)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (602)..(602)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (638)..(638)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (734)..(734)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (767)..(767)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (863)..(863)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 11
aatgactgat ttncctantg tcttnctttg nccagcgtaa cactnggcaa agaagatctt 60
tgcctagtgc ncgtgaattc acactcggca aaatatttag cgccagncaa agttngtctc 120
tcncgtagtg tcatcatata ttttatacta gtatgattgg ttctatagtc attcacggta 180
gtccttcccg ttcacgtttt ataaaaaata aagtaaaatt atgtataagt gatggttcga 240
atnnnnnttt ggttatcaat tttatattca agaacatata tatatnttta tnttttatta 300
aaataaagtc tacttattta caagcatgtg antgacagta aagccacttg tcttagatat 360
cgtangncgc acatctagag cntctngggt tgatggcaga nacgcggcgc gcgagccttg 420
ttctcctctc ctcngagagc tgcctagcga gcccaccgag ggcatcggca ttgcttcctt 480
cnccngtcac cggttcgtac ctccctgtct ccacgttgac cctggacacc cnctgtgcca 540
gcatccgctc cccgatcccg acgagcgtcc gcatgttctc cggcgtcgcc gcgtccacgg 600
tngccgcggc gccacggagc gagttgtcct ggatgcgnag gtagtcgccg tcgctgtgga 660
gcgactggaa catcgcggcg acgtggatgt ccaccaggtc cgagctggcc gccatgaaga 720
tgtcgatgat gggngccatg ccgttgttgc ggagccaccg gcagatnccc caccgggagc 780
actgccgcgc cgtgtagagg ccctgctcgg acgtcgaccc cgtcccgatg gacagcacca 840
ggaacctgcg gcagttcgac ggnttcactg ggtacagctc ctcggccttg tccttgctgg 900
caagcatctt tttggtgatc tgcgtcatcg caaccatcgt ctacgcatgt gcaatcgggc 960
gacatacata agcaacaatt agcatcgacc ttgtgggccg 1000
<210> 12
<211> 1004
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (13)..(13)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (18)..(18)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (45)..(45)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (71)..(71)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (107)..(107)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (115)..(115)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (123)..(123)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (243)..(247)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (286)..(286)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (292)..(292)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (332)..(332)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (365)..(365)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (367)..(367)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (382)..(382)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (386)..(386)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (401)..(401)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (434)..(434)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (482)..(485)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (536)..(536)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (606)..(606)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (642)..(642)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (738)..(738)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (771)..(771)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (867)..(867)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 12
aatgactgat ttncctantg tcttnctttg nccagcgtaa cactnggcaa agaagatctt 60
tgcctagtgc ncgtgaattc acactcggca aaatatttag cgccagncaa agttngtctc 120
tcncgtagtg tcatcatata ttttatacta gtatgattgg ttctatagtc attcacggta 180
gtccttcccg ttcacgtttt ataaaaaata aagtaaaatt atgtataagt gatggttcga 240
atnnnnnttt ggttatcaat tttatattca agaacatata tatatnttta tnttttatta 300
aaataaagtc tacttattta caagcatgtg antgacagta aagccacttg tcttagatat 360
cgtangncgc acatctagag cntctngggt tgatggcaga nacgcggcgc gcgagccttg 420
ttctcctctc ctcngagagc tgcctagcga gcccaccgag ggcatcggca ttgcttcctt 480
cnccngtcac cggttcgtac ctcgctccct gtctccacgt tgaccctgga cacccnctgt 540
gccagcatcc gctccccgat cccgacgagc gtccgcatgt tctccggcgt cgccgcgtcc 600
acggtngccg cggcgccacg gagcgagttg tcctggatgc gnaggtagtc gccgtcgctg 660
tggagcgact ggaacatcgc ggcgacgtgg atgtccacca ggtccgagct ggccgccatg 720
aagatgtcga tgatgggngc catgccgttg ttgcggagcc accggcagat nccccaccgg 780
gagcactgcc gcgccgtgta gaggccctgc tcggacgtcg accccgtccc gatggacagc 840
accaggaacc tgcggcagtt cgacggnttc actgggtaca gctcctcggc cttgtccttg 900
ctggcaagca tctttttggt gatctgcgtc atcgcaacca tcgtctacgc atgtgcaatc 960
gggcgacata cataagcaac aattagcatc gaccttgtgg gccg 1004
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测定 2826 TREM26 F引物
<400> 13
gcggatgctg gcacaga 17
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测定 2826 PM0033 F引物
<400> 14
gaacgtgtgt tgggtttgca t 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测定 2826 TREM26 R引物
<400> 15
gcattgcttc cttcgcca 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测定 2826 PM0033 R引物
<400> 16
tccagcaatc cttgcacctt 20
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测定 2826 FAM
<400> 17
cagggaggta cgaacc 16
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测定 2826 TET
<400> 18
tgcagcctaa ccatgcgcag ggta 24
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测定 2827 TREM27 F引物
<400> 19
gcggatgctg gcacagc 17
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测定 2827 TREM27 R引物
<400> 20
ggcattgctt ccttctccg 19
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测定 2827 FAM
<400> 21
cagggagcga ggtac 15
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4849 F引物
<400> 22
ccactcatat ttcccttgtg gct 23
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4849 R引物
<400> 23
gcaggaatag cgcctctct 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4849 FAM
<400> 24
caggatgaag gtcgattgag 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4849 TET
<400> 25
aggatgaagg tcggttgaga 20
<210> 26
<211> 1012
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (38)..(38)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (45)..(45)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (73)..(73)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (75)..(75)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (95)..(95)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (111)..(111)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (127)..(127)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (130)..(131)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (144)..(144)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (161)..(161)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (175)..(175)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (187)..(187)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (207)..(207)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (212)..(212)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (232)..(232)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (255)..(255)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (259)..(259)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (261)..(262)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (269)..(273)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (280)..(280)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (307)..(307)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (369)..(369)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (371)..(371)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (384)..(384)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (406)..(406)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (424)..(424)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (431)..(444)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (452)..(452)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (464)..(464)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (612)..(612)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (650)..(652)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (668)..(669)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (673)..(682)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (692)..(692)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (744)..(745)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (753)..(753)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (772)..(775)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (802)..(802)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (816)..(816)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (819)..(819)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (834)..(834)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (837)..(837)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (855)..(855)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (857)..(857)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (863)..(863)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (895)..(895)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (918)..(918)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (937)..(937)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (952)..(952)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (981)..(981)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (987)..(987)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (999)..(1000)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1008)..(1008)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1011)..(1011)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 26
tctncacata gattcaaaga tatttagttt ggatagtnac agagnaagtc atactgatct 60
gctggagctg tgnanctgaa gagaatttta gcaantgtat accagagtca nctttctctt 120
atctaantan nacaatcttt caantcctgg atgctacaaa nctgcaagct gtganaaatt 180
aaagatnaaa tattatttag ttatacntat anctggatct tggactttga antttaaaag 240
taggttcatg taatntgcna nnttttttnn nnnaaaaaan gaagacgcac aagttcttgt 300
aatgtcncat gtcacaagcc ttttccaata aacaattcca agaacgtata aagtttcagt 360
acttctctnt ngatataggc aacntgctgg tgcatgggta tatatnttta gttggcaacc 420
cacncataca nnnnnnnnnn nnnntatgca gnggtgcttt gaanccactc atatttccct 480
tgtggctgaa acaggatgaa ggtcggttga gagaagccct gaagttcgca aacgtctgtg 540
gagctctcac cgtgacacag agaggcgcta ttcctgcgct gcccacccga caacaagtgc 600
ttgatgccct gnccaatttt gttgcttgaa agtagccgtg cacacctacn nnttgtgtat 660
tgtaatgnng acngcctgag cnccatgtcg anagattaca ggcgtgattt cgcttgcata 720
ccacttggca tttttgttgg tgcnnaccaa agncccccca gccaaaccaa gnnnntcggt 780
ggaagaggtt gtttcccgtc gnattttgat gtgtgnagnt gtgtgttggg gacnttnggg 840
ttaacacttt gtggncntgt gtnatgtgtg tgctgatgtt gtaatgctgc tgggnagaac 900
atgacacagc ggagcagntt tggtacctga aaacatnagc tatgaatgag tnattcagtt 960
attgggccca atttgcgttg nttcccnagc atcaggtcnn ccccctcntt nc 1012
<210> 27
<211> 1012
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (38)..(38)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (45)..(45)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (73)..(73)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (75)..(75)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (95)..(95)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (111)..(111)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (127)..(127)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (130)..(131)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (144)..(144)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (161)..(161)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (175)..(175)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (187)..(187)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (207)..(207)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (212)..(212)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (232)..(232)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (255)..(255)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (259)..(259)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (261)..(262)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (269)..(273)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (280)..(280)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (307)..(307)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (369)..(369)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (371)..(371)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (384)..(384)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (406)..(406)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (424)..(424)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (431)..(444)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (452)..(464)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (612)..(612)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (650)..(652)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (668)..(669)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (673)..(673)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (682)..(682)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (692)..(692)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (744)..(745)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (753)..(753)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (772)..(775)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (802)..(802)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (816)..(816)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (819)..(819)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (834)..(834)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (837)..(837)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (855)..(855)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (857)..(857)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (863)..(863)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (895)..(895)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (918)..(918)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (937)..(937)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (952)..(952)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (981)..(981)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (999)..(1000)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
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<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1011)..(1011)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 27
tctncacata gattcaaaga tatttagttt ggatagtnac agagnaagtc atactgatct 60
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atctaantan nacaatcttt caantcctgg atgctacaaa nctgcaagct gtganaaatt 180
aaagatnaaa tattatttag ttatacntat anctggatct tggactttga antttaaaag 240
taggttcatg taatntgcna nnttttttnn nnnaaaaaan gaagacgcac aagttcttgt 300
aatgtcncat gtcacaagcc ttttccaata aacaattcca agaacgtata aagtttcagt 360
acttctctnt ngatataggc aacntgctgg tgcatgggta tatatnttta gttggcaacc 420
cacncataca nnnnnnnnnn nnnntatgca gnggtgcttt gaanccactc atatttccct 480
tgtggctgaa acaggatgaa ggtcgattga gagaagccct gaagttcgca aacgtctgtg 540
gagctctcac cgtgacacag agaggcgcta ttcctgcgct gcccacccga caacaagtgc 600
ttgatgccct gnccaatttt gttgcttgaa agtagccgtg cacacctacn nnttgtgtat 660
tgtaatgnng acngcctgag cnccatgtcg anagattaca ggcgtgattt cgcttgcata 720
ccacttggca tttttgttgg tgcnnaccaa agncccccca gccaaaccaa gnnnntcggt 780
ggaagaggtt gtttcccgtc gnattttgat gtgtgnagnt gtgtgttggg gacnttnggg 840
ttaacacttt gtggncntgt gtnatgtgtg tgctgatgtt gtaatgctgc tgggnagaac 900
atgacacagc ggagcagntt tggtacctga aaacatnagc tatgaatgag tnattcagtt 960
attgggccca atttgcgttg nttcccnagc atcaggtcnn ccccctcntt nc 1012
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8047 F引物
<400> 28
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<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8047 R引物
<400> 29
ttgcacgtca tgagttc 17
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8047 FAM
<400> 30
ttgtgtcaga taattga 17
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8047 TET
<400> 31
tgtgtcagat tattgaa 17
<210> 32
<211> 1041
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (13)..(19)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (131)..(131)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (153)..(153)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (177)..(182)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (190)..(190)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (194)..(194)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (196)..(196)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (203)..(203)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (216)..(221)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (224)..(224)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (237)..(237)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (240)..(240)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (283)..(283)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (307)..(307)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (349)..(350)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (358)..(359)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (362)..(363)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (365)..(368)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (398)..(398)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (400)..(427)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (433)..(434)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (437)..(437)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (465)..(465)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (467)..(476)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (478)..(478)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (480)..(484)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (495)..(495)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (498)..(499)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (502)..(506)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (508)..(511)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (729)..(729)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (744)..(744)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (754)..(754)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (768)..(768)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (777)..(777)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (780)..(780)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (818)..(818)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (828)..(828)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (831)..(831)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (837)..(837)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (853)..(858)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (860)..(864)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (868)..(869)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (892)..(892)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (895)..(895)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (912)..(912)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (927)..(930)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (946)..(946)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (952)..(955)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 32
tctcctccat gcnnnnnnng ctgcaggctc gctacaggtg ctatagggct cataagtacc 60
acaagaagct gaaatgcgca gccattgttg cacagtgcag atggagagga aggatcgcga 120
ggaaagagct naagaaactc aagatggtat gcntcatatt tagagttatg tagcagnnnn 180
nnagtgtgcn aaangnttgt canttctaat gcgttnnnnn natntgctgt catcttntgn 240
tcaggaagca agagaaacgg gtgcgctcaa ggaagcgaag ganaaactcg aaaagaaagt 300
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nnnnnnnagt tgnntcngta ttccagcttc tgtagtttta atatnannnn nnnnnngntn 480
cggnattggc aaatnacnnt annnnntnnn ntttttcaat aatctgacac aaatgaactc 540
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<210> 33
<211> 1041
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (13)..(19)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (131)..(131)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (153)..(153)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (177)..(182)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (190)..(190)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (307)..(307)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
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<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (508)..(511)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
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<220>
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<220>
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<221> 尚未归类的特征
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<220>
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<220>
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<220>
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<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (94)..(94)
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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gcattctgcc tacaatgcat ntcccctagt ttgactagaa actcttcaaa ctgggacgaa 780
acaaacttaa gatanccaaa acttcgcttg ccatccagtt ctgcaagatt cctcttagnn 840
ggggctgtat ntgtcaaatg tcaagaacgt tttagcgtna cggtgtctgt tcaagcaacg 900
gccaacagca accaccgtaa aataaagcat catttgcatn atctctgtta ttctttgcaa 960
catgtncctc gttttgtttt ctgaaactta tcccagaggc aca 1003
<210> 39
<211> 1003
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (94)..(94)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (130)..(130)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (176)..(176)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (183)..(183)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (234)..(234)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (345)..(345)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (404)..(404)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (407)..(407)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (430)..(430)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (473)..(473)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (483)..(483)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (504)..(504)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (508)..(508)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (525)..(530)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (569)..(569)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (571)..(571)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (585)..(585)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (587)..(587)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (619)..(619)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (623)..(624)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (638)..(638)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (665)..(665)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (688)..(688)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (709)..(710)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (741)..(741)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (795)..(795)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (839)..(840)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (851)..(851)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (879)..(879)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (940)..(940)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (966)..(966)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 39
tccacttcac cgacagcttc cgcgccccgg acgggaaggt gtactacggc ttcgtcacgc 60
cgcggggcct gtcgctgttc aggaccgggc tcgncgtcga ggtgcccagg gaggaaaggt 120
accggctcgn cttcgtcgac gtcgtgcacg ctgtcatgtc cgtgctggtc tttgcngccg 180
tcncgctcgc cgactaccgg gtctccgggt gcctcgtcgc cggccaccgc aagnagatgg 240
acgaggtgat ggagagcttc ccgctcatgg tgggcgccgt gtgcagcggc ctcttcctct 300
tgttccccaa cacccgctac ggcatcggtt gtttggctcc gtaanaaaca gcagactgga 360
acagagagta cggcagtgta actttcttcc gtacctgtga atcnggnttg atcattttat 420
gcttcatgtn ttcttagcaa ctgtaaaaac ttggatgtga tgtgatccta tcnttaatca 480
gtnccgattt gaaatttctt cagnatgnat tatacaagag aatgnnnngn caccaaaaat 540
agctttacat cagatgcaaa atgcattcnt ntcaaaagaa tggtnangac tggctcaatc 600
tatcctaacg taagctgcng ccnntgtatc ctacattntg gcaagatact agtattttac 660
aagcnacaca gtaagcaaag cagcactntc ctacctaccc aaaaaaaann gatgtgacct 720
gcattctgcc tacaatgcat ntcccctagt ttgactagaa actcttcaaa ctgggacgaa 780
acaaacttaa gatanccaaa acttcgcttg ccatccagtt ctgcaagatt cctcttagnn 840
ggggctgtat ntgtcaaatg tcaagaacgt tttagcgtna cggtgtctgt tcaagcaacg 900
gccaacagca accaccgtaa aataaagcat catttgcatn atctctgtta ttctttgcaa 960
catgtncctc gttttgtttt ctgaaactta tcccagaggc aca 1003
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8029 F引物
<400> 40
tcacgtgcca ccggaaa 17
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8029 R引物
<400> 41
ccacatgcca ccgaaaataa attgt 25
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8029 FAM
<400> 42
ttagcggcaa acgactt 17
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8029 TET
<400> 43
tttagcggca aatgactta 19
<210> 44
<211> 1003
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (230)..(231)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 44
ctttgcttaa taacatctag agtgctgcat gcgtttttca cattttatac taaagtattt 60
atatatgtaa agtattttaa atgttaaagt ctgcatggca cggtaaatga ccgacaattt 120
agggattgat gttcttgatg agcttacgaa tagcttttag gtcgtttgat ttgccgaaat 180
gtaatgcaca cggtttatat gggataatgg atgccaatac tttttttttn nggttgagct 240
ctttctagta gtaccatcta attcaattat aactagtaat tattaccgtg ataagagatc 300
ccattaacaa cgtatgaatc aaacaacacc tttagttcca aagattaaat atcaatgcct 360
aacgagtcct aaaaatgacc actaccgcaa aaatggagcg tccttccaaa aaacatttgt 420
ttttgttatc ttcaaccact gttgatataa gcttcagcac cgactaaaat tttcgatggt 480
cacgtgccac cggaaataag tcgtttgccg ctaaaaataa gcaattttca acaggaaaca 540
atttattttc ggtggcatgt ggccgccaaa aatatttggc cgaaaataag atcttatttt 600
tggcggccca ccctatactg tcaaaaaaaa ttctacggcc ttcagtggcc aacgaaaata 660
agaaaaaaaa ctttttaccg ccacacgtgt ggccgccaaa aataaatatg gtttcttttc 720
ggtggccccc tagccgcaaa aataaacagt tttagaaaaa tatacagaaa gaaaattaca 780
ccagattcaa ccacgtaaca aatatataca catatacatc agattgtaac aaatatatac 840
acatatacat cagattgaca acgcaagtca tctcatcaaa ttcacaacac atgataaaat 900
atatcatatt aaaccacaca agtcatcaca tcgaccaaat tcgcaacacc aatatcacaa 960
gcttctcaat tctacacata ataaaataca catgcctcga gcc 1003
<210> 45
<211> 1003
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (230)..(231)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 45
ctttgcttaa taacatctag agtgctgcat gcgtttttca cattttatac taaagtattt 60
atatatgtaa agtattttaa atgttaaagt ctgcatggca cggtaaatga ccgacaattt 120
agggattgat gttcttgatg agcttacgaa tagcttttag gtcgtttgat ttgccgaaat 180
gtaatgcaca cggtttatat gggataatgg atgccaatac tttttttttn nggttgagct 240
ctttctagta gtaccatcta attcaattat aactagtaat tattaccgtg ataagagatc 300
ccattaacaa cgtatgaatc aaacaacacc tttagttcca aagattaaat atcaatgcct 360
aacgagtcct aaaaatgacc actaccgcaa aaatggagcg tccttccaaa aaacatttgt 420
ttttgttatc ttcaaccact gttgatataa gcttcagcac cgactaaaat tttcgatggt 480
cacgtgccac cggaaataag tcatttgccg ctaaaaataa gcaattttca acaggaaaca 540
atttattttc ggtggcatgt ggccgccaaa aatatttggc cgaaaataag atcttatttt 600
tggcggccca ccctatactg tcaaaaaaaa ttctacggcc ttcagtggcc aacgaaaata 660
agaaaaaaaa ctttttaccg ccacacgtgt ggccgccaaa aataaatatg gtttcttttc 720
ggtggccccc tagccgcaaa aataaacagt tttagaaaaa tatacagaaa gaaaattaca 780
ccagattcaa ccacgtaaca aatatataca catatacatc agattgtaac aaatatatac 840
acatatacat cagattgaca acgcaagtca tctcatcaaa ttcacaacac atgataaaat 900
atatcatatt aaaccacaca agtcatcaca tcgaccaaat tcgcaacacc aatatcacaa 960
gcttctcaat tctacacata ataaaataca catgcctcga gcc 1003
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4257 F引物
<400> 46
cgagactcaa gaacctgata ggaa 24
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4257 R引物
<400> 47
gcagtgttgg cccacgatt 19
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4257 FAM
<400> 48
aagtgattac ctgatcgc 18
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4257 TET
<400> 49
accaaaataa gtgattagct gatc 24
<210> 50
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (192)..(192)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (213)..(213)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (240)..(240)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (282)..(282)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (291)..(291)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (297)..(297)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (387)..(387)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (416)..(416)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (435)..(435)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (601)..(601)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (613)..(613)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (710)..(710)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (977)..(977)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 50
cttagtgaca tgactagcaa tgcaggcttg cggcatcagc ctgaagagaa aaaaaaaccc 60
aacgactctc ttacctgtgc agtggccggg aggagtttgc ctgatggatc ccttagagct 120
gctgaatcgc caatcgcaaa tgtccgggga tggcctttta cttgaagggt ttcctctgtc 180
tccacctgtc cncgaccatt cagaggaata acntagggag catcaggagg ctgtaaccgn 240
ggaatctgag atgttgaacc cactgtccac agcaccaaat cngcatcgag ngtctgncct 300
ttgaggcctc tttcagcagg ttgaaggtcc aaaattagtt tcctatgatc accgtcaact 360
tcagagtatg taactgtgct acttgantca tcagatgtag gagcctcttt gatgcngctc 420
acaaaatatc ccaanaaaag ctgaatattc cgagactcaa gaacctgata ggaaagtagt 480
ggaaccaaaa taagtgatta cctgatcgct cagaaaatat aatttcctca actgaagtac 540
agatattaaa acaatataat cgtgggccaa cactgctacg taaaatagta aaggaatagc 600
ntgacttctc cangttgtat tgcatgggaa tacatgatcc ttgaacaacc caatggaaat 660
gaattgtttg gtgacatgtt acaaaaggta aaggggtttg catgataaan atagcaacat 720
tgcactaaag ctacaaccct tcaattggat cagaattcag acatgagatg accccagagc 780
atccaaatgg aatatgcaat caattacaat tttaatataa agctgaccag aatagttcat 840
tatatatgaa tagaaccttt tagcttctta ccttcagagc agcgtcacga tttccttgtg 900
gagcagtggg acatacggtt gtttgaacat ttattgcctt tacagtccca gtgtttttta 960
atctctcaga tatagtngca gctaattcaa caccggaata g 1001
<210> 51
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (192)..(192)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (213)..(213)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (240)..(240)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (282)..(282)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (291)..(291)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (297)..(297)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (387)..(387)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (416)..(416)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (435)..(435)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (601)..(601)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (613)..(613)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (710)..(710)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (977)..(977)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 51
cttagtgaca tgactagcaa tgcaggcttg cggcatcagc ctgaagagaa aaaaaaaccc 60
aacgactctc ttacctgtgc agtggccggg aggagtttgc ctgatggatc ccttagagct 120
gctgaatcgc caatcgcaaa tgtccgggga tggcctttta cttgaagggt ttcctctgtc 180
tccacctgtc cncgaccatt cagaggaata acntagggag catcaggagg ctgtaaccgn 240
ggaatctgag atgttgaacc cactgtccac agcaccaaat cngcatcgag ngtctgncct 300
ttgaggcctc tttcagcagg ttgaaggtcc aaaattagtt tcctatgatc accgtcaact 360
tcagagtatg taactgtgct acttgantca tcagatgtag gagcctcttt gatgcngctc 420
acaaaatatc ccaanaaaag ctgaatattc cgagactcaa gaacctgata ggaaagtagt 480
ggaaccaaaa taagtgatta gctgatcgct cagaaaatat aatttcctca actgaagtac 540
agatattaaa acaatataat cgtgggccaa cactgctacg taaaatagta aaggaatagc 600
ntgacttctc cangttgtat tgcatgggaa tacatgatcc ttgaacaacc caatggaaat 660
gaattgtttg gtgacatgtt acaaaaggta aaggggtttg catgataaan atagcaacat 720
tgcactaaag ctacaaccct tcaattggat cagaattcag acatgagatg accccagagc 780
atccaaatgg aatatgcaat caattacaat tttaatataa agctgaccag aatagttcat 840
tatatatgaa tagaaccttt tagcttctta ccttcagagc agcgtcacga tttccttgtg 900
gagcagtggg acatacggtt gtttgaacat ttattgcctt tacagtccca gtgtttttta 960
atctctcaga tatagtngca gctaattcaa caccggaata g 1001
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0956BQ F引物
<400> 52
ggaatggagt tttacttgtg ctgaaatc 28
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0956BQ R引物
<400> 53
gattcactac ctcaatctta catgttacca 30
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0956BQ FAM
<400> 54
cttagttaag atcaatttag 20
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0956BQ TET
<400> 55
aacttagtta agatcgattt ag 22
<210> 56
<211> 271
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 56
aatgatagaa ctagatgtac ttggtcgcat acaaggtaca aagacacaac aaagcttact 60
caagtacagt caaagtaaat tacagattca ctacctcaat cttacatgtt accaaataca 120
aacttagtta agatcaattt agtgattgaa actgtgatcc tgaaacatat cagttgtgtt 180
tgtttttgta aggatttcag cacaagtaaa actccattcc aaagaccttg tcaattgcca 240
caactttctt acagatatag tccagtgtcc t 271
<210> 57
<211> 271
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 57
aatgatagaa ctagatgtac ttggtcgcat acaaggtaca aagacacaac aaagcttact 60
caagtacagt caaagtaaat tacagattca ctacctcaat cttacatgtt accaaataca 120
aacttagtta agatcgattt agtgattgaa actgtgatcc tgaaacatat cagttgtgtt 180
tgtttttgta aggatttcag cacaagtaaa actccattcc aaagaccttg tcaattgcca 240
caactttctt acagatatag tccagtgtcc t 271
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0954BQ F引物
<400> 58
cagtgcgcct catacagttg ta 22
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0954BQ R引物
<400> 59
accaagccgg caaaggat 18
<210> 60
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0954BQ FAM
<400> 60
catgtgccta ggagag 16
<210> 61
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0954BQ TET
<400> 61
catgtgcctc ggagag 16
<210> 62
<211> 182
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 62
caaaghgaac aaataatmtc gatkcgagaa arggaaaaat ggatcaarat tttagagaga 60
agaacccagg atattawtaa ggaggctgat gagctaaaca agaagttggc gttratacca 120
agccggcaaa ggatgcatgt gcctaggaga gtacaactgt atgaggcgca ctgtgttgag 180
gc 182
<210> 63
<211> 182
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 63
caaaghgaac aaataatmtc gatkcgagaa arggaaaaat ggatcaarat tttagagaga 60
agaacccagg atattawtaa ggaggctgat gagctaaaca agaagttggc gttratacca 120
agccggcaaa ggatgcatgt gcctcggaga gtacaactgt atgaggcgca ctgtgttgag 180
gc 182
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0954HQ F引物
<400> 64
gagctgatta aatggatcat c 21
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0954HQ R引物
<400> 65
gtgctagcca tccattc 17
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0954HQ FAM
<400> 66
ttcacaaagg aactttata 19
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0954HQ TET
<400> 67
aggaactttg taaaggca 18
<210> 68
<211> 106
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 68
gagctgatta aatggatcat ctgtttttct tcttgggtga attcacaaag gaactttata 60
aaggcactga atggatggct agcactctgt cttaactatg agcctg 106
<210> 69
<211> 106
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 69
gagctgatta aatggatcat ctgtttttct tcttgggtga attcacaaag gaactttgta 60
aaggcactga atggatggct agcactctgt cttaactatg agcctg 106
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM6568 F引物
<400> 70
caagtcactg cttccgtcca tt 22
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM6568 R引物
<400> 71
ggatcgacgc tttgttcacc tg 22
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM6568 FAM
<400> 72
cacgacgaaa ggattaaa 18
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM6568 TET
<400> 73
cacgacgaaa ggatttaa 18
<210> 74
<211> 1004
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (11)..(11)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (26)..(26)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(33)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (36)..(36)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (51)..(51)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (54)..(54)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (72)..(72)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (186)..(186)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (219)..(219)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (237)..(237)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (245)..(247)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (249)..(249)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (265)..(265)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (360)..(365)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (368)..(368)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (459)..(459)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (479)..(479)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (489)..(489)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (496)..(496)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (544)..(545)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (561)..(561)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (597)..(597)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (622)..(622)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (712)..(714)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (735)..(735)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (806)..(806)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (820)..(820)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (922)..(922)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (998)..(1001)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 74
gcctctgcga ngaaatggac ctgcangnnn nnnccnctac cnctagagga nggntggacc 60
gtggacgcgt cnaatttcga ggtcccctgc tcttccccgc agccagcgcc gcctccggtg 120
gacagggcta ccgctaacgt cgccgccgac gcctcaaggg cacccgtcta cggctctcgc 180
gcgacnagtt tcatggcttg gacgaggtcc tcgcagcant cgtcgtgctc cgacgangcg 240
gcgcnnncng cagtagtgcc ggccntcgag gagccgcaga gattgctgaa gaaagtggtg 300
gccggcggcg gtgcttggga gagctgtggc ggcgcgacgg gagcagcaca ggaaatgagn 360
nnnnntgnca ccaagaacca cgtcatgtcg gagcgaaagc gacgagagaa gctcaacgag 420
atgttcctcg tcctcaagtc actgcttccg tccattcana gggtaatgaa caagatacnt 480
accatcgant tttcantttt ttaaatcctt tcgtcgtgtt gatttgaaaa cttaattgga 540
gacnnatttt ttcccccaat ntggcaggtg aacaaagcgt cgatcctcgc cgaaacnata 600
gcctacctca aggagcttca gngaagggtg caagagctgg agtccagtag ggaacctgcg 660
tcgcgcccat ccgaaacgac gacaaggcta ataacaaggc cctcccgtgg cnnnaatgag 720
agtgtgagga aggangtctg cgcgggctcc aagaggaaga gcccagagct cggcagagac 780
gacgtggagc gccccccggt cctcancatg gacgccggcn ccagcaacgt caccgtcacc 840
gtctcggaca aggacgtgct cctggaggtg cagtgccggt gggaggagct cctgatgacg 900
cgagtgttcg acgccatcaa gngcctccat ttggacgtcc tctcggttca ggcttcagcg 960
ccagatggct tcatggggct taagatacga gctcaggnnn ntat 1004
<210> 75
<211> 1004
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (11)..(11)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (26)..(26)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(33)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (36)..(36)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (51)..(51)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (54)..(54)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (72)..(72)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (186)..(186)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (219)..(219)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (237)..(237)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (245)..(247)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (249)..(265)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (360)..(368)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (459)..(459)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (479)..(479)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (489)..(489)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (496)..(496)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (544)..(545)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (561)..(561)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (597)..(597)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (622)..(622)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (712)..(714)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (735)..(735)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (806)..(806)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (820)..(820)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (922)..(922)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (998)..(1001)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 75
gcctctgcga ngaaatggac ctgcangnnn nnnccnctac cnctagagga nggntggacc 60
gtggacgcgt cnaatttcga ggtcccctgc tcttccccgc agccagcgcc gcctccggtg 120
gacagggcta ccgctaacgt cgccgccgac gcctcaaggg cacccgtcta cggctctcgc 180
gcgacnagtt tcatggcttg gacgaggtcc tcgcagcant cgtcgtgctc cgacgangcg 240
gcgcnnncng cagtagtgcc ggccntcgag gagccgcaga gattgctgaa gaaagtggtg 300
gccggcggcg gtgcttggga gagctgtggc ggcgcgacgg gagcagcaca ggaaatgagn 360
nnnnntgnca ccaagaacca cgtcatgtcg gagcgaaagc gacgagagaa gctcaacgag 420
atgttcctcg tcctcaagtc actgcttccg tccattcana gggtaatgaa caagatacnt 480
accatcgant tttcantttt tttaatcctt tcgtcgtgtt gatttgaaaa cttaattgga 540
gacnnatttt ttcccccaat ntggcaggtg aacaaagcgt cgatcctcgc cgaaacnata 600
gcctacctca aggagcttca gngaagggtg caagagctgg agtccagtag ggaacctgcg 660
tcgcgcccat ccgaaacgac gacaaggcta ataacaaggc cctcccgtgg cnnnaatgag 720
agtgtgagga aggangtctg cgcgggctcc aagaggaaga gcccagagct cggcagagac 780
gacgtggagc gccccccggt cctcancatg gacgccggcn ccagcaacgt caccgtcacc 840
gtctcggaca aggacgtgct cctggaggtg cagtgccggt gggaggagct cctgatgacg 900
cgagtgttcg acgccatcaa gngcctccat ttggacgtcc tctcggttca ggcttcagcg 960
ccagatggct tcatggggct taagatacga gctcaggnnn ntat 1004
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0953BQ F引物
<400> 76
ggcttatagc ttagaggcac ttgaa 25
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0953BQ R引物
<400> 77
cctctgcacc gccatcaa 18
<210> 78
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0953BQ FAM
<400> 78
tcagcctcat cctc 14
<210> 79
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0953BQ TET
<400> 79
ctcagcctta tcctc 15
<210> 80
<211> 288
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 80
acgtagcaca tgataagaag gctgcrttga gacagtaaga cgaagaatgg cargcagaag 60
agcacgtcrg catgctcccc gcggcttata gcttagaggc acttgaatcc ggtgggcack 120
ctcttgccgc agtggttgag gatgaggctg aggtcgacsg gyaggttgag cttgattcck 180
aggacctctc ccttgatggc ggtgcagagg cacacggcgg cctcgaggtc gacgagtccc 240
ttcagcagcr ggcagcatgg ctccgtgggc ggcacgccca ccttggcc 288
<210> 81
<211> 288
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 81
acgtagcaca tgataagaag gctgcrttga gacagtaaga cgaagaatgg cargcagaag 60
agcacgtcrg catgctcccc gcggcttata gcttagaggc acttgaatcc ggtgggcack 120
ctcttgccgc agtggttgag gataaggctg aggtcgacsg gyaggttgag cttgattcck 180
aggacctctc ccttgatggc ggtgcagagg cacacggcgg cctcgaggtc gacgagtccc 240
ttcagcagcr ggcagcatgg ctccgtgggc ggcacgccca ccttggcc 288
<210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM6604 F引物
<400> 82
tgatcatcca gggcacgac 19
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM6604 R引物
<400> 83
gggcttaaga tacgagctca gg 22
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM6604 FAM
<400> 84
cagcaaactg catagaaat 19
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM6604 TET
<400> 85
cagcaaactg cataggaa 18
<210> 86
<211> 1004
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (79)..(79)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (81)..(81)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (113)..(113)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (144)..(147)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (149)..(152)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (161)..(161)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (178)..(178)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (182)..(182)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (196)..(196)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (202)..(202)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (246)..(246)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (252)..(252)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (258)..(258)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (294)..(294)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (301)..(301)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (319)..(319)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (322)..(322)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (326)..(326)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (334)..(334)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (359)..(359)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (383)..(383)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (390)..(390)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (508)..(508)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (516)..(517)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (529)..(529)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (567)..(567)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (598)..(598)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (623)..(626)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (702)..(702)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (804)..(804)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (818)..(818)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (889)..(889)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (910)..(912)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1002)..(1002)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 86
atgatattta gacaaaagtt agccatgtca taaaaacttn gngttggagt gtagtttcca 60
atattacaaa aatatcatng ntatctagaa tgctatgact ttgaaaatat agnttttatg 120
aatgcaacca aacaccttat gccnnnnann nncactctag nattcctata aaccatgnga 180
tngcttagaa actatnaaaa anaatttact tccaaatata ccttacgctt agtctttagc 240
ttcctntctt cntttttnga gtttctacgt gttaagggct ggagtctaag tatncatgcc 300
natataattg ttgatatana gntccnattc atgnctgtta tctaaagaaa caagaaatnc 360
atctttgctt cgatcccatg aanccttccn tgcccgtcga tgtccaaatt tccagctgcc 420
ccttcaccgc ttccctatag ctttgcgaag agcctcgctg atcatccagg gcacgacggc 480
accggagcca gcaaactgca tagaaatnga gcatannagt taaacaacng cgtcagtaaa 540
aaacaaactc tccaaccaaa gagtctnatt aaccagagca gtattgcaat cgccatgnat 600
gtctcttagt ttgctggtga tannnncctg agctcgtatc ttaagcccca tgaagccatc 660
tggcgctgaa gcctgaaccg agaggacgtc caaatggagg cncttgatgg cgtcgaacac 720
tcgcgtcatc aggagctcct cccaccggca ctgcacctcc aggagcacgt ccttgtccga 780
gacggtgacg gtgacgttgc tggngccggc gtccatgntg aggaccgggg ggcgctccac 840
gtcgtctctg ccgagctctg ggctcttcct cttggagccc gcgcagacnt ccttcctcac 900
actctcattn nngccacggg agggccttgt tattagcctt gtcgtcgttt cggatgggcg 960
cgacgcaggt tccctactgg actccagctc ttgcaccctt cnct 1004
<210> 87
<211> 1004
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (42)..(42)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (79)..(79)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (81)..(81)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (113)..(113)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (144)..(147)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (149)..(152)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (161)..(161)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (178)..(178)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (182)..(182)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (196)..(196)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (202)..(202)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (246)..(246)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (252)..(252)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (258)..(258)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (294)..(294)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (301)..(301)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (319)..(319)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (322)..(322)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (326)..(326)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (334)..(334)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (359)..(359)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (383)..(383)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (390)..(390)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (508)..(508)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (516)..(517)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (529)..(529)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (567)..(567)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (598)..(598)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (623)..(626)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (702)..(702)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (804)..(804)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (818)..(818)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (889)..(889)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (910)..(912)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1002)..(1002)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 87
atgatattta gacaaaagtt agccatgtca taaaaacttn gngttggagt gtagtttcca 60
atattacaaa aatatcatng ntatctagaa tgctatgact ttgaaaatat agnttttatg 120
aatgcaacca aacaccttat gccnnnnann nncactctag nattcctata aaccatgnga 180
tngcttagaa actatnaaaa anaatttact tccaaatata ccttacgctt agtctttagc 240
ttcctntctt cntttttnga gtttctacgt gttaagggct ggagtctaag tatncatgcc 300
natataattg ttgatatana gntccnattc atgnctgtta tctaaagaaa caagaaatnc 360
atctttgctt cgatcccatg aanccttccn tgcccgtcga tgtccaaatt tccagctgcc 420
ccttcaccgc ttccctatag ctttgcgaag agcctcgctg atcatccagg gcacgacggc 480
accggagcca gcaaactgca taggaatnga gcatannagt taaacaacng cgtcagtaaa 540
aaacaaactc tccaaccaaa gagtctnatt aaccagagca gtattgcaat cgccatgnat 600
gtctcttagt ttgctggtga tannnncctg agctcgtatc ttaagcccca tgaagccatc 660
tggcgctgaa gcctgaaccg agaggacgtc caaatggagg cncttgatgg cgtcgaacac 720
tcgcgtcatc aggagctcct cccaccggca ctgcacctcc aggagcacgt ccttgtccga 780
gacggtgacg gtgacgttgc tggngccggc gtccatgntg aggaccgggg ggcgctccac 840
gtcgtctctg ccgagctctg ggctcttcct cttggagccc gcgcagacnt ccttcctcac 900
actctcattn nngccacggg agggccttgt tattagcctt gtcgtcgttt cggatgggcg 960
cgacgcaggt tccctactgg actccagctc ttgcaccctt cnct 1004
<210> 88
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8040 F引物
<400> 88
ccctgttccg aggccattt 19
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8040 R引物
<400> 89
cgtgagcttt cgtctgcgat 20
<210> 90
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8040 FAM
<400> 90
tcgatcgggt atgctct 17
<210> 91
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8040 TET
<400> 91
cgggtgtgct ctcc 14
<210> 92
<211> 1022
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (54)..(54)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (99)..(100)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (102)..(103)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (141)..(141)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (156)..(156)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (160)..(163)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (174)..(177)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (182)..(182)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (188)..(189)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (203)..(203)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (229)..(232)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (246)..(246)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (253)..(254)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (261)..(272)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (275)..(278)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (422)..(422)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (531)..(533)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 92
gcgacgaggt tgcggtagac gacgaggacg aagtggttca tgccgcgctt gagngaggcg 60
acggagacga tgtacatccc cgagaacccc acctgcagnn gnnccatcgc caggtacggc 120
ttcacgtcgt tcatcagctt ncccacgccc atggcngctn nnngtacgta cgtnnnncac 180
gncccccnnt ctgatcgatt acnagcacga cgtgctgagg gagggaggnn nncaaggcag 240
gcaggngtgg cgnnagctag nnnnnnnnnn nnctnnnnca cttgtgctgc tcctctcctc 300
gatctactcc acggcgagga agacagcccg ctgcgctgcc ggttttatag caatgcgcga 360
gcgcgcggca cacgtcaggt caatgtcgtc ccatgcatgc atgcccccca cccccacccc 420
cncgcgcgcg caacgtcacg aacgcagttg caggttgcag cataccccag cactcttgcc 480
ctgttccgag gccattttcc gcgccacatc gatcgggtgt gctctccact nnnagctcaa 540
aaaagaaaaa aaaaagataa ttaattacgc gctctcttct ccatcgcaga cgaaagctca 600
cgtctctata gttgcatata tgtgatgtta acacacgtga acagacgagg tcttcacggt 660
aaataccaca tcgtcacaca aataccatat atatacgtac gtgctacccg gagaggcgcg 720
tgatgtaact ataacacctc taggcatata taccggcgtg tacgtacggt atcagaaact 780
atagcttgtt cgattttgac agcctcataa ccaaagaaag ctcgtctagc gggagaggat 840
aatgggatct aaattttacg ctataaaatt taaggattcg atcgaattaa gattagactc 900
tgtttatatt tatttttgaa ctaaaagtaa ttaagagctc aaacaatttg ggaaaaaaat 960
atttggaccg tgatccaata ccacccctaa gtcgggaggg agactccgct aggagaatcg 1020
cg 1022
<210> 93
<211> 1022
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (54)..(54)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (99)..(100)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (102)..(103)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (141)..(141)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (156)..(156)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (160)..(163)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (174)..(177)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (182)..(182)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (188)..(189)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (203)..(203)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (229)..(232)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (246)..(246)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (253)..(254)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (261)..(272)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (275)..(278)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (422)..(422)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (531)..(533)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 93
gcgacgaggt tgcggtagac gacgaggacg aagtggttca tgccgcgctt gagngaggcg 60
acggagacga tgtacatccc cgagaacccc acctgcagnn gnnccatcgc caggtacggc 120
ttcacgtcgt tcatcagctt ncccacgccc atggcngctn nnngtacgta cgtnnnncac 180
gncccccnnt ctgatcgatt acnagcacga cgtgctgagg gagggaggnn nncaaggcag 240
gcaggngtgg cgnnagctag nnnnnnnnnn nnctnnnnca cttgtgctgc tcctctcctc 300
gatctactcc acggcgagga agacagcccg ctgcgctgcc ggttttatag caatgcgcga 360
gcgcgcggca cacgtcaggt caatgtcgtc ccatgcatgc atgcccccca cccccacccc 420
cncgcgcgcg caacgtcacg aacgcagttg caggttgcag cataccccag cactcttgcc 480
ctgttccgag gccattttcc gcgccacatc gatcgggtat gctctccact nnnagctcaa 540
aaaagaaaaa aaaaagataa ttaattacgc gctctcttct ccatcgcaga cgaaagctca 600
cgtctctata gttgcatata tgtgatgtta acacacgtga acagacgagg tcttcacggt 660
aaataccaca tcgtcacaca aataccatat atatacgtac gtgctacccg gagaggcgcg 720
tgatgtaact ataacacctc taggcatata taccggcgtg tacgtacggt atcagaaact 780
atagcttgtt cgattttgac agcctcataa ccaaagaaag ctcgtctagc gggagaggat 840
aatgggatct aaattttacg ctataaaatt taaggattcg atcgaattaa gattagactc 900
tgtttatatt tatttttgaa ctaaaagtaa ttaagagctc aaacaatttg ggaaaaaaat 960
atttggaccg tgatccaata ccacccctaa gtcgggaggg agactccgct aggagaatcg 1020
cg 1022
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8091 F引物
<400> 94
ctgcacgccg ccagatta 18
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8091 R引物
<400> 95
cagctgacgg caacaattag ta 22
<210> 96
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8091 FAM
<400> 96
cgaccgtaac catgtaac 18
<210> 97
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM8091 TET
<400> 97
accgtaaccc tgtaaca 17
<210> 98
<211> 1002
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (27)..(27)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (36)..(36)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (66)..(66)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (78)..(78)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (84)..(84)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (101)..(101)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (119)..(119)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (131)..(131)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (137)..(137)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (140)..(153)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (157)..(157)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (172)..(172)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (174)..(174)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (215)..(215)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (218)..(218)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (250)..(250)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (266)..(266)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (279)..(279)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (285)..(285)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (287)..(287)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (292)..(292)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (420)..(420)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (453)..(453)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (572)..(572)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (619)..(619)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (820)..(820)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (842)..(842)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (870)..(870)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (880)..(884)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 98
caaaangtgt tagtacattt taaaggnaag nccaangatg gataatcttc tgaatacatg 60
agttgncatc gtccttcncc tggngaccaa tggtactctc nacctcccag aagtagaant 120
gtttgttcag nattttnttn nnnnnnnnnn nnnatantcg gtcaatacta tncntagaat 180
gggccggtgg ctttaggcct atatcggtac tatgnatnga ggcccaggtt cagcctagat 240
gcatatcagn tagccctccc tcgtcngtcg atattattnt tctcngntgt tnttttgcag 300
gtcggggggg gggggggagt agttgaatgg tgctgatttt tttggtagaa agctaaaaaa 360
actgacgacc ctgcatatca actaaagtag cacgtagaaa tcttgggaag ccggtacagn 420
tcacaatttg gttccacacg cgaaaagcat cangacactt gcatgtgcct gcacgccgcc 480
agattattac gaccgtaacc ctgtaacaaa atttcaaata ctaattgttg ccgtcagctg 540
acgtaagcta tagaggattt gggaatcctt cnttaacgca aatatgccta attttttttt 600
tgtagttggt ctttttttng aaacaaattc atgtttagac ctttgacgat ttaatgtcgt 660
ttttaggcct tttgctgggc gctataaatc atgacgacaa tataatatgt ctcggcgtca 720
tgacttataa tgtcgaggta atagatacac actggactac tcatgctacg atggcgtcta 780
tgcttagctt ggcgtcatag atcacggcgc cgagctcacn gctgacgatt gcaacgcttc 840
cngcggcgag aattgatgcc gcatccaacn tgcatgtctn nnnngcggtc tcatccttca 900
tgcatgagtt cttttctttg tcaaaaataa tggacgttga tggcagcaac tctagtccca 960
ccgcatccat agcacatcac cgtgatttat ttccgtacga ag 1002
<210> 99
<211> 1002
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (27)..(27)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (36)..(36)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (66)..(66)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (78)..(78)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (84)..(84)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (101)..(101)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (119)..(119)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (131)..(131)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (137)..(137)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (140)..(153)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (157)..(157)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (172)..(172)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (174)..(174)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (215)..(215)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (218)..(218)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (250)..(250)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (266)..(266)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (279)..(279)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (285)..(285)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (287)..(287)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (292)..(292)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (420)..(420)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (453)..(453)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (572)..(572)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (619)..(619)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (820)..(820)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (842)..(842)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (870)..(870)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (880)..(884)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 99
caaaangtgt tagtacattt taaaggnaag nccaangatg gataatcttc tgaatacatg 60
agttgncatc gtccttcncc tggngaccaa tggtactctc nacctcccag aagtagaant 120
gtttgttcag nattttnttn nnnnnnnnnn nnnatantcg gtcaatacta tncntagaat 180
gggccggtgg ctttaggcct atatcggtac tatgnatnga ggcccaggtt cagcctagat 240
gcatatcagn tagccctccc tcgtcngtcg atattattnt tctcngntgt tnttttgcag 300
gtcggggggg gggggggagt agttgaatgg tgctgatttt tttggtagaa agctaaaaaa 360
actgacgacc ctgcatatca actaaagtag cacgtagaaa tcttgggaag ccggtacagn 420
tcacaatttg gttccacacg cgaaaagcat cangacactt gcatgtgcct gcacgccgcc 480
agattattac gaccgtaacc atgtaacaaa atttcaaata ctaattgttg ccgtcagctg 540
acgtaagcta tagaggattt gggaatcctt cnttaacgca aatatgccta attttttttt 600
tgtagttggt ctttttttng aaacaaattc atgtttagac ctttgacgat ttaatgtcgt 660
ttttaggcct tttgctgggc gctataaatc atgacgacaa tataatatgt ctcggcgtca 720
tgacttataa tgtcgaggta atagatacac actggactac tcatgctacg atggcgtcta 780
tgcttagctt ggcgtcatag atcacggcgc cgagctcacn gctgacgatt gcaacgcttc 840
cngcggcgag aattgatgcc gcatccaacn tgcatgtctn nnnngcggtc tcatccttca 900
tgcatgagtt cttttctttg tcaaaaataa tggacgttga tggcagcaac tctagtccca 960
ccgcatccat agcacatcac cgtgatttat ttccgtacga ag 1002
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM2918 F引物
<400> 100
atggtgccaa ttcgtaattt aagtt 25
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM2918 R引物
<400> 101
acccctctgg ttgcctctct 20
<210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM2918 FAM
<400> 102
aataccctcc agtttc 16
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM2918 TET
<400> 103
tatgaagaag aataccatcc 20
<210> 104
<211> 424
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (268)..(268)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 104
atgatgatga tgactagatg gagttccact gatatgaaga gaagaaatag aatattggct 60
aatatggtgc caattcgtaa tttaagttta cctgattatt atgaatatga agaagaatac 120
cctccagttt caagagaggc aaccagaggg gtctgtatac tcctacgaat agacagatat 180
ttatcttcaa ttggaaggag cattcaagac cgtgaggttc tacgcgattt ccgccaacgg 240
ttactctttc cccaacgcga ggctgggnac agcttttccg aaatatatga tgatatacga 300
gcgcatgggg tagaagcaag tcgattgggt cagcctctaa gagatctgta cgatgagatg 360
gaaaggaacg gcgagatagt aaataacggc tcaatcatta tccctggagg cggcggacca 420
gtaa 424
<210> 105
<211> 424
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (268)..(268)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 105
atgatgatga tgactagatg gagttccact gatatgaaga gaagaaatag aatattggct 60
aatatggtgc caattcgtaa tttaagttta cctgattatt atgaatatga agaagaatac 120
catccagttt caagagaggc aaccagaggg gtctgtatac tcctacgaat agacagatat 180
ttatcttcaa ttggaaggag cattcaagac cgtgaggttc tacgcgattt ccgccaacgg 240
ttactctttc cccaacgcga ggctgggnac agcttttccg aaatatatga tgatatacga 300
gcgcatgggg tagaagcaag tcgattgggt cagcctctaa gagatctgta cgatgagatg 360
gaaaggaacg gcgagatagt aaataacggc tcaatcatta tccctggagg cggcggacca 420
gtaa 424
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4813 F引物
<400> 106
ggctaatatg gtgccaattc gta 23
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4813 R引物
<400> 107
ggagtataca gacccctctg gtt 23
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4813 FAM
<400> 108
ttgaaactgg agggtattct 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4813 TET
<400> 109
cttgaaactg gatggtattc 20
<210> 110
<211> 424
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (268)..(268)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 110
atgatgatga tgactagatg gagttccact gatatgaaga gaagaaatag aatattggct 60
aatatggtgc caattcgtaa tttaagttta cctgattatt atgaatatga agaagaatac 120
cctccagttt caagagaggc aaccagaggg gtctgtatac tcctacgaat agacagatat 180
ttatcttcaa ttggaaggag cattcaagac cgtgaggttc tacgcgattt ccgccaacgg 240
ttactctttc cccaacgcga ggctgggnac agcttttccg aaatatatga tgatatacga 300
gcgcatgggg tagaagcaag tcgattgggt cagcctctaa gagatctgta cgatgagatg 360
gaaaggaacg gcgagatagt aaataacggc tcaatcatta tccctggagg cggcggacca 420
gtaa 424
<210> 111
<211> 424
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (268)..(268)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 111
atgatgatga tgactagatg gagttccact gatatgaaga gaagaaatag aatattggct 60
aatatggtgc caattcgtaa tttaagttta cctgattatt atgaatatga agaagaatac 120
catccagttt caagagaggc aaccagaggg gtctgtatac tcctacgaat agacagatat 180
ttatcttcaa ttggaaggag cattcaagac cgtgaggttc tacgcgattt ccgccaacgg 240
ttactctttc cccaacgcga ggctgggnac agcttttccg aaatatatga tgatatacga 300
gcgcatgggg tagaagcaag tcgattgggt cagcctctaa gagatctgta cgatgagatg 360
gaaaggaacg gcgagatagt aaataacggc tcaatcatta tccctggagg cggcggacca 420
gtaa 424
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM2914 F引物
<400> 112
gtattcgcac ctactctgcc g 21
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM2914 R引物
<400> 113
aaagcaaaaa taccattgca acc 23
<210> 114
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM2914 FAM
<400> 114
cgtaaatttt gtttgatgc 19
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM2914 TET
<400> 115
atcgtaaatt ttttttgatg c 21
<210> 116
<211> 616
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (382)..(382)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (402)..(402)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (526)..(526)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 116
gatgcctttt taaggaaccc tccccccgag tcggatttgt ctcaggaagt ggggccggtt 60
ccaccgccac cggtggcgtg ttgtcatggg gatgatcacc cccttctggc gaagggccag 120
tggttgggct caaccgttcg ccctccgtag ggctgagtgg cggatctata aaatctgggg 180
cggaccgaac ctccatttcg aattcaaaat ctaaaggagc ctttcctttg cgcccctctt 240
gggtggatcc ctcccccgct tccattagaa gcggtttttg cccccccacc tttgaaggca 300
gtttatcgga agaaccccaa ctttctcctt gggtcatccc cagagtagca ctctgctccc 360
ataggagctg gaatagaaaa cngagccaca ttacgagtgc gncaatgaga gccttccgga 420
gcgccagaaa gagttccgcg agatcaaaaa agcaaaaata ccattgcaac caacacgagg 480
caggaagcag aagcatcaaa caaaatttac gattcatgac aatccnattt ttgaagcgaa 540
aaaacttctt cttccactta ggagaggcgg cagagtaggt gcgaataccc agaagggtac 600
tcgctcctcg tgctcc 616
<210> 117
<211> 616
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (382)..(382)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (402)..(402)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (526)..(526)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 117
gatgcctttt taaggaaccc tccccccgag tcggatttgt ctcaggaagt ggggccggtt 60
ccaccgccac cggtggcgtg ttgtcatggg gatgatcacc cccttctggc gaagggccag 120
tggttgggct caaccgttcg ccctccgtag ggctgagtgg cggatctata aaatctgggg 180
cggaccgaac ctccatttcg aattcaaaat ctaaaggagc ctttcctttg cgcccctctt 240
gggtggatcc ctcccccgct tccattagaa gcggtttttg cccccccacc tttgaaggca 300
gtttatcgga agaaccccaa ctttctcctt gggtcatccc cagagtagca ctctgctccc 360
ataggagctg gaatagaaaa cngagccaca ttacgagtgc gncaatgaga gccttccgga 420
gcgccagaaa gagttccgcg agatcaaaaa agcaaaaata ccattgcaac caacacgagg 480
caggaagcag aagcatcaaa aaaaatttac gattcatgac aatccnattt ttgaagcgaa 540
aaaacttctt cttccactta ggagaggcgg cagagtaggt gcgaataccc agaagggtac 600
tcgctcctcg tgctcc 616
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4812 F引物
<400> 118
ggctttatag tcctcagaaa ggtga 25
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4812 R引物
<400> 119
tcgtagccac gtgctctaat c 21
<210> 120
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4812 FAM
<400> 120
cgggaagaga tcctgtgg 18
<210> 121
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4812 TET
<400> 121
cccgggacct gtgg 14
<210> 122
<211> 1005
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 122
tctcatatta agtcggaaga gtttaggtaa gactttcaaa gaaactctcg acgggagaat 60
cgagtctatt caggaatcat tgcagcaatt cttcaatcct aacgaagtca ttctggagga 120
atccaatgaa caacaacgat tacttaatct acggatcagc ttgcgaattt gcagcaccgt 180
aaaagtagta gaatcattac cagcggcacg ctgtgcgcct aagtgcgaaa agacagtgca 240
agctttgtta tgccgaaacc taaatgtcaa gtcagcaaca cttctaaatg ccacttcttc 300
ccgtcgcatc cgtcttcagg acgatatagt cacaggtttt cacttttcag tgagtgaaag 360
attagtatcc gggtctacaa ctttggtaga agcttctacc gtagaacaaa ttcgagaggc 420
cttcttatta gaacccagag acctaattcg agaaggcttt atagtcctca gaaaggtgag 480
ggtggggggt atccccggga agagatcctg tggagacggg gtgggcctgt agctcagctc 540
agaggattag agcacgtggc tacgaaccac gatgttgggg gttcgaatcc acttctgaga 600
aggaagtatt ggctatgcac cccttccctt gactaactaa gtctgcatat aaggagtgca 660
gaaattctat actgttcgta tcgccgtgca aattatacgc aatttgtttc attgtaaacc 720
cttggccctt ccaattcacg cccggaggag tattacaata gacgttgaaa caaccctgga 780
gcttatctgt aatttgctcc ttgagcgttt ctaacgtcaa taaagtcctc caacttatga 840
tgccagtttt ccgaagccgc ggcttttacc cgctttataa gcgatgagta gggcgatgca 900
taaaaagtca tatttcttgg tgtagggatg gatctcatag gaaaagagat accgaggccc 960
accaaccata tacttgattt atggtttggt ggggaaagaa gagtg 1005
<210> 123
<211> 999
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 123
tctcatatta agtcggaaga gtttaggtaa gactttcaaa gaaactctcg acgggagaat 60
cgagtctatt caggaatcat tgcagcaatt cttcaatcct aacgaagtca ttctggagga 120
atccaatgaa caacaacgat tacttaatct acggatcagc ttgcgaattt gcagcaccgt 180
aaaagtagta gaatcattac cagcggcacg ctgtgcgcct aagtgcgaaa agacagtgca 240
agctttgtta tgccgaaacc taaatgtcaa gtcagcaaca cttctaaatg ccacttcttc 300
ccgtcgcatc cgtcttcagg acgatatagt cacaggtttt cacttttcag tgagtgaaag 360
attagtatcc gggtctacaa ctttggtaga agcttctacc gtagaacaaa ttcgagaggc 420
cttcttatta gaacccagag acctaattcg agaaggcttt atagtcctca gaaaggtgag 480
ggtggggggt atccccggga cctgtggaga cggggtgggc ctgtagctca gctcagagga 540
ttagagcacg tggctacgaa ccacgatgtt gggggttcga atccacttct gagaaggaag 600
tattggctat gcaccccttc ccttgactaa ctaagtctgc atataaggag tgcagaaatt 660
ctatactgtt cgtatcgccg tgcaaattat acgcaatttg tttcattgta aacccttggc 720
ccttccaatt cacgcccgga ggagtattac aatagacgtt gaaacaaccc tggagcttat 780
ctgtaatttg ctccttgagc gtttctaacg tcaataaagt cctccaactt atgatgccag 840
ttttccgaag ccgcggcttt tacccgcttt ataagcgatg agtagggcga tgcataaaaa 900
gtcatatttc ttggtgtagg gatggatctc ataggaaaag agataccgag gcccaccaac 960
catatacttg atttatggtt tggtggggaa agaagagtg 999
<210> 124
<211> 1371
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 124
agttcatcac taatcacact tattgttccc tcgacgagta tctagctagc tcattaatcg 60
atcaatcggg gtgtgcggtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120
aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg 180
cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc 240
atcctcgcct tcctcgaggc caggctgcag gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg 300
gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360
gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420
gagaactgcc cgcgcatctt ccctcagaag agcaggcttg cggccgccat gtccgcgctg 480
aggaagccaa agtacaacgg caagtgcatg cgcagcctga ttaggagcat cctcggcgag 540
acgagggcca agagcacgcc tctgaagaac gctctgctct cggacgtgtg cattggcacg 600
tccgccgcgc cgacctacct cccggcgcac tacttccaga ctgaagacgc caacggcaag 660
gagcgcgaat acaacctcat cgacggcggt gtggcggcca acaacccgac gatggttgcg 720
atgacgcaga tcaccaaaaa gatgcttgcc agcaaggaca aggccgagga gctgtaccca 780
gtgaagccgt cgaactgccg caggttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcc 840
gagcagggcc tctacacggc gcggcagtgc tcccggtggg gtatctgccg gtggctccgc 900
aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctcgga cctggtggac 960
atccacgtcg ccgcgatgtt ccagtcgctc cacagcgacg gcgactacct gcgcatccag 1020
gacaactcgc tccgtggcgc cgcggccacc gtggacgcgg cgacgccgga gaacatgcgg 1080
acgctcgtcg ggatcgggga gcggatgctg gcacagaggg tgtccagggt caacgtggag 1140
acagggaggt acgaaccggt gactggcgaa ggaagcaatg ccgatgccct cggtgggctc 1200
gctaggcagc tctccgagga gaggagaaca aggctcgcgc gccgcgtgtc tgccatcaac 1260
ccaagaggct ctagatgtgc gtcgtacgat atctaagaca agtggcttta ctgtcagtca 1320
catgcttgta aataagtaga ctttatttta ataaaacata aaaatatata t 1371
<210> 125
<211> 1375
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 125
agttcatcac taatcacact tattgttccc tcgacgagta tctagctagc tcattaatcg 60
atcaatcggg gtgtgcggtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120
aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg 180
cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc 240
atcctcgcct tcctcgaggc caggctgcag gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg 300
gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360
gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420
gagaactgcc cgcgcatctt ccctcagaag agcaggcttg cggccgccat gtccgcgctg 480
aggaagccaa agtacaacgg caagtgcatg cgcagcctga ttaggagcat cctcggcgag 540
acgagggcca agagcacgcc tctgaagaac gctctgctct cggacgtgtg cattggcacg 600
tccgccgcgc cgacctacct cccggcgcac tacttccaga ctgaagacgc caacggcaag 660
gagcgcgaat acaacctcat cgacggcggt gtggcggcca acaacccgac gatggttgcg 720
atgacgcaga tcaccaaaaa gatgcttgcc agcaaggaca aggccgagga gctgtaccca 780
gtgaagccgt cgaactgccg caggttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcc 840
gagcagggcc tctacacggc gcggcagtgc tcccggtggg gtatctgccg gtggctccgc 900
aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctcgga cctggtggac 960
atccacgtcg ccgcgatgtt ccagtcgctc cacagcgacg gcgactacct gcgcatccag 1020
gacaactcgc tccgtggcgc cgcggccacc gtggacgcgg cgacgccgga gaacatgcgg 1080
acgctcgtcg ggatcgggga gcggatgctg gcacagaggg tgtccagggt caacgtggag 1140
acagggagcg aggtacgaac cggtgactgg cgaaggaagc aatgccgatg ccctcggtgg 1200
gctcgctagg cagctctccg aggagaggag aacaaggctc gcgcgccgcg tgtctgccat 1260
caacccaaga ggctctagat gtgcgtcgta cgatatctaa gacaagtggc tttactgtca 1320
gtcacatgct tgtaaataag tagactttat tttaataaaa cataaaaata tatat 1375
<210> 126
<211> 618
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 126
atggatcgca gcaacgccgg tgcggtgtcc gtcgaggtgc gcggcggcgg cggcggctcg 60
ccgccgggcg cgggaaggaa gcgccgcgcg gtggcgaggg gcgtgcagaa gacgctctcc 120
aagacgtcca tgctggccaa cttcctcccc acgggcacgc tgctaacctt cgagatgcta 180
ctcccggccg ccgcaggcga cggcacctgc tcggcggtca gcgccgcgat gctcagggcc 240
ctgctcgcgc tctgcgccgc ctcctgcttc ctcttccact tcaccgacag cttccgcgcc 300
ccggacggga aggtgtacta cggcttcgtc acgccgcggg gcctgtcgct gttcaggacc 360
gggctcggcg tcgaggtgcc cagggaggaa aggtaccggc tcgccttcgt cgacgtcgtg 420
cacgctgtca tgtccgtgct ggtctttgcg gccgtcacgc tcgccgacta ccgggtctcc 480
gggtgcctcg tcgccggcca ccgcaaggag atggacgagg tgatggagag cttcccgctc 540
atggtgggcg ccgtgtgcag cggcctcttc ctcttgttcc ccaacacccg ctacggcatc 600
ggttgtttgg ctccgtaa 618
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Waxy1探针
<400> 127
ggtttcaggt ttggggaaag a 21
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Waxy1 gRNA 靶序列
<400> 128
gggaaagacc gaggagaaga tct 23
<210> 129
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3158 F引物
<400> 129
caaaccagga accaagctca ct 22
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3158 R引物
<400> 130
ggaccacgac atcttgaagg a 21
<210> 131
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3158 FAM
<400> 131
cggcctacac taggagt 17
<210> 132
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3158 TET
<400> 132
cctacactgg gagtcc 16
<210> 133
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 133
cgcttctctg ccttggagga tgaattagca agggaagtcg ccaatacctt taatttctca 60
acctgcatca ttttagtcca ttatgttagt atatagctat attttcacca atgtccatgt 120
atataagcat agttcatcta gaatgattac tatcagcgtc cggggaagac cataccctcg 180
gatactgaca atatgcctat caaagatcac atcaacagag aaaagctcaa tcagggctcg 240
gcccaaccat gtgtccctaa ggccctgtgc ccaaaggggt cttgctcggc tccagataag 300
tcagacgccc tccacatcgg agaccaggtc ccgaggccct ctagccctcg aagctcttcc 360
gcctcaagca ccctccatac cgggggacta gatcacgggg ccctcaggac ctctgaggcc 420
cagggccttc cagcctctag agccctattt ctctcgaggc tctccaaacc aggaaccaag 480
ctcactgctc ggcctacact aggagtccct gtaggctaag atctacaact agatctctcg 540
ggcatccttc aagatgtcgt ggtcccaaca gtcgaagccc ctagggtagg acaaccccga 600
acgaagatgc ctcccaaggc agtaccaccc tagtgccatg tgaaccccta ctcaagacga 660
ccataccggg tagttaggat taaggctagc tccagcaacg gaccctaaag ggttctgtac 720
cctaaatata gaggatcaaa tggttctcta cgctctccag caacgtcctc taaacggtcc 780
tctaaattta gaggacgctg ctggattctc tatatataga gtttctctaa acggtactct 840
atccatttga atactttaaa taaccggttt agcaaaacta aaatatgtac aatacatttg 900
agagtataac aaatacgtat gtacaaaaaa taaaaataaa aaatgtctct aatatagata 960
tttgagtata gaggacgtga tttagaggac gttgctggag a 1001
<210> 134
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 134
cgcttctctg ccttggagga tgaattagca agggaagtcg ccaatacctt taatttctca 60
acctgcatca ttttagtcca ttatgttagt atatagctat attttcacca atgtccatgt 120
atataagcat agttcatcta gaatgattac tatcagcgtc cggggaagac cataccctcg 180
gatactgaca atatgcctat caaagatcac atcaacagag aaaagctcaa tcagggctcg 240
gcccaaccat gtgtccctaa ggccctgtgc ccaaaggggt cttgctcggc tccagataag 300
tcagacgccc tccacatcgg agaccaggtc ccgaggccct ctagccctcg aagctcttcc 360
gcctcaagca ccctccatac cgggggacta gatcacgggg ccctcaggac ctctgaggcc 420
cagggccttc cagcctctag agccctattt ctctcgaggc tctccaaacc aggaaccaag 480
ctcactgctc ggcctacact gggagtccct gtaggctaag atctacaact agatctctcg 540
ggcatccttc aagatgtcgt ggtcccaaca gtcgaagccc ctagggtagg acaaccccga 600
acgaagatgc ctcccaaggc agtaccaccc tagtgccatg tgaaccccta ctcaagacga 660
ccataccggg tagttaggat taaggctagc tccagcaacg gaccctaaag ggttctgtac 720
cctaaatata gaggatcaaa tggttctcta cgctctccag caacgtcctc taaacggtcc 780
tctaaattta gaggacgctg ctggattctc tatatataga gtttctctaa acggtactct 840
atccatttga atactttaaa taaccggttt agcaaaacta aaatatgtac aatacatttg 900
agagtataac aaatacgtat gtacaaaaaa taaaaataaa aaatgtctct aatatagata 960
tttgagtata gaggacgtga tttagaggac gttgctggag a 1001
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4787 F引物
<400> 135
cgctggcatg aactccactc 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4787 R引物
<400> 136
tggtgccttg acctggtatg 20
<210> 137
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4787 FAM
<400> 137
tgtgcgacga tgtcg 15
<210> 138
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4787 TET
<400> 138
tgatttgtgc gatgatgtc 19
<210> 139
<211> 1005
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (825)..(825)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (868)..(868)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (894)..(894)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (896)..(896)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (912)..(912)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (935)..(937)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (956)..(956)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (960)..(960)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (983)..(983)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 139
gaaggataaa tagggccgta gggccatcgt tttgcattgc cgtcgcgtgg ccgtgggttt 60
tcatcgacga acgacgacga ctctgccgcg cgcgtttagg cgcgtcgccg ccggccaccc 120
ggccggccac ttcgacgcgg ctgtggtggt ttaaaattct ccggctcgcc gcccacggcc 180
tcgctgcacg tagttgcagg tgagtgaggt tcttcgattc cccccaaacc cggcccatct 240
ccgacgatcc attatttgtt cgtccatatg aaaatgcatc tctttttgta cccagttgtt 300
acctacatgc agcttttact gcttcattca gttatggtcg tgtacatctt cagaaaacca 360
gacatgttca ggcaagacca gtgggtatgc aaaaacaaca gcaaagtggc tcggcatgtc 420
gacagccagc tgctacttct acttctacat ataaaccacg cgctggcatg aactccactc 480
cagcatggat agacgacatc atcgcacaaa tcacatacca ggtcaaggca ccacgtttca 540
caaacctagt gaacacccaa gaactattat gcaataccat cattttgctc gatagatttt 600
cctagcccag ttgtttcatc tgagcaagtg tctgtaggaa ctaaaacaca gtagtatgct 660
gtatatactg tcaagcatga aacgcaacca gatcagctgc aggatttgca gcaccaagct 720
ctggccatta ggtaggctgc atatcacaac acacaaaggg aacatcaaac tacatacact 780
agctccgtcc cctccaggga cactgcaggt tggcaggccc aaagntagca cagggtctcg 840
caacccacaa ggtcataatc agtacaanca tccatcggca aggggaagca agancnaatc 900
ccaggtaggt gnacgctgga cagatccgtg ctcannncgc cgttccttgc tccggncttn 960
tctggccgct tgtactagct ccnctgtttt gtttcgccaa catct 1005
<210> 140
<211> 1005
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (825)..(825)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (868)..(868)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (894)..(894)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (896)..(896)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (912)..(912)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (935)..(937)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (956)..(956)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (960)..(960)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (983)..(983)
<223> N = 腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 140
gaaggataaa tagggccgta gggccatcgt tttgcattgc cgtcgcgtgg ccgtgggttt 60
tcatcgacga acgacgacga ctctgccgcg cgcgtttagg cgcgtcgccg ccggccaccc 120
ggccggccac ttcgacgcgg ctgtggtggt ttaaaattct ccggctcgcc gcccacggcc 180
tcgctgcacg tagttgcagg tgagtgaggt tcttcgattc cccccaaacc cggcccatct 240
ccgacgatcc attatttgtt cgtccatatg aaaatgcatc tctttttgta cccagttgtt 300
acctacatgc agcttttact gcttcattca gttatggtcg tgtacatctt cagaaaacca 360
gacatgttca ggcaagacca gtgggtatgc aaaaacaaca gcaaagtggc tcggcatgtc 420
gacagccagc tgctacttct acttctacat ataaaccacg cgctggcatg aactccactc 480
cagcatggat agacgacatc gtcgcacaaa tcacatacca ggtcaaggca ccacgtttca 540
caaacctagt gaacacccaa gaactattat gcaataccat cattttgctc gatagatttt 600
cctagcccag ttgtttcatc tgagcaagtg tctgtaggaa ctaaaacaca gtagtatgct 660
gtatatactg tcaagcatga aacgcaacca gatcagctgc aggatttgca gcaccaagct 720
ctggccatta ggtaggctgc atatcacaac acacaaaggg aacatcaaac tacatacact 780
agctccgtcc cctccaggga cactgcaggt tggcaggccc aaagntagca cagggtctcg 840
caacccacaa ggtcataatc agtacaanca tccatcggca aggggaagca agancnaatc 900
ccaggtaggt gnacgctgga cagatccgtg ctcannncgc cgttccttgc tccggncttn 960
tctggccgct tgtactagct ccnctgtttt gtttcgccaa catct 1005
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3814 F引物
<400> 141
gataccgccg ctatgttctt tc 22
<210> 142
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3814 R引物
<400> 142
cgtgcttcat tcacatcaca tggat 25
<210> 143
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3814 FAM
<400> 143
tgttcttgga gcagaa 16
<210> 144
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3814 TET
<400> 144
cctgttcttg tagcaga 17
<210> 145
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 145
tcaaagcgta ctgggatgga aaagtgtaga gtagaccggt acagacgccg gagtaccaca 60
atgacgctac agttcctaca cgtcgaggtg cagtccagcc tccacctgta gaggactagc 120
gctactgccg ctgccgcctg ccagtgccag agaggcagag cgcagcctgt ctgtgagggc 180
tccgctccgg ccgccagctt tccaaggtga caggtccttt ctgtttctga ctcctctgcg 240
agcgcggggc cctgcgcaat cagcgtctcg gtccatattt ttgattttat tttcagactc 300
gagaacacgc aaaggcaaaa ggcagcagga gacaccgaga tcgccggcag gcggcagccg 360
gacatatgcg gcggcgccgc cgctccatcc tgtcgtgctg cttgcccgct cttcttccat 420
ttgtatcgtc tgcagatacc gccgctatgt tctttctata gcaaatagag ataacgagag 480
atctttccag ttcttctgct acaagaacag gaaactgtgt atccatgtga tgtgaatgaa 540
gcacgacaat tttttttttt ctgattctcc aacaacggac gaaccagctt agatttccac 600
ttgctgttgt aacatgacac cacagggcga cacaggctaa ttacacacaa aagaaccccg 660
gagaagctac cctatccacc actacacacc ttcagtccac aagaactctc atagtttact 720
ctactactgt aatgtaatct gtggctcaca ccatccagat ccatgttccc tccttcctcc 780
gtcaccatct gacgatggta agccaccagc agccaaaaac aaatgccaaa agatcacaga 840
gaacgcgcag aaactacttc gtgctaacct acctagcatt acttcaagtt tctccgtgtt 900
cttcttctga acctgcttgc ttgctattgt aggagggaca ccaacccaag aaccgcagcc 960
gccattcccc gaaccaccac caggtaccgg agcccaccga c 1001
<210> 146
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 146
tcaaagcgta ctgggatgga aaagtgtaga gtagaccggt acagacgccg gagtaccaca 60
atgacgctac agttcctaca cgtcgaggtg cagtccagcc tccacctgta gaggactagc 120
gctactgccg ctgccgcctg ccagtgccag agaggcagag cgcagcctgt ctgtgagggc 180
tccgctccgg ccgccagctt tccaaggtga caggtccttt ctgtttctga ctcctctgcg 240
agcgcggggc cctgcgcaat cagcgtctcg gtccatattt ttgattttat tttcagactc 300
gagaacacgc aaaggcaaaa ggcagcagga gacaccgaga tcgccggcag gcggcagccg 360
gacatatgcg gcggcgccgc cgctccatcc tgtcgtgctg cttgcccgct cttcttccat 420
ttgtatcgtc tgcagatacc gccgctatgt tctttctata gcaaatagag ataacgagag 480
atctttccag ttcttctgct ccaagaacag gaaactgtgt atccatgtga tgtgaatgaa 540
gcacgacaat tttttttttt ctgattctcc aacaacggac gaaccagctt agatttccac 600
ttgctgttgt aacatgacac cacagggcga cacaggctaa ttacacacaa aagaaccccg 660
gagaagctac cctatccacc actacacacc ttcagtccac aagaactctc atagtttact 720
ctactactgt aatgtaatct gtggctcaca ccatccagat ccatgttccc tccttcctcc 780
gtcaccatct gacgatggta agccaccagc agccaaaaac aaatgccaaa agatcacaga 840
gaacgcgcag aaactacttc gtgctaacct acctagcatt acttcaagtt tctccgtgtt 900
cttcttctga acctgcttgc ttgctattgt aggagggaca ccaacccaag aaccgcagcc 960
gccattcccc gaaccaccac caggtaccgg agcccaccga c 1001
<210> 147
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3362 F引物
<400> 147
ccgcgtcttt gttgtagcat tc 22
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3362 R引物
<400> 148
tcaggaaaca tcagtgccca tac 23
<210> 149
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3362 FAM
<400> 149
actagttgcc taccctatc 19
<210> 150
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM3362 TET
<400> 150
tagttgccta ctctatcag 19
<210> 151
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 151
gcaagatgac aaatatttgt ttttcatggc attgatgtag cctacaagat ggaactttga 60
ctagaaatat ctataaaaaa acattgtttc gaatataaag agttactcca tctgtcctgg 120
aatgagaagt gtattttgat caaagaaaag tcatacaaaa ttgatttgac cccttagttt 180
ctgttgcaat atgttatcat ttgccaaaca gtcaatacca tctctcagag gcaccttgaa 240
tgcacataca ttatggttct tttttcccat ccattgcaga tatgactaaa atgaagatcg 300
acggcgacaa taactttggg gagcagaaga gccatcaccg ctgcaggcgc aagaagcatg 360
atgctagggt tttggattcc ttgagttgaa gatttttgtt gtgctagaag tggtgaagcg 420
tctaagcatg tgttgtattg tagtgttcct tcactagcag cagctgttat ccgcgtcttt 480
gttgtagcat tcactgatag agtaggcaac tagttaccag tgtttctgac tttttgtatg 540
ggcactgatg tttcctgata gtatagttcc ctagtttctg ggctagtttt tttttccatg 600
agtttatctg tgaaggcttc aagagtagcg aatgcgctaa gaacaaatgt gtcgcctttt 660
tagttgtttt ttacacttgt tagcactata taatggttgt ttgagttgga tgcgtgattg 720
atacagcagc atcagtcagc tgatccctaa aataaggttg tttggtttaa ggtcaggggt 780
tgggacatga ctatcctagt gttgtcccag ttatcactca aaattggatc ctagtgttgt 840
cccagttatc actcaaaatt ggagggacga gagaggacgc cagggaacgt ccctgtcctg 900
gttgtcaagt tatcccttaa aattaggcag cagtgattaa cactgccatc gattacagcg 960
caggctaatt tttacacgaa ttatatgtgt tatatcctgc t 1001
<210> 152
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 152
gcaagatgac aaatatttgt ttttcatggc attgatgtag cctacaagat ggaactttga 60
ctagaaatat ctataaaaaa acattgtttc gaatataaag agttactcca tctgtcctgg 120
aatgagaagt gtattttgat caaagaaaag tcatacaaaa ttgatttgac cccttagttt 180
ctgttgcaat atgttatcat ttgccaaaca gtcaatacca tctctcagag gcaccttgaa 240
tgcacataca ttatggttct tttttcccat ccattgcaga tatgactaaa atgaagatcg 300
acggcgacaa taactttggg gagcagaaga gccatcaccg ctgcaggcgc aagaagcatg 360
atgctagggt tttggattcc ttgagttgaa gatttttgtt gtgctagaag tggtgaagcg 420
tctaagcatg tgttgtattg tagtgttcct tcactagcag cagctgttat ccgcgtcttt 480
gttgtagcat tcactgatag ggtaggcaac tagttaccag tgtttctgac tttttgtatg 540
ggcactgatg tttcctgata gtatagttcc ctagtttctg ggctagtttt tttttccatg 600
agtttatctg tgaaggcttc aagagtagcg aatgcgctaa gaacaaatgt gtcgcctttt 660
tagttgtttt ttacacttgt tagcactata taatggttgt ttgagttgga tgcgtgattg 720
atacagcagc atcagtcagc tgatccctaa aataaggttg tttggtttaa ggtcaggggt 780
tgggacatga ctatcctagt gttgtcccag ttatcactca aaattggatc ctagtgttgt 840
cccagttatc actcaaaatt ggagggacga gagaggacgc cagggaacgt ccctgtcctg 900
gttgtcaagt tatcccttaa aattaggcag cagtgattaa cactgccatc gattacagcg 960
caggctaatt tttacacgaa ttatatgtgt tatatcctgc t 1001
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0634AQ F引物
<400> 153
gcatgatatc ctccatggta ggg 23
<210> 154
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0634AQ R引物
<400> 154
gttttcgcaa gcaatgagaa tggt 24
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0634AQ FAM
<400> 155
aaagtattcc atgtccttac 20
<210> 156
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM0634AQ TET
<400> 156
agaaagtatt ccatctcctt ac 22
<210> 157
<211> 171
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 157
ttgcatgata tcctccatgg tagggagaaa gtattccatc tccttacata agctcagtgt 60
ttttaccatt ctcattgctt gcgaaaacat ttatctactt ccataataag mtactwtttg 120
cagttgctcc catgctwact astatgaayy ggttgctgat gcctaattwa a 171
<210> 158
<211> 171
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 158
ttgcatgata tcctccatgg tagggagaaa gtattccatg tccttacata agctcagtgt 60
ttttaccatt ctcattgctt gcgaaaacat ttatctactt ccataataag mtactwtttg 120
cagttgctcc catgctwact astatgaayy ggttgctgat gcctaattwa a 171
<210> 159
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4586 F引物
<400> 159
cagagccact cgtcaggaga t 21
<210> 160
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4586 R引物
<400> 160
ggtgtactcg ccggagtta 19
<210> 161
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4586 FAM
<400> 161
agatgcggtg gcgc 14
<210> 162
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM4586 TET
<400> 162
taagatgtgg tggcgc 16
<210> 163
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 163
tgcatgactg tctgaggtcc ttaggacaag gacatatgta ggtgggccta ataccttggg 60
aggttcagtg acaccctaga tggcggtcat aaataccaaa gagcctaggg tcagtcagac 120
aaaattttag ggctaatttg taacattctt ttaatatatt tggacaatgg gtttatagta 180
acaaaaccga ggggatctta tgtcaaattg catgatgaaa gggtattgga tgattctagt 240
cacccgatct gaaacctggg atccatatta gatcacctct agccaaaccg gtgcgtgatc 300
caaatcatcc gatcgacaat cgatgatgag gatttaaaat accttgcttt gcctagagtc 360
gtccaacgag atccgagggc gcagatgcaa tagccaaagg ggtacgcatg gggccgcacc 420
agagccactc gtcaggagat caacggctgc ccaagctctt gctggccacc cagcgcagaa 480
catagtggct gtgcgccacc acatcttata actccggcga gtacaccaat caggtgccct 540
aatgccctac gcgcctacct aattgcattt acacgacgag agggcgacaa gaaatcaatg 600
gagatggccc atactgtggg aggggtgcga aggttcgtgt tcccggtgaa gggtggtgct 660
gcggtggaga actcgcgtcg gtgtgaaatt tacccagcag gttccacgac tctcgtggtc 720
aagccttggc atgcaccaga tgtgacggaa cctcccaagg gattaggccc acctacagtt 780
ctccttgtcc taaggacttt ggacaaccct gtagatgcac ataatcactc gacaagttcg 840
gtaactgtat ccttatcatt tcgcccaaga gcgcttcacc catcacgcag atattacatc 900
acatcggagg aaagaataag cggaagcaga ttacaataac ttaatttaca ttcatcaaat 960
atataaagag agtattatta ttataacaat accagggtat t 1001
<210> 164
<211> 1001
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 164
tgcatgactg tctgaggtcc ttaggacaag gacatatgta ggtgggccta ataccttggg 60
aggttcagtg acaccctaga tggcggtcat aaataccaaa gagcctaggg tcagtcagac 120
aaaattttag ggctaatttg taacattctt ttaatatatt tggacaatgg gtttatagta 180
acaaaaccga ggggatctta tgtcaaattg catgatgaaa gggtattgga tgattctagt 240
cacccgatct gaaacctggg atccatatta gatcacctct agccaaaccg gtgcgtgatc 300
caaatcatcc gatcgacaat cgatgatgag gatttaaaat accttgcttt gcctagagtc 360
gtccaacgag atccgagggc gcagatgcaa tagccaaagg ggtacgcatg gggccgcacc 420
agagccactc gtcaggagat caacggctgc ccaagctctt gctggccacc cagcgcagaa 480
catagtggct gtgcgccacc gcatcttata actccggcga gtacaccaat caggtgccct 540
aatgccctac gcgcctacct aattgcattt acacgacgag agggcgacaa gaaatcaatg 600
gagatggccc atactgtggg aggggtgcga aggttcgtgt tcccggtgaa gggtggtgct 660
gcggtggaga actcgcgtcg gtgtgaaatt tacccagcag gttccacgac tctcgtggtc 720
aagccttggc atgcaccaga tgtgacggaa cctcccaagg gattaggccc acctacagtt 780
ctccttgtcc taaggacttt ggacaaccct gtagatgcac ataatcactc gacaagttcg 840
gtaactgtat ccttatcatt tcgcccaaga gcgcttcacc catcacgcag atattacatc 900
acatcggagg aaagaataag cggaagcaga ttacaataac ttaatttaca ttcatcaaat 960
atataaagag agtattatta ttataacaat accagggtat t 1001
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA 1 (DMP)
<400> 165
ctccctgggc acctcgacgc cga 23
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA 2 (DMP)
<400> 166
ggccgggagt agcatctcga 20
<210> 167
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA 3 (DMP)
<400> 167
actacggctt cgtcacgccg 20
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA 4 (MATL)
<400> 168
catgcagaac tgcccgcgca tct 23
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA 5 (MATL)
<400> 169
gggtcaacgt ggagacaggg 20
<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA 6 (MATL)
<400> 170
cttcctggag gccaggctgc 20
<210> 171
<211> 17462
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体26258
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(143)
<223> bNRB
<220>
<221> 启动子
<222> (222)..(2018)
<223> prSoUbi4-04
<220>
<221> 5'UTR
<222> (596)..(660)
<223> u5SoUbi4-02
<220>
<221> 内含子
<222> (661)..(2018)
<223> iSoUbi4-02
<220>
<221> 基因
<222> (2037)..(6318)
<223> LbCas12a-27
<220>
<221> 尚未归类的标志
<222> (2040)..(2060)
<223> SV40NLS-06
<220>
<221> 内含子
<222> (2672)..(3080)
<223> iAtBAF60-01
<220>
<221> 尚未归类的标志
<222> (6250)..(6270)
<223> xSV40NLS-04
<220>
<221> 尚未归类的标志
<222> (6295)..(6315)
<223> xSV40NLS-07
<220>
<221> 终止子
<222> (6327)..(6579)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> 启动子
<222> (6607)..(7122)
<223> prOsU6-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7124)..(7144)
<223> rLbCrRNA-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7124)..(7167)
<223> rLbgRNACas12aZmO2-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7168)..(7188)
<223> rLbCrRNA-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7168)..(7211)
<223> rLbgRNACas12aZmYellow1-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7212)..(7232)
<223> rLbCrRNA-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7212)..(7255)
<223> rLbgRNACas12aZmWaxy1-01
<220>
<221> 启动子
<222> (7271)..(7786)
<223> prOsU6-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7788)..(7808)
<223> rLbCrRNA-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7788)..(7830)
<223> rLbgRNACas12aZmUBL-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7831)..(7851)
<223> rLbCrRNA-01
<220>
<221> 尚未归类的RNA
<222> (7831)..(7873)
<223> rLbgRNACas12aZmUPL3-01
<220>
<221> 启动子
<222> (7889)..(9881)
<223> prUbi1-18
<220>
<221> 内含子
<222> (8872)..(9881)
<223> iUbi1-07
<220>
<221> 基因
<222> (9889)..(11064)
<223> cPMI-14
<220>
<221> 终止子
<222> (11077)..(12111)
<223> tUbi1-06
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (12194)..(12323)
<223> bNLB-05
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (12229)..(12253)
<223> bNLB-01-01
<220>
<221> 基因
<222> (12603)..(13391)
<223> cSpec-03
<220>
<221> 启动子
<222> (13486)..(13616)
<223> prVirG-02
<220>
<221> 基因
<222> (14446)..(15519)
<223> cRepA-05
<220>
<221> 复制原点
<222> (15562)..(15966)
<223> oVS1-03
<220>
<221> 复制原点
<222> (16644)..(17450)
<223> oCOLE-06
<400> 171
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactggcact agcctaacgg tgttgactaa ctaggccgct 180
tccctaatta gctaacccgg gggcgcgccg ggacccgaat tcattatgtg gtctaggtag 240
gttctatata taagaaaact tgaaatgttc taaaaaaaaa ttcaagccca tgcatgattg 300
aagcaaacgg tatagcaacg gtgttaacct gatctagtga tctcttgcaa tccttaacgg 360
ccacctaccg caggtagcaa acggcgtccc cctcctcgat atctccgcgg cgacctctgg 420
ctttttccgc ggaattgcgc ggtggggacg gattccacga gaccgcgacg caaccgcctc 480
tcgccgctgg gccccacacc gctcggtgcc gtagcctcac gggactcttt ctccctcctc 540
ccccgttata aattggcttc atcccctcct tgcctcatcc atccaaatcc cagtccccaa 600
tcccatccct tcgtaggaga aattcatcga agctaagcga atcctcgcga tcctctcaag 660
gtactgcgag ttttcgatcc ccctctcgac ccctcgtatg tttgtgtttg tcgtagcgtt 720
tgattaggta tgctttccct gtttgtgttc gtcgtagcgt ttgattaggt atgctttccc 780
tgttcgtgtt catcgtagtg tttgattagg tcgtgtgagg cgatggcctg ctcgcgtcct 840
tcgatctgta gtcgatttgc gggtcgtggt gtagatctgc gggctgtgat gaagttattt 900
ggtgtgatct gctcgcctga ttctgcgggt tggctcgagt agatatgatg gttggaccgg 960
ttggttcgtt taccgcgcta gggttgggct gggatgatgt tgcatgcgcc gttgcgcgtg 1020
atcccgcagc aggacttgcg tttgattgcc agatctcgtt acgattatgt gatttggttt 1080
ggacttttta gatctgtagc ttctgcttat gtgccagatg cgcctactgc tcatatgcct 1140
gatgataatc ataaatggct gtggaactaa ctagttgatt gcggagtcat gtatcagcta 1200
caggtgtagg gactagctac aggtgtaggg acttgcgtct aattgtttgg tcctttactc 1260
atgttgcaat tatgcaattt agtttagatt gtttgttcca ctcatctagg ctgtaaaagg 1320
gacactgctt agattgctgt ttaatctttt tagtagatta tattatattg gtaacttatt 1380
acccctatta catgccatac gtgacttctg ctcatgcctg atgataatca tagatcactg 1440
tggaattaat tagttgattg ttgaatcatg tttcatgtac ataccacggc acaattgctt 1500
agttccttaa caaatgcaaa ttttactgat ccatgtatga tttgcgtggt tctctaatgt 1560
gaaatactat agctacttgt tagtaagaat caggttcgta tgcttaatgc tgtatgtgcc 1620
ttctgctcat gcctgatgat aatcatatat cactggaatt aattagttga tcgtttaatc 1680
atatatcaag tacataccat gccacaattt ttagtcactt aacccatgca gattgaactg 1740
gtccctgcat gttttgctaa attgttctat tctgattaga ccatatatca tgtatttttt 1800
tttggtaatg gttctcttat tttaaatgct atatagttct ggtacttgtt agaaagatct 1860
gcttcatagt ttagttgcct atccctcgaa ttaggatgct gagcagctga tcctatagct 1920
ttgtttcatg tatcaattct tttgtgttca acagtcagtt tttgttagat tcattgtaac 1980
ttatggtcgc ttactcttct ggtcctcaat gcttgcaggg atcccctaaa tagaccatgc 2040
cgaagaagaa gcgcaaggtc gggggcgggg gctcaggcgg gggcgggagc ggcggcgggg 2100
gctctggggg cggcggcagc ggcgggggcg gcagcggggg cggcgggtcg atgagcaagc 2160
tggagaagtt cacgaactgc tactccctca gcaagaccct gaggttcaag gcgatcccgg 2220
tcggcaagac ccaggagaac atcgacaaca agcggctgct ggtggaggac gagaagaggg 2280
ctgaggacta caagggcgtg aagaagctcc tggaccgcta ctacctgtcc ttcatcaacg 2340
acgtgctcca cagcatcaag ctcaagaacc tgaacaacta catcagcctc ttcaggaaga 2400
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tcaacggctt caccacggcg ttcaccggct tcttcgacaa ccgcgagaac atgttcagcg 2640
aggaggccaa gtccacgagc atcgcgttca ggtaccaagc tgcgaatctt cgttttttta 2700
aggaattctc gatctttatg gtgtataggc tctgggtttt ctgttttttg tatctcttag 2760
gattttgtaa attccagatc tttctatggc cacttagtag tatatttcaa aaattctcca 2820
atcgagttct tcattcgcat tttcagtcat tttctcttcg acgttgtttt taagcctggg 2880
tattactcct atttagttga actctgcagc aatcttagaa aattagggtt ttgaggtttc 2940
gatttctcta ggtaaccgat ctattgcatt catctgaatt tctgcatata tgtcttagat 3000
ttctgataag cttacgatac gttaggtgta attgaagttt atttttcaag agtgttattt 3060
tttgtttctg aatttttcag gtgcatcaac gagaacctca cccgctacat ctccaacatg 3120
gacatcttcg agaaggtcga cgcgatcttc gacaagcacg aggtgcagga gatcaaggag 3180
aagatcctga acagcgacta cgacgtcgag gacttcttcg agggcgagtt cttcaacttc 3240
gtcctcacgc aggagggcat cgacgtgtac aacgccatca tcggtggctt cgtgaccgag 3300
tccggcgaga agatcaaggg cctgaacgag tacatcaacc tctacaacca gaagaccaag 3360
cagaagctgc cgaagttcaa gcccctgtac aagcaggtgc tctccgacag ggagtccctc 3420
agcttctacg gcgagggcta cacgagcgac gaggaggtcc tggaggtgtt ccgcaacacc 3480
ctcaacaaga acagcgagat cttctccagc atcaagaagc tcgagaagct gttcaagaac 3540
ttcgacgagt actccagcgc cggcatcttc gtcaagaacg gcccggcgat ctccacgatc 3600
agcaaggaca tcttcggcga gtggaacgtg atccgcgaca agtggaacgc cgagtacgac 3660
gacatccacc tcaagaagaa ggcggtggtc accgagaagt acgaggacga caggcgcaag 3720
tccttcaaga agatcggctc cttcagcctc gagcagctgc aggagtacgc cgacgcggac 3780
ctgagcgtgg tcgagaagct caaggagatc atcatccaga aggtcgacga gatctacaag 3840
gtgtacggct ccagcgagaa gctcttcgac gcggacttcg tcctcgagaa gtccctgaag 3900
aagaacgacg ccgtggtcgc gatcatgaag gacctcctgg actccgtgaa gagcttcgag 3960
aattacatca aggccttctt cggcgagggc aaggagacga acagggacga gtccttctac 4020
ggcgacttcg tcctggccta cgacatcctc ctgaaggtgg accacatcta cgacgcgatc 4080
cgcaactacg tgacccagaa gccgtacagc aaggacaagt tcaagctcta cttccagaac 4140
ccccagttca tgggcggctg ggacaaggac aaggagacgg actacagggc gaccatcctg 4200
cgctacggca gcaagtacta cctcgccatc atggacaaga agtacgcgaa gtgcctgcag 4260
aagatcgaca aggacgacgt caacggcaac tacgagaaga tcaactacaa gctcctgccg 4320
ggccccaaca agatgctccc gaaggtgttc ttctccaaga agtggatggc ctactacaac 4380
cccagcgagg acatccagaa gatctacaag aacggcacgt tcaagaaggg cgacatgttc 4440
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aagtggtcca acgcctacga cttcaacttc agcgagaccg agaagtacaa ggacatcgcg 4560
ggcttctacc gcgaggtcga ggagcagggc tacaaggtgt ccttcgagtc cgccagcaag 4620
aaggaggtcg acaagctggt ggaggagggc aagctctaca tgttccagat ctacaacaag 4680
gacttctccg acaagagcca cggcacgccc aacctgcaca ccatgtactt caagctcctg 4740
ttcgacgaga acaaccacgg ccagatcagg ctgtccggcg gcgccgagct cttcatgagg 4800
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aagaacccgg acaaccccaa gaagaccacg accctgtcct acgacgtgta caaggacaag 4920
aggttcagcg aggaccagta cgagctccac atcccgatcg cgatcaacaa gtgccccaag 4980
aacatcttca agatcaacac cgaggtccgc gtgctcctga agcacgacga caacccctac 5040
gtgatcggca tcgacagggg cgagaggaac ctcctgtaca tcgtggtcgt ggacggcaag 5100
ggcaacatcg tggagcagta ctccctcaac gagatcatca acaacttcaa cggcatcagg 5160
atcaagacgg actaccacag cctcctggac aagaaggaga aggagaggtt cgaggcccgc 5220
cagaactgga cctccatcga gaacatcaag gagctgaagg cgggctacat cagccaggtc 5280
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aactccggct tcaagaacag ccgcgtcaag gtggagaagc aggtctacca gaagttcgag 5400
aagatgctca tcgacaagct gaactacatg gtggacaaga agtccaaccc ctgcgctacg 5460
ggcggcgcgc tgaagggcta ccagatcacc aacaagttcg agagcttcaa gtccatgagc 5520
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accggcttcg tcaacctcct gaagacgaag tacacctcca tcgccgacag caagaagttc 5640
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tacggcaacc gcatccgcat cttcaggaac cccaagaaga acaacgtctt cgactgggag 5820
gaggtgtgcc tgacctccgc gtacaaggag ctcttcaaca agtacggcat caactaccag 5880
cagggcgaca tcagggctct cctgtgcgag cagagcgaca aggccttcta ctccagcttc 5940
atggcgctga tgtccctcat gctgcagatg aggaactcga tcaccggcag gacggacgtg 6000
gacttcctca tctccccggt gaagaacagc gacggcatct tctacgactc caggaactac 6060
gaggcccagg agaacgcgat cctcccaaag aacgcggacg ccaacggcgc ctacaacatc 6120
gccaggaagg tcctctgggc tatcggccag ttcaagaagg cggaggacga gaagctggac 6180
aaggtgaaga tcgccatcag caacaaggag tggctcgagt acgcccagac ctcggtcaag 6240
cacggcagcc cgaagaagaa gcgcaaggtg tccggcggca gctccggcgg cagcccgaag 6300
aagaagcgca aagtgtgatt aattaagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa 6360
gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta 6420
agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta 6480
gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg 6540
ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatct tcgaacgcgt taactagcta 6600
ggaatttttg tgaaagttga attacggcat agccgaagga ataacagaat cgtttcacac 6660
tttcgtaaca aaggtcttct tatcatgttt cagacgatgg aggcaaggct gatcaaagtg 6720
atcaagcaca taaacgcatt tttttaccat gtttcactcc ataagcgtct gagattatca 6780
caagtcacgt ctagtagttt gatggtacac tagtgacaat cagttcgtgc agacagagct 6840
catacttgac tacttgagcg attacaggcg aaagtgtgaa acgcatgtga tgtgggctgg 6900
gaggaggaga atatatacta atgggccgta tcctgatttg ggctgcgtcg gaaggtgcag 6960
cccacgcgcg ccgtaccgcg cgggtggcgc tgctacccac tttagtccgt tggatgggga 7020
tccgatggtt tgcgcggtgg cgttgcgggg gatgtttagt accacatcgg aaaccgaaag 7080
acgatggaac cagcttataa acccgcgcgc tgtagtcagc ttgtaatttc tactaagtgt 7140
agatctgtat ctcgagcgtc tggctgataa tttctactaa gtgtagatct atcttatcct 7200
aaagatggtg gtaatttcta ctaagtgtag atgggaaaga ccgaggagaa gatctttttt 7260
ttttcctagg tttgtgaaag ttgaattacg gcatagccga aggaataaca gaatcgtttc 7320
acactttcgt aacaaaggtc ttcttatcat gtttcagacg atggaggcaa ggctgatcaa 7380
agtgatcaag cacataaacg cattttttta ccatgtttca ctccataagc gtctgagatt 7440
atcacaagtc acgtctagta gtttgatggt acactagtga caatcagttc gtgcagacag 7500
agctcatact tgactacttg agcgattaca ggcgaaagtg tgaaacgcat gtgatgtggg 7560
ctgggaggag gagaatatat actaatgggc cgtatcctga tttgggctgc gtcggaaggt 7620
gcagcccacg cgcgccgtac cgcgcgggtg gcgctgctac ccactttagt ccgttggatg 7680
gggatccgat ggtttgcgcg gtggcgttgc gggggatgtt tagtaccaca tcggaaaccg 7740
aaagacgatg gaaccagctt ataaacccgc gcgctgtagt cagcttgtaa tttctactaa 7800
gtgtagatgg aaggaaaagg tatctgaagg taatttctac taagtgtaga tggagggaaa 7860
aggtgtctga ggcttttttt tcggaccgct gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc 7920
tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt 7980
cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata tatttaaact ttactctacg 8040
aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac 8100
agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa caggactcta cagttttatc 8160
tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc 8220
atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa tggtttttat agactaattt 8280
ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt 8340
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ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt 9000
gctgttagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt 9060
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tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa 9180
tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg 9240
atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc 9300
tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat 9360
tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac 9420
tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc 9480
ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat 9540
taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg 9600
gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg 9660
atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa 9720
caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc 9780
tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct 9840
tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt tacttctgca gctaaaccat gcagaagctg 9900
atcaacagcg tgcagaacta cgcctggggc agcaagaccg ccctgaccga gctgtacggc 9960
atggagaacc ccagcagcca gccaatggcc gagctgtgga tgggcgccca ccccaaaagc 10020
tcaagccgcg tgcagaacgc cgccggcgat atcgttagcc tgcgcgacgt gatcgagagc 10080
gacaagagca ccctgctggg cgaggccgtg gccaagcgct tcggcgagct gcccttcctg 10140
ttcaaggtgc tgtgcgccgc tcagcccctg agcatccagg tgcaccctaa caagcacaac 10200
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ctgcacgacc tgagcgacaa ggagactact atcagccagc agagcgccgc gatcctgttc 10920
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tcataattct tatgaaagct ttatgtttcc tggaggcagt ggcatgcaat gcatgacagc 11820
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tcattggaga acacacatac acattcttgc cagtcttggt tagagaaatt tcatgacaaa 11940
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ccgggggcgc gccctaatta gctaacggcc aggatcgccg cgtgagcctt tagcaactag 12180
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gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc 12900
gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag 12960
gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag 13020
aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac 13080
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gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt 13260
atcagcccgt catacttgaa gctaggcagg cttatcttgg acaagaagat cgcttggcct 13320
cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgttc actacgtgaa aggcgagatc accaaagtag 13380
tcggcaaata aagctctagt ggatctccgt acccggggat ctggctcgcg gcggacgcac 13440
gacgccgggg cgtgaccata ggcgatctcc taaatcaata gtagctgtaa cctcgaagcg 13500
tttcacttgt aacaacgatt gagaattttt gtcataaaat tgaaatactt ggttcgcatt 13560
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acatccttca cgtgaaaatt tctcaagcgc tgtgaacaag ggttcagatt ttagattgaa 13680
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tattgaatac cttacgatcc acgccttcaa agtgaccgcg gtagccgaca gcacccagtt 13800
cacaagagta ctctcttccg cgacggtcga tgtcgtggtt gttgatctag atttaggtcg 13860
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gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 14160
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cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 14280
tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 14340
aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 14400
gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 14460
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 14520
gcggcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 14580
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 14640
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 14700
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 14760
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 14820
tccgcagggc cggcgggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 14880
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 14940
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 15000
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 15060
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 15120
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 15180
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 15240
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 15300
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 15360
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 15420
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 15480
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 15540
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggactct ttcctgtgga tagcacgtac 15600
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 15660
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 15720
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 15780
ctgtctggcc agcgcacagc cgatgagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 15840
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 15900
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 15960
cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 16020
ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 16080
cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 16140
gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 16200
aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 16260
catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 16320
gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 16380
gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 16440
cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 16500
agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 16560
attgggcgct gttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 16620
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 16680
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 16740
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 16800
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 16860
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 16920
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 16980
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 17040
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 17100
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 17160
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 17220
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 17280
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 17340
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 17400
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 17460
ta 17462
<210> 172
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Opaque2 gRNA 靶序列
<400> 172
ctgtatctcg agcgtctggc tga 23
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Waxy1 gRNA 靶序列
<400> 173
gggaaagacc gaggagaaga tct 23
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 黄胚乳1 gRNA 靶序列
<400> 174
ctatcttatc ctaaagatgg tgg 23
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E3泛素连接酶2 gRNA 靶序列
<400> 175
ggagggaaaa ggtgtctgag gc 22
<210> 176
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 假定的泛素蛋白连接酶gRNA 靶序列
<400> 176
ggaaggaaaa ggtatctgaa gg 22
<210> 177
<211> 19587
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体24288
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(143)
<223> bNRB-04
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (101)..(125)
<223> bNRB-01-01
<220>
<221> 启动子
<222> (205)..(601)
<223> prCMP-04
<220>
<221> 5'UTR
<222> (205)..(601)
<220>
<221> 基因
<222> (638)..(1417)
<223> cDsRed2Nu-03
<220>
<221> 尚未归类的标志
<222> (1325)..(1414)
<223> xSV40NLS-02
<220>
<221> 终止子
<222> (1418)..(1687)
<223> t35S-12
<220>
<221> 尚未归类的标志
<222> (1659)..(1661)
<223> Poly\A\site
<220>
<221> 启动子
<222> (1694)..(2296)
<223> prRab17-05
<220>
<221> 基因
<222> (2306)..(3337)
<223> cCRE-01
<220>
<221> 终止子
<222> (3343)..(3660)
<223> tPI-15
<220>
<221> 启动子
<222> (3675)..(3863)
<223> prNOS-05-01
<220>
<221> 基因
<222> (3872)..(4528)
<223> cSbWUS-01
<220>
<221> 终止子
<222> (4538)..(4790)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> 启动子
<222> (4810)..(6802)
<223> prUbi1-18
<220>
<221> 内含子
<222> (5793)..(6802)
<223> iUbi1-07
<220>
<221> 基因
<222> (6820)..(8559)
<223> cBnBBM1-02
<220>
<221> 终止子
<222> (8569)..(9603)
<223> tUbi1-04
<220>
<221> 基因
<222> (9654)..(10343)
<223> cAmCyan-03
<220>
<221> 终止子
<222> (10351)..(10603)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> 启动子
<222> (10611)..(12795)
<223> prAct1-09
<220>
<221> 内含子
<222> (12313)..(12774)
<223> iAct1-03
<220>
<221> 基因
<222> (12807)..(13982)
<223> cPMI-01
<220>
<221> 终止子
<222> (13993)..(14245)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (14319)..(14448)
<223> bNLB-05
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (14354)..(14378)
<223> bNLB-01-01
<220>
<221> 基因
<222> (14728)..(15516)
<223> cSpec-03
<220>
<221> 启动子
<222> (15611)..(15741)
<223> prVirG-02
<220>
<221> 基因
<222> (15816)..(16541)
<223> cVirG-06
<220>
<221> 基因
<222> (16571)..(17644)
<223> cRepA-10
<220>
<221> 复制原点
<222> (17687)..(18091)
<223> oVS1-02
<220>
<221> 复制原点
<222> (18769)..(19575)
<223> oCOLE-06
<400> 177
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactggcact agcctaacgg tgttgactaa ctaggccgct 180
tccctaatta gctaaattta aatctggcag acaaagtggc agacatactg tcccacaaat 240
gaagatggaa tctgtaaaag aaaacgcgtg aaataatgcg tctgacaaag gttaggtcgg 300
ctgcctttaa tcaataccaa agtggtccct accacgatgg aaaaactgtg cagtcggttt 360
ggctttttct gacgaacaaa taagattcgt ggccgacagg tgggggtcca ccatgtgaag 420
gcatcttcag actccaataa tggagcaatg acgtaagggc ttacgaaata agtaagggta 480
gtttgggaaa tgtccactca cccgtcagtc tataaatact tagcccctcc ctcattgtta 540
agggagcaaa atctcagaga gatagtccta gagagagaaa gagagcaagt agcctagaag 600
tagataactt cgtatagcat acattatacg aagttatatg gcctcctccg agaacgtcat 660
caccgagttc atgcgcttca aggtgcgcat ggagggcacc gtgaacggcc acgagttcga 720
gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggccac aacaccgtga agctgaaggt 780
gaccaagggc ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tccccccagt tccagtacgg 840
ctccaaggtg tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacaagaagc tgtccttccc 900
cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg cgaccgtgac 960
ccaggactcc tccctgcagg acggctgctt catctacaag gtgaagttca tcggcgtgaa 1020
cttcccctcc gacggccccg tgatgcagaa gaagacaatg ggctgggagg cctccaccga 1080
gcgcctgtac ccccgcgacg gcgtgctgaa gggcgagacc cacaaggccc tgaagctgaa 1140
ggacggcggc cactacctgg tggagttcaa gtccatctac atggccaaga agcccgtgca 1200
gctgcccggc tactactacg tggacgccaa gctggacatc acctcccaca acgaggacta 1260
caccatcgtg gagcagtacg agcgcaccga gggccgccac cacctgttcc tgagatctcg 1320
agctgatcca aaaaagaaga gaaaggtaga tccaaaaaag aagagaaagg tagatccaaa 1380
aaagaagaga aaggtaggct ccaccggatc tagataatcc ttcgcaagac ccttcctcta 1440
tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctgaaa tcaccagtct ctctctacaa 1500
atctatctct ctctattttc tccataataa tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta 1560
gggttcttat agggtttcgc tcacgtgttg agcatataag aaacccttag tatgtatttg 1620
tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta 1680
aaatccacct aggctatagt attttaaaat tgcattaaca aacatgtcct aattggtact 1740
cctgagatac tataccctcc tgttttaaaa tagttggcat tatcgaatta tcattttact 1800
ttttaatgtt ttctcttctt ttaatatatt ttatgaattt taatgtattt taaaatgtta 1860
tgcagttcgc tctggacttt tctgctgcgc ctacacttgg gtgtactggg cctaaattca 1920
gcctgaccga ccgcctgcat tgaataatgg atgagcaccg gtaaaatccg cgtacccaac 1980
tttcgagaag aaccgagacg tggcgggccg ggccaccgac gcacggcacc agcgactgca 2040
cacgtcccgc cggcgtacgt gtacgtgctg ttccctcact ggccgcccaa tccactcatg 2100
catgcccacg tacacccctg ccgtggcgcg cccagatcct aatcctttcg ccgttctgca 2160
cttctgctgc ctataaatgg cggcatcgac cgtcacctgc ttcaccaccg gcgagccaca 2220
tcgagaacac gatcgagcac acaagcacga agactcgttt aggagaaacc acaaaccacc 2280
aagccgtgca agcatctgat cagcgatggc caatcttctt actgttcacc agaatttgcc 2340
agctctgcct gtcgacgcca cttcggacga ggttcgcaag aatctcatgg acatgttccg 2400
cgacaggcag gccttcagcg agcacacctg gaagatgctg ctgtcggtgt gcaggtcctg 2460
ggctgcgtgg tgcaagctga ataataggaa gtggttcccc gccgagccgg aggacgtgcg 2520
cgactacctc ctgtacctgc aggctcgcgg cctcgccgtc aagacgatcc agcagcactt 2580
gggccagctg aacatgctgc acaggcgcag cggcctgccg aggccaagcg acagcaacgc 2640
cgtgtccttg gtcatgcgca ggattcgcaa ggagaacgtg gacgcgggcg agcgcgccaa 2700
gcaggccctg gccttcgagc gcaccgactt cgaccaggtc aggagcctga tggagaacag 2760
cgacaggtgc caggacatca ggaacctggc cttcctcggc atcgcgtaca atacactcct 2820
gaggatcgcg gagatcgccc gcatcagggt caaggacatc tcacgcacgg acggtggcag 2880
gatgctgata catatcggca ggacgaagac cctcgtgagc acggcgggcg tggagaaggc 2940
gctctccctg ggcgtgacga agctggtcga gcggtggatc tccgtgagcg gcgtggcgga 3000
cgacccgaat aattacctct tctgccgcgt gaggaagaac ggcgtggcgg ccccatcggc 3060
caccagccag ctgtcgacca gggctctgga gggcatcttc gaggcgaccc acaggctgat 3120
ctacggcgct aaggacgact cgggccagcg ctacctcgct tggtcgggcc actcggccag 3180
ggtgggcgcg gcccgcgaca tggccagggc gggcgtctcc atcccggaga tcatgcaggc 3240
tggcggctgg acgaacgtga acatcgtcat gaactacatt aggaatctgg actcggagac 3300
tggggcgatg gttcggctgc tggaggacgg cgattaattc gaagacttgt ccatcttctg 3360
gattggccaa cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca cacatagtga catgctaatc 3420
actataatgt gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt gctagttatc tgaataaaag 3480
agaaagagat catccatatt tcttatccta aatgaatgtc acgtgtcttt ataattcttt 3540
gatgaaccag atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat ataaatatta atcatatata 3600
attaatatca attgggttag caaaacaaat ctagtctagg tgtgttttgc gaatgcggcc 3660
tcgagaccgg tacctttctg gagtttaatg agctaagcac atacgtcaga aaccattatt 3720
gcgcgttcaa aagtcgccta aggtcactat cagctagcaa atatttcttg tcaaaaatgc 3780
tccactgacg ttccataaat tcccctcggt atccaattag agtctcatat tcactctcaa 3840
tccaaataat ctgcaccgga tctgatcaaa aatggaggcg ctgagcgggc gggtaggcgt 3900
caagtgcggg cggtggaacc ctacggcgga gcaggtgaag gtcctgacgg agctgttccg 3960
cgcggggctg cgcacgccca gcacggagca gatccagcgc atctccaccc acctcagcgc 4020
cttcggcaag gtggagagca agaacgtctt ctactggttc cagaaccaca aggcccgcga 4080
gcgccaccac cacaagaagc gccgccgcgg cgcgtcctcc cccgacagtg gcagcggctc 4140
cggcagcggc agcaacgagg aagacggcgg ccgtgctgct gccgcctcgc acgacgccga 4200
ggccgacgtc gacctcgtgc tgcagccgcc agagagcaag cgggaggcca gaagctacgc 4260
ccaccatcat caccggctgg ccgtgacatg ctacgtcagg gacgtggtgg agcagcagga 4320
ggccacgtgg gagcggccga cgcgcgaggt ggagacgctg gagctgttcc ctctcaagtc 4380
gtacgtggac ctggaggctg cggagaaggt ccggtatgtc aggggcagcg ccgccagcga 4440
gcagtgcagg gagttctcct tcttcgacgt ctccggcggc cgcgatccgc cacttgagct 4500
gaggctctgc agcttcggtc cctactaaga attctaagat cgttcaaaca tttggcaata 4560
aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt 4620
gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt 4680
ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg 4740
cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc ggtacctacg 4800
tacggacccc tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt 4860
gcatgtctaa gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca 4920
gtttatctat ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta 4980
ctacaataat atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag 5040
gacaattgag tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt 5100
ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat 5160
ccatttaggg tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta 5220
ttctatttta gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata 5280
atttagatat aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga 5340
aattaaaaaa actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa 5400
cgccgccgac gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag 5460
cgaagcagac ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc 5520
caccgttgga cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg 5580
agccggcacg gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc 5640
tttcccaccg ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc 5700
acaccctctt tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc 5760
ccaaatccac ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc 5820
ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatagtta gggcccggta gttctacttc 5880
tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgttagc gttcgtacac 5940
ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg 6000
gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt 6060
tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt 6120
tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg 6180
cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt 6240
ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa 6300
tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg 6360
ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag 6420
atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt 6480
gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata 6540
ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta 6600
ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta 6660
ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag 6720
ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg 6780
ttgtttggtg ttacttctgc agggatctaa ctagttaaaa tggctaataa ttggcttggt 6840
ttctctcttt caccatacga gcagaatcat catcggaagg acgtttactc atccaccact 6900
acgaccgtgg tcgacgtggc gggcgagtac tgctacgacc cgacggcggc ctcggacgag 6960
tccagcgcga tccagacgtc cttccccagc ccattcggcg tggtcgtgga cgctttcacc 7020
agggacaaca actcccacag cagggactgg gacatcaacg gctgcgcctg caacaacatc 7080
cataacgacg agcaggacgg cccgaagctc gagaacttcc tgggccgcac cacgaccatc 7140
tacaatacta acgagaacgt gggcgacggc agcggcagcg ggtgctacgg tggtggcgac 7200
ggcagcggcg gctccctcgg cctgagcatg atcaagacgt ggctgcgcaa ccagcccgtg 7260
gacaacgtcg acaaccagga gaacggcaac gcggccaagg gcctctccct gagcatgaac 7320
tccagcacct cctgcgacaa caacaacgat tccaacaaca acgtggtcgc ccagggcaag 7380
acgatcgacg actccgtgga ggcgaccccg aagaagacga tcgagtcctt cggccagcgc 7440
acttctatct acaggggcgt cacccgccac aggtggaccg gccgctacga ggcgcacctc 7500
tgggataaca gctgcaagag ggagggccag acccgcaagg gcaggcaggt gtacctgggc 7560
ggctacgaca aggaggagaa ggcggccagg gcttacgacc tcgcggccct gaagtactgg 7620
ggcacgacca cgaccacgaa cttcccgatg tccgagtacg agaaggaggt ggaggagatg 7680
aagcacatga cccgccagga gtatgtggct agcctcagga ggaagtccag cggcttctcc 7740
aggggcgcga gcatctaccg cggcgtgacg aggcaccacc agcacggcag gtggcaggct 7800
cgcatcggca gggtcgcggg caacaaggac ctctacctgg gcaccttcgg cacgcaggag 7860
gaggctgccg aggcttacga catcgctgcg atcaagttcc gcggcctcac cgcggtgacg 7920
aacttcgaca tgaacaggta caacgtcaag gccatcctcg agagccccag cctgccaatc 7980
ggctccgctg ccaagaggct gaaggaggcc aacaggccgg tgccctccat gatgatgatc 8040
agcaacaacg tctccgagtc ggagaactcg gcttcgggct ggcagaacgc ggccgtgcag 8100
caccaccagg gcgtcgacct ctccctcctc caccagcacc aggagaggta caacggctac 8160
tactacaacg gcggcaacct gtccagcgag tcggctaggg cctgcttcaa gcaggaggac 8220
gaccagcacc acttcctctc caatacacag agcctgatga cgaacatcga ccaccagtcc 8280
agcgtgtccg acgacagcgt gacggtctgc ggcaacgtgg tgggctacgg cggctaccag 8340
ggcttcgcgg ccccagtcaa ctgcgacgcc tacgccgcga gcgagttcga ctacaacgcc 8400
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gctatctacc gtttcttact taggaggtgt ttgaatgcac taaaactaat agttagtggc 8880
taaaattagt taaaacatcc aaacaccata gctaatagtt gaactattag ctatttttgg 8940
aaaattagtt aatagtgagg tagttatttg ttagctagct aattcaacta acaattttta 9000
gccaactaac aattagtttc agtgcattca aacaccccct taatgttaac gtggttctat 9060
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tgctgctagt tcttgctgaa tccagaagtt ctcgtagtat agctcagatt catattattt 9180
atttgagtga taagtgatcc aggttattac tatgttagct aggttttttt tacaaggata 9240
aattatctgt gatcataatt cttatgaaag ctttatgttt cctggaggca gtggcatgca 9300
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ctgttcacca aatcattgga gaacacacat acacattctt gccagtcttg gttagagaaa 9420
tttcatgaca aaatgccaaa gctgtcttga ctcttcactt ttggccatga gtcgtgactt 9480
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ataagttgtg atggttgatc tctggatttt gttttgctct caatagtgga cgagattaga 9600
tagctacgta tttataactt cgtatagcat acattatacg aagttattaa accatggccc 9660
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acggccacta cttcaccgtg aagggcgagg gcagcggcaa gccctacgag ggcacccaga 9780
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tgtccaccgt gttcatgtac ggcaaccgct gcttcaccgc ctaccccacc agcatgcccg 9900
actacttcaa gcaggccttc cccgacggca tgtcctacga gagaaccttc acctacgagg 9960
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agtccacctt ccacggcgtg aacttccccg ccgacggccc cgtgatggcc aagaagacca 10080
ccggctggga cccctccttc gagaagatga ccgtgtgcga cggcatcttg aagggcgacg 10140
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gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 10500
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atccgtgtga tcgcgtctga ttggctagag atatgtttct tccttgttgg atgtattttc 10800
atacataatc atatgcatac aaatatttca ttacacttta tagaaatggt cagtaataaa 10860
ccctatcact atgtctggtg tttcatttta tttgctttta aacgaaaatt gacttcctga 10920
ttcaatattt aaggatcgtc aacggtgtgc agttactaaa ttctggtttg taggaactat 10980
agtaaactat tcaagtcttc acttattgtg cactcacctc tcgccacatc accacagatg 11040
ttattcacgt cttaaatttg aactacacat catattgaca caatattttt tttaaataag 11100
cgattaaaac ctagcctcta tgtcaacaat ggtgtacata accagcgaag tttagggagt 11160
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ccacccttca accaatgttt cactttagaa cgagtaattt tattattgtc actttggacc 11280
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aatttactct tttctactat tataaaaatt gaggatgttt ttgtcggtac tttgatacgt 11580
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tttttctagt aaaaataaaa gataaactta gactcaaaac atttacaaaa acaaccccta 11880
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ccagatcggt gcgcgggagg ggcgggatct cgcggctggg gctctcgccg gcgtcgatcc 12480
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aggccgttgc caaacgcttt ggcgaactgc ctttcctgtt caaagtatta tgcgcagcac 13080
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agccggagct ggtttttgcg ctgacgcctt tccttgcgat gaacgcgttt cgtgaatttt 13260
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tacaacagcc tgatgccgaa cgtttaagcg aactgttcgc cagcctgttg aatatgcagg 13380
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<210> 178
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<212> DNA
<213> 高粱
<400> 178
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<210> 179
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<212> DNA
<213> 油菜
<400> 179
atggctaata attggcttgg tttctctctt tcaccatacg agcagaatca tcatcggaag 60
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tggctgcgca accagcccgt ggacaacgtc gacaaccagg agaacggcaa cgcggccaag 480
ggcctctccc tgagcatgaa ctccagcacc tcctgcgaca acaacaacga ttccaacaac 540
aacgtggtcg cccagggcaa gacgatcgac gactccgtgg aggcgacccc gaagaagacg 600
atcgagtcct tcggccagcg cacttctatc tacaggggcg tcacccgcca caggtggacc 660
ggccgctacg aggcgcacct ctgggataac agctgcaaga gggagggcca gacccgcaag 720
ggcaggcagg tgtacctggg cggctacgac aaggaggaga aggcggccag ggcttacgac 780
ctcgcggccc tgaagtactg gggcacgacc acgaccacga acttcccgat gtccgagtac 840
gagaaggagg tggaggagat gaagcacatg acccgccagg agtatgtggc tagcctcagg 900
aggaagtcca gcggcttctc caggggcgcg agcatctacc gcggcgtgac gaggcaccac 960
cagcacggca ggtggcaggc tcgcatcggc agggtcgcgg gcaacaagga cctctacctg 1020
ggcaccttcg gcacgcagga ggaggctgcc gaggcttacg acatcgctgc gatcaagttc 1080
cgcggcctca ccgcggtgac gaacttcgac atgaacaggt acaacgtcaa ggccatcctc 1140
gagagcccca gcctgccaat cggctccgct gccaagaggc tgaaggaggc caacaggccg 1200
gtgccctcca tgatgatgat cagcaacaac gtctccgagt cggagaactc ggcttcgggc 1260
tggcagaacg cggccgtgca gcaccaccag ggcgtcgacc tctccctcct ccaccagcac 1320
caggagaggt acaacggcta ctactacaac ggcggcaacc tgtccagcga gtcggctagg 1380
gcctgcttca agcaggagga cgaccagcac cacttcctct ccaatacaca gagcctgatg 1440
acgaacatcg accaccagtc cagcgtgtcc gacgacagcg tgacggtctg cggcaacgtg 1500
gtgggctacg gcggctacca gggcttcgcg gccccagtca actgcgacgc ctacgccgcg 1560
agcgagttcg actacaacgc ccgcaaccac tactacttcg cgcagcagca gcagacccag 1620
cagtccccgg gcggcgactt cccggctgcg atgacgaaca acgtgggcag caacatgtac 1680
taccacggcg agggcggcgg cgaggttgct ccgactttca ctgtttggaa cgataattaa 1740
<210> 180
<211> 13283
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体25072
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (101)..(125)
<223> bNRB-01-01
<220>
<221> 启动子
<222> (349)..(2342)
<223> prUbi1-44
<220>
<221> 内含子
<222> (1333)..(2342)
<223> iUbi1-30
<220>
<221> 基因
<222> (2367)..(3002)
<223> cBdWOX5/7-v1
<220>
<221> 终止子
<222> (3011)..(4045)
<223> tUbi1-04
<220>
<221> 启动子
<222> (4070)..(6062)
<223> prUbi1-10
<220>
<221> 内含子
<222> (5053)..(6062)
<223> iUbi1-02-01
<220>
<221> 基因
<222> (6071)..(7684)
<223> cPPO-04
<220>
<221> 终止子
<222> (7710)..(7962)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (8015)..(8144)
<223> bNLB-03
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (8050)..(8074)
<223> bNLB-01-01
<220>
<221> 基因
<222> (8424)..(9212)
<223> cSpec-03
<220>
<221> 基因
<222> (9512)..(10237)
<223> cVirG-01
<220>
<221> 基因
<222> (10267)..(11340)
<223> cRepA-01
<220>
<221> 复制原点
<222> (11383)..(11787)
<223> oVS1-02
<220>
<221> 复制原点
<222> (12465)..(13271)
<223> oCOLE-06
<400> 180
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc 300
gcgccgaatt cgagctcagg gaccccggac cctaattagc taaggtacct gcagtgcagc 360
gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa 420
ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata 480
tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt 540
agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa 600
caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag 660
cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa 720
tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt 780
aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata 840
aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac 900
atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg 960
acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc 1020
tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct 1080
gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct 1140
cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt 1200
tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc 1260
gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc 1320
tccgcttcct aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct tctctagatc 1380
ggcgttccgg tccatagtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat 1440
ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag 1500
acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag 1560
ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt 1620
tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg 1680
cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt 1740
agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca 1800
tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat 1860
acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt 1920
gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt 1980
caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata 2040
gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg 2100
ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga 2160
gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg 2220
gatgatggca tatccagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt 2280
tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc 2340
agggatcttc gaataaccta gcagcgatgg aggtgctgag cgggagggta ggggtgaagt 2400
gcgggcggtg gaacccgacg gcggagcagg tgaaggtgct gacggagctt ttccgggcgg 2460
ggctgcggac gccgagcacg gagcagatcc agcggatctc cacccacctc ggcgccttcg 2520
gcaaggtgga gagcaagaac gtcttctact ggttccagaa ccacaaggcc cgcgagcgcc 2580
accaccacaa gaagcgccgc cgcgtcgcct cctcctcctc cgacaacagc agcgccagca 2640
acaacaacga cgaagcagca gatcacggcc gcagtagtgc ccgcgaggac ctcctgctgc 2700
agcctcccga gagcaagcgc gaggccagaa gctacaacca ccaccgccgg ccgatcatga 2760
catatgtagg ctatgtgagg gacgaggtgg agcaggaggt ggtgatgtgg gagcggccga 2820
cgagggaggt ggagacgctc gagctgttcc cgctcaaggc agcctacgac ctcgaggcgg 2880
cggacaggct ccggtacgtg aggggcgccg gcgagcagca gtgcagggag atctccttct 2940
tcgacgtcgc caacggacgg gatccgccgc tggagctcag gctctgcagc ttcgatatct 3000
agttaattaa gtcatgggtc gtttaagctg ccgatgtgcc tgcgtcgtct ggtgccctct 3060
ctccatatgg aggttgtcaa agtatctgct gttcgtgtca tgagtcgtgt cagtgttggt 3120
ttaataatgg accggttgtg ttgtgtgtgc gtactaccca gaactatgac aaatcatgaa 3180
taagtttgat gtttgaaatt aaagcctgtg ctcattatgt tctgtctttc agttgtctcc 3240
taatatttgc ctccaggtac tggctatcta ccgtttctta cttaggaggt gtttgaatgc 3300
actaaaacta atagttagtg gctaaaatta gttaaaacat ccaaacacca tagctaatag 3360
ttgaactatt agctattttt ggaaaattag ttaatagtga ggtagttatt tgttagctag 3420
ctaattcaac taacaatttt tagccaacta acaattagtt tcagtgcatt caaacacccc 3480
cttaatgtta acgtggttct atctaccgtc tcctaatata tggttgattg ttcggtttgt 3540
tgctatgcta ttgggttctg attgctgcta gttcttgctg aatccagaag ttctcgtagt 3600
atagctcaga ttcatattat ttatttgagt gataagtgat ccaggttatt actatgttag 3660
ctaggttttt tttacaagga taaattatct gtgatcataa ttcttatgaa agctttatgt 3720
ttcctggagg cagtggcatg caatgcatga cagcaacttg atcacaccag ctgaggtaga 3780
tacggtaaca aggttcttaa atctgttcac caaatcattg gagaacacac atacacattc 3840
ttgccagtct tggttagaga aatttcatga caaaatgcca aagctgtctt gactcttcac 3900
ttttggccat gagtcgtgac ttagtttggt ttaatggacc ggttctccta gcttgttcta 3960
ctcaaaactg ttgttgatgc gaataagttg tgatggttga tctctggatt ttgttttgct 4020
ctcaatagtg gacgagatta gatagcggac cgggtaccag cttgcatgcc tgcagtgcag 4080
cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa gttataaaaa 4140
attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat ctttatacat 4200
atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat atcagtgttt 4260
tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag tattttgaca 4320
acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt tttgcaaata 4380
gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg tttagggtta 4440
atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta gcctctaaat 4500
taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata atttagatat aaaatagaat 4560
aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa actaaggaaa 4620
catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac gagtctaacg 4680
gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac ggcacggcat 4740
ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga cttgctccgc 4800
tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg gcaggcggcc 4860
tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc tttcccaccg ctccttcgct 4920
ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt tccccaacct 4980
cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac ccgtcggcac 5040
ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct tctctagatc 5100
ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat 5160
ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag 5220
acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag 5280
ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt 5340
tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg 5400
cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt 5460
agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca 5520
tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat 5580
acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt 5640
gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt 5700
caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata 5760
gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg 5820
ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga 5880
gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg 5940
gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt 6000
tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc 6060
agggatcccg atggaactct ccctcctccg cccgaccacc cagtccctcc tcccgtcctt 6120
ctccaagccg aacctccgcc tcaacgtgta caagccgctc cgcctccgct gctccgtggc 6180
cggcggcccg accgtgggct cctccaagat cgagggcggc ggcggcacca ccatcaccac 6240
cgactgcgtg atcgtgggcg gcggcatctc cggcctctgc atcgcccagg ccctcgccac 6300
caagcacccg gacgccgccc cgaacctcat cgtgaccgag gccaaggacc gcgtgggcgg 6360
caacatcatc acccgcgagg agaacggctt cctctgggag gagggcccga actccttcca 6420
gccgtccgac ccgatgctca ccatggtggt ggactccggc ctcaaggacg acctcgtgct 6480
cggcgacccg accgccccgc gcttcgtgct ctggaacggc aagctccgcc cggtgccgtc 6540
caagctcacc gacctcccgt tcttcgacct catgtccatc ggcggcaaga tccgcgccgg 6600
cttcggcgcc ctcggcatcc gcccgtcccc gccgggccgc gaggagtccg tggaggagtt 6660
cgtgcgccgc aacctcggcg acgaggtgtt cgagcgcctc atcgagccgt tctgctccgg 6720
cgtgtacgcc ggcgacccgt ccaagctctc catgaaggcc gccttcggca aggtgtggaa 6780
gctcgagcag aacggcggct ccatcatcgg cggcaccttc aaggccatcc aggagcgcaa 6840
gaacgccccg aaggccgagc gcgacccgcg cctcccgaag ccgcagggcc agaccgtggg 6900
ctccttccgc aagggcctcc gcatgctccc ggaggccatc tccgcccgcc tcggctccaa 6960
ggtgaagctc tcctggaagc tcctcggcat caccaagctc gagtccggcg gctacaacct 7020
cacctacgag accccggacg gcctcgtgtc cgtgcagtcc aagtccgtgg tgatgaccgt 7080
gccgtcccac gtggcctccg gcctcctccg cccgctctcc gagtccgccg ccaacgccct 7140
ctccaagctc tactacccgc cggtggccgc cgtgtccatc tcctacccga aggaggccat 7200
ccgcaccgag tgcctcatcg acggcgaact caagggcttc ggccagctcc acccgcgcac 7260
ccagggcgtg gagaccctcg gcaccatcta ctcctcctcc ctcttcccga accgcgcccc 7320
gccgggccgc atcctcctcc tcaacatgat cggcggctcc accaacaccg gcatcctctc 7380
caagtccgag ggcgaactcg tggaggccgt ggaccgcgac ctccgcaaga tgctcatcaa 7440
gccgaactcc accgacccgc tcaagctcgg cgtgcgcgtg tggccgcagg ccatcccgca 7500
gttcctcgtg ggccacttcg acatcctcga caccgccaag tcctccctca cctcctccgg 7560
ctacgagggc ctcttcctcg gcggcaacta cgtggccggc gtggccctcg gccgctgcgt 7620
ggagggcgcc tacgagaccg ccatcgaggt gaacaacttc atgtcccgct acgcctacaa 7680
gtaagcagag ctcgatccgt cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 7740
taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 7800
ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 7860
ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 7920
aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tctgtagccc tgcaggaaat 7980
ttaccggtgc ccgggcggcc agcatggccg tatccgcaat gtgttattaa gttgtctaag 8040
cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct gccaccagcc agccaacagc tccccgaccg 8100
gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac aggcagccca tcagaattaa ttctcatgtt 8160
tgacagctta tcatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc agccatcgga 8220
agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca 8280
ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca aatattctga 8340
aatgagctgt tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 8400
caatttcaca caggaaacag accatgaggg aagcgttgat cgccgaagta tcgactcaac 8460
tatcagaggt agttggcgtc atcgagcgcc atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt 8520
tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga agccacacag tgatattgat ttgctggtta 8580
cggtgaccgt aaggcttgat gaaacaacgc ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa 8640
cttcggcttc ccctggagag agcgagattc tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc 8700
acgacgacat cattccgtgg cgttatccag ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc 8760
agcgcaatga cattcttgca ggtatcttcg agccagccac gatcgacatt gatctggcta 8820
tcttgctgac aaaagcaaga gaacatagcg ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac 8880
tctttgatcc ggttcctgaa caggatctat ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat 8940
ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca 9000
tttggtacag cgcagtaacc ggcaaaatcg cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa 9060
tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg tcatacttga agctaggcag gcttatcttg 9120
gacaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtt cactacgtga 9180
aaggcgagat caccaaagta gtcggcaaat aaagctctag tggatctccg tacccgggga 9240
tctggctcgc ggcggacgca cgacgccggg gcgagaccat aggcgatctc ctaaatcaat 9300
agtagctgta acctcgaagc gtttcacttg taacaacgat tgagaatttt tgtcataaaa 9360
ttgaaatact tggttcgcat ttttgtcatc cgcggtcagc cgcaattctg acgaactgcc 9420
catttagctg gagatgattg tacatccttc acgtgaaaat ttctcaagcg ctgtgaacaa 9480
gggttcagat tttagattga aaggtgagcc gttgaaacac gttcttcttg tcgatgacga 9540
cgtcgctatg cggcatctta ttattgaata ccttacgatc cacgccttca aagtgaccgc 9600
ggtagccgac agcacccagt tcacaagagt actctcttcc gcgacggtcg atgtcgtggt 9660
tgttgatcta gatttaggtc gtgaagatgg gctcgagatc gttcgtaatc tggcggcaaa 9720
gtctgatatt ccaatcataa ttatcagtgg cgaccgcctt gaggagacgg ataaagttgt 9780
tgcactcgag ctaggagcaa gtgattttat cgctaagccg ttcagtatca gagagtttct 9840
agcacgcatt cgggttgcct tgcgcgtgcg ccccaacgtt gtccgctcca aagaccgacg 9900
gtctttttgt tttactgact ggacacttaa tctcaggcaa cgtcgcttga tgtccgaagc 9960
tggcggtgag gtgaaactta cggcaggtga gttcaatctt ctcctcgcgt ttttagagaa 10020
accccgcgac gttctatcgc gcgagcaact tctcattgcc agtcgagtac gcgacgagga 10080
ggtttatgac aggagtatag atgttctcat tttgaggctg cgccgcaaac ttgaggcaga 10140
tccgtcaagc cctcaactga taaaaacagc aagaggtgcc ggttatttct ttgacgcgga 10200
cgtgcaggtt tcgcacgggg ggacgatggc agcctgagcc aattcccaga tccccgagga 10260
atcggcgtga gcggtcgcaa accatccggc ccggtacaaa tcggcgcggc gctgggtgat 10320
gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa 10380
gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa 10440
ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca agggcgacga gcaaccagat 10500
tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg 10560
gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt 10620
ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca tggccagtgt gtgggattac 10680
gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg 10740
aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt ccacacgttg cggacgtact caagttctgc 10800
cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac 10860
accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta 10920
tccgagggtg aagccttgat tagccgctac aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg 10980
gagtacatcg agatcgagct agctgattgg atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac 11040
ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt 11100
ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg 11160
atctacgaac gcagtggcag cgccggagag ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag 11220
ctgatcgggt caaatgacct gccggagtac gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc 11280
ccgatcctag tcatgcgcta ccgcaacctg atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa 11340
tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggtctc 11400
tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg 11460
tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggtcac acatgtaagt gactgatata 11520
aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa aactctttaa aacttattaa aactcttaaa 11580
acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg 11640
cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt cgcgtcggcc tatcgcggcc 11700
gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc taccagggcg cggacaagcc 11760
gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgctga ggtctgcctc gtgaagaagg tgttgctgac 11820
tcataccagg cctgaatcgc cccatcatcc agccagaaag tgagggagcc acggttgatg 11880
agagctttgt tgtaggtgga ccagttggtg attttgaact tttgctttgc cacggaacgg 11940
tctgcgttgt cgggaagatg cgtgatctga tccttcaact cagcaaaagt tcgatttatt 12000
caacaaagcc gccgtcccgt caagtcagcg taatgctctg ccagtgttac aaccaattaa 12060
ccaattctga ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag 12120
gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga 12180
ggcagttcca taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat 12240
caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat 12300
gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca aaagctctgc attaatgaat cggccaacgc 12360
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 12420
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 12480
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 12540
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 12600
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 12660
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 12720
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 12780
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 12840
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 12900
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 12960
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 13020
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 13080
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 13140
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 13200
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 13260
tagatccttt tgatccggaa tta 13283
<210> 181
<211> 636
<212> DNA
<213> 二穗短柄草（Brachybacterium distachyon）
<400> 181
atggaggtgc tgagcgggag ggtaggggtg aagtgcgggc ggtggaaccc gacggcggag 60
caggtgaagg tgctgacgga gcttttccgg gcggggctgc ggacgccgag cacggagcag 120
atccagcgga tctccaccca cctcggcgcc ttcggcaagg tggagagcaa gaacgtcttc 180
tactggttcc agaaccacaa ggcccgcgag cgccaccacc acaagaagcg ccgccgcgtc 240
gcctcctcct cctccgacaa cagcagcgcc agcaacaaca acgacgaagc agcagatcac 300
ggccgcagta gtgcccgcga ggacctcctg ctgcagcctc ccgagagcaa gcgcgaggcc 360
agaagctaca accaccaccg ccggccgatc atgacatatg taggctatgt gagggacgag 420
gtggagcagg aggtggtgat gtgggagcgg ccgacgaggg aggtggagac gctcgagctg 480
ttcccgctca aggcagccta cgacctcgag gcggcggaca ggctccggta cgtgaggggc 540
gccggcgagc agcagtgcag ggagatctcc ttcttcgacg tcgccaacgg acgggatccg 600
ccgctggagc tcaggctctg cagcttcgat atctag 636
<210> 182
<211> 1994
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 182
ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240
gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300
ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360
gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720
acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780
ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840
gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900
ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960
cccgtcggca cctccgcttc ctaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac 1020
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatagt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg 1080
tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga 1140
cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg 1200
ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca 1260
tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt 1320
catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt 1380
ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt 1440
atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc 1500
taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt 1560
tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt 1620
agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca 1680
tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca 1740
tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 1800
ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc 1860
ttgatatact tggatgatgg catatccagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 1920
tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 1980
tgttacttct gcag 1994
<210> 183
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12949正向引物
<400> 183
atcgatctgt cacttgattt taattagaa 29
<210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12950反向引物
<400> 184
gtgagcggct ttcctgtatc t 21
<210> 185
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12951探针
<400> 185
tctggctgat tctctatt 18
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12703正向引物
<400> 186
tgtagtccgt tccagcgaca 20
<210> 187
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12704反向引物
<400> 187
ggtttcaggt ttggggaaag a 21
<210> 188
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12705探针
<400> 188
ccgtagatct tctcctc 17
<210> 189
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12958正向引物
<400> 189
gctgactggt ctcaccatct cat 23
<210> 190
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12959反向引物
<400> 190
agtatgatgg ccatatattt gctatctta 29
<210> 191
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12960探针
<400> 191
ctaaagatgg tggtggtg 18
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12952正向引物
<400> 192
tgggacattt gggaaggaaa 20
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12953反向引物
<400> 193
gtctaagggc ctgctgacga 20
<210> 194
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12954探针
<400> 194
ctgaaggaaa cctatctc 18
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12952正向引物
<400> 195
tgggacattt gggaaggaaa 20
<210> 196
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12956反向引物
<400> 196
ctgactgcct gatgacgca 19
<210> 197
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FE12957探针
<400> 197
ttggtatgtt tgcctcaga 19
Claims (45)
1.一种玉米植物，所述玉米植物对于马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α基因(MATL)中的功能失去突变是纯合的，并且对于在至少一个与提高的单倍体诱导相关的数量性状基因座(QTL)(HI-QTL)处的HI等位基因至少是杂合的，其中所述玉米植物具有正常A(“NA”)细胞型。
2.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述玉米植物对于所述在至少一个HI-QTL处的HI等位基因是纯合的。
3.如权利要求1或2所述的玉米植物，其中所述至少一个HI-QTL是第9号染色体上的qhir8(HI-QTL qhir8)。
4.如权利要求3所述的玉米植物，其中在所述HI-QTL qhir8处的所述HI等位基因包含在DUF679结构域膜蛋白7(DMP)基因中的功能失去突变。
5.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述玉米植物对于在至少一个与提高的转化频率相关的QTL(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的。
6.如权利要求5所述的玉米植物，其中所述玉米植物对于所述在至少一个TF-QTL处的TF等位基因是纯合的。
7.如权利要求5或6所述的玉米植物，其中所述至少一个TF-QTL是第3号染色体上的qCYTO-A_TF3.1(TF-QTL qCYTO-A_TF3.1)。
8.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述玉米植物包含选择性标记。
9.如权利要求8所述玉米植物，其中所述玉米植物对于选择性标记是纯合的。
10.如权利要求9所述的玉米植物，其中所述选择性标记是GUS、PMI、PAT、GFP、RFP、CFP、B1、CI、NPTII、HPT、ACC3、AADA、高油含量、R-navajo(R-nj)、R1盾片(R1-SCM2)和/或花色素苷色素中的任一种。
11.如权利要求10所述的玉米植物，其中所述玉米植物对于在第10号染色体上的R1基因座处的所述R1-盾片(R1-SCM2)等位基因是纯合的。
12.如权利要求11所述的玉米植物，其中所述玉米植物对于在所述玉米植物中的颜色抑制基因座处的野生型等位基因至少是杂合的，所述颜色抑制基因座对应于位于B73v5参考基因组中第8Mb位与第10Mb位之间的第9号染色上的颜色抑制基因座。
13.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述玉米植物能够表达DNA修饰酶和任选地至少一种指导核酸。
14.如权利要求13所述的玉米植物，其中所述DNA修饰酶是定点核酸酶，所述定点核酸酶选自由以下组成的组：Cas9核酸酶、Cas12a核酸酶、兆核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、dCas9-Fokl、dCas12a-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9-腺嘌呤脱氨酶、嵌合FENl-FokI、MegaTAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9非Fokl核酸酶、dCas12a非Fokl核酸酶、嵌合Cas12a-胞苷脱氨酶和Cas12a-腺嘌呤脱氨酶。
15.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述玉米植物包含非坚秆种质、坚秆种质、非坚秆Iodent种质、非坚秆Mo17样种质、热带种质或亚热带种质中的一种或多种。
16.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述玉米植物来源于品系Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS、NP2222、SYN-INBE56、SYN-INBB23、SYN-INBF67、SYN-INBC34、SYN-INBD45、SYN-INBG78、SYN-INBH89、SYN-INBI90、SYN-INBJ13和/或SYN-INBK14中的任一种。
17.一种玉米植物，所述玉米植物对于在至少一个与提高的转化频率相关的数量性状基因座(QTL)(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的。
18.如权利要求17所述的玉米植物，其中所述玉米植物对于所述在至少一个TF-QTL处的TF等位基因是纯合的。
19.如权利要求17或18所述的玉米植物，其中所述至少一个TF-QTL是第3号染色体上的qCYTO-A_TF3.1(TF-QTL qCYTO-A_TF3.1)。
20.如权利要求17至19中任一项所述的玉米植物，其中所述玉米植物具有正常A(“NA”)细胞型。
21.一种产生可转化单倍体诱导系玉米植物的方法，该方法包括：
a.提供来自第一玉米植物的花粉，其中所述第一玉米植物是单倍体诱导系植物品系，其对于在马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α基因(MATL)中的功能失去突变是纯合的，对于在第二基因座处的HI等位基因至少是杂合的，并且是转化顽固性的；
b.提供第二玉米植物，其中所述第二玉米植物包含正常A(“NA”)细胞质，并且任选地，其中所述第二玉米植物对于在与提高的转化频率相关的数量性状基因座(QTL)(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的；
c.用来自所述第一玉米植物的花粉为所述第二玉米植物授粉，并从中获得至少一种二倍体子代植物；
d.使所述至少一种二倍体子代植物自交和/或使所述至少一种二倍体子代植物与所述第一玉米植物或所述第二玉米植物回交至少一代；以及
e.从步骤d的杂交中选择子代，其中所述选择的子代包含NA细胞型，对于所述MATL基因中的功能失去突变是纯合的，对于所述在第二基因座处的HI等位基因至少是杂合的，并且任选地，对于所述在TF-QTL处的TF等位基因至少是杂合的。
22.一种产生可转化单倍体诱导系玉米植物的方法，该方法包括：
a.提供来自第一玉米植物的花粉，其中所述第一玉米植物是单倍体诱导系植物品系，其对于在马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α基因(MATL)中的功能失去突变是纯合的，对于在第二基因座处的HI等位基因至少是杂合的，并且是转化顽固性的；
b.提供第二玉米植物，其中所述第二玉米植物对于在与提高的转化频率相关的数量性状基因座(QTL)(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的；
c.用来自所述第一玉米植物的花粉为所述第二玉米植物授粉，并从中获得至少一种二倍体子代植物；
d.使所述至少一种二倍体子代植物自交和/或使所述至少一种二倍体子代植物与所述第一玉米植物或所述第二玉米植物回交至少一代；以及
e.从步骤d的杂交中选择子代，其中所述选择的子代对于所述MATL基因中的功能失去突变是纯合的，对于所述在第二基因座处的HI等位基因至少是杂合的，并且对于所述在TF-QTL处的TF等位基因至少是杂合的。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述在第二基因座处的HI等位基因是纯合的。
24.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述选择的子代对于所述在第二基因座处的HI等位基因是纯合的。
25.如权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述第二基因座是与提高的单倍体诱导相关的QTL(HI-QTL)，并且其中所述HI-QTL是位于第9号染色体上的qhir 8(HI-QTLqhir 8)。
26.如权利要求25所述的方法，其中在所述HI-QTL qhir8处的所述HI等位基因包含在DUF679结构域膜蛋白7(DMP)基因中的功能失去突变。
27.一种产生可转化单倍体诱导系玉米植物的方法，该方法包括：
a.提供来自第一玉米植物的花粉，其中所述第一玉米植物对于马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2α基因(MATL)的野生型等位基因是纯合的，并且对于DUF679结构域膜蛋白7(DMP)基因的野生型等位基因是纯合的；
b.提供第二玉米植物，其中所述第二玉米植物包含正常A(“NA”)细胞质，并且任选地，其中所述第二玉米植物对于在与提高的转化频率相关的数量性状基因座(QTL)(TF-QTL)处的TF等位基因至少是杂合的；
c.用来自所述第一玉米植物的花粉为所述第二玉米植物授粉，并从中获得至少一种二倍体子代植物；
d.使所述至少一种二倍体子代植物自交和/或使所述至少一种二倍体子代植物与所述第一玉米植物或所述第二玉米植物回交至少一代；
e.从步骤d的杂交中选择子代，其中所述选择的子代包含NA细胞型，并且任选地，对于所述在TF-QTL处的TF等位基因至少是杂合的；以及
f.编辑至少一株子代植物以使得野生型MATL基因和/或DMP基因的功能失去突变，从而获得可转化的单倍体诱导系玉米植物。
28.如权利要求21、22或27所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述在TF-QTL处的TF等位基因是纯合的。
29.如权利要求21、22、27或28所述的方法，其中所述选择的子代对于所述在TF-QTL处的TF等位基因是纯合的。
30.如权利要求21、22、27、28、或29所述的方法，其中所述TF-QTL是第3号染色体上的qCYTO-A_TF3.1(TF-QTL qCYTO-A_TF3.1)。
31.如权利要求21、22或27所述的方法，其中所述第一玉米植物和/或所述第二玉米植物包含非坚秆种质、坚秆种质、非坚秆Iodent种质、非坚秆Mo17样种质、热带种质或亚热带种质中的一种或多种。
32.如权利要求21、22或27所述的方法，其中所述第一玉米植物与所述第二玉米植物属于不同的杂种优势群。
33.如权利要求21、22或27所述的方法，其中所述第一玉米植物和/或所述第二玉米植物包含品系Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS、NP2222、SYN-INBE56、SYN-INBB23、SYN-INBF67、SYN-INBC34、SYN-INBD45、SYN-INBG78、SYN-INBH89、SYN-INBI90、SYN-INBJ13和/或SYN-INBK14中的任一种。
34.如权利要求21、22或27所述的方法，其中所述第一玉米植物包含选择性标记。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述选择性标记是纯合的。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述步骤e的所选子代对于所述选择性标记是纯合的。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述选择性标记是GUS、PMI、PAT、GFP、RFP、CFP、B1、CI、NPTII、HPT、ACC3、AADA、高油含量、R-navajo(R-nj)、R1盾片(R1-SCM2)和/或花色素苷色素中的任一种。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述选择性标记是第10号染色体上R1基因座处的所述R1-盾片(R1-SCM2)等位基因。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述步骤e的所选子代对于在所述所选择的子代中的颜色抑制基因座处的野生型等位基因是纯合的，所述颜色抑制基因座对应于位于B73v5参考基因组中第8Mb位与第10Mb位之间的第9号染色体上的颜色抑制基因座。
40.一种获得可转化玉米植物的方法，该方法包括将编码目的序列的异源DNA分子转化至如权利要求1所述的玉米植物中。
41.如权利要求40所述的方法，其中将所述异源DNA分子转化至所述玉米植物中是通过生物射弹粒子轰击、农杆菌介导的转化、细胞穿透肽(CPP)介导的转化或乙二醇介导的转化来完成的。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中编码选自以下的组的一种或多种形态发生因子的核苷酸序列中的至少一种：BABY BOOM(BBM)、BBM样、EMBRYOMAKER(EMK)、AINTEGUMENTA(ANT)、AINTEGUMENTA样(AIL)、PLETHORA(PLT)、WUSCHEL(WUS)或WUS同源框(Wox)、GRF(生长调节因子)、SHOOT MERISTEMLESS(STM)、AGAMOUS样(AGL)、MYB115、MYB118、体细胞胚胎发生受体样激酶(SERK)、体细胞胚相关因子(SERF)、胚珠发育蛋白(ODP)和含有核定位的AT-HOOK基序(AHL)。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述异源DNA分子编码DNA修饰酶和任选地至少一种指导核酸。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述DNA修饰酶是定点核酸酶，所述定点核酸酶选自由以下组成的组：Cas9核酸酶、Cas12a核酸酶、兆核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、dCas9-Fokl、dCas12a-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9-腺嘌呤脱氨酶、嵌合FENl-FokI、MegaTAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9非Fokl核酸酶、dCas12a非Fokl核酸酶、嵌合Cas12a-胞苷脱氨酶和Cas12a-腺嘌呤脱氨酶。
45.一种编辑植物基因组DNA的方法，所述方法包括：
a.提供靶植物，其中所述靶植物包含待编辑的植物基因组DNA；
b.用来自如权利要求1所述的玉米植物的花粉为所述靶植物授粉，其中所述玉米植物能够表达DNA修饰酶和任选地至少一种指导核酸；以及
c.选择由步骤c产生的至少一种单倍体子代，其中所述单倍体子代包含所述靶植物的基因组但不包含所述玉米植物的基因组，并且所述单倍体子代的基因组已经通过由所述玉米植物递送的所述DNA修饰酶和任选的指导核酸修饰。
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