JP2024512692A - 植物における形質転換性及び半数体誘導の増強 - Google Patents
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Abstract
ＨＩ－ＮＡ植物と称される非常に形質転換性のトウモロコシ植物並びにそれらの産生及び使用の方法が、本明細書において提供される。ＨＩ－ＮＡ植物は、本明細書において開示されるように、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α（ＭＡＴＬ）遺伝子における機能喪失型突然変異対立遺伝子についてホモ接合であり、植物において半数体誘導及び／又は形質転換頻度の増強を担う１つ又は複数のＱＴＬ及び／又は遺伝子の対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。ＨＩ－ＮＡ植物はまた、本明細書において開示されるように、サイトタイプＡバックグラウンドを有していてもよく、これは、ＨＩ－ＮＡ植物を非常に形質転換性にしてもよい。ＨＩ－ＮＡ植物を産生するための方法及び植物ゲノムＤＮＡを編集するためにＨＩ－ＮＡ植物を使用するための方法もまた、提供される。【選択図】図１
Description
本開示は、植物バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本開示は、外来性の導入遺伝子を受け入れることに対して抵抗性の植物におけるものを含む、植物形質転換及び植物育種並びに遺伝子編集に関する。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
配列表の公式の写しは、２３１ＫＢのサイズを有する２０２２年３月２５日に作成されたファイル名が８２２２２＿ＳＴ２５．ｔｘｔのＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、明細書と共に出願される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含有される配列表は、明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表の公式の写しは、２３１ＫＢのサイズを有する２０２２年３月２５日に作成されたファイル名が８２２２２＿ＳＴ２５．ｔｘｔのＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、明細書と共に出願される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含有される配列表は、明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
植物形質転換、すなわち、植物ゲノムへの外来性ＤＮＡ（「導入遺伝子」）の安定した統合は、作物に新規で有用な形質を追加するために、何十年もの間、使用されてきた。トウモロコシ系統の中には形質転換する（すなわち、トランスジェニックＤＮＡを受け入れる）のが比較的簡単なものもあるが、ほとんどの系統は、そうではない。例えば、純粋な又はほぼ純粋なホモ接合ゲノムを得るために数世代にわたって自家受粉によって産生され、商業的に価値があるハイブリッドを作出するための親系統として使用されるほとんどの優良な近交系は、多くの場合、外来性ＤＮＡにより形質転換することができない。従って、トランスジェニック形質を近交系に移すためには、トランスジェニック形質は、最初に、形質転換性のトウモロコシ系統に形質転換されなければならない。その形質転換されたトウモロコシ系統は、育種プラットフォームにおいて親系統として使用するのに適していることはめったにない。そのため、形質転換されたトウモロコシ系統は、近交系の親及び形質転換された親の両方のゲノムをヘテロ接合で含む子孫植物を作出するために、近交系と交配される。次に、導入遺伝子を含むその子孫植物は、トランスジェニック形質を保持しながら、形質転換された親によって与えられたゲノムを可能な限り消失させるために、およそ６又は７世代の間、近交系と戻し交配されなければならない。この形質遺伝子移入プロセスは、一般に、３～７年間かかる。
トウモロコシは、少なくとも５つの異なるサイトタイプを有することが知られている（ミトコンドリアゲノムに基づいて分類される）：正常Ａ（「ＮＡ」）、正常Ｂ（「ＮＢ」）、細胞質雄性不稔Ｃ（「ＣＭＳ－Ｃ」又は「Ｃ」）、細胞質雄性不稔Ｓ（「ＣＭＳ－Ｓ」又は「Ｓ」）及び細胞質雄性不稔Ｔ（「ＣＭＳ－Ｔ」又は「Ｔ」）。他のサイトタイプが、まだ発見されるかもしれない。これらの種々のサイトタイプに存在するミトコンドリア及び葉縁体は、従って、それらのゲノムを通して、比較して言うと植物細胞の表現型に対して、特別大きな影響を有しているかもしれない。これらの影響は、今になってようやく解明されつつある。例えば、形質転換性とサイトタイプとの間に関係があるということが最近発見された。形質転換性であることが知られているトウモロコシ系統は、ＮＡサイトタイプを有するのに対して、形質転換性でない（抵抗性である）ことが知られているトウモロコシ系統は、ＮＢサイトタイプを有する。
植物育種におけるもう一つの重要なツールは、半数体誘導（「ＨＩ」）であり、これは、受精の間又は後の、多くの場合、初期胚発生の間のある時点での、胚からの、一方の親の染色体のセット（半数体誘導体の親（haploid inducer parent）からの染色体）の喪失によって特徴付けられる一種の植物現象である。半数体誘導は、モロコシ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、及び多くの他の種などの数多くの植物種において観察されてきた。トウモロコシにおいて、半数体の種子又は胚は、半数体誘導体の雄（haploid inducer male）（すなわち「半数体誘導体の花粉（haploid inducer pollen）」）と事実上任意の選ばれた雌穂との間で交配を行うことによって産生することができる。母系のＨＩ系、例えば母方ベースの系の場合、半数体は、半数体誘導体の花粉ＤＮＡが胚の最初の細胞分裂を通して完全には伝達されない及び／又は維持されない場合に、産生される。結果として生じる穀粒は、母系のＤＮＡのみを含有する半数体の胚と正常な（受精した）三倍体の胚乳を有する。父系のＨＩ系、例えばＣＥＮＨ３ベースの又はｉｇ１ベースの系の場合、半数体は、卵が精細胞によって受精した後に産生され、母系の染色体は、細胞分裂の際に失われる。結果として生じる穀粒は、父系のＤＮＡのみを含有する半数体の胚と正常な（受精した）三倍体の胚乳を有する。使用されるＨＩ系に関係なく、結果として生じる表現型は、完全には浸透せず、半数体の胚を含有している胚珠もあれば、二倍体の胚、異数性の胚、キメラ胚、又は発育不全の胚を含有している胚珠もある。半数体誘導後、半数体の胚又は種子は、典型的に、表現型又は遺伝子マーカーによる選別を使用して二倍体及び異数性の同胞から分離され、成長させ又は培養して、半数体植物にする。これらの植物は、次いで、自然に又は化学的操作を介して（例えば、コルヒチンなどの微小管阻害剤を使用して）、倍加半数体（「ＤＨ」）植物に変換され、これは次いで近交系の種子を産生する。
ＤＨ植物の産生は、植物育種家が、多世代にわたって近親交配することなく近交系を得ることを可能にし、従って、ホモ接合植物を産生するために必要とされる時間を減少させる。ＤＨ植物は、特に、近交系の産出、量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）マッピング、細胞質遺伝子変換、形質遺伝子移入及びハイスループットな形質改善のためのＦ２スクリーニングのための、計り知れない価値のあるツールを植物育種家に提供する。ホモ接合系統が本質的に一世代で産出されるので、多くの時間が省かれ、多世代にわたる単粒系統法（従来の近親交配）の必要をなくす。特に、ＤＨ植物は全部がホモ接合であるので、ＤＨ植物は量的遺伝学研究に非常に適している。半数体の種子の産生は、倍加半数体育種プロセスにとって重要である。
植物形質転換は、特にトウモロコシにおいて、難しい。ほとんど植物系統は、本来、形質転換性ではなく、大多数は、形質転換性ではない。さらに、半数体誘導体系統（haploid inducer line）は、奇異な生殖性の特徴（例えば、生殖の間のＤＮＡの自己欠失）を有するので、育種が難しい。「ＨＩ－ＮＡ植物」と称される非常に形質転換性のトウモロコシ植物並びにそれらの産生及び使用の方法が、本明細書において提供される。ＨＩ－ＮＡ植物は、本明細書において開示されるように、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子における機能喪失型突然変異対立遺伝子についてホモ接合であり（これはまた、種々の刊行物において、ＭＡＴＲＩＬＩＮＥＡＬ［ＭＡＴＬ］、ＮＯＴ ＬＩＫＥ ＤＡＤ［ＮＬＤ］及びＰＨＯＳＰＨＯＬＩＰＡＳＥ Ａ１［ＰＬＡ１］とも称されており、トウモロコシＢ７３＿ｖ４遺伝子ＩＤ ＧＲＭＺＭ２Ｇ４７１２４０によって示される）、植物における半数体誘導の増強を担うＱＴＬ及び／又は遺伝子の１つ又は複数の対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。例えば、ＨＩ－ＮＡ植物は、機能喪失型ｍａｔｌ突然変異対立遺伝子についてホモ接合とすることができ且つｑｈｉｒ８ ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合とすることができる。さらに、ＨＩ－ＮＡ植物は、サイトタイプ正常Ａ（「ＮＡ」）のバックグラウンドを有し、これは、ＨＩ－ＮＡ植物を非常に形質転換性にする。本明細書において提供されるＨＩ－ＮＡ植物は、注目すべき半数体誘導能力を有するだけでなく（少なくとも１２％、少なくとも１５％又は少なくとも１８％の半数体誘導率を有する）、優れた形質転換性（少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％又は少なくとも１５％の形質転換率）も有する。ＨＩ－ＮＡ系統は、多様なヘテローシス群（下記に定義される）からの植物から産生することができる。
これらの非常に形質転換性のＨＩ－ＮＡ植物は、目的の植物系統のゲノムＤＮＡを編集して植物形質を改善するために、遺伝子編集機構により形質転換することができる。このような方法は、例えば米国特許第１０，２８５，３４８号明細書及び米国特許第１０，５１９，４５６号明細書において記載され、それぞれその全体が本明細書に参照によって組み込まれる。強力な半数体誘導体（haploid inducer）であるだけでなく、非常に形質転換性でもある易形質転換性のＨＩ－ＮＡ植物を提供することによって、本開示は、効率的に且つ費用効果的に作物ゲノムを編集し、所望の形質を有する植物系統を産生するための有用なツールを提供する。
一態様において、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子（ＭＡＴＬ）における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり且つ半数体誘導の増強と関連する少なくとも１つの量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＨＩ－ＱＴＬ）のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であるトウモロコシ植物であって、トウモロコシ植物は、正常Ａ（「ＮＡ」）サイトタイプを有する、トウモロコシ植物が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、少なくとも１つのＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子についてホモ接合である。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、形質転換頻度の増強と関連する少なくとも１つのＱＴＬ（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、ＤＮＡ修飾酵素及び任意に少なくとも１つのガイド核酸を発現することができる。
別の態様において、形質転換頻度の増強と関連する少なくとも１つの量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であるトウモロコシ植物が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、形質転換頻度の増強と関連する少なくとも１つのＱＴＬ（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子についてホモ接合である。
別の態様において、形質転換性の（transformable）半数体誘導体トウモロコシ植物（haploid inducer maize plant）を産生するための方法であって：ａ）第１のトウモロコシ植物からの花粉を提供すること、第１のトウモロコシ植物は、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子（ＭＡＴＬ）遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、第２の遺伝子座のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であり且つ形質転換抵抗性である半数体誘導体植物系統（haploid inducer plant line）である；ｂ）第２のトウモロコシ植物を提供すること、第２のトウモロコシ植物は、正常Ａ（「ＮＡ」）細胞質を含み、任意に、第２のトウモロコシ植物は、形質転換頻度の増強と関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である；ｃ）第１のトウモロコシ植物からの花粉により第２のトウモロコシ植物を受粉すること及びそれから少なくとも１つの二倍体の子孫植物を得ること；ｄ）少なくとも一世代の間、少なくとも１つの二倍体の子孫植物を自殖すること及び／又は少なくとも１つの二倍体の子孫植物を第１のトウモロコシ植物若しくは第２のトウモロコシ植物に戻し交配すること；並びにｅ）ステップｄの交配から子孫を選択すること、選択された子孫は、ＮＡサイトタイプを含み、ＭＡＴＬ遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、第２の遺伝子座のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であり且つ任意に、ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である、を含む方法が、本明細書において提供される。
別の態様において、形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物を産生するための方法であって：ａ）第１のトウモロコシ植物からの花粉を提供すること、第１のトウモロコシ植物は、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子（ＭＡＴＬ）遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、第２の遺伝子座のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であり且つ形質転換抵抗性である半数体誘導体植物系統である；ｂ）第２のトウモロコシ植物を提供すること、第２のトウモロコシ植物は、形質転換頻度の増強と関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である；ｃ）第１のトウモロコシ植物からの花粉により第２のトウモロコシ植物を受粉すること及びそれから少なくとも１つの二倍体の子孫植物を得ること；ｄ）少なくとも一世代の間、少なくとも１つの二倍体の子孫植物を自殖すること及び／又は少なくとも１つの二倍体の子孫植物を第１のトウモロコシ植物若しくは第２のトウモロコシ植物に戻し交配すること；並びにｅ）ステップｄの交配から子孫を選択すること、選択された子孫は、ＭＡＴＬ遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、第２の遺伝子座のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であり且つＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である、を含む方法が、本明細書において提供される。
別の態様において、形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物を産生するための方法であって：ａ）第１のトウモロコシ植物からの花粉を提供すること、第１のトウモロコシ植物は、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子（ＭＡＴＬ）遺伝子の野生型対立遺伝子についてホモ接合であり且つＤＵＦ６７９ドメイン膜タンパク質７（ＤＭＰ）遺伝子の野生型対立遺伝子についてホモ接合である；ｂ）第２のトウモロコシ植物を提供すること、第２のトウモロコシ植物は、正常Ａ（「ＮＡ」）細胞質を含み、任意に、第２のトウモロコシ植物は、形質転換頻度の増強と関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である；ｃ）第１のトウモロコシ植物からの花粉により第２のトウモロコシ植物を受粉すること及びそれから少なくとも１つの二倍体の子孫植物を得ること；ｄ）少なくとも一世代の間、少なくとも１つの二倍体の子孫植物を自殖すること及び／又は少なくとも１つの二倍体の子孫植物を第１のトウモロコシ植物若しくは第２のトウモロコシ植物に戻し交配すること；ｅ）ステップｄの交配から子孫を選択すること、選択された子孫は、ＮＡサイトタイプを含み且つ任意に、ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である；並びにｆ）野生型ＭＡＴＬ遺伝子及び／又はＤＭＰ遺伝子において機能喪失型突然変異を引き起こすために少なくとも１つの子孫植物を編集し、それによって、形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物を得ること、を含む方法が、本明細書において提供される。
別の態様において、植物ゲノムＤＮＡを編集するための方法であって：ａ）標的植物を提供すること、標的植物は、編集されることになる植物ゲノムＤＮＡを含む；ｂ）本明細書において記載されているトウモロコシ植物からの花粉により標的植物を受粉すること、トウモロコシ植物は、ＤＮＡ修飾酵素及び任意に少なくとも１つのガイド核酸を発現することができる；並びにｃ）ステップｃによって産生される少なくとも１つの半数体の子孫を選択すること、半数体の子孫は、標的植物のゲノムを含み且つトウモロコシ植物のゲノムを含まず、半数体の子孫のゲノムは、トウモロコシ植物によって送達されるＤＮＡ修飾酵素及び任意のガイド核酸によって修飾されている、を含む方法が、本明細書において提供される。
いくつかの実施形態において、上記の態様のいずれかのＨＩ－ＱＴＬは、第９染色体上のｑｈｉｒ８（ＨＩ－ＱＴＬ ｑｈｉｒ８）である。いくつかの実施形態において、上記の態様のいずれかのＨＩ－ＱＴＬ ｑｈｉｒ８のＨＩ対立遺伝子は、ＤＵＦ６７９ドメイン膜タンパク質７（ＤＭＰ）遺伝子における機能喪失型突然変異を含む。いくつかの実施形態において、上記の態様のいずれかのＴＦ－ＱＴＬは、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１（ＴＦ－ＱＴＬ ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１）である。
配列の簡単な説明
詳細な説明
Ｉ．専門用語
本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、下記に定義されない限り、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。本明細書において用いられる技術に対する言及は、当業者に明らかであろうそれらの技術の変形物及び／又は等価な技術の代用物を含め、当技術分野おいて一般的に理解される技術を指すことが意図される。以下の用語は、当業者に十分に理解されると考えられるが、以下の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために記載される。
Ｉ．専門用語
本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、下記に定義されない限り、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。本明細書において用いられる技術に対する言及は、当業者に明らかであろうそれらの技術の変形物及び／又は等価な技術の代用物を含め、当技術分野おいて一般的に理解される技術を指すことが意図される。以下の用語は、当業者に十分に理解されると考えられるが、以下の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために記載される。
本明細書において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって明示されない限り、複数形の指示物を含む。従って、例えば、「抗体」に対する言及は、２つ又はそれ以上のこのような分子の組み合わせ及びその他同種のものを任意に含む。
本明細書において使用される用語「約」は、当業者に直ちに知られる、それぞれの値についての通常の誤差範囲を指し、例えば、±２０％、±１０％又は±５％は、列挙される値の意図される意味の範囲内にある。
本明細書において使用されるように、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、オープンエンドである。主題の核酸（又はアミノ酸配列）に関連して使用される場合、それは、主題の配列を一部として又はその配列全体として含む核酸配列（又はアミノ酸配列）を指す。
用語「複数」は、１つを超える実体を指す。従って、「複数の個体」は、少なくとも２つの個体を指す。いくつかの実施形態において、複数という用語は、全体の半分超を指す。例えば、いくつかの実施形態において、「集団の複数」は、その集団の半分を超えるメンバーを指す。
「植物」は、発生の任意の段階の任意の植物、特に種子植物である。特に、本開示の文脈において、植物は、トウモロコシ植物を指す。
「植物細胞」は、プロトプラスト及び細胞壁を含む、植物の構造的及び生理的単位である。植物細胞は、単離された単細胞若しくは培養細胞の形態をしていてもよい又は例えば植物組織、植物器官、若しくは植物全体などの高度に組織化された単位の一部としてのものであってもよい。
「植物細胞培養物」は、例えばプロトプラスト、細胞培養物の細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、受精卵、及び種々の発生段階の胚などの植物単位の培養物を意味する。
「植物器官」は、根、茎、葉、花芽又は胚などの植物の別個の、目にみえて構造化され且つ分化した部分である。
本明細書において使用される「植物組織」は、構造的及び機能的単位に組織化された植物細胞の群を意味する。植物体における又は培養中の植物の任意の組織が含まれる。この用語は、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養物並びに構造的及び／又は機能的単位に組織化された植物細胞の任意の群を含むが、これらに限定されない。上記にリストされる又はそうでなければこの定義によって包含される任意の特定のタイプの植物組織と併せた又はそれがない場合のこの用語の使用は、任意の他のタイプの植物組織を除くことを意図するものではない。
用語「植物部」は、植物中の無傷の植物細胞、細胞塊及び植物を再生することができる組織培養物などの単細胞及び細胞組織を含む植物の一部を示す。植物部の例は、花粉、胚珠、受精卵、葉、胚、根、根端、葯、花、花部、果実、茎、芽、挿し木及び種子からの単細胞及び組織；並びに花粉、胚珠、卵細胞、受精卵、葉、胚、根、根端、葯、花、花部、果実、茎、芽、挿し木、接ぎ穂、台木、種子、プロトプラスト、カルス及びその他同種のものを含むが、これらに限定されない。
用語「品種」又は「栽培品種」は、構造的又は遺伝的特徴及び／又は性能によって、同じ種内の他の品種と区別することができる同様の植物の群を意味する。
用語「集団」は、共通の遺伝的起源を共有する植物の遺伝的に不均一な集合体を意味する。
用語「子孫」は、特定の交配の後代（複数可）を指す。典型的に、子孫は、２つの個体の育種から結果として生じるが、種の中には（特にいくつかの植物及び雌雄同体の動物）、自殖することができるものもある（すなわち、同じ植物が、雄性配偶子及び雌性配偶子の両方のドナーとして働く）。後代（複数可）は、例えば、Ｆ１、Ｆ２又は任意の後続の世代のものとすることができる。
用語「子」植物は、１つ又は複数の親植物又はその後代から栄養又は有性生殖により子孫として結果として生じる任意の植物を指す。例えば、子植物は、親植物のクローニング若しくは自殖によって又は２つの親植物を交配することによって得られてもよく、自殖したもの及びＦ１又はＦ２又はさらなる世代を含む。Ｆ１は、親から産生される第１世代の子であり、少なくとも１つは、形質のドナーとして初めて使用されるが、第２世代（Ｆ２）又は後続の世代（Ｆ３、Ｆ４など）の子は、Ｆ１、Ｆ２などの自殖から産生される試料である。Ｆ１は、従って、２つの純粋種（true breeding）の親の交配から結果として生じるハイブリッドであってもよいが（純粋種は、ある形質についてホモ接合である）、Ｆ２は、前記Ｆ１ハイブリッドの自家受粉から結果として生じる子であってもよい。
本開示に関連する句「有性交配される」及び「有性生殖」は、子孫を産生するための配偶子の融合を指す（例えば、植物において受粉によって種子を産生するためなどの、受精によって）。いくつかの実施形態において、「有性交配」又は「他家受精」は、ある個体の別の個体による受精である（例えば、植物における他家受粉）。いくつかの実施形態において、用語「自殖」は、自家受精又は自家受粉による種子の産生を指す；すなわち、花粉及び胚珠は、同じ植物からのものである。
「選択育種」は、親として望ましい形質を持つ又は表す植物を使用する育種のプログラムを指すために、本開示の範囲内で理解される。
植物育種に関連する用語「ハイブリッド」、「ハイブリッド植物」及び「ハイブリッド子孫」は、２つの近交系の間の交配を含むがこれに限定されない、異なる系統又は育成品種又は種の植物を交配することによって産生される遺伝的に似ていない親の子である植物を指す（例えば、遺伝的にヘテロ接合である又はほとんどヘテロ接合である個体）。句「単交配ＦＩハイブリッド」は、２つの近交系の間の交配から産生されるＦＩハイブリッドを指す。
句「近交系」は、遺伝的にホモ接合の又はほぼホモ接合の集団を指す。近交系は、例えば、数サイクルの兄妹育種又は自殖を通して誘導することができる。いくつかの実施形態において、近交系は、目的の１つ又は複数の表現型形質についての純種を育種する。「近交系」、「近交系の個体」又は「近交系の子孫」は、近交系からサンプリングされた個体である。用語「近交系」は、実質的にホモ接合の個体又は系統を意味する。近交系は、育種プログラムにおいて使用される場合、「親系統」と称されてもよい。
用語「戻し交配すること」は、ハイブリッド子孫が親のうちの１つと繰り返し交配し戻されるプロセスを指すために本開示の範囲内で理解される。
用語「遺伝子移入」、「遺伝子移入された」及び「遺伝子移入すること」は、ある種、品種又は栽培品種のゲノム領域がそれらの種を交配することによって別の種、品種又は栽培品種のゲノムに移される自然の及び人工のプロセスを指す。プロセスは、任意に、反復親と戻し交配することによって、完了させもよい。
本明細書において「半数体」と称される植物は、半数体植物において染色体の数（ｎ）が低減しており、その染色体のセットは、配偶子に等しい。半数体の生物において、染色体の正常数の半分しか存在しない。従って、二倍体（２ｎ）生物（例えばトウモロコシ）の半数体は、一倍性（１ｎ）を呈する；四倍体（４ｎ）生物（例えばドクムギ）の半数体は、二倍性（２ｎ）を呈する；六倍体（６ｎ）生物（例えばコムギ）の半数体は、三倍体性（３ｎ）を呈するなどである。本明細書において使用されるように、「倍加半数体」と称される植物は、一倍体の染色体のセットを二倍にすることによって発生させる。任意の世代数まで自殖される倍加半数体植物から得られる植物又は種子は、なお倍加半数体植物として特定されてもよい。倍加半数体植物は、ホモ接合植物とみなされる。植物の全栄養部が染色体の倍加されたセットを有する細胞からならない場合であっても、植物が稔性である場合、植物は、倍加半数体とみなされる；すなわち、植物が栄養組織においてキメラの場合であっても、植物が生存能力のある配偶子を含有する場合、植物は、倍加半数体とみなされる。
「組換え」は、新規なヌクレオチド配列の配置を産生するためのＤＮＡ鎖の交換である。この用語は、二本鎖ＤＮＡ断裂修復において生じる相同組換えのプロセスを指してもよく、ポリヌクレオチドは、相同なポリヌクレオチドを修復するための鋳型として使用される。この用語はまた、減数分裂の間の２つの相同染色体の間の情報の交換を指してもよい。二重組換えの頻度は、単一組換え体の頻度の積である。例えば、１０ｃＭのエリアにおける組換え体は、１０％の頻度で見つかり、二重組換え体は、１０％×１０％＝１％の頻度で見つかる（１センチモルガンは、検定交雑において１％の組換え体子孫と定義される）。
「テスター植物」は、検定される植物における形質を遺伝的に特徴付けるために使用される植物を指すよう、本開示の範囲内で理解される。典型的に、検定されることになる植物は、「テスター」植物と交配され、交配の子孫における形質の分離比が、記録される。
用語「テスター」は、標準遺伝子型、既知の特徴及び確立された性能を有する系統又は個体を指す。「テスター親」は、有性交配において親として使用されるテスター系統からの個体である。典型的に、テスター親は、テスター親が交配される個体とは無関係であり且つ遺伝的に異なる。テスターは、典型的に、表現型の評価のために個体又は近交系に交配される場合に、ＦＩ子孫を産出するために使用される。
用語「ヘテローシス群」及び「ヘテローシスプール」は、区別なく使用され、他の遺伝的に別個の生殖質群からの遺伝子型又は近交系と交配した場合に同様のヘテローシス応答を示す遺伝子型又は近交系の群を指す。ヘテローシス群の間で比較すると、遺伝的関係の度合いがより遠い系統に対して、遺伝的関係の度合いがより近い系統がヘテローシス群内に含有される。一般に、同じヘテローシス群内で互いに交配した２つの近交系のハイブリッドは、あるヘテローシス群からの近交系を異なるヘテローシス群からの近交系に交配したハイブリッドよりもずっとヘテローシスを示さない。特定のヘテローシス群は、多種多様な遺伝的性質を有する多数の系統を含むことができる。例示的なヘテローシス群及びそれぞれの個々のヘテローシス群内の専売生殖質系統を、表７に記載する。本開示において、ヘテローシス群全体の遺伝子型の総体は、ヘテローシス群の生殖質と称されてもよい。概して、ヘテローシスプールの主要な名前は、Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ（「ＳＳ」、Ｉｏｗａ Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ又は「ＢＳＳＳ」とも呼ばれる）、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ（「ＮＳＳ」）、Ｔｒｏｐｉｃａｌ及びＮｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｉｏｄｅｎｔ（「ＩＤＴ」）である。Ｊ．Ｈｗｅｅｒｗａａｒｄｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｍａｉｚｅ，ＰＲＯＣ．ＮＡＴ’Ｌ ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９（３１）：１２４２０－２５（２０１２）を参照されたい。しかしながら、これらは、排他的ではなく、他の名前、例えばＬａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｕｒｅ Ｃｒｏｐ（「ＬＳＣ」）が知られている。例えばＣ．Ｌｉｖｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ａｍｏｎｇ ｈｅｔｅｒｏｔｉｃ ｇｒｏｕｐｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ＲＦＬＰｓ，ＴＨＥＯＲ．ＡＰＰＬ．ＧＥＮＥＴ．８４：１７－２５（１９９２）を参照されたい。
用語「ヘテローシス」は、雑種強勢、すなわち、その親と比べた、ハイブリッドの子における任意の生物学的な特質（例えばサイズ、成長速度、捻性、収量など）の機能の改善又は増強を指す。例えば、異なるヘテローシス群からの近交系植物系統間の交配の子は、上記に記載されるように、その親系統よりもよりヘテローシスを表す可能性がある。このような交配の第１世代の子は、一般に、両親の所望の特徴を、より大いに示す。第１世代のハイブリッドを互いにかけ合わせる場合、このヘテローシスは後続の世代において減少するかもしれない。
用語「結実」は、胚（すなわち穀粒又は種子）を産生するトウモロコシ雌穂の部分の尺度を指す。結実は、質的に（例えば低い、良い、若しくは高い）又は量的に表現されてもよい。量的測定において、測定値は、雌穂当たりの種子のパーセンテージ又は数として与えられてもよい。用語は、一般に、正常な穀粒（すなわち発育不全ではない、胚乳に生存能力のある穀粒）のパーセンテージ又は数を指す。普通のトウモロコシ系統（すなわち半数体誘導体系統ではない）については、８０％を上回る結実（又は雌穂当たり３００を上回る穀粒）は、良い結実とみなされる。半数体誘導体系統については、結実は、より低くなる傾向があるので、５０％を上回る（例えば６０％を上回る、７０％を上回る若しくは８０％を上回る）結実又は雌穂当たり１８０を上回る穀粒（例えば２００を上回る、２２０を上回る、２６０を上回る若しくは２８０を上回る）は、一般に、高い結実とみなされる。
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、区別なく使用され、本明細書において使用されるように、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ及び合成形態のセンス及びアンチセンス鎖の両方並びに上記の混合ポリマーを指す。特定の実施形態において、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾形態及びその組み合わせを指す。用語はまた、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの単鎖及び二重鎖の形態を含むが、これらに限定されない。加えて、本明細書において開示されるポリヌクレオチド、例えば、環状ＤＮＡ鋳型、本明細書において開示される核酸コンカテマーは、自然に生じる及び／又は自然に生じないヌクレオチド連結によって互いに連結された自然に生じる及び修飾されたヌクレオチドのいずれか又は両方を含んでいてもよい。核酸分子は、当業者らによって直ちに理解されるように、化学的に若しくは生化学的に修飾されてもよい又は非自然の若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。このような修飾は、例えばラベル、メチル化、類似体による自然に生じるヌクレオチドの１つ又は複数の置換、無電荷連結（例えばメチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸及びその他同種のもの）、電荷連結（例えばホスホロチオエート、ジチオリン酸及びその他同種のもの）、ペンダント成分（例えばポリペプチド）、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレン及びその他同種のもの）、キレート剤、アルキル化剤並びに修飾された連結（例えばアルファアノマー核酸及びその他同種のもの）などのヌクレオチド間の修飾を含む。上記の用語はまた、単鎖、二重鎖、部分的に二重の、三重の、ヘアピン型（hairpinned）、環状及び南京錠型（padlocked）コンフォメーションを含む、任意の形態のコンフォメーションを含むことも意図される。核酸配列に対する言及は、特記しない限り、その相補体を包含する。従って、特定の配列を有する核酸分子に対する言及は、その相補配列と共にその相補鎖を包含することが理解されなければならない。ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が溶液中で特異的にハイブリダイズする場合、「相補的である」（例えばワトソン－クリック型塩基対形成のルールに従って）。用語はまた、同じポリペプチド配列をコードするコドン最適化された核酸も含む。核酸は、未精製、精製又は例えばビーズ若しくはカラムマトリックスなどの合成材料に付加することができることもまた、理解される。
核酸配列に関連する用語「に相当する」は、ある特定の配列の核酸配列がお互いにアラインメントされる場合に、本発明におけるある特定の数えた位置に「相当する」核酸が、参照配列におけるこれらの位置とアラインメントするが、本発明の特定の核酸配列に関して必ずしもこれらの正確な数で示される位置にあるというわけではない核酸であることを意味する。比較のための配列の最適なアラインメントは、既知のアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって又は視覚的検査によって行うことができる。直ちに入手可能な配列比較及び多重配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれ、インターネットで入手可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）及びＣｌｕｓｔａｌＷ／ＣｌｕｓｔａｌＷ２／Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａプログラムである（例えば、ＥＭＢＬ－ＥＢＩのウェブサイト）。他の適したプログラムは、ＧＡＰ、ＢｅｓｔＦｉｔ、Ｐｌｏｔ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ及びＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されず、これらは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．ｏｆ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａから入手可能なＡｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅの一部である。Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８；及びＳａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１もまた参照されたい。
用語「遺伝子」は、染色体上の特定の位置を占め且つ生物における特定の特徴又は形質についての遺伝的命令を含有するＤＮＡの配列を含む遺伝単位を指す。
用語「量的形質遺伝子座」又は「ＱＴＬ」は、特定の表現型形質、すなわち、数値的に測定することができ且つ程度において変動する表現型と関連するＤＮＡの領域を指し、これは、多遺伝子性の影響、すなわち、２つ又はそれ以上の遺伝子の産物及びそれらの環境によるものとすることができる。典型的に、ＱＴＬは、質的な（すなわち不連続的な）形質とは対照的に、連続形質（連続的に変動する形質、例えば半数体誘導率）の根拠をなす。
用語「対立遺伝子（複数可）」は、遺伝子の１つ又は複数の代替の形態のいずれかを意味し、対立遺伝子はすべて、少なくとも１つの形質又は特徴に関する。二倍体細胞において、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の相当する遺伝子座を占める。いくつかの例において（例えばＱＴＬについて）、「対立遺伝子」の代わりに、「ハプロタイプ」（すなわち、染色体セグメントの対立遺伝子）を指すのがより正確であるが、それらの例において、用語「対立遺伝子」は、用語「ハプロタイプ」を含むことが理解されるべきである。２つの個体（例えば２つの植物）が特定の遺伝子座で同じ対立遺伝子を持っている場合、対立遺伝子が１つ共通祖先から遺伝によって受け継がれていれば（すなわち、対立遺伝子が同じ親対立遺伝子のコピーであれば）、対立遺伝子は「同祖」と言われる。そうでなければ、対立遺伝子は、「同質（identical by state）」である（すなわち、対立遺伝子は、同一であるように見えるが、対立遺伝子の２つの異なるコピーに由来する）。同祖情報は、連鎖解析にとって有用である；同祖情報も同質情報も、関連解析において使用することができるが、同祖情報は特に有用となり得る。
用語「ハプロタイプ」は、個体が片親から遺伝によって受け継いだ対立遺伝子のセットを指すことができる。二倍体の個体は、従って、２つのハプロタイプを有する。用語「ハプロタイプ」は、表現型形質と関連する、物理的に連鎖した及び／又は連鎖していない遺伝子マーカー（例えば配列多型）を指すために、より限られた意味で使用することができる。句「ハプロタイプブロック」（時に、文献において、単にハプロタイプと称される）は、単一の染色体（又はその一部分）上で物理的に連鎖している２つ又はそれ以上の遺伝子マーカーの群を指す。典型的に、それぞれのブロックは、少数の共通のハプロタイプを有し、これらのハプロタイプのそれぞれをただ一つのものとして特定する遺伝子マーカーのサブセット（すなわち「ハプロタイプタグ」）を、選ぶことができる。
用語「遺伝子型」及びその変異体は、生物の遺伝的組成を指し、例えば、二倍体生物が、１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子座について、ヘテロ接合である（すなわち、所与の遺伝子又はＱＴＬについて２つの異なる対立遺伝子を有する）かホモ接合である（すなわち、所与の遺伝子又はＱＴＬについて同じ対立遺伝子を有する）かどうかを含む（例えばＳＮＰ、ハプロタイプ、遺伝子突然変異、挿入又は欠失）。本明細書において使用されるように、特定の対立遺伝子について「少なくともヘテロ接合である」という用語は、対立遺伝子の少なくとも１つのコピーが存在することを示す。例えば、遺伝子のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であるトウモロコシ植物は、ＨＩ対立遺伝子の１つ又は２つのコピーを有する（すなわち、ヘテロ接合である又はホモ接合である）。
「表現型」は、遺伝的にコントロールされた形質の区別可能な特徴（複数可）を指すために、本開示の範囲内で理解される。句「表現型形質」は、環境とそのゲノムの相互作用から結果として生じる、個体の外観又は他の検出可能な特徴を指す。
句「質的形質」は、２つ又はそれ以上の文字値を有するカテゴリーとして記載することができる大きな表現型の影響を呈する１つ又は少数の遺伝子によってコントロールされる表現型形質を指す。このため、質的形質は、典型的に、単純に、遺伝によって受け継がれる。植物における例は、花の色、穂軸の色及び例えばトウモロコシ煤斑病耐性などの耐病性を含むが、これらに限定されない。
用語「多型」及びその変異体は、集団における２つ又はそれ以上の遺伝的に決定された代替の配列又は対立遺伝子の存在を指す。「多型部位」は、多様化が生じる遺伝子座を指す。好ましい多型部位は、少なくとも２つの対立遺伝子を有し、それぞれが集団において特定の頻度で生じる。多型遺伝子座は、１つの塩基対ほどの小さなものであってもよい。多型の対立遺伝子のうちの１つは、参照対立遺伝子と恣意的に指定され、他の対立遺伝子は、代替の対立遺伝子、「変異対立遺伝子」又は「相違体（variance）」と指定される。選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子は、時に、「野生型」対立遺伝子と称することができる。二倍体生物は、変異対立遺伝子についてホモ接合であっても、ヘテロ接合であってもよい。変異対立遺伝子は、変異対立遺伝子を所持している個体において、観察可能な物理的又は生化学的特徴（表現型）を産生しても、産生しなくてもよい。例えば、変異対立遺伝子は、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性を改変してもよい又は代わりに、変異対立遺伝子は、コードされたタンパク質の酵素活性に対する効果を有していなくてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「マーカー」、「多型マーカー」又は「遺伝子マーカー」は、対立遺伝子の存在又は不在を示す既知の染色体遺伝子座を有する遺伝子又はＤＮＡ配列を指す。マーカーは、遺伝子内にあってもよく又は遺伝子に連鎖していてもよく、それは、遺伝子型を同定するために使用される。マーカーは、ゲノムヌクレオチド配列に又はそのコードされた産物に由来することができる（例えばｍＲＮＡ転写物、非コーディングＲＮＡ転写物又はタンパク質）。用語はまた、マーカー配列を増幅することができるプローブ及び／又はプライマーとして使用されるヌクレオチド配列などの、マーカー配列に対して相補的な又は側面に位置するヌクレオチド配列も指す。用語はまた、多型に対して相補的な又は側面に位置するヌクレオチド配列の不在を指すこともできる。マーカーは、一塩基変異多型（ＳＮＰ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、わずかな挿入又は欠失（インデル）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、タンデムリピート数（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、単純配列反復及びトランスポゾンなどの挿入因子を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
用語「機能喪失型突然変異」は、野生型遺伝子の分子機能を欠く突然変異した遺伝子産物をもたらす、遺伝子のＤＮＡ配列における変化（すなわち「突然変異」）である。機能喪失型突然変異に至り得る４つの主な遺伝子変異がある：１）切断型タンパク質配列を産生する中途終止コドンをもたらす突然変異；２）スプライシングに影響を及ぼすカノニカルスプライス部位で生じる突然変異（ｍＲＮＡ転写物におけるイントロンの組み入れ又はエキソンの排除をもたらす）；３）全長の転写を中断させることによってフレームシフトを引き起こす、遺伝子コーディング領域中に位置する、３の非整数倍の挿入又は欠失変異体；及び４）開始コドン（転写開始コドン、例えばＡＴＧ）の喪失をもたらす突然変異、これは、代替の開始コドンが突然変異の近くにない場合、遺伝子転写を妨げる。加えて、遺伝子のプロモーター又は非翻訳領域（ＵＴＲ）における突然変異は、遺伝子発現を低減させ又は消失させ、機能喪失に至り得る。
用語「マーカーベースの選択」は、植物から１つ又は複数の核酸を検出するための遺伝子マーカーの使用を指すために、本開示の範囲内で理解され、核酸は、望ましい（又は望ましくない）形質の遺伝子を所持する植物を特定するために所望の形質と関連しており、それらの植物は、任意の目的のために、例えば形質転換プログラムにおいて又は選択育種プログラムにおいて、使用する（又は避ける）ことができる。本明細書において使用されるように、正常Ａ細胞質を示すマーカーは、正常Ｂ細胞質を有する非ＣＭＳ植物と正常Ｂ細胞質を有していない、すなわち正常Ａ細胞質を有する非ＣＭＳ植物とを区別する。マーカーは、ゲノムの遺伝子座内の突然変異であってもよい（例えば一塩基変異多型（ＳＮＰ）又は１つの対立遺伝子内の突然変異）。
用語「マーカープローブ」及び「プローブ」は、本明細書において使用されるように、より大きな配列内の配列（例えば、本明細書において開示されるマーカー）の存在又は不在を検出するために使用することができるヌクレオチド配列又は核酸分子を指す。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、マーカー又はマーカー遺伝子座のすべて又は一部分に対して相補的であり、例えば核酸ハイブリダイゼーションを通してマーカーの存在又は不在を検出することができる。マーカープローブの長さは、変動してもよい。いくつかの実施形態において、マーカープローブは、８～２００のヌクレオチド、例えば１０～１００の間のヌクレオチド又は１５～６０の間のヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態において、約８、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又はそれ以上の連続ヌクレオチドのプローブは、マーカーに対して相補的であり、核酸ハイブリダイゼーションのために使用することができる。
本明細書において使用されるように、用語「プライマー」は、核酸標的にアニールする（いくつかの実施形態において、核酸標的に特異的にアニールする）ことが可能であり、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素がそれに付加するのを可能にし、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合に（例えば、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための薬剤の存在下において且つ適した温度及びｐＨで）、ＤＮＡ合成の開始点として果たすオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、１つ又はそれ以上の複数のプライマーは、植物核酸を増幅するために使用される（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応；ＰＣＲを使用して）。
用語「と関連する」は、本明細書において使用されるように、２つの実体の認識可能な及び／又はアッセイ可能な関係を指す。例えば、句「半数体誘導（ＨＩ）と関連する」は、形質、遺伝子座、遺伝子、対立遺伝子、マーカー、表現型など又はその発現産物を指し、その存在又は不在は、植物又はその子孫がＨＩを呈する限度及び／又は程度に影響し得る又は示し得る。このように、マーカーが形質と連鎖している場合及びマーカーの存在が、所望の形質又は形質の形態がマーカーを含む植物／生殖質において生じるかどうか及び／又はどういった限度まで生じるのかについての指標となる場合、マーカーは、形質「と関連している」。同様に、マーカーが対立遺伝子と連鎖している場合及びマーカーの存在（又は不在）が、対立遺伝子がマーカーを含む植物、生殖質又は集団において存在するか（又は不在であるか）どうかについての指標となる場合、マーカーは、対立遺伝子と「関連している」。例えば、「ＨＩと関連するマーカー」は、その存在又は不在を、植物がＨＩを表すかどうか及び／又はどういった限度まで表すのかを予測するために使用することができるマーカーを指す。
本明細書において使用されるように、用語「植物材料」は、トウモロコシの単一の雌穂又は雌穂のセット又はそれから成長した植物から起こる種子、胚又は他の再生組織を指す。
本明細書において使用されるように、用語「植物系統」は、単一の植物材料又は材料の遺伝的に同一のセットを指す。
用語「生殖質」は、集団又は個体の他の群（例えば種又は植物系統）の遺伝子型の総体を指す。句「適応生殖質」は、例えば所与の環境又は地理的エリアについて、遺伝的優位性が証明された植物材料を指すが、句「非適応生殖質」、「ありのままの生殖質」及び「外来生殖質」は、例えば所与の環境又は地理的エリアについて、遺伝的価値が未知の又は証明されていない植物材料を指す；このように、句「非適応生殖質」は、いくつかの実施形態において、確立された育種集団の一部ではない且つ確立された育種集団のメンバーと既知の関係がない植物材料を指す。
用語「サイトタイプ」は、植物系統と関連するミトコンドリア及び葉縁体の遺伝的寄与を含む細胞質の分類を指す。現在知られているサイトタイプは、正常Ａ（「ＮＡ」）及び正常Ｂ（「ＮＢ」）細胞質を含むが、細胞質雄性不稔サイトタイプもまた含む：細胞質雄性不稔Ｃ（「Ｃ」又は「ＣＭＳ－Ｃ」）細胞質、細胞質雄性不稔Ｓ（「Ｓ」又は「ＣＭＳ－Ｓ」）細胞質及び細胞質雄性不稔Ｔ（「Ｔ」又は「ＣＭＳ－Ｔ」）細胞質。サイトタイプ及び細胞質という用語は、区別なく使用される。
「形質転換性の」、「形質転換性」及びその他同種のものは、外来性ＤＮＡをより直ちに受け入れ、外来性ＤＮＡをそのゲノムに安定して組み込むことができる植物、植物の系統又は植物細胞（カルス組織若しくはプロトプラストなど）を指す。
「形質転換頻度」、「ＴＦ」、「形質転換効率」及び「形質転換率」は、形質転換を試みた植物（例えば胚）の合計の数で割った形質転換に成功した植物の数の尺度を意味する。この尺度は、例えばパーセンテージ、ありのままの数として量的に又は質的に、例えば「低い」若しくは「高い」と表現されてもよい。
用語「ＴＦ対立遺伝子」は、植物（例えばトウモロコシ植物）におけるその存在が、同じ遺伝子又は遺伝子座の代替の対立遺伝子と比較して、ＴＦの増強と関連する遺伝子又は遺伝子座の対立遺伝子を指す。場合によっては、ＴＦ対立遺伝子は、遺伝子、ＱＴＬ、又はＱＴＬにおける遺伝子座の対立遺伝子である。
用語「ＴＦ－ＱＴＬ」は、形質転換頻度（ＴＦ）の増強と関連するＱＴＬを指す。ＴＦ－ＱＴＬでのＴＦ対立遺伝子の存在は、非ＴＦ対立遺伝子がＴＦ－ＱＴＬに存在する場合と比較して、ＴＦの増強をもたらす。
本明細書において使用されるように、「抵抗性」は、形質転換性ではない又は本質的に形質転換性ではない植物系統を指す。言い換えれば、その形質転換効率は、０％又は本質的に０％である。抵抗性という用語は、「非形質転換性」と同義であり、これらの用語は区別なく使用される。
用語「半数体誘導率」又は「ＨＩＲ」は、雌穂を半数体誘導体花粉により受粉した後の穀粒の総数によって割った生き残っている半数体穀粒の数を指す。
用語「ＨＩ対立遺伝子」は、植物（例えばトウモロコシ植物）におけるその存在が、同じ遺伝子又は遺伝子座の代替の対立遺伝子と比較して、ＨＩの増強と関連する遺伝子又は遺伝子座の対立遺伝子を指す。場合によっては、ＨＩ対立遺伝子は、遺伝子、ＱＴＬ、又はＱＴＬにおける遺伝子座の対立遺伝子である。
用語「ＨＩ－ＱＴＬ」は、半数体誘導（ＨＩ）と関連するＱＴＬを指す。ＨＩ－ＱＴＬでのＨＩ対立遺伝子の存在は、非ＨＩ対立遺伝子がＨＩ－ＱＴＬに存在する場合と比較して、半数体誘導率（ＨＩＲ）の増強をもたらす。例示的なＨＩ－ＱＴＬは、Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおける３，４４４，４２２位～１１，３６０，０９０位の間の第９染色体上に位置するｑｈｉｒ８である。
ＩＩ．ＨＩ－ＮＡトウモロコシ植物
一態様において、少なくとも２つの特徴を持つトウモロコシ植物が、本明細書において提供される：１）半数体誘導を効率的に誘導する能力；及び２）高レベルの形質転換性。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α（ＭＡＴＬ）遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、少なくとも１つのＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、ＨＩ－ＱＴＬは、ｑｈｉｒ８とすることができる（Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおいて３，４４４，４２２位と１１，３６０，０９０位との間の第９染色体上に位置する）。本明細書において提供されるトウモロコシ植物はまた、正常Ａ（「ＮＡ」）サイトタイプを有し、これは、いくつかの実施形態において、形質転換性の増強に寄与する。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、形質転換性の増強と関連する少なくとも１つの遺伝子又はＱＴＬのＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物はまた、高い花粉量及び／又は雄穂重量も呈する。
一態様において、少なくとも２つの特徴を持つトウモロコシ植物が、本明細書において提供される：１）半数体誘導を効率的に誘導する能力；及び２）高レベルの形質転換性。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α（ＭＡＴＬ）遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、少なくとも１つのＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、ＨＩ－ＱＴＬは、ｑｈｉｒ８とすることができる（Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおいて３，４４４，４２２位と１１，３６０，０９０位との間の第９染色体上に位置する）。本明細書において提供されるトウモロコシ植物はまた、正常Ａ（「ＮＡ」）サイトタイプを有し、これは、いくつかの実施形態において、形質転換性の増強に寄与する。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、形質転換性の増強と関連する少なくとも１つの遺伝子又はＱＴＬのＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物はまた、高い花粉量及び／又は雄穂重量も呈する。
Ａ．半数体誘導
一般的に、半数体誘導育種の間、誘導交配において使用される両方の親系統は二倍体であるので、それらの配偶子（すなわち卵細胞及び精細胞）は半数体である。半数体誘導は、誘導体系統の形質の浸透度が中程度～低いことが頻繁であるので、結果として生じる子孫は、種又は状況に依存して、二倍体であっても（ゲノム消失が起こらない場合）、半数体であっても（ゲノム消失が生じる場合）よい。そのため、本明細書において使用されるように、「半数体」は、いずれかの親の染色体の数の半分を持ち、従って、二倍体生物（例えばトウモロコシ）の半数体は、一倍性を呈し、四倍体生物（例えばドクムギ）の半数体は、二倍性を呈し、六倍性生物（例えばコムギ）の半数体は、三倍性を呈するなどである。
一般的に、半数体誘導育種の間、誘導交配において使用される両方の親系統は二倍体であるので、それらの配偶子（すなわち卵細胞及び精細胞）は半数体である。半数体誘導は、誘導体系統の形質の浸透度が中程度～低いことが頻繁であるので、結果として生じる子孫は、種又は状況に依存して、二倍体であっても（ゲノム消失が起こらない場合）、半数体であっても（ゲノム消失が生じる場合）よい。そのため、本明細書において使用されるように、「半数体」は、いずれかの親の染色体の数の半分を持ち、従って、二倍体生物（例えばトウモロコシ）の半数体は、一倍性を呈し、四倍体生物（例えばドクムギ）の半数体は、二倍性を呈し、六倍性生物（例えばコムギ）の半数体は、三倍性を呈するなどである。
いくつかの実施形態において、半数体誘導は、半数体誘導体雄性系統を別の系統に交配することによって実現され、これは、半数体誘導体系統からの染色体のセットの喪失の誘導及び半数体の胚の産生（すなわち、効率的な半数体誘導）をもたらす。半数体誘導効率は、半数体誘導率（「ＨＩＲ」）として示すことができ、これは、半数体誘導体系統と別の系統との間の交配からの半数体である子孫胚の合計のパーセンテージである。ＨＩＲを決定するための例示的な方法は、第ＩＩ．Ｂ節において及び本開示の実施例においても記載される。本明細書において記載されるように、数個のゲノム遺伝子座の変異ＨＩ対立遺伝子は、効率的な半数体誘導を促進することができる（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１２％又は少なくとも１５％のＨＩＲ）。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子は、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子（ＰＬＰＡ２α、第１染色体上のトウモロコシＢ７３遺伝子ＩＤ ＧＲＭＺＭ２Ｇ４７１２４０［この遺伝子ＩＤはＢ７３＿ｖ４ゲノムからのものである］別称Ｚｍ００００１ｄ０２９４１２［Ｂ７３＿ｖ５］、別称ＭＡＴＲＩＬＩＮＥＡＬ［ＭＡＴＬ］、ＮＯＴ ＬＩＫＥ ＤＡＤ１［ＮＬＤ１］及びＰＨＯＳＰＨＯＬＩＰＡＳＥ Ａ１［ＰＬＡ１］）の対立遺伝子である。さらに、本明細書において記載されるように、種々のＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子もまた、半数体誘導を促進することができる。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子は、第９染色体上のｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるトウモロコシ植物は、ＭＡＴＬ遺伝子にＨＩ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子は、ＭＡＴＬにおける機能喪失型突然変異体（一般にｍａｔｌと称される）である。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子は、ＭＡＴＬコーディング配列において４塩基対挿入フレームシフト突然変異を含む。いくつかの実施形態において、４塩基対挿入は、配列番号１２５の１１４６～１１４９位の４つのヌクレオチドに相当する。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子は、異なる突然変異（すなわち、４塩基対挿入突然変異以外）又はＭＡＴＬによってコードされるタンパク質産物において機能喪失をもたらす異なる突然変異を含む。ＭＡＴＬにおける機能喪失型突然変異を特定することができる任意のアッセイは、本明細書において記載される植物を特定するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アッセイは、下記の第ＩＩ．Ｅ節において記載される遺伝子型同定方法の１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＭＡＴＬにおける機能喪失型突然変異を特定するためのアッセイは、遺伝子の野生型ｃＤＮＡ配列（配列番号１２４）に基づいて開発されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＭＡＴＬにおける機能喪失型突然変異を特定するためのアッセイは、マーカーＳＭ７２４６、ＳＭ７２５２、アッセイ２８２６及びアッセイ２８２７の１つ又は複数で個体の遺伝子型を同定することを含む。いくつかの実施形態において、これらのマーカーの遺伝子型は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイを使用して（例えば、本明細書における第ＩＩ．Ｅ節において又は実施例１において詳述される方法に従って）検出されてもよい。表１は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ遺伝子型同定アッセイにおいて使用することができるプライマー及びプローブの例と一緒に、いくつかの実施形態による、これらのマーカーのそれぞれで予想される遺伝子型及び配列構成をリストする。マーカーＳＭ７２４６及びＳＭ７２５２について表１において記載されるＴａｑＭａｎアッセイは、それぞれ、リストされた遺伝子型を区別することができる、異なる蛍光体を有する２本のプローブを含む。アッセイ２８２６及びアッセイ２８２７について表１において記載されるＴａｑＭａｎアッセイは、それぞれ、ＭＡＴＬゲノム遺伝子座の一部分及び比較のためのコントロールの増幅及び蛍光プローブベースの検出を含む。いくつかの実施形態において、アッセイ２８２６におけるＭＡＴＬ特異的プローブは、野生型ＭＡＴＬ配列を検出する（すなわち、突然変異配列は検出されない）。いくつかの実施形態において、アッセイ２８２７におけるｍａｔｌ特異的プローブは、４ｂｐ挿入を有する機能喪失型突然変異ｍａｔｌ配列を検出する（すなわち、野生型配列は検出されない）。
いくつかの実施形態において、ＭＡＴＬにおける機能喪失型突然変異を特定するためのアッセイは、表現型アッセイであってもよい。例えば、突然変異したＭＡＴＬ配列によってコードされるタンパク質のレベルは、当業者らに知られている多様な方法のいずれかによって検出されてもよい（例えばウエスタンブロット、免疫蛍光法、質量分析法など）。いくつかの実施形態において、機能的アッセイは、突然変異ＭＡＴＬ配列によってコードされるタンパク質がその通常の機能を実行することができるかどうかを決定するために使用されてもよい。例えば、推定ＭＡＴＬ突然変異を含む植物は、ＭＡＴＬによってコードされるタンパク質の正常機能に関する形質を判断するために、テスター植物に交配されてもよい（例えば、下記の実施例において詳述されるように、結実又は半数体誘導率）。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるトウモロコシ植物は、半数体誘導の増強と関連する少なくとも１つの量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）対立遺伝子（ＨＩ－ＱＴＬ）にＨＩ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、少なくとも１つのＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（例えば、ヘテロ接合又はホモ接合）である。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、少なくとも１つのＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子についてホモ接合である。いくつかの実施形態において、ＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子についてホモ接合であるトウモロコシ植物は、ＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子についてヘテロ接合であるトウモロコシ植物と比べて、より効率的な半数体誘導を表す。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、第９染色体上のｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬにＨＩ対立遺伝子を含む。ＱＴＬを特定する又はその遺伝子型を同定することができる任意のアッセイは、本明細書において記載されるようにｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬにＨＩ対立遺伝子を含む植物を特定するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子を特定するためのアッセイは、下記の第ＩＩ．Ｅ節において記載される遺伝子型同定方法の１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子を特定するためのアッセイは、既知のｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬマーカーのいずれかに基づいて開発されてもよい。いくつかの実施形態において、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子を特定するためのアッセイは、半数体誘導の増強と関連する遺伝子座の野生型配列とその遺伝子座の変異対立遺伝子の配列との間の任意の違いに基づいて開発されてもよい。
いくつかの実施形態において、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子を特定するためのアッセイは、マーカーＳＭ４８４９、ＳＭ８０４７、ＳＭ８１３３、ＳＭ８０２９、ＳＭ４２５７及びＳＭ０９５６ＢＱの１つ又は複数で個体の遺伝子型を同定することを含む。いくつかの実施形態において、これらのマーカーの遺伝子型は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して（例えば、本明細書における第Ｅ節において又は実施例１において詳述される方法に従って）検出されてもよい。表２は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ遺伝子型同定アッセイにおいて使用することができるプライマー及びプローブの例と一緒に、いくつかの実施形態による、これらのマーカーのそれぞれで予想される遺伝子型及び配列構成をリストする。
いくつかの実施形態において、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子は、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬ内に位置するＤＵＦ６７９ドメイン膜タンパク質７（ＤＭＰ）遺伝子（Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおけるＺｍ００００１ｄ０４４８２２）に変異対立遺伝子を含む。例えばＺｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１９，「Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＺｍＤＭＰ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｈａｐｌｏｉｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｉｚｅ」Ｎａｔｕｒｅ Ｐｌａｎｔｓ ５：５７５－５８０を参照されたい。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、ＤＭＰ遺伝子のＨＩ変異対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（例えば、ヘテロ接合又はホモ接合）である。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子は、ＤＭＰにおける機能喪失型突然変異体である。ＤＭＰにおける機能喪失型突然変異を特定することができる任意のアッセイは、本明細書において記載される植物を特定するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アッセイは、下記の第Ｅ節において記載される遺伝子型同定方法の１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＤＭＰにおける機能喪失型突然変異を特定するためのアッセイは、遺伝子の野生型配列（配列番号１２６）に基づいて開発されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＤＭＰにおける機能喪失型突然変異を特定するためのアッセイは、表現型アッセイであってもよい。例えば、ＤＭＰによってコードされるタンパク質のレベルは、当業者らに知られている多様な方法のいずれかによって検出されてもよい（例えばウエスタンブロット、免疫蛍光法、質量分析法など）。いくつかの実施形態において、機能的アッセイは、ＤＭＰによってコードされるタンパク質がその通常の機能を実行することができるかどうかを決定するために使用されてもよい。例えば、推定ＤＭＰ突然変異を含む植物は、ＤＭＰによってコードされるタンパク質の正常機能に関する形質を判断するために、テスター植物に交配されてもよい（例えば、下記の実施例において詳述されるように、結実又は半数体誘導率）。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるトウモロコシ植物は、目的の子（例えば、半数体になった子の穀粒）のスクリーニング及び選択を容易にするために、少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。本明細書において使用されるように、選択可能マーカーという用語は、スクリーニング又はレポーターマーカー（例えば、目的の子を視覚的にスクリーニングするために使用することができる色指標）及び選択マーカー（例えば、目的の子の抗生物質介在性の濃縮のために使用することができる抗生物質耐性遺伝子）を包含する。いくつかの実施形態において、植物は、選択可能マーカー遺伝子を含む。選択可能マーカー遺伝子は、例えば、内在性遺伝子の突然変異体又は導入遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態において、選択可能マーカー遺伝子は、検出可能なタンパク質産物をコードする。いくつかの実施形態において、植物は、選択可能マーカーについてヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、植物は、選択可能マーカーについてホモ接合である。いくつかの実施形態において、選択可能マーカー遺伝子は、下記に及び実施例において詳述されるように、二倍体の胚においてのみ存在し、半数体の胚の選択を容易にする色素又は他の検出可能な産物をコードする。いくつかの実施形態において、選択可能マーカーは、ＧＵＳ、ＰＭＩ、ＰＡＴ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、Ｂ１、ＣＩ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＣＣ３、ＡＡＤＡ、高油分（例えばＭｅｌｃｈｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：２１２９及びＣｈａｉｋａｍ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｔｈｅｏｒ．ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３２：３２２７－３２４３を参照されたい）、Ｒ－ｎａｖａｊｏ（Ｒ－ｎｊ）、Ｒ１－ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ（Ｒ１－ＳＣＭ２）及び／又はアントシアニン色素のいずれか１つを含んでいてもよい。他の選択可能マーカー遺伝子は、当業者に知られている（例えばＺｉｅｍｉｅｎｏｗｉｃｚ．２００１．Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２３：３６３－３７４を参照されたい）。いくつかの実施形態において、選択可能マーカーは、抗生物質耐性遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、選択可能マーカーは、第１０染色体上のＲ１遺伝子座にＲ－ｎａｖａｊｏ（「Ｒ－ｎｊ」）又はＲ１－ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ（「Ｒ１－ＳＣＭ２」）変異対立遺伝子を含む（Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおける約１３９Ｍｂ～約１４０Ｍｂの位置のあたり）。これらの対立遺伝子は、種子の胚及び胚乳の両方において紫色又は赤色を発現する優性アントシアニン形質を与える。Ｒ－ｎｊ対立遺伝子は、糊粉層（胚乳の最も外側の層）における非常に強力なアントシアニン発現及び胚における弱い発現と関連する。Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子は、胚の胚盤における強力なアントシアニン発現及び糊粉層における弱い発現と関連する。これらの優性に発現される対立遺伝子を含む半数体誘導体系統と別の系統との間の交配から結果として生じる二倍体の胚は、紫色又は赤色を表す。半数体誘導体系統の親の染色体のセットを失った胚は、色を表さない。
野生型Ｒ１遺伝子座と変異対立遺伝子Ｒ－ｎｊ及び／又はＲ１－ＳＣＭ２とを区別することができる任意のアッセイは、本明細書において記載される植物を特定するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アッセイは、下記の第Ｅ節において記載される遺伝子型同定方法の１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、アッセイは、遺伝子座の野生型配列並びに／又は変異対立遺伝子Ｒ－ｎｊ及び／若しくはＲ１－ＳＣＭ２の配列に基づいて開発されてもよい。
いくつかの実施形態において、Ｒ１遺伝子座に変異Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を含む植物を特定するためのアッセイは、マーカーＳＭ０９５４、ＳＭ０９５４ＨＱ、ＳＭ６５６８、ＳＭ０９５３ＢＱ及びＳＭ６６０４の１つ又は複数で個体の遺伝子型を同定することを含む。いくつかの実施形態において、これらのマーカーでの遺伝子型は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して（例えば、本明細書における第Ｅ節において又は実施例１において詳述される方法に従って）検出されてもよい。表３は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ遺伝子型同定アッセイにおいて使用することができるプライマー及びプローブの例と一緒に、いくつかの実施形態による、これらのマーカーのそれぞれで予想される遺伝子型及び配列構成をリストする。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるトウモロコシ植物は、Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおける８Ｍｂ～１０Ｍｂの位置にある第９染色体上の色阻害遺伝子座に野生型対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、植物は、色阻害遺伝子座の野生型対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（例えばヘテロ接合又はホモ接合）である。この色阻害遺伝子座の変異対立遺伝子は、Ｒ１遺伝子座にＲ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を含むトウモロコシ系統の胚において紫色及び／又は赤色の色素形成を低減させ得る。色素形成の低減は、白色又はクリーム色の胚（すなわち、半数体の胚）から紫色又は赤色の胚（すなわち、二倍体の胚）を区別するのを難しくし得る。いくつかの実施形態において、色阻害遺伝子座にこの変異対立遺伝子を有していないトウモロコシ植物を選択することは、前記植物の二倍体の子が強力な紫色又は赤色を表し、それらを白色又はクリーム色の半数体の胚と区別するのを簡単にするのを確実にすることができる。いくつかの実施形態において、この選択は、色阻害遺伝子座に野生型対立遺伝子を有する植物を選択することによって実現される。野生型色阻害遺伝子座と変異対立遺伝子とを区別することができる任意のアッセイは、本明細書において記載される植物を特定するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アッセイは、下記の第Ｅ節において記載される遺伝子型同定方法の１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、アッセイは、遺伝子座の野生型配列及び／又は変異色阻害対立遺伝子の配列に基づいて開発されてもよい。
いくつかの実施形態において、第９染色体色阻害遺伝子座の野生型対立遺伝子を特定するためのアッセイは、マーカーＳＭ８０４０及びＳＭ８０９１の一方又は両方で個体の遺伝子型を同定することを含む。いくつかの実施形態において、これらのマーカーの遺伝子型は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して（例えば、本明細書における第Ｅ節において又は実施例１において詳述される方法に従って）検出されてもよい。表４は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ遺伝子型同定アッセイにおいて使用することができるプライマー及びプローブの例と一緒に、いくつかの実施形態による、これらのマーカーのそれぞれで予想される遺伝子型及び配列構成をリストする。
Ｂ．半数体誘導率（ＨＩＲ）を決定するための方法
半数体誘導率は、受粉後に（例えば、受粉の約１５～２０日後に）、検定交雑した雌穂を収穫することによって決定することができる。穀粒の胚を、単離し、胚の生存能を維持するのに適した適切な培地（胚救出培地と称される）においてインキューベートする。一実施形態において、ＨＩＲの決定のために使用される救出培地は、４．４３グラムのビタミンありのムラシゲ及びスクーグの基礎培地、３０グラムのスクロース及び７０ｍｇのサリチル酸を含む。救出培地中の胚は、色指標遺伝子（例えばＲ１－ＳＣＭ２）の発現を可能にする条件下に置くことができる。例示的な実施形態において、胚のいくつかがＲ１－ＳＣＭ２遺伝子の発現により紫色に変わるまで、胚は、２２～３１℃で１６～２４時間、１００～４００マイクロモルの照明下に置かれる。例えば国際公開第２０１５／１０４３５８号において記載されるプロトコールを参照されたい。紫色（二倍体）及びクリーム色（半数体）の胚を、それぞれの雌穂からカウントすることができる。半数体誘導率として知られる半数体の頻度は、胚の合計に対する半数体の数に基づいて決定することができる。
半数体誘導率は、受粉後に（例えば、受粉の約１５～２０日後に）、検定交雑した雌穂を収穫することによって決定することができる。穀粒の胚を、単離し、胚の生存能を維持するのに適した適切な培地（胚救出培地と称される）においてインキューベートする。一実施形態において、ＨＩＲの決定のために使用される救出培地は、４．４３グラムのビタミンありのムラシゲ及びスクーグの基礎培地、３０グラムのスクロース及び７０ｍｇのサリチル酸を含む。救出培地中の胚は、色指標遺伝子（例えばＲ１－ＳＣＭ２）の発現を可能にする条件下に置くことができる。例示的な実施形態において、胚のいくつかがＲ１－ＳＣＭ２遺伝子の発現により紫色に変わるまで、胚は、２２～３１℃で１６～２４時間、１００～４００マイクロモルの照明下に置かれる。例えば国際公開第２０１５／１０４３５８号において記載されるプロトコールを参照されたい。紫色（二倍体）及びクリーム色（半数体）の胚を、それぞれの雌穂からカウントすることができる。半数体誘導率として知られる半数体の頻度は、胚の合計に対する半数体の数に基づいて決定することができる。
Ｃ．植物形質転換性
本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、高レベルの形質転換性を有する。形質転換性は、当業者らに知られている多様な方法において測定することができる。例えば、下記の実施例１において記載されるように、胚は、検定ベクターを形質転換し、形質転換に成功した胚のパーセンテージ（すなわち形質転換率）を検出することによって、形質転換性を検定することができる。形質転換は、本明細書において使用されるように、外来性ＤＮＡをトウモロコシゲノムに導入するための任意の方法を指すことができる（例えばアグロバクテリウム介在性の形質転換、微粒子銃など）。トウモロコシ形質転換の方法の例は、下記の第ＩＶ節において記載される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％又は少なくとも１５％の形質転換率を表す。いくつかの実施形態において、高レベルの形質転換性を有する本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、正常Ａサイトタイプを有する。いくつかの実施形態において、高レベルの形質転換性を有する本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬ（例えば、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（すなわち、ヘテロ接合又はホモ接合）である。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬ（例えばｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子についてホモ接合である。いくつかの実施形態において、ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子についてホモ接合であるトウモロコシ植物は、ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子についてヘテロ接合であるトウモロコシ植物よりも高いレベルの形質転換性を有する。いくつかの実施形態において、高レベルの形質転換性を有する本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、正常Ａサイトタイプ及び少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬ（例えば、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬ）にＴＦ対立遺伝子の両方を含む。ＴＦ－ＱＴＬにＴＦ対立遺伝子を含むトウモロコシ植物は、本明細書において記載されるものを含め、任意の既知の遺伝子型同定戦略を使用して特定されてもよい。
本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、高レベルの形質転換性を有する。形質転換性は、当業者らに知られている多様な方法において測定することができる。例えば、下記の実施例１において記載されるように、胚は、検定ベクターを形質転換し、形質転換に成功した胚のパーセンテージ（すなわち形質転換率）を検出することによって、形質転換性を検定することができる。形質転換は、本明細書において使用されるように、外来性ＤＮＡをトウモロコシゲノムに導入するための任意の方法を指すことができる（例えばアグロバクテリウム介在性の形質転換、微粒子銃など）。トウモロコシ形質転換の方法の例は、下記の第ＩＶ節において記載される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％又は少なくとも１５％の形質転換率を表す。いくつかの実施形態において、高レベルの形質転換性を有する本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、正常Ａサイトタイプを有する。いくつかの実施形態において、高レベルの形質転換性を有する本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬ（例えば、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（すなわち、ヘテロ接合又はホモ接合）である。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬ（例えばｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子についてホモ接合である。いくつかの実施形態において、ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子についてホモ接合であるトウモロコシ植物は、ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子についてヘテロ接合であるトウモロコシ植物よりも高いレベルの形質転換性を有する。いくつかの実施形態において、高レベルの形質転換性を有する本明細書において提供されるトウモロコシ植物は、正常Ａサイトタイプ及び少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬ（例えば、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬ）にＴＦ対立遺伝子の両方を含む。ＴＦ－ＱＴＬにＴＦ対立遺伝子を含むトウモロコシ植物は、本明細書において記載されるものを含め、任意の既知の遺伝子型同定戦略を使用して特定されてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される植物及び方法は、正常Ａ（ＮＡ）サイトタイプを有する植物を含む。植物のサイトタイプは、多様な既知の方法を介して決定することができる。ＮＡサイトタイプを、正常Ｂ（ＮＢ）及び細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）サイトタイプを含む他の既知のサイトタイプと区別することができる任意のアッセイが、使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アッセイは、下記の第ＩＩ．Ｅ節において記載される遺伝子型同定方法の１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＮＡサイトタイプを区別するためのアッセイは、Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００７，「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｔｗｏ ｆｅｒｔｉｌｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｍａｌｅ－ｓｔｅｒｉｌｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ」，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７７：１１７３－１１９２によって開示されるＮＡ及びＮＢミトコンドリアゲノムに基づいて開発することができる。
いくつかの実施形態において、ＮＡサイトタイプを他のサイトタイプと区別するためのアッセイは、マーカーＳＭ２９１８、ＳＭ４８１３、ＳＭ２９１４及びＳＭ４８１２の１つ又は複数で個体の遺伝子型を同定することを含む。いくつかの実施形態において、これらのマーカーでの遺伝子型は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して（例えば、本明細書における第ＩＩ．Ｅ節において又は実施例１において詳述される方法に従って）検出されてもよい。いくつかの実施形態において、マーカーＳＭ２９１８及びＳＭ４８１３の一方又は両方は、正常サイトタイプ（すなわち、ＮＡ又はＮＢ）をＣＭＳサイトタイプと区別するために使用される。いくつかの実施形態において、マーカーＳＭ２９１４及びＳＭ４８１２の一方又は両方は、ＮＡサイトタイプをＮＢサイトタイプと区別するために使用される。表５は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ遺伝子型同定アッセイにおいて使用することができるプライマー及びプローブの例と一緒に、いくつかの実施形態による、これらのマーカーのそれぞれで予想される遺伝子型及び配列構成をリストする。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるトウモロコシ植物は、形質転換性の増強と関連する少なくとも１つの量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＴＦ－ＱＴＬ）にＴＦ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおいて１４，７４２，４０７位と７０，５６２，０７０位との間の第３染色体上に位置するｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬにＴＦ対立遺伝子を含む。ＱＴＬを特定する又はその遺伝子型を同定することができる任意のアッセイは、本明細書において記載されるｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬにＴＦ対立遺伝子を含む植物を特定するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子は、トウモロコシＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４系統のＴＦ対立遺伝子にマッチする。いくつかの実施形態において、ＴＦ－ＱＴＬに異なる対立遺伝子を含む植物（例えば、トウモロコシＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ系統の対立遺伝子）は、形質転換にそれほど適していない。いくつかの実施形態において、ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子を特定するためのアッセイは、下記の第ＩＩ．Ｅ節において記載される遺伝子型同定方法の１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子を特定するためのアッセイは、本明細書において記載されるマーカーのいずれかでトウモロコシ植物の遺伝子型を同定することを含んでいてもよい（例えば、下記の実施例１において記載される並びに表６、表１９及び／又は表２０においてリストされるマーカー）。いくつかの実施形態において、ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子を特定するためのアッセイは、遺伝子座のＲＷＫＳ対立遺伝子（すなわち、形質転換性の増強と関連していないＴＦ－ＱＴＬ対立遺伝子）の配列と遺伝子座のＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４対立遺伝子（すなわち、ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子）の配列との間の何らかの違いに基づいて開発されてもよい。
いくつかの実施形態において、ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子を特定するためのアッセイは、マーカーＳＭ３１５８、ＳＭ４７８７、ＳＭ３８１４、ＳＭ３３６２、ＳＭ０６３４ＡＱ及びＳＭ４５８６の１つ又は複数で個体の遺伝子型を同定することを含む。いくつかの実施形態において、これらのマーカーでの遺伝子型は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して（例えば、本明細書における第ＩＩ．Ｅ節において又は実施例１において詳述される方法に従って）検出されてもよい。表６は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ遺伝子型同定アッセイにおいて使用することができるプライマー及びプローブの例と一緒に、いくつかの実施形態による、これらのマーカーのそれぞれで予想される遺伝子型及び配列構成をリストする。
Ｄ．形質転換頻度（ＴＦ）を決定するための方法
形質転換頻度（ＴＦ）は、当技術分野おいてよく知られている方法を使用して決定することができる。例えば、目的の１つ又は複数の遺伝子を含む構築物は、下記の第ＩＶ節において記載される方法を使用して、植物、植物の系統又は植物細胞に導入することができる。形質転換を試みた植物又は植物部（例えば胚）の数に対する導入遺伝子を発現する植物の数を計算するが、これは、ＴＦに等しい。いくつかの実施形態において、目的の１つ又は複数の導入遺伝子は、指標導入遺伝子を含み、その発現は、植物において直ちに観察することができる表現型をもたらす。従って、植物における表現型の観察は、形質転換の成功を示す。
形質転換頻度（ＴＦ）は、当技術分野おいてよく知られている方法を使用して決定することができる。例えば、目的の１つ又は複数の遺伝子を含む構築物は、下記の第ＩＶ節において記載される方法を使用して、植物、植物の系統又は植物細胞に導入することができる。形質転換を試みた植物又は植物部（例えば胚）の数に対する導入遺伝子を発現する植物の数を計算するが、これは、ＴＦに等しい。いくつかの実施形態において、目的の１つ又は複数の導入遺伝子は、指標導入遺伝子を含み、その発現は、植物において直ちに観察することができる表現型をもたらす。従って、植物における表現型の観察は、形質転換の成功を示す。
Ｅ．遺伝子型を同定するための方法
多様な手段は、遺伝子（例えばＭＡＴＬ、ＤＭＰ）、ＱＴＬ（例えばｑｈｉｒ８、ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ 第３染色体ＱＴＬ）又はミトコンドリアゲノム遺伝子座などの目的の多型部位で個体（例えば植物）の遺伝子型を同定するために使用することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子型同定アッセイは、サンプル（例えば核酸サンプル）が特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプを含有するかどうかを決定するために使用される。例えば、個体からの核酸の酵素による増幅は、好都合にも、後続の解析のための核酸を得るために使用することができる。目的の１つ又は複数の遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在はまた、酵素による増幅を伴わないで、個体の核酸から直接決定することもできる。ある特定の実施形態において、個体は、目的の１つ又は複数の遺伝子座において一塩基変異多型（ＳＮＰ）などの１、２、３、４、５又はそれ以上の多型部位で遺伝子型を同定される。いくつかの実施形態において、個体は、ミトコンドリアゲノムにおける目的の１つ又は複数の遺伝子座において１、２、３、４、５又はそれ以上の多型部位で遺伝子型を同定される（例えば、ＮＡサイトタイプの個体を他のサイトタイプの個体と区別するために）。
多様な手段は、遺伝子（例えばＭＡＴＬ、ＤＭＰ）、ＱＴＬ（例えばｑｈｉｒ８、ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ 第３染色体ＱＴＬ）又はミトコンドリアゲノム遺伝子座などの目的の多型部位で個体（例えば植物）の遺伝子型を同定するために使用することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子型同定アッセイは、サンプル（例えば核酸サンプル）が特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプを含有するかどうかを決定するために使用される。例えば、個体からの核酸の酵素による増幅は、好都合にも、後続の解析のための核酸を得るために使用することができる。目的の１つ又は複数の遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在はまた、酵素による増幅を伴わないで、個体の核酸から直接決定することもできる。ある特定の実施形態において、個体は、目的の１つ又は複数の遺伝子座において一塩基変異多型（ＳＮＰ）などの１、２、３、４、５又はそれ以上の多型部位で遺伝子型を同定される。いくつかの実施形態において、個体は、ミトコンドリアゲノムにおける目的の１つ又は複数の遺伝子座において１、２、３、４、５又はそれ以上の多型部位で遺伝子型を同定される（例えば、ＮＡサイトタイプの個体を他のサイトタイプの個体と区別するために）。
個体からの核酸の遺伝子型同定は、増幅するかどうかにかかわらず、種々の技術のいずれかを使用して実行することができる。有用な技術は、限定されることなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの解析アッセイ、配列解析アッセイ、電気泳動的解析アッセイ、制限酵素断片長多型解析アッセイ、ハイブリダイゼーション解析アッセイ、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーション対立遺伝子特異的伸長／ライゲーション、対立遺伝子特異的増幅、一塩基伸長、分子反転プローブ、侵入型切断、選択的終結、制限酵素断片長多型、シークエンシング、一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）、一本鎖鎖多型、ミスマッチ切断及び変性勾配ゲル電気泳動などのアッセイを含み、これらはすべて、単独で又は組み合わせて使用することができる。
核酸を含有する材料は、個体からルーチン的に得られる。このような材料は、核酸を調製することができる任意の生物学的物質である。非限定的な例として、材料は、植物部（例えば葉、茎、根、花若しくは花部、果実、花粉、卵細胞、受精卵、種子、挿し木、細胞若しくは組織培養物又は植物の任意の他の一部若しくは産物）或いは核酸を含む任意の植物組織又は他の植物部とすることができる。一実施形態において、本開示の方法は、実生からのリーフパンチにより実施され、これは、非侵襲性の手段によって直ちに得ることができ、ゲノム及び／又はミトコンドリアＤＮＡを調製するために使用することができる。別の実施形態において、遺伝子型同定は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する個体の核酸の増幅を含む。
多様な異なるプライマーのいずれも、植物における変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）の存在若しくは不在を決定するためにＰＣＲ又は本開示の方法によって個体の核酸を増幅するのに使用することができる。当業者によって理解されるように、ＰＣＲ解析のためのプライマーは、目的の遺伝子における目的の多型部位（複数可）の側面に位置する配列に基づいて設計することができる。非限定的な例として、配列プライマーは、目的の遺伝子又は遺伝子座における目的の多型部位の上流又は下流の配列の約１５～約３０ヌクレオチドを含有することができる。このようなプライマーは、一般に、増幅反応において安定したアニーリングステップを可能にする高融解温度を達成するために十分なグアニン及びシトシン含量を有するように設計される。Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｌｅｃｔなどの数個のコンピュータプログラムは、ＰＣＲプライマーの設計を支援するのに利用可能である。
対立遺伝子識別アッセイ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ）は、多型部位で個体の遺伝子型を同定するのに有用であり、それによって、目的の遺伝子又は遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在を決定することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイにおいて、それぞれの対立遺伝子に対する特異的な蛍光色素標識プローブが、構築される。プローブは、それぞれの対立遺伝子の増幅を区別するために、ＦＡＭ及びＴＥＴなどの異なる蛍光レポーター色素を含有する。加えて、それぞれのプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光をクエンチするクエンチャー色素を一方の末端に有する。ＰＣＲの間に、それぞれのプローブは、個体からの核酸中の相補的配列に特異的にアニールする。Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、対立遺伝子にハイブリダイズするプローブだけを切断するために使用される。切断は、レポーター色素をクエンチャー色素から分離し、レポーター色素による蛍光の増強をもたらす。従って、ＰＣＲ増幅によって産出される蛍光シグナルは、どの対立遺伝子がサンプル中に存在するかを示す。プローブと対立遺伝子との間のミスマッチは、プローブハイブリダイゼーションの効率もＴａｑポリメラーゼによる切断も低減し、蛍光発光はほとんど又は全くもたらされない。当業者らは、対立遺伝子識別アッセイにおける特異性の改善が、例えばＫｕｔｙａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：６５５－６６１（２０００）において記載されるように、ＤＮＡ副溝結合剤（ＭＧＢ）の基をＤＮＡプローブにコンジュゲートすることによって実現することができることを理解する。副溝結合剤は、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ３）などの化合物を含むが、これに限定されない。
配列解析はまた、目的の遺伝子又は遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在を決定するために、本明細書において記載される方法に従って個体の遺伝子型を同定するのに有用となり得る。当業者らに知られているように、目的の変異対立遺伝子は、目的の遺伝子又は遺伝子座における目的の多型部位の側面に位置する配列に基づいて設計される適切なプライマーを使用して配列解析によって検出することができる。例えば、目的の遺伝子又は遺伝子座における変異対立遺伝子は、当業者によって設計されるプライマーを使用して、配列解析によって検出することができる。追加の又は代替の配列プライマーは、目的の遺伝子又は遺伝子座における目的の多型部位の約４０～約４００塩基対上流の又は下流の配列に相当する約１５～約３０ヌクレオチドの配列を含有することができる。このようなプライマーは、一般に、シークエンシング反応において安定したアニーリングステップを可能にする高融解温度を達成するために十分なグアニン及びシトシン含量を有するように設計される。本明細書において使用されるように、用語「配列解析」は、核酸中のヌクレオチドの順序が決定される任意の手動又は自動プロセスを含み、限定されることなく、化学的な及び酵素による方法を包含する。
電気泳動的解析もまた、目的の遺伝子又は遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在を決定するために、本開示の方法に従って個体の遺伝子型を同定するのに有用となり得る。増幅された断片などの１つ又は複数の核酸に関して本明細書において使用される「電気泳動的解析」は、電荷分子が電場の影響下で固定培地を移動するプロセスを含む。電気泳動的解析の方法及びその変形物は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４５）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）において記載されるように、当技術分野おいてよく知られている。
制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）解析もまた、目的の遺伝子又は遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在を決定するために、本開示の方法に従って個体の遺伝子型を同定するのに有用となり得る（Ｊａｒｃｈｏ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｐａｇｅｓ ２．７．１－２．７．５，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｅｄ．），ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）を参照されたい）。ＲＦＬＰ解析は、ＰＣＲ増幅産物に対して実行されてもよい。
加えて、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、目的の遺伝子又は遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在を決定するために、本明細書において記載される植物又は方法において個体の遺伝子型を同定するのに有用となり得る。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、例えば、変異対立遺伝子を包含する配列に対して完全に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく。適切な条件下で、変異対立遺伝子特異的プローブは、変異対立遺伝子を含有する核酸にハイブリダイズするが、プローブと比較して、１つ又は複数のヌクレオチドミスマッチを有する１つ又は複数の他の対立遺伝子にはハイブリダイズしない。必要に応じて、代替の（例えば野生型）対立遺伝子にマッチする第２の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブもまた、使用することができる。同様に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド増幅の技術は、例えば、変異対立遺伝子のヌクレオチド配列に対して完全に相補的であるが、他の対立遺伝子と比較して１つ又は複数のミスマッチを有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって、変異対立遺伝子を選択的に増幅するために使用することができる（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，前掲）。当業者は、変異対立遺伝子と他の対立遺伝子とを区別する１つ又は複数のヌクレオチドミスマッチが、多くの場合、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにおいて使用されことになる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの中心に位置することを理解する。対照的に、ＰＣＲ増幅において使用されることになる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、プライマーの３’末端に変異体と他の対立遺伝子とを区別する１つ又は複数のヌクレオチドミスマッチを含有する。
ヘテロ二本鎖移動度分析（ＨＭＡ）は、目的の遺伝子又は遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在を決定するために、本開示の植物又は方法において遺伝子型を同定するために使用することができる別のよく知られているアッセイである。ミスマッチを所持するＤＮＡ二本鎖が、完全に塩基対形成した二本鎖の移動度と比較して、ポリアクリルアミドゲルにおいて移動度の低減を有するので、ＨＭＡは、変異対立遺伝子の存在を検出するのに有用である（Ｄｅｌｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：１２５７－１２６１（１９９３）；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１２：３０１－３０６（１９９２）を参照されたい）。
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）の技術もまた、目的の遺伝子又は遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在を決定するために、本明細書において記載される植物又は方法において遺伝子型を同定するのに有用となり得る（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．，１：３４－３８（１９９１）を参照されたい）。この技術は、非変性ゲル電気泳動の際に電気泳動移動度の改変を産生する単鎖ＤＮＡの二次構造における違いに基づいて変異対立遺伝子を検出するために使用される。変異対立遺伝子は、既知の対立遺伝子を含有する相当する標準断片と検定断片の電気泳動パターンの比較によって検出される。
変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）もまた、目的の遺伝子又は遺伝子座における特定の変異対立遺伝子（例えば突然変異体若しくはＱＴＬマーカー）又はハプロタイプの存在又は不在を決定するために、本開示の植物又は方法において有用となり得る。ＤＧＧＥにおいて、二重鎖ＤＮＡは、濃度が増加する変性剤を含有するゲルにおいて電気泳動にかけられる；ミスマッチ対立遺伝子から構成される二重鎖断片は、より速やかに融解するセグメントを有し、このような断片が、完全に相補的な配列と比較して、異なって泳動する原因となる（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」ｉｎ Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，前掲，１９９０を参照されたい）。
個体の遺伝子型を同定するのに有用な他の分子的な方法は、当技術分野において知られており、本開示の植物又は方法において有用である。このようなよく知られている遺伝子型同定アプローチは、限定されることなく、自動シークエンシング及びＲＮアーゼミスマッチ技術を含む（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：７５７５－７５７９（１９８５）を参照されたい）。さらに、当業者は、多数の変異対立遺伝子の存在又は不在が決定されることになる場合、個々の変異対立遺伝子は、分子的な方法の任意の組み合わせによって検出することができることを理解する。一般に、Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｖｏｌｕｍｅ １（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照されたい。加えて、当業者は、多数の変異対立遺伝子が、個々の反応において又は単一の反応（「マルチプレックス」アッセイ）において検出することができることを理解する。
Ｆ．ＤＮＡ修飾酵素
いくつかの実施形態において、本開示のＨＩ－ＮＡトウモロコシ植物は、ＤＮＡ修飾酵素を発現することができる。いくつかの実施形態において、このような植物はまた、任意に、少なくとも１つのガイド核酸を発現することもできる（例えばガイドＲＮＡ）。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修飾は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription-activator like effector nuclease）（ＴＡＬＥＮ）、ｄＣａｓ９－Ｆｏｋｌ、ｄＣａｓ１２ａ－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮｌ－ＦｏｋＩ、ＭｅｇａＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非Ｆｏｋｌヌクレアーゼ、ｄＣａｓ１２ａ非Ｆｏｋｌヌクレアーゼ、キメラＣａｓ１２ａ－シチジンデアミナーゼ及びＣａｓ１２ａ－アデニンデアミナーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼである。このような植物を得るための方法は、下記の第ＩＩＩ節においてより詳細に記載される。
いくつかの実施形態において、本開示のＨＩ－ＮＡトウモロコシ植物は、ＤＮＡ修飾酵素を発現することができる。いくつかの実施形態において、このような植物はまた、任意に、少なくとも１つのガイド核酸を発現することもできる（例えばガイドＲＮＡ）。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修飾は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription-activator like effector nuclease）（ＴＡＬＥＮ）、ｄＣａｓ９－Ｆｏｋｌ、ｄＣａｓ１２ａ－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮｌ－ＦｏｋＩ、ＭｅｇａＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非Ｆｏｋｌヌクレアーゼ、ｄＣａｓ１２ａ非Ｆｏｋｌヌクレアーゼ、キメラＣａｓ１２ａ－シチジンデアミナーゼ及びＣａｓ１２ａ－アデニンデアミナーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼである。このような植物を得るための方法は、下記の第ＩＩＩ節においてより詳細に記載される。
Ｇ．植物ヘテローシス群
有利には、本明細書において述べられるＨＩ－ＮＡ植物を産生するための育種において使用されるＨＩ植物及びＮＡ植物を含む本開示のトウモロコシ植物は、任意の既知のヘテローシス群に由来してもよい。形質遺伝子移入の他に、植物育種のゴールは、品種系統及びさらにハイブリッドの親系統において遺伝的改善を行うことである。有効なハイブリッド育種プログラムは、ハイブリッドの雌性親ヘテローシス群及びハイブリッドの雄性親ヘテローシス群の両方における親系統に対して遺伝的改善を行う。そのため、育種プログラムにおいて使用されるすべてのヘテローシス群において遺伝的改善を行うことは有利である。表７は、種々の生殖質が属する一般的なヘテローシス群を示す。ＨＩ－ＮＡ植物はまた、任意のヘテローシス群からのトウモロコシ植物と交配し、そのゲノムを編集し、その形質を改善するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、本開示のトウモロコシ植物は、表７におけるヘテローシス群のいずれかに属する。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｉｏｄｅｎｔ生殖質、ｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質又はｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質を含む。他の実施形態において、トウモロコシ植物は、当業者に知られている任意の他のヘテローシス群に分類される生殖質を含む（例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＬ．Ｒｅｉｄ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １１９ Ｃａｎａｄｉａｎ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｅｄｉｇｒｅｅ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ」Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９１：６５１－６６１及びＭ．Ｍｉｋｅｌ ａｎｄ Ｊ．Ｄｕｄｌｅｙ，２００６，「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｅｎｔ Ｃｏｒｎ ｆｒｏｍ Ｐｕｂｌｉｃ ｔｏ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ」Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．４６：１１９３－１２０５を参照されたい）。本開示のトウモロコシ植物はまた、任意の公的に知られている又は専売の系統に由来してもよい。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、系統Ｓｔｏｃｋ ６、ＲＷＫ、ＲＷＳ、ＵＨ４００、ＡＸ５７０７ＲＳ及び／又はＮＰ２２２２のいずれかに由来する。他の実施形態において、トウモロコシ植物は、目的の任意の他の系統に由来する。
有利には、本明細書において述べられるＨＩ－ＮＡ植物を産生するための育種において使用されるＨＩ植物及びＮＡ植物を含む本開示のトウモロコシ植物は、任意の既知のヘテローシス群に由来してもよい。形質遺伝子移入の他に、植物育種のゴールは、品種系統及びさらにハイブリッドの親系統において遺伝的改善を行うことである。有効なハイブリッド育種プログラムは、ハイブリッドの雌性親ヘテローシス群及びハイブリッドの雄性親ヘテローシス群の両方における親系統に対して遺伝的改善を行う。そのため、育種プログラムにおいて使用されるすべてのヘテローシス群において遺伝的改善を行うことは有利である。表７は、種々の生殖質が属する一般的なヘテローシス群を示す。ＨＩ－ＮＡ植物はまた、任意のヘテローシス群からのトウモロコシ植物と交配し、そのゲノムを編集し、その形質を改善するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、本開示のトウモロコシ植物は、表７におけるヘテローシス群のいずれかに属する。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｉｏｄｅｎｔ生殖質、ｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質又はｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質を含む。他の実施形態において、トウモロコシ植物は、当業者に知られている任意の他のヘテローシス群に分類される生殖質を含む（例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＬ．Ｒｅｉｄ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １１９ Ｃａｎａｄｉａｎ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｅｄｉｇｒｅｅ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ」Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９１：６５１－６６１及びＭ．Ｍｉｋｅｌ ａｎｄ Ｊ．Ｄｕｄｌｅｙ，２００６，「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｅｎｔ Ｃｏｒｎ ｆｒｏｍ Ｐｕｂｌｉｃ ｔｏ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ」Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．４６：１１９３－１２０５を参照されたい）。本開示のトウモロコシ植物はまた、任意の公的に知られている又は専売の系統に由来してもよい。いくつかの実施形態において、トウモロコシ植物は、系統Ｓｔｏｃｋ ６、ＲＷＫ、ＲＷＳ、ＵＨ４００、ＡＸ５７０７ＲＳ及び／又はＮＰ２２２２のいずれかに由来する。他の実施形態において、トウモロコシ植物は、目的の任意の他の系統に由来する。
ＩＩＩ．ＨＩ－ＮＡ植物の産生
別の態様において、形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物（ＨＩ－ＮＡ植物）を産生するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＨＩ－ＮＡ植物の産生は、花粉ドナーとしてのＨＩ植物系統（上記に開示される遺伝子又はＨＩ－ＱＴＬのいずれかのＨＩ対立遺伝子の組み合わせを持つ）をレシピエントとしてのＮＡ植物系統と交配することを含む。いくつかの実施形態において、レシピエント植物系統もまた、上記に記載される１つ又は複数のＴＦ－ＱＴＬにＴＦ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、レシピエント植物系統は、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬにＴＦ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、花粉ドナー植物系統及び／又はレシピエント植物系統は、高い花粉量及び／又は雄穂重量を呈する。いくつかの実施形態において、野生型対立遺伝子は、１つ又は複数の遺伝子及び／又はＨＩ－ＱＴＬで相当するＨＩ対立遺伝子を形成するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子及びＨＩ－ＱＴＬのすべてを編集するための遺伝子編集機構は、例えば同時形質転換プロセスを通して、同じ標的植物に送達される。いくつかの実施形態において、ＨＩ－ＱＴＬ／ＨＩ対立遺伝子の編集は、順次生じる。例えば、第１のＨＩ対立遺伝子（例えばｑｈｉｒ８ ＱＴＬの）を産生するために野生型対立遺伝子を編集するための遺伝子編集機構は、最初に送達されてもよく、第１のＨＩ対立遺伝子を含む植物が、選択される。その後、第２のＨＩ対立遺伝子（例えばＭＡＴＬ遺伝子の）を標的にする遺伝子編集機構は、第１のＨＩ対立遺伝子をすでに含む同じ植物又は同じ植物の後続の世代に導入されるなどである。いくつかの実施形態において、２つ又はそれ以上のＨＩ－ＱＴＬ／ＨＩ対立遺伝子は、同時に編集され、その後、追加のＨＩ－ＱＴＬ／ＨＩ対立遺伝子が編集される。前述の形質転換方式の種々の代替物もまた、本開示において企図され、包含される。ＨＩ植物の産生の例示的な実施形態は、米国特許第１０，２８５，３４８号明細書において開示され、その全開示が、参照によって本明細書に組み込まれる。
別の態様において、形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物（ＨＩ－ＮＡ植物）を産生するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＨＩ－ＮＡ植物の産生は、花粉ドナーとしてのＨＩ植物系統（上記に開示される遺伝子又はＨＩ－ＱＴＬのいずれかのＨＩ対立遺伝子の組み合わせを持つ）をレシピエントとしてのＮＡ植物系統と交配することを含む。いくつかの実施形態において、レシピエント植物系統もまた、上記に記載される１つ又は複数のＴＦ－ＱＴＬにＴＦ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、レシピエント植物系統は、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬにＴＦ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、花粉ドナー植物系統及び／又はレシピエント植物系統は、高い花粉量及び／又は雄穂重量を呈する。いくつかの実施形態において、野生型対立遺伝子は、１つ又は複数の遺伝子及び／又はＨＩ－ＱＴＬで相当するＨＩ対立遺伝子を形成するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子及びＨＩ－ＱＴＬのすべてを編集するための遺伝子編集機構は、例えば同時形質転換プロセスを通して、同じ標的植物に送達される。いくつかの実施形態において、ＨＩ－ＱＴＬ／ＨＩ対立遺伝子の編集は、順次生じる。例えば、第１のＨＩ対立遺伝子（例えばｑｈｉｒ８ ＱＴＬの）を産生するために野生型対立遺伝子を編集するための遺伝子編集機構は、最初に送達されてもよく、第１のＨＩ対立遺伝子を含む植物が、選択される。その後、第２のＨＩ対立遺伝子（例えばＭＡＴＬ遺伝子の）を標的にする遺伝子編集機構は、第１のＨＩ対立遺伝子をすでに含む同じ植物又は同じ植物の後続の世代に導入されるなどである。いくつかの実施形態において、２つ又はそれ以上のＨＩ－ＱＴＬ／ＨＩ対立遺伝子は、同時に編集され、その後、追加のＨＩ－ＱＴＬ／ＨＩ対立遺伝子が編集される。前述の形質転換方式の種々の代替物もまた、本開示において企図され、包含される。ＨＩ植物の産生の例示的な実施形態は、米国特許第１０，２８５，３４８号明細書において開示され、その全開示が、参照によって本明細書に組み込まれる。
Ａ．育種戦略
種々の方法は、本開示においてＨＩ－ＮＡ植物を産生するために使用することができる。方法の１つの例示的な実施形態は、図１において例示される。いくつかの実施形態において、ＨＩ植物は、花粉ドナー親（雄性親）として果たし、Ｆ１植物を産出するために雌性親としてのＮＡ植物と交配することができる。いくつかの実施形態において、花粉ドナー親は、ＭＡＴＬ遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、第２の遺伝子座のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（例えばヘテロ接合又はホモ接合）である。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子は、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬにＨＩ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子は、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬ内のＤＭＰ遺伝子において機能喪失型突然変異を含む。いくつかの実施形態において、花粉ドナー親は、形質転換抵抗性である。いくつかの実施形態において、雌性親トウモロコシ植物は、第３の遺伝子座の（例えばＴＦ－ＱＴＬの）ＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（例えばヘテロ接合又はホモ接合）である。いくつかの実施形態において、雌性親は、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、花粉ドナー親からの花粉は、雌性親トウモロコシ植物を受粉するために使用される。
種々の方法は、本開示においてＨＩ－ＮＡ植物を産生するために使用することができる。方法の１つの例示的な実施形態は、図１において例示される。いくつかの実施形態において、ＨＩ植物は、花粉ドナー親（雄性親）として果たし、Ｆ１植物を産出するために雌性親としてのＮＡ植物と交配することができる。いくつかの実施形態において、花粉ドナー親は、ＭＡＴＬ遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、第２の遺伝子座のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（例えばヘテロ接合又はホモ接合）である。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子は、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬにＨＩ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子は、ｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬ内のＤＭＰ遺伝子において機能喪失型突然変異を含む。いくつかの実施形態において、花粉ドナー親は、形質転換抵抗性である。いくつかの実施形態において、雌性親トウモロコシ植物は、第３の遺伝子座の（例えばＴＦ－ＱＴＬの）ＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（例えばヘテロ接合又はホモ接合）である。いくつかの実施形態において、雌性親は、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、花粉ドナー親からの花粉は、雌性親トウモロコシ植物を受粉するために使用される。
いくつかの実施形態において、上記に記載される交配からのＦ１子孫植物はすべて、母系の細胞質遺伝によりＮＡ細胞質を有する。いくつかの実施形態において、Ｆ１子孫植物は、ＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、花粉ドナーＨＩ植物は、半数体と二倍体の子孫の胚との区別を可能にするために、上記に記載されるように、選択可能マーカーの対立遺伝子を所持する。いくつかの実施形態において、花粉ドナーＨＩ植物は、選択可能マーカーについてホモ接合である。いくつかの実施形態において、選択可能マーカーは、ＧＵＳ、ＰＭＩ、ＰＡＴ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、Ｂ１、ＣＩ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＣＣ３、ＡＡＤＡ、高油分、Ｒ－ｎａｖａｊｏ（Ｒ－ｎｊ）、Ｒ１－ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ（Ｒ１－ＳＣＭ２）及び／又はアントシアニン色素のいずれか１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、選択可能マーカーは、第１０染色体上のＲ１遺伝子座のＲ１－ＳＣＭ２対立遺伝子である。いくつかの実施形態において、Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を含む花粉ドナーＨＩ植物は、上記に記載されるように、第９染色体上の色阻害遺伝子座の野生型対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子についてヘテロ接合である又はホモ接合である二倍体の胚は、紫色を呈するが、Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を有していない半数体の胚は、クリーム色を呈する。色指標遺伝子がＨＩ対立遺伝子と同じ親からのものであるので、胚の色は、それがＨＩ対立遺伝子を所持するかどうかを示してもよい。いくつかの実施形態において、色が紫色である胚は、二倍体である。
いくつかの実施形態において、二倍体のＦ１植物は、選択され、Ｆ２世代の胚を産生するために自家受粉される。他の実施形態において、二倍体のＦ１植物は、ＢＣ１世代を産生するためにＮＡ親植物系統と戻し交配される。いくつかの実施形態において、二倍体のＦ１植物は、選択可能マーカーを使用して特定される。いくつかの実施形態において、選択可能マーカー産物を有するもの（例えば、Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子の場合、紫色を有するもの）はまた、ＨＩ対立遺伝子も保持する。Ｆ２植物及びＢＣ１植物は、上記に記載される方法を使用してＨＩ対立遺伝子の存在を確認するために遺伝子型を同定されてもよい。いくつかの実施形態において、上記に記載されるようにＨＩ対立遺伝子についてホモ接合である又はヘテロ接合であるＦ２及び／又はＢＣ１植物は、さらなる育種のために選択される。いくつかの実施形態において、Ｆ２及び／又はＢＣ１子孫植物は、ＭＡＴＬ遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、追加のＨＩ対立遺伝子（例えばｑｈｉｒ８ ＨＩ－ＱＴＬの）について少なくともヘテロ接合であるＮＡサイトタイプ植物について選択される。いくつかの実施形態において、Ｆ２及び／又はＢＣ１子孫植物は、ＴＦ対立遺伝子（例えば、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬの）について少なくともヘテロ接合である植物について選択される。
いくつかの実施形態において、選択されたＦ２植物は、Ｆ３植物を産生するために自家受粉される。いくつかの実施形態において、選択されたＢＣ１植物は、ＢＣ１Ｆ２植物を産出するために自家受粉される。Ｆ３植物及び／又はＢＣ１Ｆ２植物は、ＨＩ対立遺伝子、ＴＦ対立遺伝子及び／又は選択可能マーカーの存在について遺伝子型を同定されてもよい。いくつかの実施形態において、これらの植物はまた、本明細書において開示される方法を使用してＨＩＲについても検定される。適したＦ３植物及び／又はＢＣ１Ｆ２植物は、それらが所望のＨＩ対立遺伝子組み合わせについて少なくともヘテロ接合であり、さらに、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％又は少なくとも１０％のＨＩＲを有する場合、さらなる育種のために選択されてもよい。
同様の方法でＦ４植物及び／又はＢＣ１Ｆ３植物を産出するために、選択されたＦ３植物及び／又はＢＣ１Ｆ２植物は、自家受粉されてもよい。いくつかの実施形態において、これらの植物のＨＩＲ及び形質転換頻度（ＴＦ）は、決定される。いくつかの実施形態において、十分に高い、例えば少なくとも１０％、少なくとも１２％又は少なくとも１５％のＨＩＲ及び高い、例えば少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも７％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又は少なくとも６０％のＴＦもまたを呈する植物は、ＨＩ－ＮＡ植物として選択される。
いくつかの実施形態において、十分に高いＨＩＲを呈するＦ４植物及び／又はＢＣ１Ｆ３植物は、植物のさらなる世代、例えばＦ５、Ｆ６、Ｆ７、ＢＣ１Ｆ４、ＢＣ１Ｆ５、ＢＣ１Ｆ６を産生するために、自家受粉を通してさらに育種される。これらの植物は、それらが所望のＨＩＲ及びＴＦ率を有することを確認するために、検定されてもよい。
上記に記載される育種戦略の追加の実施形態もまた、本明細書において企図される。例えば、上記に記載されるＢＣ１植物は、ＢＣ２植物を産出するために、ＮＡ親系統に戻し交配されてもよい。いくつかの実施形態において、それぞれの世代は、親系統に繰り返し戻し交配される（例えば、ＢＣ３植物、ＢＣ４植物、ＢＣ５植物などを産出するために）。いくつかの実施形態において、自家受粉交配は、１つ又は複数の戻し交配世代の後に実行される（例えばＢＣ２Ｆ２植物、ＢＣ２Ｆ３植物、ＢＣ３Ｆ２植物、ＢＣ２Ｆ３植物などを産出するために）。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子についての遺伝子型同定、ＴＦ対立遺伝子についての遺伝子型同定、ＨＩＲ及び／若しくはＴＦについての表現型同定などの１つ又は複数は、それぞれの世代で実行されてもよい。
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法の雄性親及び／又は雌性親は、表７におけるヘテローシス群のいずれかに属する。いくつかの実施形態において、雄性親は、雌性親と異なるヘテローシス群に属する。いくつかの実施形態において、雄性親及び／又は雌性親は、Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｉｏｄｅｎｔ生殖質、ｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質又はｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質を含む。他の実施形態において、雄性親及び／又は雌性親は、当業者に知られている任意の他のヘテローシス群に分類される生殖質を含む（例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＬ．Ｒｅｉｄ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １１９ Ｃａｎａｄｉａｎ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｅｄｉｇｒｅｅ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ」Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９１：６５１－６６１及びＭ．Ｍｉｋｅｌ ａｎｄ Ｊ．Ｄｕｄｌｅｙ，２００６，「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｅｎｔ Ｃｏｒｎ ｆｒｏｍ Ｐｕｂｌｉｃ ｔｏ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ」Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．４６：１１９３－１２０５を参照されたい）。雄性親及び／又は雌性親は、任意の公的に知られている又は専売の系統に由来してもよい。いくつかの実施形態において、雄性親及び／又は雌性親は、系統Ｓｔｏｃｋ ６、ＲＷＫ、ＲＷＳ、ＵＨ４００、ＡＸ５７０７ＲＳ及び／又はＮＰ２２２２のいずれかに由来する。
Ｂ．育種及び突然変異ターゲティング
別の態様において、本明細書において記載される形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物を産生するための方法は、育種及び遺伝子の直接の突然変異ターゲティングを介しての形質遺伝子移入の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、野生型対立遺伝子は、ＨＩ対立遺伝子を形成するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＭＡＴＬ及び／又はＤＭＰ遺伝子の突然変異ターゲティングは、ＨＩ対立遺伝子（例えば、機能喪失型突然変異ｍａｔｌ及び／又はｄｍｐ）を産生するために使用される。いくつかの実施形態において、突然変異ターゲティングは、遺伝子編集を介して実現される。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子のすべてを編集するための遺伝子編集機構は、例えばガイドＲＮＡ多重化によって又は同時形質転換プロセスを通して同じ標的植物に送達される。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子の編集は、順次生じる。例えば、第１のＨＩ対立遺伝子（例えば、ＤＭＰにおける機能喪失型突然変異体）を産生するために野生型対立遺伝子を編集するための遺伝子編集機構は、最初に送達されてもよく、第１のＨＩ対立遺伝子を安定して発現する植物が、選択される。その後、第２のＨＩ対立遺伝子（例えば、ＭＡＴＬにおける機能喪失型突然変異体）を標的にする遺伝子編集機構は、第１のＨＩ対立遺伝子をすでに発現する同じ植物又は同じ植物の後続の世代に導入されるなどである。いくつかの実施形態において、２つ以上のＨＩ対立遺伝子は、同時に編集され、その後、追加のＨＩ対立遺伝子が編集される。前述の形質転換方式の種々の代替物もまた、本開示において企図され、包含される。ＨＩ植物の産生の例示的な実施形態は、米国特許第１０，２８５，３４８号明細書において開示され、その全開示が、参照によって本明細書に組み込まれる。
別の態様において、本明細書において記載される形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物を産生するための方法は、育種及び遺伝子の直接の突然変異ターゲティングを介しての形質遺伝子移入の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、野生型対立遺伝子は、ＨＩ対立遺伝子を形成するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＭＡＴＬ及び／又はＤＭＰ遺伝子の突然変異ターゲティングは、ＨＩ対立遺伝子（例えば、機能喪失型突然変異ｍａｔｌ及び／又はｄｍｐ）を産生するために使用される。いくつかの実施形態において、突然変異ターゲティングは、遺伝子編集を介して実現される。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子のすべてを編集するための遺伝子編集機構は、例えばガイドＲＮＡ多重化によって又は同時形質転換プロセスを通して同じ標的植物に送達される。いくつかの実施形態において、ＨＩ対立遺伝子の編集は、順次生じる。例えば、第１のＨＩ対立遺伝子（例えば、ＤＭＰにおける機能喪失型突然変異体）を産生するために野生型対立遺伝子を編集するための遺伝子編集機構は、最初に送達されてもよく、第１のＨＩ対立遺伝子を安定して発現する植物が、選択される。その後、第２のＨＩ対立遺伝子（例えば、ＭＡＴＬにおける機能喪失型突然変異体）を標的にする遺伝子編集機構は、第１のＨＩ対立遺伝子をすでに発現する同じ植物又は同じ植物の後続の世代に導入されるなどである。いくつかの実施形態において、２つ以上のＨＩ対立遺伝子は、同時に編集され、その後、追加のＨＩ対立遺伝子が編集される。前述の形質転換方式の種々の代替物もまた、本開示において企図され、包含される。ＨＩ植物の産生の例示的な実施形態は、米国特許第１０，２８５，３４８号明細書において開示され、その全開示が、参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ＭＡＴＬ及びＤＭＰ遺伝子の野生型対立遺伝子を含むトウモロコシ植物は、別のトウモロコシ植物（すなわち雌性親植物）との交配において花粉ドナー（すなわち雄性親植物）として使用される。いくつかの実施形態において、雌性親植物は、ＮＡ細胞質を含む。いくつかの実施形態において、雌性親植物は、ＴＦ－ＱＴＬの（例えば、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬの）ＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合（例えばヘテロ接合又はホモ接合）である。いくつかの実施形態において、花粉ドナー植物は、上記に記載されるように、半数体と二倍体の子孫の胚との区別を可能にするために、選択可能マーカー遺伝子対立遺伝子を所持する。いくつかの実施形態において、花粉ドナー植物は、選択可能マーカー遺伝子対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、選択可能マーカー遺伝子対立遺伝子は、ＧＵＳ、ＰＭＩ、ＰＡＴ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、Ｂ１、ＣＩ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＣＣ３、ＡＡＤＡ、高油分、Ｒ－ｎａｖａｊｏ（Ｒ－ｎｊ）、Ｒ１－ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ（Ｒ１－ＳＣＭ２）及び／又はアントシアニン色素のいずれか１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、選択可能マーカー遺伝子対立遺伝子は、第１０染色体上のＲ１遺伝子座のＲ１－ＳＣＭ２対立遺伝子である。いくつかの実施形態において、Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を含む花粉ドナー植物は、上記に記載されるように、第９染色体上の色阻害遺伝子座の野生型対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である。
いくつかの実施形態において、Ｆ１植物は、Ｆ２世代の胚を産生するために自家受粉される。他の実施形態において、Ｆ１植物は、ＢＣ１世代を産生するために雌性又は雄性親植物系統と戻し交配される。Ｆ２植物及び／又はＢＣ１植物は、上記に記載される遺伝子型同定方法を使用して、ＮＡ細胞質、ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子、選択可能マーカー遺伝子対立遺伝子及び／又は第９染色体上の色阻害遺伝子座の野生型対立遺伝子の存在について選択されてもよい。選択されたＦ２及び／又はＢＣ１植物は、上記に記載されるように、一世代又は数世代以上の間、自家受粉されてもよい及び／又は戻し交配されてもよい。いくつかの実施形態において、選択されたＦ２及び／又はＢＣ１植物又はその子孫は、形質転換性の半数体誘導体植物を得るためにＭＡＴＬ遺伝子及び／又はＤＭＰ遺伝子において機能喪失型突然変異を引き起こすように、上記に及び下記の第Ｖ節において記載されるように編集される。いくつかの実施形態において、形質転換性の半数体誘導体植物は、一世代又は数世代の間、自家受粉される及び／又は戻し交配される。形質転換性の半数体誘導体植物又はその子孫は、高い形質転換性及び高い半数体誘導を有する植物を選択するために、上記に記載されるように遺伝子型を同定されてもよい及び／又は表現型を同定されてもよい。
いくつかの実施形態において、上記に記載される方法の雄性親及び／又は雌性親は、表７におけるヘテローシス群のいずれかに属する。いくつかの実施形態において、雄性親は、雌性親と異なるヘテローシス群に属する。いくつかの実施形態において、雄性親及び／又は雌性親は、Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｉｏｄｅｎｔ生殖質、ｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質又はｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質を含む。他の実施形態において、雄性親及び／又は雌性親は、当業者に知られている任意の他のヘテローシス群に分類される生殖質を含む（例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＬ．Ｒｅｉｄ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １１９ Ｃａｎａｄｉａｎ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｅｄｉｇｒｅｅ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ」Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９１：６５１－６６１及びＭ．Ｍｉｋｅｌ ａｎｄ Ｊ．Ｄｕｄｌｅｙ，２００６，「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｅｎｔ Ｃｏｒｎ ｆｒｏｍ Ｐｕｂｌｉｃ ｔｏ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ」Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．４６：１１９３－１２０５を参照されたい）。雄性親及び／又は雌性親は、任意の公的に知られている又は専売の系統に由来してもよい。いくつかの実施形態において、雄性親及び／又は雌性親は、系統Ｓｔｏｃｋ ６、ＲＷＫ、ＲＷＳ、ＵＨ４００、ＡＸ５７０７ＲＳ及び／又はＮＰ２２２２のいずれかに由来する。
ＩＶ．ＨＩ－ＮＡトウモロコシ植物の形質転換
別の態様において、上記に記載されるＨＩ－ＮＡ植物を形質転換するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子（例えば、上記に開示されるＤＮＡ修飾酵素及び１つ又は複数のガイドＲＮＡをコードする遺伝子）は、上記に記載されるＨＩ－ＮＡトウモロコシ植物に導入することができる。植物の形質転換のための適した方法は、ポリエチレングリコール誘導ＤＮＡ取込みによるプロトプラスト形質転換、遺伝子銃を使用する微粒子銃プロセス－「パーティクルガン」法、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）介在性の形質転換、グリコール介在性の形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びアグロバクテリウムが介在する上記に記載される遺伝子導入である。述べられたプロセスは、例えばＢ．Ｊｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓ．Ｄ．Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３），１２８－１４３及びＰｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１），２０５－２２５）において記載される。
別の態様において、上記に記載されるＨＩ－ＮＡ植物を形質転換するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子（例えば、上記に開示されるＤＮＡ修飾酵素及び１つ又は複数のガイドＲＮＡをコードする遺伝子）は、上記に記載されるＨＩ－ＮＡトウモロコシ植物に導入することができる。植物の形質転換のための適した方法は、ポリエチレングリコール誘導ＤＮＡ取込みによるプロトプラスト形質転換、遺伝子銃を使用する微粒子銃プロセス－「パーティクルガン」法、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）介在性の形質転換、グリコール介在性の形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びアグロバクテリウムが介在する上記に記載される遺伝子導入である。述べられたプロセスは、例えばＢ．Ｊｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓ．Ｄ．Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３），１２８－１４３及びＰｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１），２０５－２２５）において記載される。
一実施形態において、目的の遺伝子は、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に形質転換するのに適しているベクターにクローニングされる。このようなベクターを使用して形質転換されるアグロバクテリウムは、次いで、例えば、アグロバクテリウム溶液中に傷ついた葉又は葉片を浸し、その後、適した培地中で培養することによる、植物の、特に作物植物の形質転換のための既知の方法において使用することができる。
いくつかの実施形態において、形質転換性を増加させる能力を有することが知られている１つ又は複数の遺伝子は、目的の遺伝子と共にＨＩ－ＮＡ植物に同時形質転換される。これらの遺伝子は、この適用において形態形成因子又はブースター遺伝子と称される。形態発生因子のクラスは、ＢＡＢＹ ＢＯＯＭ（ＢＢＭ）、ＢＢＭ様、ＥＭＢＲＹＯＭＡＫＥＲ（ＥＭＫ）、ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＡ（ＡＮＴ）、ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＡ－ＬＩＫＥ（ＡＩＬ）、ＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）、ＷＵＳＣＨＥＬ（ＷＵＳ）又はＷＵＳホメオボックス（Ｗｏｘ）、ＧＲＦ（成長調節因子）、ＳＨＯＯＴ ＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ（ＳＴＭ）、ＡＧＡＭＯＵＳ様（ＡＧＬ）、ＭＹＢ１１５、ＭＹＢ１１８、体細胞胚形成受容体様キナーゼ（ＳＥＲＫ）、ＳＯＭＡＴＩＣ ＥＭＢＲＹＯ ＲＥＬＡＴＥＤ ＦＡＣＴＯＲ（ＳＥＲＦ）及びＡＴ－ＨＯＯＫ ＭＯＴＩＦ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＮＵＣＬＥＡＲ ＬＯＣＡＬＩＺＥＤ（ＡＨＬ）を含む。ブースター遺伝子の非限定的な例は、ＯＶＵＬＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＰＥＰＴＩＤＥ（ＯＤＰ）、ＢＡＢＹ ＢＯＯＭ（ＢＢＭ）、ＷＵＳＣＨＥＬ２（ＷＵＳ２）、ＷＵＳＣＨＥＬ－ＲＥＬＡＴＥＤ ＨＯＭＥＯＢＯＸ ５（ＷＯＸ５）、ＧＲＯＷＴＨ－ＲＥＧＵＬＡＴＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ ５（ＧＲＦ５）又はＧＲＯＷＴＨ－ＲＥＧＵＬＡＴＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ ４（ＧＲＦ４）及びそのコファクターＧＲＦ－ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ １（ＧＩＦ１）組み合わせるキメラタンパク質を含む。形質転換効率を高めるために目的の遺伝子とブースター遺伝子の同時形質転換を実行するための方法は、例えばＬｏｗｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）「Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ Ｂａｂｙ ｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｕｓｃｈｅｌ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｍｏｎｏｃｏｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２８，１９９８－２０１５；Ｈｏｅｒｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０２０）「Ｕｓｅ ｏｆ ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ＺｍＷｕｓ２ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｍａｉｚｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｍｏｏｋｋａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）「Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ Ｂ７３ ａｎｄ ｓｏｒｇｈｕｍ Ｐ８９８０１２ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ＢＡＢＹ ＢＯＯＭ ａｎｄ ＷＵＳＣＨＥＬ２」，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３６：１４７７－１４９１；Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ５ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｏｔ ａｎｄ Ｄｉｃｏｔ Ｓｐｅｃｉｅｓ」，Ｆｒｏｎｔ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０２０．５７２３１９）において開示されるように、知られている又はＤｅｂｅｒｎａｒｄｉ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０２０），「Ａ ＧＲＦ－ＧＩＦ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３８：１２７４－１２７９において記載されるＧＲＦ４－ＧＩＦ１を利用することによるものである。前述の参考文献の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。例えば米国特許第７，１５１，１７０号明細書；米国特許第７，５７９，５２９号明細書；米国特許第７，２５６，３２２号明細書；米国特許第７，７００，８２９号明細書；国際公開第２０１８／２２４００１号；国際公開第２０１８／０９８４２０号；及びＰＣＴ／ＵＳ２０２０／４５５７３もまた参照されたい；これらすべてについて、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、同時形質転換において使用されるブースター遺伝子は、目的の遺伝子と異なるベクター中に存在する。いくつかの実施形態において、ブースター遺伝子は、目的の遺伝子と同じベクター中にある。下記の実施例２及び７は、目的の遺伝子と１つ又は複数のブースター遺伝子の本明細書において開示されるＨＩ－ＮＡ植物への同時形質転換についての例証となる例示的な実施形態を示す。
Ｖ．標的植物の遺伝子編集
本明細書において記載される方法の種々の実施形態は、遺伝子編集を使用する。いくつかの実施形態において、遺伝子編集は、１つ若しくは複数のＨＩ対立遺伝子（例えば、遺伝子のＨＩ対立遺伝子及び／若しくはＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子）並びに／又は１つ若しくは複数のＴＦ対立遺伝子（例えばＴＦ－ＱＴＬの）を有する植物を産生するよう、植物のゲノムを突然変異誘発するために使用される。
本明細書において記載される方法の種々の実施形態は、遺伝子編集を使用する。いくつかの実施形態において、遺伝子編集は、１つ若しくは複数のＨＩ対立遺伝子（例えば、遺伝子のＨＩ対立遺伝子及び／若しくはＨＩ－ＱＴＬのＨＩ対立遺伝子）並びに／又は１つ若しくは複数のＴＦ対立遺伝子（例えばＴＦ－ＱＴＬの）を有する植物を産生するよう、植物のゲノムを突然変異誘発するために使用される。
いくつかの実施形態において、上記に記載される遺伝子編集機構により形質転換され、それを発現するＨＩ－ＮＡ植物は、本明細書において提供され、これは、標的植物と交配された場合に、標的植物において遺伝子編集をもたらす。
一般に、遺伝子編集は、遺伝子編集構成要素又はシステムの一過性、誘導性又は恒常的発現を含んでいてもよい。遺伝子編集は、遺伝子編集構成要素又はシステムのゲノム統合又はエピソームとしての存在を含んでいてもよい。
遺伝子編集は、一般に、所望の位置でヌクレオチド配列をカットするための部位特異的ヌクレアーゼの使用を指す（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ及びその他同種のものを含むが、これらに限定されない）。これは、挿入／欠失（「インデル」）突然変異（すなわち「ＳＤＮ１」）、塩基編集（すなわち「ＳＤＮ２」）又は対立遺伝子挿入若しくは置き換え（すなわち「ＳＤＮ３」）を引き起こしてもよい。ＳＤＮ２又はＳＤＮ３遺伝子編集は、植物内で相同組換え修復（ＨＤＲ）のために使用することができる（すなわち植物ゲノムに導入されることになる）目的の遺伝子配列を含む１つ又は複数の組換え鋳型（例えばベクターにおける）の提供を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、ＨＩ植物又はＨＩ－ＮＡ植物を産出するために植物ゲノムに導入されることになるＨＩ対立遺伝子（例えばｍａｔｌ又はｄｍｐ）であってもよい。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子又は対立遺伝子は、植物に改善された形質、例えば改善された収量を与えることができるものである。遺伝子組換え鋳型は、形質転換を通して又は遺伝子組換え鋳型を含むドナー植物との育種を通して、編集されることになる植物に導入することができる。植物ゲノムにおける断裂は、標的配列内に、その上流に及び／又は下流に導入されてもよい。いくつかの実施形態において、二本鎖ＤＮＡ断裂は、標的配列遺伝子座内で又はその近くで行われる。いくつかの実施形態において、断裂は、標的配列遺伝子座の上流及び下流で行われ、これは、ゲノムからのその切取りに至ってもよい。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の一本鎖ＤＮＡの断裂（ニック）は、標的配列内で、その上流及び／又はその下流で行われる（例えば、ニッカーゼＣａｓ９変異体を使用して）。これらのＤＮＡ断裂のいずれも及び当業者に知られている他の方法を介して導入されるＤＮＡ断裂は、ＨＤＲを誘導してもよい。ＨＤＲを通して、標的配列は、提供される遺伝子組換え鋳型の配列によって置き換えられる。ある特定の実施形態において、本明細書において記載される目的の遺伝子配列（例えばｍａｔｌ又はｄｍｐ対立遺伝子配列）は、鋳型上に／として提供されてもよい。１つ又は複数の一本鎖又は二本鎖断裂が、目的の遺伝子配列を含まない植物のゲノムにおける相当する領域内に、その上流に及び／又は下流に導入されるようにシステムを設計することによって、この領域は、目的の遺伝子配列を含む鋳型と置き換えることができる。このように、植物における目的の遺伝子配列の導入は、特に特定の遺伝的バックグラウンドの植物において多数の戻し交配を含む必要はない。同様に、目的の突然変異した遺伝子配列（例えばｍａｔｌ又はｄｍｐ）は、鋳型として提供されてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される目的の遺伝子における突然変異（例えばｍａｔｌ又はｄｍｐ）は、ＤＮＡ二本鎖断裂の標的導入を介して組換え鋳型を使用せずに産出されてもよい。このような断裂は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のプロセスを通して修復されてもよく、これは、修復部位に小さい挿入又は欠失（インデル）の産出をもたらすことができる。このようなインデルは、標的にされた遺伝子において、中途終止コドンを引き起こすフレームシフト突然変異又は他のタイプの機能喪失型突然変異に至ってもよい。
いくつかの実施形態において、遺伝子編集は、標的植物において遺伝子編集構成要素又はシステムの一過性、誘導性又は恒常的発現を含んでいてもよい。遺伝子編集はまた、標的植物における遺伝子編集構成要素又はシステムのゲノム統合又はエピソームとしての存在を含んでいてもよい。
ある特定の実施形態において、核酸修飾又は突然変異は、（修飾）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムによって遂行される。ＺＦＮシステムは、所望のＤＮＡ配列を標的にするように操作することができるＤＮＡ切断ドメインにジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを融合することによって産出される人工制限酵素を使用する。ＺＦＮを使用するゲノム編集の例示的な方法は、例えば米国特許第６，５３４，２６１号明細書；米国特許第６，６０７，８８２号明細書；米国特許第６，７４６，８３８号明細書；米国特許第６，７９４，１３６号明細書；米国特許第６，８２４，９７８号明細書；米国特許第６，８６６，９９７号明細書；米国特許第６，９３３，１１３号明細書；及び米国特許第６，９７９，５３９号明細書において見つけることができる。
ある特定の実施形態において、核酸修飾は、大きな認識部位（１２～４０塩基対の二重鎖ＤＮＡ配列）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである（修飾）メガヌクレアーゼによって遂行される。メガヌクレアーゼを使用する例示的な方法は、参照によって詳細に組み込まれる米国特許第８，１６３，５１４号明細書；米国特許第８，１３３，６９７号明細書；米国特許第８，０２１，８６７号明細書；米国特許第８，１１９，３６１号明細書；米国特許第８，１１９，３８１号明細書；米国特許第８，１２４，３６９号明細書；及び米国特許第８，１２９，１３４号明細書において見つけることができる。
ある特定の実施形態において、核酸修飾は、（修飾）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体又はシステムによって遂行される。ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム又は複合体は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。ある特定の実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム又は複合体は、ＩＩ型、Ｖ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム又は複合体である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、特異的な配列を標的にするための特化したタンパク質の産出を必要とせず、代わりに、単一のＣａｓタンパク質を、特異的な核酸標的を認識するようにＲＮＡガイド（ｇＲＮＡ）によってプログラムすることができる、言い換えれば、Ｃａｓ酵素タンパク質を、前記短いＲＮＡガイドを使用して、目的の特異的な核酸標的遺伝子座（ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含んでもよい又はからなってもよい）に動員することができる。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲシステムは、前述の文書において本明細書において使用されるとおりであり、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列並びに１つ又は複数のｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えばｔｒａｃｒＲＮＡ若しくは活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連する「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「スペーサー」とも称される）又は用語が本明細書において使用されるとおりの「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓを導くＲＮＡ（複数可）、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び該当する場合、トランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ若しくはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与する又はその活性を指示する転写物及び他のエレメントを集合的に指す。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連してプロトスペーサーとも称される）。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関連して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、キメラガイドＲＮＡ又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、ガイド配列及びｔｒａｃｒメイト配列（又はダイレクトリピート）を含む。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列（又はダイレクトリピート）及びｔｒａｃｒ配列を含む。ある特定の実施形態において、本明細書において記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム又は複合体は、ｔｒａｃｒ配列を含まない及び／又はその存在に依存しない（例えばＣａｓタンパク質がＣａｓ１２ａである場合）。
限定されることなくＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（以前は、Ｃｐｆ１と称された）、Ｃａｓ１２ｂ（以前は、Ｃ２ｃ１と称された）、Ｃａｓ１３ａ（以前は、Ｃ２ｃ２と称された）、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３ｂタンパク質などの本明細書において言及されるＣａｓタンパク質は、任意の適した起源から起こったものであってもよく、したがって、当技術分野おいて十分に記述されているように、多様な（原核）生物から起こる様々なオルソログを含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、（修飾）Ｃａｓ９、好ましくは（修飾）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）又は（修飾）化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である。ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、任意に、アシドアミノコックス種ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）などのアシドアミノコックス種又はラクノスピラバクテリウムＭＡ２０２０若しくはラクノスピラバクテリウムＭＤ２００６（ＬＢＣａｓ１２ａ）などのラクノスピラバクテリウムＣａｓ１２ａからのＣａｓ１２ａである。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第１０，６６９，５４０号明細書を参照されたい。その代わりに、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、モラクセラ・ボーボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ０８＿００２０５［Ｍｂ２Ｃａｓ１２ａ］又はモラクセラ・ボーボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ１１＿００２０５［Ｍｂ３Ｃａｓ１２ａ］からのものであってもよい。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／１８９３０８号を参照されたい。ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、（修飾）Ｃ２ｃ２、好ましくはレプトトリキア・ワデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｃ２ｃ２（ＬｗＣ２ｃ２）又はリステリア・ニューヨーケンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ Ｍ６－０６３５ Ｃ２ｃ２（ＬｂＦＳＬＣ２ｃ２）である。ある特定の実施形態において、（修飾）Ｃａｓタンパク質は、Ｃ２ｃ１である。ある特定の実施形態において、（修飾）Ｃａｓタンパク質は、Ｃ２ｃ３である。ある特定の実施形態において、（修飾）Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ｂである。他のＣａｓ酵素は、当業者に入手可能である。
植物（例えばＨＩ－ＮＡ植物）に導入される遺伝子編集機構（例えばＤＮＡ修飾酵素）は、トウモロコシにおいて組換え遺伝子発現を駆動することができる任意のプロモーターによってコントロールすることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、恒常的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば花粉特異的プロモーター若しくは精細胞特異的プロモーター、受精卵特異的プロモーター又は精子、卵、及び受精卵において高度に発現されるプロモーター（例えばｐｒＯｓＡｃｔｉｎ１）である。適したプロモーターは、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５１９，４５６号明細書において開示される。例示的なプロモーターを、下記の表８に示す。
別の態様において、植物ゲノムＤＮＡを編集するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、方法は、編集されることになるゲノムＤＮＡを含む標的植物を受粉するための上記に記載されるＤＮＡ修飾酵素及び少なくとも１つの任意のガイド核酸を発現するＨＩ－ＮＡトウモロコシ植物の使用を含む。いくつかの実施形態において、交配からの少なくとも１つの半数体の子孫は、選択される。いくつかの実施形態において、半数体の子孫は、標的植物のゲノムを含み、ＨＩ－ＮＡトウモロコシ植物のゲノムを含まない。いくつかの実施形態において、半数体の子孫は、ＤＮＡ修飾酵素を発現しない。いくつかの実施形態において、半数体の子孫のゲノムは、ＨＩ－ＮＡトウモロコシ植物によって送達されるＤＮＡ修飾酵素及び任意のガイド核酸によって修飾される。ＨＩ－Ｅｄｉｔとして知られているこのプロセスは、米国特許第１０，５１９，４５６号明細書、米国特許第１０，２８５，３４８号明細書において記載される。編集された半数体植物は、次いで、特定し、倍加剤により処置し、それによって、編集された倍加半数体子孫を作出することができる。染色体倍加剤の非限定的な例は、コルヒチン、プロナミド、ジチピル、トリフルアリン又は別の知られている微小管阻害剤を含む。二倍体植物は、次いで、成熟するまで成長させ、編集された二倍体種子を産出するために自家受粉され、これは、追加の育種及び種子産生プロセスのために使用される。任意に、すべての二倍体世代系統は、ホモ接合標的部位編集の実存及び遺伝子編集機構がないことを確認するために評価することができる。
実施例１．形質転換性の半数体誘導体の育種
トウモロコシ系統及びマーカーの遺伝子型同定
形質転換性の半数体誘導体系統は、半数体誘導体系統及び形質転換性系統を互いに交配することによって育種することができる。雌性親として「正常Ａ」サイトタイプを有する（すなわち、上記に記載されるように、マーカーＳＭ２９１８及び／若しくはＳＭ４８１３並びにＳＭ２９１４についてＣ／Ｃ遺伝子型並びに／又はマーカーＳＭ４８１２についてＩ／Ｉ遺伝子型を有する）形質転換性系統並びに雄性親として半数体誘導体系統花粉ドナーを使用することは好ましく、これは、正常Ａサイトタイプがすべての子孫に伝達されるのを確実にする。このサイトタイプは、形質転換性において利点を与える。高成績の（＞１５％の半数体誘導率）誘導体及び非常に形質転換性の品種（形質転換頻度＞１５％）から始めることもまた、好ましい。高い花粉量又は雄穂重量について選択することもまた、有益であってもよい。
トウモロコシ系統及びマーカーの遺伝子型同定
形質転換性の半数体誘導体系統は、半数体誘導体系統及び形質転換性系統を互いに交配することによって育種することができる。雌性親として「正常Ａ」サイトタイプを有する（すなわち、上記に記載されるように、マーカーＳＭ２９１８及び／若しくはＳＭ４８１３並びにＳＭ２９１４についてＣ／Ｃ遺伝子型並びに／又はマーカーＳＭ４８１２についてＩ／Ｉ遺伝子型を有する）形質転換性系統並びに雄性親として半数体誘導体系統花粉ドナーを使用することは好ましく、これは、正常Ａサイトタイプがすべての子孫に伝達されるのを確実にする。このサイトタイプは、形質転換性において利点を与える。高成績の（＞１５％の半数体誘導率）誘導体及び非常に形質転換性の品種（形質転換頻度＞１５％）から始めることもまた、好ましい。高い花粉量又は雄穂重量について選択することもまた、有益であってもよい。
本実施例において、半数体誘導体ＢＣ１材料「ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ」（ＢＣ１は戻し交配１世代＝７５％ＲＷＫＳ及び２５％Ｚ２１Ｓを意味する）を、２つの形質転換性の品種に交配した。半数体誘導体は、１５～１８％の半数体誘導率（非常に良い）及び０％の形質転換率を有する。この誘導体は、雄性花粉ドナーとして使用し、２つの商業的に重要な形質転換性のトウモロコシ系統からの雌穂に交配した：ｉ）５％の形質転換頻度、高い花粉量及び０％の半数体誘導率を有するＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３（ｎｏｎ－ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ系統）；並びにｉｉ）５０％の形質転換頻度、高い花粉量及び０％の半数体誘導率を有するＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４（ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ系統）。これらの交配は、２０１８年の春にＲＴＰ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの研究所で行った。ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３及びＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４系統の両方は、「正常Ａ」サイトタイプとして特定されたのに対して、ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ系統は、「正常Ｂ」サイトタイプを有する。表９において示されるアッセイにおいて、ＳＭ２９１８及びＳＭ４８１３は、ＣＭＳ細胞質（Ａ／Ａ）を正常Ａ又はＢ細胞質（Ｃ／Ｃ）と区別する；育種プロセスを始めるために使用される３つすべての系統は、正常細胞質（マーカーＳＭ２９１８及びＳＭ４８１３についてＣ／Ｃ）を有する。ＳＭ２９１４及びＳＭ４８１２は、正常Ｂ細胞質（それぞれＡ／Ａ及びＤ／Ｄ）を正常Ａ細胞質（それぞれＣ／Ｃ及びＩ／Ｉ）と区別する。正常Ａ細胞質は、トウモロコシにおいて、形質転換され、トランスジェニック植物を再生する能力と関連するのに対して（例えばＳｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．による国際公開第２０２０／２０５３３４号を参照されたい）、正常Ｂ細胞質は、形質転換に対してより抵抗性である。
ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳは、半数体誘導体材料として特定される。重要なことに、この半数体誘導体は、天然の母方の突然変異（ｍａｔｌ；４ｂｐ挿入）を有する。ＭＡＴＲＩＬＩＮＥＡＬ（別名ＮＯＴ ＬＩＫＥ ＤＡＤ及びＰＬＡ１；第１染色体上のトウモロコシＢ７３遺伝子ＩＤ ＧＲＭＺＭ２Ｇ４７１２４０）における突然変異は、例えばＫｅｌｌｉｈｅｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第１０，４４８，５８８号明細書及びＫｅｌｌｉｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７において記載されている。ＭＡＴＲＩＬＩＮＥＡＬにおける突然変異は、１％～７％の母系半数体誘導率（ＨＩＲ）しか与えない（すなわちｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子なしで、下記を参照されたい）。ＨＩＲは、半数体である交配の子の割合を指す；他の９３～９９％は、二倍体である。この率は、環境条件並びに交配される誘導体系統及び雌性系統の両方の遺伝的バックグラウンドによって影響を及ぼされ得る。下記に示される半数体誘導率の結果は、半数体誘導体（例えばＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ）及び非誘導体（例えばＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３又はＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４）系統について典型的なものである。ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳは、ｍａｔｌと組み合わせてより高いＨＩＲを与える他のＱＴＬ（例えばｑｈｉｒ８、下記を参照されたい）又は遺伝子のＨＩ対立遺伝子を有するので、より高い誘導率を有する。４ｂｐ挿入ｍａｔｌ対立遺伝子は、下記に及び表１０において記載されるように、部位特異的ＳＮＰマーカー（ＳＭ７２４６及びＳＭ７２５２）又は対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎマーカー（アッセイ２８２６及び２８２７）を使用して検出することができる。アッセイ２８２６は、野生型対立遺伝子を検出する；アッセイ２８２７は、４ｂｐ挿入、半数体誘導を誘発する突然変異対立遺伝子を検出する。アッセイＳＭ７２５２における「Ｉ」遺伝子型は、半数体誘導体系統における母方の遺伝子における４塩基対挿入対立遺伝子を指し（遺伝子のノックアウトを引き起こす）、「Ｄ」遺伝子型は、挿入がない対立遺伝子を指すことに注意されたい。「Ｄ」対立遺伝子は、機能的タンパク質産物がある、遺伝子の野生型バージョンである。
加えて、ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳは、第９染色体上に位置するｑｈｉｒ８と以前の研究において称される遺伝子座に半数体誘導エンハンサー対立遺伝子（ＨＩ対立遺伝子）を有する。この対立遺伝子は、半数体誘導率を向上させる。ｍａｔｌ突然変異対立遺伝子と組み合わせると、半数体誘導率は、他のＱＴＬ／遺伝子、環境条件、雌性生殖質遺伝群及び場合によっては他の因子などの一連の他の因子に依存して、このＱＴＬ対立遺伝子によって約１０～２０％まで押し上げられる。表１１におけるマーカーは、ｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子を有する系統と有していない系統とを区別するために使用することができる。ｑｈｉｒ８の位置は、マーカーＳＭ４８４９とＳＭ０９５６ＢＱとの間にマップされた。緻密なマッピング及びゲノム編集は、ｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子を担う遺伝子が、ＤＵＦ６７９ドメイン膜タンパク質７（略してＤＭＰ）として知られているＧＲＭＺＭ２Ｇ４６５０５３（Ｂ７３＿ｖ４）又はＺｍ００００１ｄ０４４８２２（Ｂ７３ｖ５）であり、それは、３，９１９，２３５位と３，９１９，８５２位との間のＢ７３ｖ５ゲノム中に位置することを示した。アッセイＳＭ８１３３は、ＤＭＰ遺伝子中に位置する。
ｍａｔｌベースの半数体誘導交配の間に、結果として生じる胚の大多数は、二倍体であり（通常、６５～９９％の間）、およそ１～３５％は、半数体である（「良い」半数体誘導体について平均するとおそらく１５～２０％）。誘導体染色体のセット又はＤＮＡを欠く胚（半数体）を特定し、誘導体の染色体のセット又はＤＮＡを有するもの（二倍体）からそれらを選び出すために、倍加半数体育種ルートが、遺伝的にコントロールされた視覚的形質を有することは重要である。トウモロコシにおいて、ほとんどの倍加半数体育種ルートは、種子の胚及び胚乳の両方において紫色又は赤色を発現する優性アントシアニン形質を与えるＲ１遺伝子の対立遺伝子を所持する誘導体系統を利用する。少なくとも２つの選択肢がある：Ｒ－ｎａｖａｊｏ（Ｒ－ｎｊ）、糊粉層（胚乳の最も外側の層）における非常に強力な発現及び胚における弱い発現と関連する対立遺伝子並びにＲ１－ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ（Ｒ１－ＳＣＭ２）、未発達の胚における強力な発現及び胚乳の糊粉における弱い発現と関連する対立遺伝子。両方の対立遺伝子は、Ｒ１遺伝子座と関連し、これは、トウモロコシＢ７３近交系ゲノムのバージョン５（Ｂ７３ｖ５）において、第１０染色体上の約１３９Ｍｂ～約１４０Ｍｂの位置のあたりにある。本実施例において育種するために使用される誘導体、ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳは、Ｒ１－ＳＣＭ２を有する。ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３及びＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４植物系統は、ほとんどのトウモロコシの優良な生殖質のように、Ｒ１遺伝子座にこの対立遺伝子又はＲ－ｎｊ対立遺伝子を有していない（これらの系統は、Ｒ１について野生型であり、種子又は穀粒においていかなる色誘導も有していない）。決定的に、Ｒ－ｎｊ及びＲ１－ＳＣＭ２色誘導対立遺伝子は、野生型に対して優性である。トウモロコシ生殖質は、Ｒ１－ＳＣＭ２（ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ）対立遺伝子を野生型ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３及びＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４対立遺伝子と区別するために、以下の３つの連鎖したマーカーを使用してアッセイすることができる（表１２に示す）。ＳＭ０９５３ＢＱ、ＳＭ６５６８及びＳＭ０９５４ＢＱについて、Ｒ１－ＳＣＭ２遺伝子型は、Ａ／Ａ、Ｔ／Ｔ及びＣ／Ｃであるのに対して、野生型遺伝子型は、それぞれＧ／Ｇ、Ａ／Ａ及びＡ／Ａである。
加えて、ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４生殖質において第９染色体上の８Ｍｂ～１０Ｍｂの位置に色阻害遺伝子座がある。この遺伝子座の色阻害対立遺伝子は、Ｒ１－ＳＣＭ２によって誘発される胚色素の蓄積を妨げる。メカニズムは明白ではないが、この対立遺伝子がＲ１－ＳＣＭ２に関連して存在する場合、胚の色は、通常ほど強力ではないかもしれない。ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３との新規誘導体の育種の間に、ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ親からの色誘導Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を選択した；ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４との新規誘導体の育種の間に、第９染色体上の色阻害因子についての野生型対立遺伝子（すなわち、色阻害対立遺伝子でない）に加えて、同じ対立遺伝子を選択したので（表１２において示されるアッセイを使用して）、結果として生じる誘導体は、可能性として色が強力である。
ＨＩ－ＮＡ系統の育種
新規な形質転換性の半数体誘導体を育種するための第１のステップは、重要である：形質転換性系統（例えばＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３又はＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４）を、半数体誘導体系統（例えばＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ）との交配において雌として使用する。このような交配は、母系の細胞質遺伝により、正常Ａ細胞質をＦ１子に自動的に与える、すなわち、雌性卵細胞は、そのミトコンドリア（従ってミトコンドリアゲノム）をその子孫に供与するのに対して、雄性生殖細胞（精細胞、花粉粒において見つけられる）は、ミトコンドリアを子孫に伝えない。約２０のＦ１植物は、成長させ、自家受粉し、少数の他のＦ１植物は、ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／ＲＷＫに戻し交配し、合計約７０００のＦ２又は「ＢＣ１」（戻し交配世代１）子孫を産出した。これらの子孫の種子は、同様に正常Ａ細胞質を自動的に遺伝によって受け継ぐ。ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３及びＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４の種子は、紫色を有する種子を選択することによって、Ｒ１－ＳＣＭ２形質を選び出す。黄色の種子は、廃棄した。黄色の種子は、優性Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子のメンデル分離により、種子の合計の約１／４を構成した（３／４は紫色であった）。下記に記載されるように、実生を生長させ、リーフパンチを、約５２００の紫色の種子を有するＢＣ１又はＦ２植物から採取し、上記に記載される半数体誘導体マーカーについて遺伝子型を同定した。
新規な形質転換性の半数体誘導体を育種するための第１のステップは、重要である：形質転換性系統（例えばＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３又はＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４）を、半数体誘導体系統（例えばＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ）との交配において雌として使用する。このような交配は、母系の細胞質遺伝により、正常Ａ細胞質をＦ１子に自動的に与える、すなわち、雌性卵細胞は、そのミトコンドリア（従ってミトコンドリアゲノム）をその子孫に供与するのに対して、雄性生殖細胞（精細胞、花粉粒において見つけられる）は、ミトコンドリアを子孫に伝えない。約２０のＦ１植物は、成長させ、自家受粉し、少数の他のＦ１植物は、ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／ＲＷＫに戻し交配し、合計約７０００のＦ２又は「ＢＣ１」（戻し交配世代１）子孫を産出した。これらの子孫の種子は、同様に正常Ａ細胞質を自動的に遺伝によって受け継ぐ。ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３及びＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４の種子は、紫色を有する種子を選択することによって、Ｒ１－ＳＣＭ２形質を選び出す。黄色の種子は、廃棄した。黄色の種子は、優性Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子のメンデル分離により、種子の合計の約１／４を構成した（３／４は紫色であった）。下記に記載されるように、実生を生長させ、リーフパンチを、約５２００の紫色の種子を有するＢＣ１又はＦ２植物から採取し、上記に記載される半数体誘導体マーカーについて遺伝子型を同定した。
ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／ＲＷＫ Ｆ２及びＢＣ１世代は、２０１８／２０１９年の冬にＲＴＰ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの温室において成長させた。すべての生長させた植物（合計５２１９）をサンプリングし、４つのリーフパンチを実生葉から得た。ＤＮＡを抽出し、ＴａｑＭａｎを、上記に概説されるアッセイで実行した。詳細には、リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子及び内在性コントロール遺伝子を同時に増幅するためにマルチプレックスＴａｑＭａｎ反応において設定した。サンプルごとに、アッセイは、抽出したゲノムＤＮＡサンプルをＴａｑＭａｎ ＰＣＲマスターミックス（プライマー及びプローブを補足したＪｕｍｐｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ）を含有する）と組み合わせることによって設定した。リアルタイムＰＣＲは、以下のパラメーターを使用してリアルタイムＰＣＲ装置において実行した：５分間９５℃、５秒間９５℃及び３０秒間６０℃を４０サイクル。実行後のデータ解析は、メーカーの指示に従って実行した。追加のＴａｑＭａｎ手順の詳細については、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０３００５４４号明細書（２００９年１２月７日に提出された）を参照されたい。
遺伝子型同定の判定を記録した後、５０００＋の植物から、好都合な半数体誘導体遺伝子型の組み合わせを有するとして遺伝子型を同定した１１７を選択し（それらの遺伝子型と一緒に、選択された及び選択されなかった植物の概要について表１３を参照されたい）、大きな鉢に移植し、次世代の種子を作るために自家受粉したが、少数は、半数体であり、不稔性により自家受粉することができなかった。ｍａｔｌ及びｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子に対する分離ひずみにより、Ｒ１－ＳＣＭ２又はｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子についてヘテロ接合であった追加の植物は、Ｆ３／ＢＣ１Ｆ２ファミリーの間でより広い遺伝的多様性を維持するために保管したが、多くの個体が、すべての半数体誘導体遺伝子座について固定されたホモ接合であることがわかった。それらの植物に由来する子孫は、分離しているので、それらは、下記に記載されるように、ＨＩＲ表現型同定（検定交雑）前にＦ３／ＢＣ１Ｆ２世代として遺伝子型を同定する必要があった。色阻害因子は、ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３のバックグラウンドにおいて色誘導に影響を及ぼすことが知られていなかったが、１１７の植物のこのセットにおいて、半数体誘導体対立遺伝子に対して一貫して固定されており（すなわち野生型対立遺伝子）、色誘導を確実にした。選択したＦ３又はＢＣ１Ｆ２雌穂を、２０１９年の夏の間、Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎに送った（下記に記載される）。
ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４ Ｆ２集団において、１９４の個体は、好都合な半数体誘導体遺伝子型の組み合わせを有することが特定された（それらの遺伝子型と一緒に、選択された及び選択されなかった植物の概要について表１４を参照されたい）。これらを選択し、次世代の種子を作るために自家受粉したが、半数体のものもあり、不稔性により自家受粉することができなかった。数個は、すべての半数体誘導体遺伝子座について固定（ホモ接合）されていた。ｍａｔｌ及びｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子に対する分離ひずみのために、Ｒ１－ＳＣＭ２、ｍａｔｌ又はｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子と第９染色体上のｑｈｉｒ８の近くの色阻害対立遺伝子についてヘテロ接合であることがわかった他の植物は、Ｆ３ファミリーの間でより広い遺伝的多様性を維持するために保管した。それらの植物に由来する子孫は、分離していたので、それらは、下記に示されるように、あらゆるＨＩＲ表現型同定（検定交雑）前にＦ３世代において遺伝子型を同定する必要があった。ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ Ｆ２において、植物は、色蓄積の阻害因子として作用するＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４対立遺伝子を持ち込むのを避けるために、第９染色体上の色阻害遺伝子についてＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／ＲＷＫ対立遺伝子のヘテロ接合性又はホモ接合性を選択した。このＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ Ｆ２集団は、２０１９年の夏の間、Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにおいて成長させた。選択したＦ３雌穂（自家受粉したＦ２からの）は、次いで、下記に記載されるように、遺伝子型同定のためにＧｒａｎｅｒｏｓ、Ｃｈｉｌｅに送った。
次のＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ世代について、５２０列を、２０１９年の夏にＪａｎｅｓｖｉｌｌｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの育種場において植え、４通り植えた９５のＦ３及び３５のＢＣ１Ｆ２サブファミリーとコントロールを含んだ。列ごとに、１つ又は複数の雌性テスターの列を、そばに植えた。ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳについては、約１８７のＦ３サブファミリーを代表する６９９列（２通り又は４通り植えた）を、Ｇｒａｎｅｒｏｓ、Ｃｈｉｌｅの育種場において雌性テスターの列のそばに植えた。ほとんどのサブファミリーについて、葉サンプルを、半数体誘導体遺伝子座ｑｈｉｒ８及び／又はＲ１－ＳＣＭ２の（並びにＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４については、色阻害遺伝子座の）遺伝子型同定のために得た。ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ対立遺伝子についてホモ接合であった選択された個体を、雌性テスターからの数個の雌穂に対して雄として検定交雑するために候補に挙げた。合計で、７７７の個体と数個のコントロールを、ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３ Ｆ３世代から検定交雑した。同様に、コントロールを含む８１３の個体を、ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４ Ｆ３世代から検定交雑した。野外チームは、花粉産生が低い又は雄穂開花期と絹糸抽出期の差が大きいなどの負の表現型を選り分けた。半数体誘導率は、受粉の約１５～２０日後に検定交雑した雌穂を収穫し、次いで、胚救出培地（４．４３グラムのビタミンありのムラシゲ・スクーグ基礎培地、３０グラムのスクロース及び７０ミリグラムのサリチル酸）を含有するペトリ皿に穀粒から胚を単離することによって決定した。ペトリ皿を、光に曝露した（例えば国際公開第２０１５／１０４３５８号において記載されており、これを参照されたい）。紫色（二倍体）及びクリーム色（半数体）の胚の数を、半数体誘導率（ＨＩＲ）として知られている半数体の頻度及び雌穂当たりの胚の合計を求めるために、それぞれの雌穂からカウントした。検定交雑のために使用した植物をさらに自家受粉した；種子は、Ｆ４又はＢＣ１Ｆ３種子を産出するためにＦ３又はＢＣ１Ｆ２植物のこの選択されたセットからの自家受粉した雌穂から収集した。表１５（ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４）及び表１６（ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３）において、代表的なプロット並びに固定されたｍａｔｌ及びｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子を有していないいくつかの成績が中程度の及び低い系統からの半数体誘導率、マーカー遺伝子型並びに胚の合計（半数体及び二倍体の胚に分けた）を示す。表１５は、すべてのＨＩ対立遺伝子について固定されたＦ３ ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ系統並びにｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子及び／又はｍａｔｌについてホモ接合野生型又はヘテロ接合であった系統を示す。すべての系統は、色阻害対立遺伝子及び二倍体において紫色の胚を与えるＲ１－ＳＣＭ２遺伝子について固定されていた。すべての誘導体対立遺伝子について固定された系統は、コントロール（ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ）と同様に、ＨＩＲが１０～１９％の範囲にあったのに対して、他の系統は、より低い半数体誘導率を有した。表１６は、すべてのＨＩ対立遺伝子について固定されたＦ３ ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ系統を示す。すべての系統は、二倍体において紫色の胚を与えるＲ１－ＳＣＭ２遺伝子について固定されていた。
ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳにおけるＦ３世代から、ｍａｔｌ、ｑｈｉｒ８の半数体誘導体対立遺伝子及びＲ１－ＳＣＭ２について固定されており且つ少なくとも１０％の半数体誘導率及び雌穂当たり少なくとも７０の穀粒の結実を有した４７の異なるＦ２由来のファミリーに由来する６３の個々の植物を特定した。少なくとも２０の穀粒を有したこれらの個体から自家受粉した雌穂を収穫し、次世代に進め、追加の検定交雑（半数体誘導率を決定するためのＦ４世代検定交雑）のための１つ又は複数の雄性の列を植えるために使用し、加えて、ほとんどの場合において、いくつかの種子を、Ｆ４世代形質転換率検定に回した。同様に、ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ集団におけるＦ３世代からのデータは、誘導体遺伝子について固定されており且つ＞１０％の半数体誘導率及び高い結実を有し且つ自家受粉した雌穂当たり少なくとも２０の穀粒があった４１のＦ３ファミリーに由来する７１の個体を特定するために使用した。これらを、Ｆ４世代に進めた。
ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ Ｆ４世代について（Ｇｒａｎｅｒｏｓ、Ｃｈｉｌｅ ２０１９／２０２０シーズンにおいてそれぞれ１又は通常２列×２雄性テスターを使用するＦ４ ＨＩＲ表現型同定からのデータに基づく８１の異なる植物系統からの１４０の雄性の列）、すべての系統が、半数体誘導率遺伝子／遺伝子座についてその時完全に固定されていたので、遺伝子型同定は、行わなかった。半数体誘導率表現型同定は、Ａｒｉｃａ、Ｃｈｉｌｅの育種及び倍加半数体の施設において実行し、形質転換検定は、ＲＴＰ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの研究センターで同じＦ４植物材料の約６０のサブセットに対して実行した。形質転換率検定について、バイナリーベクター＃１２６７２は、株ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４、ｐＶＧＷ７）を使用し、アグロバクテリウム介在性の形質転換を介して、自家受粉した３～１０の間のＦ４からプールした胚に送達した。ｐＡＬ４４０４及びｐＶＧＷ７ヘルパープラスミド及び病原性領域についての詳細な情報は、以下の参考文献によって記載されている：Ｔｅｒｕｙｕｋｉ Ｉｍａｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊａｐａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌ．Ｎｏ．２０１６００８３７３７，ＪＡＰＡＮ ＴＯＢＡＣＣＯ ＩＮＣ．，ＪＡＰＡＮ，２０１６；Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，７４５－７５０（１９９６）；及びＮｅｇｒｏｔｔｏ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｔｏ ｒｅｃｏｖｅｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１９，７９８－８０３（２０００）。バイナリーベクター及び検定構築物を含有するアグロバクテリウム株は、上記に引用されるＮｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）によって記載されるように調製した。トウモロコシ形質転換について、温室で成長させたトウモロコシ近交系ＮＰ２２２２からの未発達の胚を、Ｈｅｎｇ Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍａｉｚｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６７６，４１－５９（２０１８）に従って外植片として使用した。未発達の胚の単離、アグロバクテリウム接種及び未発達の胚とアグロバクテリウムの共培養は、上記に引用されるＺｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．によって記載されるように実行した。形質転換された組織及び推定トランスジェニックイベントは、以前に記載されるマンノース選択を使用して培地で産出した（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０００））。Ｆ４植物系統（植物材料）についての表現型同定結果を、表１５に要約する。
ほとんどのイベントは、検定した構築物及びプロトコールでは形質転換性ではなかったが、多くのイベントは、強力な半数体誘導率を有した。半数体誘導率遺伝子がＦ２及びＦ３世代において選択され、表現型がＦ３において選択されたのに対して、形質転換性に対する選択がなかったので（初めにＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３において約５％の形質転換頻度しかなく、ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳにおいては０％であった）、これは辻褄が合う。半数体誘導率が２つのテスター系統との数個の検定交雑した雌穂に基づくことに注意されたい。胚の合計（すなわち結実）は、ニック及び受粉した雌穂の数に強く影響を及ぼされた。胚の合計は、選択の測定基準として使用しなかった；それは、単に、半数体誘導率が胚の数に基づくことを示すことを意味する。３つの植物材料は、１０％＋形質転換率と特定された：１９ＢＤ９１５１４７、１９ＢＤ９１５８７５及び１９ＢＤ９１５１５８。最初の２つはまた、有望な＞１５％のＨＩＲをも有した。
さらなるＨＩＲ検定を、形質転換性でもある最良の誘導体に絞るために使用した。２０２０年の夏に、Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの育種場で、１０のＦ３世代ファミリー及び数個のＦ４サブファミリーに由来する４１のＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ Ｆ５世代の雄性の列を、半数体誘導率を評価するための検定交雑のために雌性テスター３列のそばに植えた。これらの系統のいくつかからの種子もまた、形質転換頻度について再検定するためにＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの施設に送った。Ｆ４及びＦ５世代試験の選択したセットの結果を、表１６に示す。これらの５つの系統は、Ｆ５世代において高成績の半数体誘導体系統である；最初の３つの系統における形質転換性については、いくらかの証拠がある（Ｆ４又はＦ５形質転換率検定からの）。示される系統は、下記に記載されるように、Ｆ６世代においてＨＩ－Ｅｄｉｔ実験に進めるために選んだものである。
Ｆ６世代種子は、これらの植物から自家受粉した雌穂から収穫し、ＨＩ－Ｅｄｉｔ検定のために次世代に進めた。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ形質転換及びＨＩ－Ｅｄｉｔ検定については実施例２を参照されたい。前の検定において、ＢＢＭの使用により、親植物材料の形質転換頻度を増強させた（表１７を参照されたい）。
ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４×ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ Ｆ４世代について、半数体誘導試験を、２０２０年の夏にＪａｎｅｓｖｉｌｌｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの育種場において行った。上記に述べられる７１の選択された植物材料を植え、３セットの雌性テスター雌穂によって検定交雑した；受粉の１５～２０日後に、雌穂を、ＨＩＲ評価のためにＲＴＰ、ＮＣサイトに再度発送した。同時に、系統のサブセットの形質転換率を、上記に記載される同じ形質転換プロセスを使用してＲＴＰサイトで決定し、Ｆ５世代種子を、自家受粉した植物の選択したサブセットから得て、次世代に進めた。結果を表１８に示す。
わずかな系統しか、この実験において高い形質転換頻度を呈しなかったが、ほとんどの系統は、非常に高い半数体誘導率（ほとんどが１０％超であり、１５％超のものもある）を有した。この成果は、Ｆ２及びＦ３世代における半数体誘導遺伝子（マーカー）の選択並びにＦ３世代における高ＨＩＲ表現型の選択と一貫している。従って、この集団は、半数体誘導率の遺伝的性質に富んでいた。対照的に、最初に行ったハイブリッド交配における正常Ａサイトタイプ母系親（ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４）の使用の他に、この時点まで、形質転換性表現型又は遺伝子（マーカー）の選択がなかった。ＨＩＲは、２つのテスター系統との数個の検定交雑した雌穂に基づき、雌穂の総数が提供される。結実は、雄穂開花期と絹糸抽出期の差によって影響を及ぼされることがあるかもしれない（誘導体雄性花粉飛散期間及び雌性テスター雌穂絹糸抽出日の同期）。この実験において、雄穂開花期と絹糸抽出期の差は、Ｆ３世代よりも小さかった（すなわち、花粉飛散とテスター雌穂絹糸抽出との間の時間が短くなった）。そのため、半数体誘導率及び形質転換率に加えて、評価の次のラウンド（Ｆ５世代）に進めるための最良の系統を特定するために、結実を、選択の測定基準として使用している。結実平均値は、雌穂の数によって、正常な（発育不全ではない、胚乳に生存能力のある）穀粒の総数を割り、両方のテスターを組み合わせることによって求めた。
２つのＦ４系統は、有望な性能を表した。最初に、系統１９ＳＮ９５２１９６は、５８％の形質転換頻度（ＴＦ）（他のいかなる既知のトウモロコシ系統形質転換率よりも高い）、１３％を上回る有望なＨＩＲ及び良い結実を有した。第２に、系統１９ＳＮ９５２４５４は、１３．７％のＴＦ、１５％を上回るＨＩＲ及び良い結実を有した。これらの２つの系統は、それぞれ、平均で雌穂当たりの半数体が２７及び３３であった。テスター雌穂の写真は、雄と雌との間に完全な同期がないことを明らかにし、雌穂の上部１／３が受粉されなかったので、雌穂は少し早く受粉されていたかもしれない。そのため、可能性として、雌穂の当たりの結実及び半数体といった測定基準がさらに高くなることがあるかもしれない。これらの２つの植物材料からの数個の個々の植物は、半数体誘導率性能検定及び様々なトウモロコシ品種にわたるＨＩ－Ｅｄｉｔｉｎｇ率を評価するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構築物を使用する形質転換（ＨＩ－Ｅｄｉｔスペクトル検定）を含むさらなる評価のためのＦ５種子ロットを産出するために自家受粉した。１９ＳＮ９５２１９６に由来するＦ５系統は、Ｆ４世代について上記に概説されるように、単純なアグロバクテリウムベースのプロセスを使用して形質転換したが、この時はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構築物を使用した。１９ＳＮ９５２４５４からのＦ５系統もまた、Ｆ４世代について上記に概説されるように、単純なアグロバクテリウムベースのプロセスを使用して形質転換したが、この時はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構築物を使用した。加えて、１９ＳＮ９５２４５４からのＦ５系統は、ＢＢＭ支援形質転換プロセスを使用して形質転換し、ＢＢＭ構築物及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構築物は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構築物の形質転換頻度を改善するために一緒に同時形質転換した。形質転換については実施例２を参照されたい。
加えて、強力な半数体誘導率性能を有するが、良い形質転換頻度を有していない（例えば１９ＳＮ９５１９２４）又は形質転換率データを有していない（検定に利用可能な種子がなかったため、例えば１９ＳＮ９５１９５８、１９ＳＮ９５２０１９及び１９ＳＮ９５２０７２）系統が少数あった。これらの系統は、平均で雌穂当たりの半数体が３５～４０であった。これらの４つのＦ４植物材料からの数個の個体は、追加の半数体誘導率性能検定及び様々なトウモロコシ品種にわたるＨＩ－Ｅｄｉｔｉｎｇ率を評価するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構築物を使用する形質転換（ＨＩ－Ｅｄｉｔスペクトル検定）を含むさらなる評価のためのＦ５種子ロットを産出するために自家受粉した。１９ＳＮ９５１９２４、１９ＳＮ９５１９５８、１９ＳＮ９５２０１９及び１９ＳＮ９５２０７２に由来するＦ５系統は、ＢＢＭ支援形質転換を介して形質転換し、ＢＢＭ構築物及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構築物は、形質転換頻度を改善するために一緒に同時形質転換した（実施例２を参照されたい）。
ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４バックグラウンドにおいて形質転換性を担う遺伝要因を特定するために、上記で（表１８において）検討されたＦ４系統を産出するために使用した親植物を、トウモロコシゲノム全体に均一に分散する４８０の多型ＳＮＰマーカーを使用して遺伝子型を同定した。形質転換について検定した表１８における系統のＧＷＡＳ解析は、マーカーＳＭ３１５８（ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４の遺伝子型はＧＧであり、マーカーはＢ７３ｖ５ １４，７４２，４０７位にある）とＳＭ４５８６（ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４の遺伝子型はＧＧであり、マーカーはＢ７３ｖ５ ７０，５６２，０７０位にある）との間の第３染色体上のＱＴＬの特定に至った。マーカーＳＭ４７８７（ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４遺伝子型はＧＧ）、ＳＭ３８１４（ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４遺伝子型はＣＣ）、ＳＭ３３６２（ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４遺伝子型はＧＧ）及びＳＭ０６３４ＡＱ（ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４遺伝子型はＧＧ）は、ＳＭ３１５８とＳＭ４５８６との間に配置され、これらもまた、ＱＴＬを特定するために有効であってもよい。＞５％の形質転換頻度を有する系統のセットを０％のものと比較すると、ＳＭ４７８７は、１．７のＧＷＡＳ ｌｏｇ１０値及びｐ値＜０．０２を有し、ＳＭ４５８６は、０．５７のｌｏｇ１０値を有し、ＳＭ３３６２は０．９０のｌｏｇ１０値を有する。＞５％のＴＦを有する系統のセットを＜５％のＴＦのものと比較すると、ＳＭ３８１４は１．６のＧＷＡＳ ｌｏｇ１０値を有し、ＳＭ４７８７及びＳＭ３１５８は１．３である。下記の表２１において、ＴＦ検定した植物系統のすべての遺伝子型を示す。最も高い形質転換率を有するトップ１０の形質転換性の系統のうちの７つは、好都合なＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４の遺伝子型を有する（下線を引く）。＜１％のＴＦの又は非形質転換性の系統の大部分は、好ましくない（ＲＷＫＳの）対立遺伝子を有する。
この情報に基づくと、Ｆ２、Ｆ３又は任意の他の世代においてこのＱＴＬ（本明細書において、ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１と称される）にＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４の対立遺伝子を有する植物の選択は、正常Ａサイトタイプと組み合わせて又は単独で、結果として生じる系統の形質転換性を富ませるかもしれない（すなわち、それは、より高い形質転換頻度に至るかもしれない）。この高形質転換率ＱＴＬ対立遺伝子は、トウモロコシ形質転換についての以前の研究において特定されていなかった。いかなる特定の理論によっても束縛されないが、このＱＴＬにおける１つ又は複数の遺伝子座と組み合わせた、正常Ａサイトタイプ（ミトコンドリア又は葉縁体における）における１つ又は複数の遺伝子座によって促される核－細胞質の相互作用又はコミュニケーションは、組み合わさって、高形質転換率を生むかもしれない。
トウモロコシ形質転換性におけるこのＱＴＬの重要性を検証するために、正常Ａサイトタイプを有する植物材料の多種多様なセットを、形質転換性能について評価し、このＱＴＬの遺伝子型を同定した。５つの最も形質転換性ではない系統（ＴＦ＜０．５％）は、これらのマーカーのすべてについて好都合な遺伝子型を有していなかった。対照的に、１３％を上回るＴＦを有したすべての系統は、マーカーのすべてについて好都合な遺伝子型を有した又は十分なデータを有していなかった（表１９を参照されたい）。示されるすべての系統は、マーカーについてホモ接合であったが、それらが近交系の植物系統であるので、意外なことではない。
１７２のマーカーを、第３染色体ＱＴＬ区間において評価し、遺伝子型同定の判定は、存在するＳＮＰがＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４のＳＮＰと一致したかどうかに基づいて行った。表２０は、第３染色体ＱＴＬ区間において評価した追加のマーカーを、Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおけるゲノム座標及びＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４における（すなわち、ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１ ＴＦ－ＱＴＬのＴＦ対立遺伝子における）それぞれのマーカーの遺伝子型と一緒にリストする。所与の品種とＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４との間のあらゆるミスマッチをカウントし、ＱＴＬ領域におけるミスマッチの総数を、表１９に示す。このデータから、解釈についての注記を作成した（「好都合」は、ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４との少なくとも８５％又は少なくとも９５％の一致を指す）。非常に形質転換性の品種がすべて好都合な対立遺伝子を有したが、非形質転換性の品種が好都合な対立遺伝子を有しない傾向があることに注意されたい。
実施例２．形質転換率及びＨＩ－Ｅｄｉｔ検定
表２１に示すＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３×ＲＷＫＳ由来植物材料の個々のＦ６世代雌穂種子ロットからの少なくとも４０の種子を、２０２０年１２月に、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａに位置するＳｙｎｇｅｎｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒの温室において形質転換のために植えた。
表２１に示すＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３×ＲＷＫＳ由来植物材料の個々のＦ６世代雌穂種子ロットからの少なくとも４０の種子を、２０２０年１２月に、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａに位置するＳｙｎｇｅｎｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒの温室において形質転換のために植えた。
別に、表２２に示すＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４×ＲＷＫＳ植物材料の４つのＦ５世代雌穂からの約４０のプールした種子を、２０２１年１月に同じ施設の温室において形質転換のために植えた。
バイナリー構築物、ベクターＩＤ＃２６２５８（図２；配列番号１７１）を、これらの植物材料からのＦ７世代の未発達の胚の形質転換のために構築した。ベクターは、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）選択可能マーカーカセット並びにＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ－Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ１２ａカセット並びに以下の遺伝子及び配列を標的にするように設計されたＣａｓ１２ａガイドＲＮＡを含有する２つのカセットを含む：第７染色体上のＯｐａｑｕｅ２（Ｚｍ００００１ｄ０１８９７１、ＣＴＧＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＣＴＧＡ；配列番号１７２）、ｃｈｒ９上のＷａｘｙ１（Ｚｍ００００１ｄ０４５４６２、ＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴ；配列番号１７３）、ｃｈｒ６上の黄色胚乳１（Ｚｍ００００１ｄ０３６３４５、ＣＴＡＴＣＴＴＡＴＣＣＴＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧ；配列番号１７４）、ｃｈｒ２上のＥ３ユビキチンリガーゼ２（Ｚｍ００００１ｄ００４１３９、ＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣ；配列番号１７５）及びｃｈｒ５上の推定ユビキチン－タンパク質リガーゼ（Ｚｍ００００１ｄ０１４９２０、ＧＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＴＡＴＣＴＧＡＡＧＧ；配列番号１７６）。ＣＲＩＳＰＲ／ＬｂＣａｓ１２ａガイドＲＮＡは、ラクノスピラ細菌ＮＤ２００６ ＬｂＣｒＲＮＡのダイレクトリピートを含んだ。Ｃａｓ９カセット（異なるガイドＲＮＡ及び多重化方法の使用を必要とする）もまたＣａｓ１２ａの代わりに使用することができたことに注意されたい（実際に、Ｑ．Ｑｕｅ及びＴ．Ｋｅｌｌｉｈｅｒに対する米国特許第１０５１９４５６号明細書、米国特許第１０２８５３４８号明細書Ｑ．Ｑｕｅ及びＴ．Ｋｅｌｌｉｈｅｒ並びにＫｅｌｌｉｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｅｌｉｔｅ ｃｒｏｐ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７，ｐａｇｅｓ ２８７－２９２において、Ｃａｓ９ベクターは、ＨＩ－Ｅｄｉｔベースのゲノム編集のために使用された）。標準形質転換プロトコールを使用してこのベクターにより４つの形質転換性の植物材料（１９ＳＮ９５２８２１、１９ＳＮ９５２８２２、１９ＳＮ９５２８７１及び１９ＳＮ９５２１９６）を形質転換することに加えて（実施例１において上記に概説される）、これらの系統の最初の３つと高いＨＩＲ及び結実を有する７つの他の系統（１９ＳＮ９５２７６３、１９ＳＮ９５３０９８、１９ＳＮ９５２４５４、１９ＳＮ９５２０１９、１９ＳＮ９５１９５８、１９ＳＮ９５１９２４、１９ＳＮ９５２０７２）からの胚を、ある特定の品種において形質転換体の数を押し上げるためのモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）ＷＵＳＣＨＥＬカセット（ｃＳｂＷＵＳ－０１；配列番号１７８）及びセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＢＡＢＹＢＯＯＭ１カセット（ｃＢｎＢＢＭ１－０２；配列番号１７９）、発根後にＷＵＳ、ＣＲＥ及びＢＢＭ１カセットの除去を可能にするための乾燥誘導性ＣＲＥ－ＬＯＸ切取りシステムを所持したベクター２４２８８（図３；配列番号１７７）により同時形質転換した。これらの実験のすべての形質転換頻度を、表２４及び２５において報告する。
以下の発生上の他の遺伝子は、形質転換頻度を増加させるために使用されてもよい：ＢＢＭ、ＢＢＭ－ＷＯＸ５、ＷＯＸ５（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５５７３を参照されたい）。参考として、ＢＢＭ、ＷＵＳ２又はＢＢＭ－ＷＵＳ２支援形質転換は、トウモロコシにおいて確証されている（Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ Ｂａｂｙ ｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｕｓｃｈｅｌ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｍｏｎｏｃｏｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２８，１９９８－２０１５；Ｈｏｅｒｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｕｓｅ ｏｆ ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ＺｍＷｕｓ２ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｍａｉｚｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｍｏｏｋｋａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ Ｂ７３ ａｎｄ ｓｏｒｇｈｕｍ Ｐ８９８０１２ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ＢＡＢＹ ＢＯＯＭ ａｎｄ ＷＵＳＣＨＥＬ２，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３６：１４７７－１４９１）。その代わりに、ＧＲＦ５システムを使用して（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ５ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｏｔ ａｎｄ Ｄｉｃｏｔ Ｓｐｅｃｉｅｓ，Ｆｒｏｎｔ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，Ｖｏｌ．１１，Ａｒｔ．５７２３１９）又はＧＲＦ４－ＧＩＦ１を利用することによって（Ｊ．Ｍ．Ｄｅｂｅｒｎａｒｄｉ，ｅｔ ａｌ．（２０２０），Ａ ＧＲＦ－ＧＩＦ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３８：１２７４－１２７９）、形質転換を押し上げてもよい。
表２４及び２５における形質転換実験と同時に、形質転換された親系統は、２０２１年の夏に半数体誘導性能の特徴について再検定し（それぞれ２つのテスター系統からの３つの雌穂からの平均のＨＩＲ及び結実に基づいて、高い誘導率及び結実は、一般に、Ｃａｓ１２ａ ２６２５８形質転換にかけたすべての系統について確認した。２０２１年の研究後のＳＹＮ－ＩＮＢＣ２３×ＲＷＫＳ（Ｉｏｄｅｎｔバックグラウンド）からの最上位の系統は、２０ＢＤ９１７２３３（１９ＳＮ９５２８２２からの）であり、これは、非常に強力な半数体誘導率及び結実の特徴を維持し（２０２１年に、誘導率は１５．８％、雌穂当たり２０７の種子（雌穂当たりの半数体は合計３２．３であった）、これは、野外試験において優れた性能及び農業形質を有し、低いが、安定した形質転換率（１．５％）を有し、ベクター２４２８８（ｃＳｂＷＵＳ－０１及びｃＢｎＢＢＭ１－０２ブースター）を有するアグロバクテリウムを介しての同時送達によって８．０％まで向上した（表２４）。別の実験において、Ｃａｓ１２ａゲノム編集ベクターのアグロバクテリウム介在性の形質転換を介した２０ＢＤ９１７２３３の形質転換率は、１．０％であり（１９６の胚から２つのＣａｓ１２ａ陽性イベント）、これは、トウモロコシＵｂｉ１プロモーター（配列番号１８２）によって駆動されるミナトカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（Ｂｒａｄｉ２ｇ５５２７０）からのＷＵＳＣＨＥＬホメオボックス遺伝子ＢｄＷＯＸ５／７（配列番号１８１）を含有するベクター２５０７２（配列番号１８０）によるアグロバクテリウム同時送達を使用して７．０％まで向上した（２４２の胚から１７のＣａｓ１２ａ陽性イベント）。
ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４×ＲＷＫＳファミリーについて、最上位の系統は、明白でなかった。２０ＡＬＬ１１３４ＶＧ＿ＭＭは、強力な誘導体であり、ＢＢＭ／ＷＵＳの存在下において７％の形質転換率を有したが、フィールドノートは、黄変及び他の農学的課題を示した。最も形質転換性の生殖質は、２０ＡＬＬ１１３４ＶＫ＿ＭＭ（２０．７％のＴＦ）であったが、それは、２０２１年に中程度から低い（約６％）半数体誘導率を有した（表２６）。ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４×ＲＷＫＳファミリーから優れた系統を特定するために（すなわち、高いＴＦ率及び強力なＨＩＲを有する新規なｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ＨＩ－Ｅｄｉｔ系統）、発明者らは、もともと１９ＳＮ９５２４５４及び１９ＳＮ９５２１９６に由来する発明者らが検定した形質転換性の誘導体に密接に関係する優良な誘導体の新規なパネルを選択するために２０２１年のＨＩＲデータを使用した（それらは、同じＦ４ファミリーに由来するＦ５～Ｆ７世代の近縁関係にあるもの／近縁系統である）。表２６における太字は、この文書の最終の提出時の形質転換及び再生カルスにおけるものである。
イベントを産出し、ＴａｑＭａｎアッセイ２７２３（ＰＭＩ－１４遺伝子を増幅した）及び３６３３（ＬｂＣａｓ１２ａ導入遺伝子を増幅した）を使用してＴ－ＤＮＡ挿入について検定した。Ｔ０イベントを温室に送り、開花まで成長させ、Ｔ１種子を産出するために自家受粉した。Ｔ０世代植物は、どのＴ１イベントがＨＩ－Ｅｄｉｔ試験における使用のための高いＣＲＩＳＰＲ活性を有するかを特定するために編集について検定した。標的部位の編集を判断するために、未編集の「野生型」対立遺伝子について高ＰＣＲコピー数を与えるが、編集された対立遺伝子ほど強く増幅もプローブもしない天然対立遺伝子ＴａｑＭａｎアッセイを利用する。発明者らはＣａｓ１２ａを使用しているので、発明者らは、典型的な編集が小さい欠失であると予想する（一般的に、Ｃａｓ１２ａ編集は、ＰＡＭ部位のおよそ８ｂｐ下流から始まる長さが６～１８ヌクレオチドの欠失に至る）。そのため、アッセイは、Ｃａｓ１２ａによって欠失させるこのエリアをカバーするプローブ配列を有する。例えば、アッセイ３６８６（ＴＱ２８１７）は、Ｗａｘｙ１に使用した：プローブＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＧＡ（配列番号１２７）は、ｇＲＮＡ標的配列ＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴ（配列番号１２８）とオーバーラップする。表２７は、他のアッセイのプライマーを示す。
Ｃａｓ１２ａベクターＴ－ＤＮＡ挿入の単一のコピーを有し、バックボーンなしであった数個のＴ０イベントを産生し、これらのイベントは、いくつかのバックボーンを含む多数のコピーを有した他と一緒に、Ｔｌ種子を作るために自家受粉した。ＣＲＩＳＰＲ Ｔ－ＤＮＡについてホモ接合であるＴ１植物（すなわち、Ｔ１植物は、ゲノム編集導入遺伝子の接合性を決定するためにＴａｑＭａｎアッセイを使用して遺伝子型を同定し、Ｔ１植物は、単一又は多数の挿入イベントにより安定して形質転換されたＣａｓ１２ａ及びガイドＲＮＡ編集機構の少なくとも２つのコピーを有した）は、Ｔ２種子を産出するよう、自家受粉するために選択した（表２８）。
結果として生じるＴ２植物は、編集機構（Ｔ－ＤＮＡ）について固定されたホモ接合である（さらに、これらは単一又は任意に多コピーであってもよい）。Ｔ０又はＴ１又はＴ２世代のいずれかで、Ｔ－ＤＮＡ＋植物は、「ＨＩ－Ｅｄｉｔ」を行うために任意のトウモロコシ近交系に他殖されてもよい。この実験において、Ｔ２種子は、ＮＰ２２２２などのｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ系統並びにＳＹＮ－ＩＮＢＤ４５（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＥ５６（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＦ６７（ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＧ７８（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＨ８９（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統、ＳＹＮ－ＩＮＢＩ９０（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＪ１３（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ Ｍｏ１７様系統）及びＳＹＮ－ＩＮＢＫ１４（ｔｒｏｐｉｃａｌ系統）を含むさまざまなトウモロコシ品種に他殖する。半数体は、特定し、（米国特許第１０，２８５，３４８号明細書；Ｋｅｌｌｉｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｅｌｉｔｅ ｃｒｏｐ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７（３）：２８７－２９２）において概説されるプロセスに従って編集について検定する。ｔｅｍｐｅｒａｔｅ、ｔｒｏｐｉｃａｌ、ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ又は他の生殖質からの編集された半数体植物は、次いで、特定し、倍加し、成熟するまで成長させ、編集されたＤＨ種子（純粋な近交系の編集された系統）を産出するために自家受粉し、これを、追加の育種及び種子産生プロセスのために使用する。すべてのＤＨ及びＤＨ１世代系統及び植物は、ホモ接合標的部位編集の実存及びＣＲＩＳＰＲ導入遺伝子（半数体誘導プロセスの間に消失したはずであった）がないことを確認するために評価する。
これらのイベントはすべて、少なくともｍａｔｌ、ｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子及びＲ１－ＳＣＭ２について固定された新規な半数体誘導体系統に由来するので、それらは、頑健な半数体誘導率を有しているはずであり、導入遺伝子の追加により、多くのトウモロコシ系統において効率的なレベルのＨＩ－Ｅｄｉｔを実現できるはずである。この実験において、Ｔ０イベントからの花粉を使用してＨＩ－Ｅｄｉｔを行うことは可能である。しかしながら、ホモ接合Ｔ１及びＴ２植物においてＨＩ－Ｅｄｉｔを行うことは好ましいかもしれない、なぜなら、これらの植物において、すべての花粉粒がＨＩ－Ｅｄｉｔの能力を所持し、すべてが遺伝子／ＱＴＬについて半数体誘導体対立遺伝子を有し、すべてがＣＲＩＳＰＲ導入遺伝子を所持するからである。Ｔ０花粉が使用される場合、半数体誘導体遺伝子座がすべての花粉粒において存在するが、ＣＲＩＳＰＲ機構は存在せず、単一コピーＴ０イベントについて、花粉の５０％しか、ＣＲＩＳＰＲ導入遺伝子を有しておらず、２コピー又はそれ以上のイベントについては、可能性として、花粉の５０％超が、分離に依存して導入遺伝子を有する。
ＨＩ－Ｅｄｉｔ受粉の間、編集されることになる雌性系統は、非半数体誘導体系統である（それらは、ＭＡＴＬ及びｑｈｉｒ８及びＲ１－ＳＣＭ２遺伝子座についてホモ接合野生型対立遺伝子を有し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集導入遺伝子を欠く）。子孫の胚は、研究室において他花受粉した雌穂からシャーレに抽出し、次いで、どれが編集された半数体であるかを決定するために、数個のアッセイにかける。子孫種子もまた、成熟するまで成長させてもよく、この時点で、半数体は、胚の色を調べることによって特定し、次いで、土壌で生長させてもよい。計画的な研究室ベースの方法において、胚を、抽出し、蒔き、次いで、それらが紫色（Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子の作用に由来する）を呈していれば二倍体のハイブリッドとして又はそれらがクリーム色であれば半数体として記録する。Ｒ１－ｎｊなどの他の色マーカーは、代わりに使用されてもよい。一般に、Ｖｉｊａｙ Ｃｈａｉｋａｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５），「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ Ｒ１－ｎｊ ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｐｌｏｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｉｚｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ１－ｎｊ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２８（１）：１５９－１７１を参照されたい。これは、二倍体ハイブリッドが雄性半数体誘導体花粉－ドナー系統からの優性Ｒ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を所持するのに対して、半数体が母系のゲノムからしか構成されず、従って、誘導体系統からのＲ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を有していない（すなわち、雄性ゲノムが失われている）からである。Ｒ１－ＳＣＭ２形質が種子において及びさらに植物のいくつかの部分において発現するので、半数体はまた、成熟段階又は実生段階において胚に色素がないことによって特定されてもよい。多くの場合、雌穂及び発達中の穀粒が受粉後の初期種子成熟期の間に受けた光の量に依存して、二倍体のハイブリッド胚は、抽出の際に紫色をしていないが、それらが紫色に変わる前に、だいたい２～３６時間、光に曝露させる必要がある（光がアントシアニン経路を活性化する）。胚は、受粉の１３～２２日後に（ＤＡＰ）抽出し、１０～２５のＤＡＰの抽出が理論的に可能であるが、１６～２４時間、光に曝露させ、半数体は保管し、二倍体は廃棄する。光による処置の間、胚は、コルヒチン（好ましい）、トリフルラリン又は別の染色体倍加剤などの染色体の倍加剤と接触させる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＣ．Ｌ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．による米国特許出願公開第２００４／０２１０９５９号明細書を参照されたい。その代わりに、染色体倍加剤は、発芽の間に単離された胚に又は土壌において生長させた半数体の実生に適用されてもよい。計画的実験において、推定半数体胚（クリーム色の）を、ｐｈｙｔａｔｒａｙにおいて生長させ、根及び葉を産出させる。成長の６～１４日後に、小さい葉サンプルを、推定半数体のどれが編集されているかを決定するために採取する。さらに、ＴａｑＭａｎアッセイ又は典型的なＰＣＲアッセイは、標的部位がこれらの推定半数体において編集されているかどうかを判断するために使用する。標的部位での突然変異の存在は、遺伝子標的に依存して、配列解析（ＤＮＡシークエンシング）によって、マーカー解析によって又はさらに視覚的表現型によってチェックすることができる。半数体植物において突然変異させるのはＤＮＡの一方のコピーだけなので、劣性表現型は、表されるはずであり、編集された半数体を特定するための別の方法とすることができる。同時に、標的部位に対するＴａｑＭａｎアッセイを実行し、推定半数体は、雄性親からのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集導入遺伝子及び半数体誘導体マーカーを検出するために設計されたＴａｑＭａｎアッセイによって真の半数体として確認され、真の半数体は、これらの遺伝子又は対立遺伝子のすべてを欠く（マーカーは野生型として現れる又は存在しない）。表２９は、編集された半数体のマーカーの成果の例を示す。
推定編集半数体は、未編集コントロールほど強くＷＴ対立遺伝子を増幅しない標的部位アッセイによって特定する、すなわち、推定編集半数体は、未編集コントロールの「２コピー」リードと比較して、「野生型」対立遺伝子について「０」又は「１」の結果を与える。同時に、すべての半数体は、ＭＡＴＬ、ｑｈｉｒ８及びＲ１－ＳＣＭ２についてホモ接合野生型遺伝子型を有し（少なくともＴａｑＭａｎマーカーアッセイＳＭ７２５２及びＳＭ４８４９）、トランスジェニックＣａｓ１２ａアッセイ３６３３について「ヌル」であることが予想され、それらが雄性親によって提供される誘導体対立遺伝子又は編集機構を有しないこと並びにそれらが編集されている場合、それらが雄性ゲノム消失及び半数体誘導の前に編集されたことを意味する。
この実験において、発明者らが生長させ、ＴａｑＭａｎのためにサンプリングするクリーム色の胚の中には、色阻害（すなわち、Ｒ１－ＳＣＭ２マーカーが発現されない若しくは紫色が現れない）、部分的な（不完全な）雄性ゲノム消失（すなわち、胚がキメラ又は異数体であり、部分的に誘導体ＤＮＡを欠いている）又は花粉混入（雌性自家受粉若しくは他の花粉による）のために、偽半数体のものもあることもまた、予想される。花粉混入によって産生される胚は、編集されない。偽陽性半数体が編集される場合（標的部位アッセイに基づく）、それらは、他のアッセイについて別個のパターンを有し（ＭＡＴＬ、ｑｈｉｒ８、Ｒ１－ＳＣＭ２の誘導体対立遺伝子又はＣＲＩＳＰＲ Ｔ－ＤＮＡ導入遺伝子が増幅される）、従って、特定し、真の編集半数体から選び出して分けることができる。
フローサイトメトリーを介した倍数性解析もまた、半数体としての植物のステータスを確認するために、倍数性解析装置において葉組織を使用して任意の推定編集半数体実生に対して実行する。この時、植物は、場合によっては、倍加半数体であるかもしれず（自然発生的な又は誘導されたゲノム倍加により）、これは、フローサイトメトリーの結果において、二倍体と同じになるであろう：遺伝子マーカーは、そのため、どの推定半数体（クリーム色の胚）が編集されるが、誘導体ゲノム及び編集機構を欠く若い植物に生長するかを明らかにするために重要である：これらは、真の編集半数体である。
ＨＩ－Ｅｄｉｔ花粉による交配からのそれぞれの雌性の「優良な」系統から単離された１，０００の胚のうち、およそ１００～２００が半数体であり、それらの半数体の中で、０～１００がガイドＲＮＡ標的部位で編集されていることが予想される。典型的に、半数体の編集の効率は、ＣＲＩＳＰＲ導入遺伝子及びＣａｓタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体が、受精後であるが半数体誘導の間の半数体誘導体ＤＮＡの自然な消失前の短期間の間しか、雌性の「優良な」ゲノムと同じ核中にいないので、典型的な形質転換植物よりも低い：雄性ゲノム消失は、受精の前に、受精の間に又は受精の数時間若しくは数日後に生じてもよい。過去のＨＩ－Ｅｄｉｔの試みにおいて（Ｑ．Ｑｕｅ及びＴ．Ｋｅｌｌｉｈｅｒに対する米国特許第１０５１９４５６号明細書、米国特許第１０２８５３４８号明細書 Ｑ．Ｑｕｅ及びＴ．Ｋｅｌｌｉｈｅｒ並びにＫｅｌｌｉｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ｅｌｉｔｅ Ｃｒｏｐ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７，ｐａｇｅｓ ２８７－２９２を参照されたい）、半数体編集頻度は、トウモロコシにおいて０～１０％の間にあることが観察された。
それぞれの標的遺伝子のガイドＲＮＡ標的部位で生じた編集の性質を決定するために、編集について陽性ヒットを与えるＴａｑＭａｎアッセイからのＰＣＲ断片を、市販で入手可能なＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ ＩＶキットの使用を通してサブクローニングし、それぞれのサブクローニング反応についての少なくとも４つのコロニーを、フォワード及びリバースプライマーによるサンガーシークエンシングを使用して配列決定する。小さい欠失が、野生型配列と比較して、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡカット部位（ＰＡＭ部位の約８～１０塩基対下流から始まる）で、推定上編集された植物からのＰＣＲ産物において特定されることが予想される。目的のガイドＲＮＡ標的部位について「０コピー」のＴａｑＭａｎ結果（すなわち、ＰＣＲ産物の増幅がない又はほとんどない）を与えた植物における編集もまた、予想されてもよい。半数体の中には、１つを超える標的部位が編集されたものも見られるかもしれない（米国特許第１０，２８５，３４８号明細書及びＫｅｌｌｉｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．２０１９を参照されたい）。編集を、予測されるタンパク質配列に対する影響について解析する。
実施例３．戻し交配戦略を使用するＨＩ－ＮＡ系統の育種
すべての世代（Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５まで）について自殖する代わりに、育種集団においてそれらのゲノムの割合を増強するために、プロセスにおける１つ又は複数のステップで、形質転換性のバックグラウンド（例えばＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４又はＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３）に戻し交配することを使用することを除いて、実施例１と同じプロセスを使用する。戻し交配する間に、戻し交配は、それら近交系と（雄性又は雌性植物としてそれらを使用する）重要な半数体誘導体遺伝子座（ｍａｔｌ、ｑｈｉｒ８、Ｒ１－ＳＣＭ２及び任意に色阻害因子）のそれぞれにＨＩ対立遺伝子の少なくとも１つのコピーを所持する育種集団植物との間で行う。マーカー支援による選択（遺伝子型同定）は、それら対立遺伝子についてヘテロ接合である植物を選択するために使用する（交配の前又は後に）。１回又は複数回戻し交配した後に、結果として生じる系統を、それら対立遺伝子の遺伝子型についてさらにスクリーニングし、すべての遺伝子座についてヘテロ接合である植物を、自家受粉し、次いで、遺伝子型同定を、それら遺伝子座のほとんど又はすべての半数体誘導体対立遺伝子についてホモ接合であるそれら植物を特定するために、再度使用する。自家受粉の任意の追加のラウンドを、それら遺伝子座のすべてをホモ接合にするために実行し、次いで、結果として生じる系統（例えばＢＣ２Ｆ３）を、形質転換率及び半数体誘導率の検定のために使用する。両方の表現型同定評価において良い結果を残す系統を、ＨＩ－Ｅｄｉｔに利用する（例えば、＞５％の形質転換率及び＞１２％のＨＩＲを有する系統）。
すべての世代（Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５まで）について自殖する代わりに、育種集団においてそれらのゲノムの割合を増強するために、プロセスにおける１つ又は複数のステップで、形質転換性のバックグラウンド（例えばＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４又はＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３）に戻し交配することを使用することを除いて、実施例１と同じプロセスを使用する。戻し交配する間に、戻し交配は、それら近交系と（雄性又は雌性植物としてそれらを使用する）重要な半数体誘導体遺伝子座（ｍａｔｌ、ｑｈｉｒ８、Ｒ１－ＳＣＭ２及び任意に色阻害因子）のそれぞれにＨＩ対立遺伝子の少なくとも１つのコピーを所持する育種集団植物との間で行う。マーカー支援による選択（遺伝子型同定）は、それら対立遺伝子についてヘテロ接合である植物を選択するために使用する（交配の前又は後に）。１回又は複数回戻し交配した後に、結果として生じる系統を、それら対立遺伝子の遺伝子型についてさらにスクリーニングし、すべての遺伝子座についてヘテロ接合である植物を、自家受粉し、次いで、遺伝子型同定を、それら遺伝子座のほとんど又はすべての半数体誘導体対立遺伝子についてホモ接合であるそれら植物を特定するために、再度使用する。自家受粉の任意の追加のラウンドを、それら遺伝子座のすべてをホモ接合にするために実行し、次いで、結果として生じる系統（例えばＢＣ２Ｆ３）を、形質転換率及び半数体誘導率の検定のために使用する。両方の表現型同定評価において良い結果を残す系統を、ＨＩ－Ｅｄｉｔに利用する（例えば、＞５％の形質転換率及び＞１２％のＨＩＲを有する系統）。
実施例４．ｔｒｏｐｉｃａｌ又はｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ ＨＩ－ＮＡ系統の育種
実施例１及び３において概説するのと同じプロセスを、形質転換性ｔｒｏｐｉｃａｌ半数体誘導体系統を選択するために使用する。すなわち、形質転換性のサイトタイプＡ ｔｒｏｐｉｃａｌ又はｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ系統（例えばＳＹＮ－ＩＮＢＡ１２）を、ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ又は別の半数体誘導体系統から提供される花粉によって雌性植物として交配する。Ｆ２又はＢＣ１集団（ｔｒｏｐｉｃａｌサイトタイプに系統を戻し交配する）は、次いで、最初の交配において産出されるＦ１植物から産出される。マーカー支援による選択を、次いで、用い、半数体誘導体系統からのｍａｔｌ、ｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子及びＲ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を含むＦ２及び／又はＢＣ１、ＢＣ２、Ｆ３、若しくはそれより後の世代の植物並びに任意に、第９染色体色阻害遺伝子座について野生型対立遺伝子を特定し、選択するために、表１０、表１１及び表１２におけるアッセイ（又はそれら同じゲノム領域からの他のアッセイ）を利用する。誘導体対立遺伝子の固定後の後の世代（例えばＦ４、Ｆ５又はＢＣ１Ｆ３若しくはＢＣ２Ｆ３など）で、形質転換率及び半数体誘導率を検定し、両方の表現型同定評価において良い結果を残す系統を、特定する（例えば、＞５％の形質転換率及び＞１２％のＨＩＲを有する系統）。これらの系統は、次いで、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ゲノム編集カセットのＨＩ－Ｅｄｉｔ形質転換のために使用する；結果として生じるＴ０、Ｔ１、Ｔ２又はそれより後の世代の形質転換系統は、実施例２において概説されるように半数体誘導及び同時のゲノム編集（ＨＩ－Ｅｄｉｔ）を誘発するために、他のｔｒｏｐｉｃａｌ、ｓｕｂ－ｔｒｏｐｉｃａｌ又はｔｅｍｐｅｒａｔｅ（ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ若しくは非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ）系統に交配するために使用する（例えばＳＹＮ－ＩＮＢＤ４５（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＥ５６（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＦ６７（ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＧ７８（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＨ８９（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統、ＳＹＮ－ＩＮＢＩ９０（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＪ１３（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ Ｍｏ１７様系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＫ１４（ｔｒｏｐｉｃａｌ系統）。編集された半数体のｔｒｏｐｉｃａｌ又はｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ又は他の生殖質植物を、次いで、特定し、倍加し、編集されたＤＨ種子（純粋な近交系の編集された系統）を産出するための自家受粉のために成熟するまで成長させ、これを、追加の育種及び種子産生プロセスのために使用する。
実施例１及び３において概説するのと同じプロセスを、形質転換性ｔｒｏｐｉｃａｌ半数体誘導体系統を選択するために使用する。すなわち、形質転換性のサイトタイプＡ ｔｒｏｐｉｃａｌ又はｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ系統（例えばＳＹＮ－ＩＮＢＡ１２）を、ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ又は別の半数体誘導体系統から提供される花粉によって雌性植物として交配する。Ｆ２又はＢＣ１集団（ｔｒｏｐｉｃａｌサイトタイプに系統を戻し交配する）は、次いで、最初の交配において産出されるＦ１植物から産出される。マーカー支援による選択を、次いで、用い、半数体誘導体系統からのｍａｔｌ、ｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子及びＲ１－ＳＣＭ２対立遺伝子を含むＦ２及び／又はＢＣ１、ＢＣ２、Ｆ３、若しくはそれより後の世代の植物並びに任意に、第９染色体色阻害遺伝子座について野生型対立遺伝子を特定し、選択するために、表１０、表１１及び表１２におけるアッセイ（又はそれら同じゲノム領域からの他のアッセイ）を利用する。誘導体対立遺伝子の固定後の後の世代（例えばＦ４、Ｆ５又はＢＣ１Ｆ３若しくはＢＣ２Ｆ３など）で、形質転換率及び半数体誘導率を検定し、両方の表現型同定評価において良い結果を残す系統を、特定する（例えば、＞５％の形質転換率及び＞１２％のＨＩＲを有する系統）。これらの系統は、次いで、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ゲノム編集カセットのＨＩ－Ｅｄｉｔ形質転換のために使用する；結果として生じるＴ０、Ｔ１、Ｔ２又はそれより後の世代の形質転換系統は、実施例２において概説されるように半数体誘導及び同時のゲノム編集（ＨＩ－Ｅｄｉｔ）を誘発するために、他のｔｒｏｐｉｃａｌ、ｓｕｂ－ｔｒｏｐｉｃａｌ又はｔｅｍｐｅｒａｔｅ（ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ若しくは非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ）系統に交配するために使用する（例えばＳＹＮ－ＩＮＢＤ４５（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＥ５６（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＦ６７（ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＧ７８（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＨ８９（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統、ＳＹＮ－ＩＮＢＩ９０（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ ｉｏｄｅｎｔ系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＪ１３（非ｓｔｉｆｆ ｓｔａｌｋ Ｍｏ１７様系統）、ＳＹＮ－ＩＮＢＫ１４（ｔｒｏｐｉｃａｌ系統）。編集された半数体のｔｒｏｐｉｃａｌ又はｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ又は他の生殖質植物を、次いで、特定し、倍加し、編集されたＤＨ種子（純粋な近交系の編集された系統）を産出するための自家受粉のために成熟するまで成長させ、これを、追加の育種及び種子産生プロセスのために使用する。
実施例５．Ｒ１－ＳＣＭ２又は第９染色体色阻害因子を選択しないＨＩ－ＮＡ系統の育種
この場合は、Ｒ１－ＳＣＭ２遺伝子（及び第９染色体色阻害因子）を、マーカー支援による選択を使用して選択しないことを除いて、実施例１、３及び４において概説するのと同じプロセスに従う；ｍａｔｌ及びｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子マーカーだけを、選択する。Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６若しくはＢＣ３Ｆ２、ＢＣ４Ｆ２又はそれより後の世代の選択された系統は、実施例２でのように、ＨＩ－Ｅｄｉｔに使用されることになるＣａｓ９又はＣａｓ１２又は他のゲノム編集カセット（形質標的のために設計されるガイドＲＮＡと）により形質転換し、種子又は胚において発現する可視又は蛍光マーカーをコーディングするカセットを含有する：これは、半数体を特定するために使用する。マーカー遺伝子の例は、例えばＺｅｉｎプロモーター（例えばＹ．Ｗｕ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，２０１２，Ｒａｐｉｄ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｌａｍｉｎ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ Ｍａｉｚｅ Ａｆｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｐｅｒｓａｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１９２，５０７－５１９において記載されるように、種子において高度で特異的な発現を与える）のコントロール下にある緑色蛍光タンパク質又は任意の他の蛍光タンパク質又は可視マーカー（ＧＵＳなど）である。
この場合は、Ｒ１－ＳＣＭ２遺伝子（及び第９染色体色阻害因子）を、マーカー支援による選択を使用して選択しないことを除いて、実施例１、３及び４において概説するのと同じプロセスに従う；ｍａｔｌ及びｑｈｉｒ８ ＨＩ対立遺伝子マーカーだけを、選択する。Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６若しくはＢＣ３Ｆ２、ＢＣ４Ｆ２又はそれより後の世代の選択された系統は、実施例２でのように、ＨＩ－Ｅｄｉｔに使用されることになるＣａｓ９又はＣａｓ１２又は他のゲノム編集カセット（形質標的のために設計されるガイドＲＮＡと）により形質転換し、種子又は胚において発現する可視又は蛍光マーカーをコーディングするカセットを含有する：これは、半数体を特定するために使用する。マーカー遺伝子の例は、例えばＺｅｉｎプロモーター（例えばＹ．Ｗｕ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，２０１２，Ｒａｐｉｄ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｌａｍｉｎ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ Ｍａｉｚｅ Ａｆｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｐｅｒｓａｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１９２，５０７－５１９において記載されるように、種子において高度で特異的な発現を与える）のコントロール下にある緑色蛍光タンパク質又は任意の他の蛍光タンパク質又は可視マーカー（ＧＵＳなど）である。
安定して形質転換された編集タンパク質システムの発現を駆動するプロモーターの選出は、半数体における編集の率に対して大きな影響を有しているかもしれないことに注意されたい。例えば、弱いプロモーター又は誘導性プロモーターは、他の環境効果がない限り、編集システムの発現を十分に駆動しないかもしれず、そのようなシナリオにおいて、半数体における編集率は、従って、低いかもしれない。恒常的サトウキビプロモーター（ｐｒＳｏＵｂｉ４）が使用されるが、胚嚢において、花粉において又は精細胞において高度な又は特異的な発現を駆動する他のプロモーターがより有効であるかもしれない（上記の表８及びそれに伴う記載を参照されたい）。
実施例６．ＭＡＴＬ及びＤＭＰの直接の突然変異ターゲティングを介したＨＩ－ＮＡ系統の育種
この場合は、Ｒ１－ＳＣＭ２遺伝子（及び任意に第９染色体色阻害因子）だけをマーカー支援による選択を使用して選択することを除いて、実施例１、３及び４において概説するのと同じプロセスを使用し、次いで、選択した系統を形質転換し、ゲノムを、より高い（＞７％）ＨＩＲを与えることができるＭＡＴＬ及びＤＭＰ遺伝子を標的にするＣＲＩＳＰＲカセットを使用して編集する。育種は、そのため、非常に単純化され、育種のゴールは、単純に、形質転換性のバックグラウンドに色マーカーを遺伝子移入することであり、高形質転換率は、可能性として、ほとんどの遺伝子移入植物材料において得ることができる。利点は、これが非常に速く安価な育種プロセスであるということである。ＢＣ３Ｆ２、ＢＣ４Ｆ２の世代又はそれより後の世代の後、選択された系統は、表３０におけるガイドＲＮＡの１つを使用して（ここで有効な他のガイドＲＮＡがある）ＭＡＴＬ及びＤＭＰ遺伝子においてノックアウト突然変異を誘発するように設計されるガイドＲＮＡを含有するＣａｓ９又はＣａｓ１２又は他のゲノム編集カセットにより形質転換する。標的遺伝子の両方に編集を有するＴ０植物を、特定し、自家受粉する。Ｃａｓ導入遺伝子を欠くが、編集されたｍａｔｌ及びｄｍｐ対立遺伝子についてホモ接合であるＴ１又はＴ２又はそれより後の世代の子孫を特定し、高（７％～２５％）ＨＩＲを確認するために使用する（Ｒ１－ＳＣＭ２色変化を利用する半数体選択マーカーにより）。その後、高誘導率及び非常に形質転換性の系統は、次いで、実施例２でのように、ＨＩ－Ｅｄｉｔのために使用されることになる新規なＣＲＩＳＰＲゲノム編集カセット（形質標的のために設計されるガイドＲＮＡと）により形質転換する。
この場合は、Ｒ１－ＳＣＭ２遺伝子（及び任意に第９染色体色阻害因子）だけをマーカー支援による選択を使用して選択することを除いて、実施例１、３及び４において概説するのと同じプロセスを使用し、次いで、選択した系統を形質転換し、ゲノムを、より高い（＞７％）ＨＩＲを与えることができるＭＡＴＬ及びＤＭＰ遺伝子を標的にするＣＲＩＳＰＲカセットを使用して編集する。育種は、そのため、非常に単純化され、育種のゴールは、単純に、形質転換性のバックグラウンドに色マーカーを遺伝子移入することであり、高形質転換率は、可能性として、ほとんどの遺伝子移入植物材料において得ることができる。利点は、これが非常に速く安価な育種プロセスであるということである。ＢＣ３Ｆ２、ＢＣ４Ｆ２の世代又はそれより後の世代の後、選択された系統は、表３０におけるガイドＲＮＡの１つを使用して（ここで有効な他のガイドＲＮＡがある）ＭＡＴＬ及びＤＭＰ遺伝子においてノックアウト突然変異を誘発するように設計されるガイドＲＮＡを含有するＣａｓ９又はＣａｓ１２又は他のゲノム編集カセットにより形質転換する。標的遺伝子の両方に編集を有するＴ０植物を、特定し、自家受粉する。Ｃａｓ導入遺伝子を欠くが、編集されたｍａｔｌ及びｄｍｐ対立遺伝子についてホモ接合であるＴ１又はＴ２又はそれより後の世代の子孫を特定し、高（７％～２５％）ＨＩＲを確認するために使用する（Ｒ１－ＳＣＭ２色変化を利用する半数体選択マーカーにより）。その後、高誘導率及び非常に形質転換性の系統は、次いで、実施例２でのように、ＨＩ－Ｅｄｉｔのために使用されることになる新規なＣＲＩＳＰＲゲノム編集カセット（形質標的のために設計されるガイドＲＮＡと）により形質転換する。
実施例７．育種を伴わないＨＩ－ＮＡ系統の作出
ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ ＢＣ１半数体誘導体又は任意の他の高成績の半数体誘導体系統を、ＨＩ－Ｅｄｉｔの目的のためにＣＲＩＳＰＲ導入遺伝子を送達するために、実施例２において概説されるようにＢＢＭ又は関係する優良な系統形質転換技術を使用して形質転換する。ＨＩ－Ｅｄｉｔにおける他のステップのすべては、実施例２でのように実行する。ここでの利点は、育種が必要とされないということであり、最高の半数体誘導体系統（誘導体遺伝子及び色マーカーのすべてを有する）を、ＨＩ－Ｅｄｉｔのために直接使用することができる。この実施例において、形質転換されることになる半数体誘導体系統は、正常Ａサイトタイプを有しておらず、それらは、１％未満のベースライン形質転換頻度を有する。このように、ＢＢＭ技術又は別の形質転換を押し上げる技術（実施例２を参照されたい）は、高成績の半数体誘導体系統の十分な形質転換を実現するために必要とされる。
ＲＷＫＳ／Ｚ２１Ｓ／／ＲＷＫＳ ＢＣ１半数体誘導体又は任意の他の高成績の半数体誘導体系統を、ＨＩ－Ｅｄｉｔの目的のためにＣＲＩＳＰＲ導入遺伝子を送達するために、実施例２において概説されるようにＢＢＭ又は関係する優良な系統形質転換技術を使用して形質転換する。ＨＩ－Ｅｄｉｔにおける他のステップのすべては、実施例２でのように実行する。ここでの利点は、育種が必要とされないということであり、最高の半数体誘導体系統（誘導体遺伝子及び色マーカーのすべてを有する）を、ＨＩ－Ｅｄｉｔのために直接使用することができる。この実施例において、形質転換されることになる半数体誘導体系統は、正常Ａサイトタイプを有しておらず、それらは、１％未満のベースライン形質転換頻度を有する。このように、ＢＢＭ技術又は別の形質転換を押し上げる技術（実施例２を参照されたい）は、高成績の半数体誘導体系統の十分な形質転換を実現するために必要とされる。
実施例８．Ｒ１－ＳＣＭ２又は第９染色体色阻害因子の選択を伴わないＭＡＴＬ及びＤＭＰの直接の突然変異ターゲティングを介したＨＩ－ＮＡ系統の作出
任意の系統（半数体誘導体系統ではない、さらに色マーカーを欠く系統）を、ＭＡＴＲＩＬＩＮＥＡＬ及びＤＭＰ遺伝子を標的にするように設計されるＣａｓ９又はＣａｓ１２ゲノム編集カセット及びガイドＲＮＡカセットを含む第１の構築物により形質転換する（実施例６でのように）。その系統を、次いで、新規なＨＩ－Ｅｄｉｔ系統として使用する。追加のガイドを、ＨＩ－Ｅｄｉｔに使用することができる第１の構築物中に含める又は好ましくは、新規な形質転換を、ＣＲＩＳＰＲなしのｍａｔｌ及びｄｍｐ突然変異Ｔ１又はＴ２系統に対して実行し（実施例５でのように）、ＨＩ－Ｅｄｉｔの目的のために新規なゲノム編集構築物を持ち込む。いずれの方法でも、ＨＩ－Ｅｄｉｔ構築物は、種子又は胚において発現する可視又は蛍光マーカーをコーディングするカセットを含有し、これは、半数体を特定するために使用する。このプロセスの利点は、ｍａｔｌ及びｄｍｐ編集が行われる限り並びにトランスジェニックマーカーが半数体を容易に特定することができるように含まれる限り、任意の形質転換性の系統をＨＩ－Ｅｄｉｔのために使用することができるということである。マーカー遺伝子の例は、実施例５において記載されるように、Ｚｅｉｎプロモーター（種子において高度で特異的な発現を与える）のコントロール下の緑色蛍光タンパク質である。
任意の系統（半数体誘導体系統ではない、さらに色マーカーを欠く系統）を、ＭＡＴＲＩＬＩＮＥＡＬ及びＤＭＰ遺伝子を標的にするように設計されるＣａｓ９又はＣａｓ１２ゲノム編集カセット及びガイドＲＮＡカセットを含む第１の構築物により形質転換する（実施例６でのように）。その系統を、次いで、新規なＨＩ－Ｅｄｉｔ系統として使用する。追加のガイドを、ＨＩ－Ｅｄｉｔに使用することができる第１の構築物中に含める又は好ましくは、新規な形質転換を、ＣＲＩＳＰＲなしのｍａｔｌ及びｄｍｐ突然変異Ｔ１又はＴ２系統に対して実行し（実施例５でのように）、ＨＩ－Ｅｄｉｔの目的のために新規なゲノム編集構築物を持ち込む。いずれの方法でも、ＨＩ－Ｅｄｉｔ構築物は、種子又は胚において発現する可視又は蛍光マーカーをコーディングするカセットを含有し、これは、半数体を特定するために使用する。このプロセスの利点は、ｍａｔｌ及びｄｍｐ編集が行われる限り並びにトランスジェニックマーカーが半数体を容易に特定することができるように含まれる限り、任意の形質転換性の系統をＨＩ－Ｅｄｉｔのために使用することができるということである。マーカー遺伝子の例は、実施例５において記載されるように、Ｚｅｉｎプロモーター（種子において高度で特異的な発現を与える）のコントロール下の緑色蛍光タンパク質である。
本開示において述べられる特許、特許公報、特許出願、雑誌記事、書物、技術的な参考文献及びその他同種のものはすべて、あらゆる目的のためにそれら全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示の図及び説明が、本開示の明白な理解のために関連するエレメントを示すよう単純化されたことが理解されるべきである。図は、設計図としてではなく、例証の目的のために示されることが認識されるべきである。省略された詳細及び変更又は代替の実施形態は、当業者の範囲内にある。
本開示のある特定の態様において、エレメント若しくは構造を提供するために又は所与の機能（複数可）を実行するために、単一の構成要素は、多数の構成要素によって置き換えられてもよく、多数の構成要素は、単一の構成要素によって置き換えられてもよいことを認識することができる。このような置換が本開示のある特定の実施形態を実施するのに効果がない場合を除いて、このような置換は、本開示の範囲内にあるとみなされる。
本明細書において示される実施例は、本開示の可能性としての特定の実施を示すことが意図される。実施例は、主に、当業者らに対する本開示の例証の目的のためのものであることが意図されることを認識することができる。本開示の精神から逸脱することなく本明細書において記載されるこれらの図表又は作業に変形物があってもよい。例えば、ある特定の場合において、方法のステップ若しくは作業は、異なる順序で実行されてもよい若しくは遂行されてもよい又は作業は、追加されてもよい、削除されてもよい若しくは変更されてもよい。
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に指示しない限り、その範囲の上限値と下限値との間の、下限値の単位の最も小さな小数部までのそれぞれの介在値もまた、明確に開示されることが理解される。明記される範囲における任意の明記される値又は明記されない介在値とその明記される範囲における任意の他の明記される値又は介在値との間の任意のより狭い範囲が、包含される。それらのより小さな範囲の上限値及び下限値は、独立して、範囲に含まれてもよく又は除外されてもよく、明記される範囲における任意の明確に除外される限界値に従って、より小さな範囲において限界値のどちらかが含まれる、どちらも含まれない、又は両方とも含まれるそれぞれの範囲もまた、技術の範囲内に包含される。明記される範囲が、一方又は両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除外する範囲もまた、含まれる。
前述の説明において、数多くの具体的詳細は、本発明のより徹底的な理解を提供するために記載される。しかしながら、本開示において記載される本発明が１つ又は複数のこれらの具体的詳細なしで実施されてもよいことは、当業者に明らかである。他の例において、当業者らによく知られている周知の特徴及び手順は、本発明を不明瞭にすることを避けるために記載しなかった。本開示の実施形態は、制限する目的ではなく例証の目的のために記載した。本発明が主に特定の実施形態を参照して記載されるが、他の実施形態が、本開示を読んだ際に、当業者らに明らかになることもまた想定され、このような実施形態が本発明の方法の範囲内に含有されることが意図される。したがって、本開示は、上記に記載される又は図面に描かれる実施形態に限定されず、種々の実施形態及び変更物は、下記の請求項の精神から逸脱することなく作製することができる。
Claims (45)
- パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子（ＭＡＴＬ）における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり且つ半数体誘導の増強と関連する少なくとも１つの量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＨＩ－ＱＴＬ）のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であるトウモロコシ植物であって、正常Ａ（「ＮＡ」）サイトタイプを有する、トウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、前記少なくとも１つのＨＩ－ＱＴＬの前記ＨＩ対立遺伝子についてホモ接合である、請求項１に記載のトウモロコシ植物。
- 前記少なくとも１つのＨＩ－ＱＴＬは、第９染色体上のｑｈｉｒ８（ＨＩ－ＱＴＬ ｑｈｉｒ８）である、請求項１又は２に記載のトウモロコシ植物。
- 前記ＨＩ－ＱＴＬ ｑｈｉｒ８のＨＩ対立遺伝子は、ＤＵＦ６７９ドメイン膜タンパク質７（ＤＭＰ）遺伝子における機能喪失型突然変異を含む、請求項３に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、形質転換頻度の増強と関連する少なくとも１つのＱＴＬ（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である、請求項１に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、前記少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬの前記ＴＦ対立遺伝子についてホモ接合である、請求項５に記載のトウモロコシ植物。
- 前記少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬは、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１（ＴＦ－ＱＴＬ ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１）である、請求項５又は６に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、選択可能マーカーを含む、請求項１に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、選択可能マーカーについてホモ接合である、請求項８に記載のトウモロコシ植物。
- 前記選択可能マーカーは、ＧＵＳ、ＰＭＩ、ＰＡＴ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、Ｂ１、ＣＩ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＣＣ３、ＡＡＤＡ、高油分、Ｒ－ｎａｖａｊｏ（Ｒ－ｎｊ）、Ｒ１－ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ（Ｒ１－ＳＣＭ２）、及び／又はアントシアニン色素のいずれか１つである、請求項９に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、第１０染色体上のＲ１遺伝子座のＲ１－ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ（Ｒ１－ＳＣＭ２）対立遺伝子についてホモ接合である、請求項１０に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおける８Ｍｂ～１０Ｍｂの位置で第９染色体上に位置する色阻害遺伝子座に相当する、前記トウモロコシ植物における色阻害遺伝子座の野生型対立遺伝子について、少なくともヘテロ接合である、請求項１１に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、ＤＮＡ修飾酵素を発現することができ、任意に少なくとも１つのガイド核酸を発現することができる、請求項１に記載のトウモロコシ植物。
- 前記ＤＮＡ修飾酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｄＣａｓ９－Ｆｏｋｌ、ｄＣａｓ１２ａ－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮｌ－ＦｏｋＩ、ＭｅｇａＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非Ｆｏｋｌヌクレアーゼ、ｄＣａｓ１２ａ非Ｆｏｋｌヌクレアーゼ、キメラＣａｓ１２ａ－シチジンデアミナーゼ及びＣａｓ１２ａ－アデニンデアミナーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼである、請求項１３に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｉｏｄｅｎｔ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｍｏ１７様生殖質、Ｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質、又はＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質の１種以上を含む、請求項１に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、系統Ｓｔｏｃｋ６、ＲＷＫ、ＲＷＳ、ＵＨ４００、ＡＸ５７０７ＲＳ、ＮＰ２２２２、ＳＹＮ－ＩＮＢＥ５６、ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３、ＳＹＮ－ＩＮＢＦ６７、ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４、ＳＹＮ－ＩＮＢＤ４５、ＳＹＮ－ＩＮＢＧ７８、ＳＹＮ－ＩＮＢＨ８９、ＳＹＮ－ＩＮＢＩ９０、ＳＹＮ－ＩＮＢＪ１３、及び／又はＳＹＮ－ＩＮＢＫ１４のいずれかに由来する、請求項１に記載のトウモロコシ植物。
- 形質転換頻度の増強と関連する少なくとも１つの量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であるトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、前記少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬの前記ＴＦ対立遺伝子についてホモ接合である、請求項１７に記載のトウモロコシ植物。
- 前記少なくとも１つのＴＦ－ＱＴＬは、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１（ＴＦ－ＱＴＬ ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１）である、請求項１７又は１８に記載のトウモロコシ植物。
- 前記トウモロコシ植物は、正常Ａ（「ＮＡ」）サイトタイプを有する、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のトウモロコシ植物。
- 形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物を産生するための方法であって：
ａ．第１のトウモロコシ植物からの花粉を提供することであって、前記第１のトウモロコシ植物は、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子（ＭＡＴＬ）遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、第２の遺伝子座のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であり、且つ形質転換抵抗性である半数体誘導体植物系統である、提供すること；
ｂ．第２のトウモロコシ植物を提供することであって、前記第２のトウモロコシ植物は、正常Ａ（「ＮＡ」）細胞質を含み、任意に、前記第２のトウモロコシ植物は、形質転換頻度の増強と関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である、提供すること；
ｃ．前記第１のトウモロコシ植物からの前記花粉により前記第２のトウモロコシ植物を受粉させること及びそれから少なくとも１つの二倍体の子孫植物を得ること；
ｄ．少なくとも一世代の間、前記少なくとも１つの二倍体の子孫植物を自殖すること及び／又は前記少なくとも１つの二倍体の子孫植物を前記第１のトウモロコシ植物若しくは前記第２のトウモロコシ植物に戻し交配すること；並びに
ｅ．ステップｄの交配から子孫を選択することであって、選択された前記子孫は、ＮＡサイトタイプを含み、前記ＭＡＴＬ遺伝子における前記機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、前記第２の遺伝子座の前記ＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であり、且つ任意に、前記ＴＦ－ＱＴＬの前記ＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である、選択すること
を含む方法。 - 形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物を産生するための方法であって：
ａ．第１のトウモロコシ植物からの花粉を提供することであって、前記第１のトウモロコシ植物は、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子（ＭＡＴＬ）遺伝子における機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、第２の遺伝子座のＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であり、且つ形質転換抵抗性である半数体誘導体植物系統である、提供すること；
ｂ．第２のトウモロコシ植物を提供することであって、前記第２のトウモロコシ植物は、形質転換頻度の増強と関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である、提供すること；
ｃ．前記第１のトウモロコシ植物からの前記花粉により前記第２のトウモロコシ植物を受粉させること及びそれから少なくとも１つの二倍体の子孫植物を得ること；
ｄ．少なくとも一世代の間、前記少なくとも１つの二倍体の子孫植物を自殖すること及び／又は前記少なくとも１つの二倍体の子孫植物を前記第１のトウモロコシ植物若しくは前記第２のトウモロコシ植物に戻し交配すること；並びに
ｅ．ステップｄの交配から子孫を選択することであって、選択された前記子孫は、前記ＭＡＴＬ遺伝子における前記機能喪失型突然変異についてホモ接合であり、前記第２の遺伝子座の前記ＨＩ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合であり、且つ前記ＴＦ－ＱＴＬの前記ＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である、選択すること
を含む方法。 - 前記第１のトウモロコシ植物は、前記第２の遺伝子座の前記ＨＩ対立遺伝子についてホモ接合である、請求項２１又は２２に記載の方法。
- 前記選択された子孫は、前記第２の遺伝子座の前記ＨＩ対立遺伝子についてホモ接合である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の遺伝子座は、半数体誘導の増強と関連するＱＴＬ（ＨＩ－ＱＴＬ）であり、前記ＨＩ－ＱＴＬは、第９染色体上に位置するｑｈｉｒ８（ＨＩ－ＱＴＬ ｑｈｉｒ８）である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＩ－ＱＴＬ ｑｈｉｒ８のＨＩ対立遺伝子は、ＤＵＦ６７９ドメイン膜タンパク質７（ＤＭＰ）遺伝子における機能喪失型突然変異を含む、請求項２５に記載の方法。
- 形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物を産生するための方法であって：
ａ．第１のトウモロコシ植物からの花粉を提供することであって、第１のトウモロコシ植物は、パタチン様ホスホリパーゼＡ２α遺伝子（ＭＡＴＬ）遺伝子の野生型対立遺伝子についてホモ接合であり、且つＤＵＦ６７９ドメイン膜タンパク質７（ＤＭＰ）遺伝子の野生型対立遺伝子についてホモ接合である、提供すること；
ｂ．第２のトウモロコシ植物を提供することであって、前記第２のトウモロコシ植物は、正常Ａ（「ＮＡ」）細胞質を含み、任意に、前記第２のトウモロコシ植物は、形質転換頻度の増強と関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（ＴＦ－ＱＴＬ）のＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である、提供すること；
ｃ．前記第１のトウモロコシ植物からの前記花粉により前記第２のトウモロコシ植物を受粉させること及びそれから少なくとも１つの二倍体の子孫植物を得ること；
ｄ．少なくとも一世代の間、前記少なくとも１つの二倍体の子孫植物を自殖すること及び／又は前記少なくとも１つの二倍体の子孫植物を前記第１のトウモロコシ植物若しくは前記第２のトウモロコシ植物に戻し交配すること；
ｅ．ステップｄの交配から子孫を選択することであって、選択された前記子孫は、ＮＡサイトタイプを含み、且つ任意に、前記ＴＦ－ＱＴＬの前記ＴＦ対立遺伝子について少なくともヘテロ接合である、選択すること；並びに
ｆ．野生型ＭＡＴＬ遺伝子及び／又はＤＭＰ遺伝子において機能喪失型突然変異を引き起こすために少なくとも１つの子孫植物を編集し、それによって、形質転換性の半数体誘導体トウモロコシ植物を得ること
を含む方法。 - 前記第２のトウモロコシ植物は、前記ＴＦ－ＱＴＬの前記ＴＦ対立遺伝子についてホモ接合である、請求項２１、２２又は２７に記載の方法。
- 前記選択された子孫は、前記ＴＦ－ＱＴＬの前記ＴＦ対立遺伝子についてホモ接合である、請求項２１、２２、２７又は２８に記載の方法。
- 前記ＴＦ－ＱＴＬは、第３染色体上のｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１（ＴＦ－ＱＴＬ ｑＣＹＴＯ－Ａ＿ＴＦ３．１）である、請求項２１、２２、２７、２８又は２９に記載の方法。
- 前記第１のトウモロコシ植物及び／又は前記第２のトウモロコシ植物は、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｉｏｄｅｎｔ生殖質、Ｎｏｎ－Ｓｔｉｆｆ Ｓｔａｌｋ Ｍｏ１７様生殖質、Ｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質、又はＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ生殖質の１種以上を含む、請求項２１、２２又は２７に記載の方法。
- 前記第１のトウモロコシ植物は、前記第２のトウモロコシ植物と異なるヘテローシス群に属する、請求項２１、２２又は２７に記載の方法。
- 前記第１のトウモロコシ植物及び／又は前記第２のトウモロコシ植物は、系統Ｓｔｏｃｋ６、ＲＷＫ、ＲＷＳ、ＵＨ４００、ＡＸ５７０７ＲＳ、ＮＰ２２２２、ＳＹＮ－ＩＮＢＥ５６、ＳＹＮ－ＩＮＢＢ２３、ＳＹＮ－ＩＮＢＦ６７、ＳＹＮ－ＩＮＢＣ３４、ＳＹＮ－ＩＮＢＤ４５、ＳＹＮ－ＩＮＢＧ７８、ＳＹＮ－ＩＮＢＨ８９、ＳＹＮ－ＩＮＢＩ９０、ＳＹＮ－ＩＮＢＪ１３、及び／又はＳＹＮ－ＩＮＢＫ１４のいずれかを含む、請求項２１、２２又は２７に記載の方法。
- 前記第１のトウモロコシ植物は、選択可能マーカーを含む、請求項２１、２２又は２７に記載の方法。
- 前記第１のトウモロコシ植物は、前記選択可能マーカーについてホモ接合である、請求項３４に記載の方法。
- ステップｅの選択された子孫は、前記選択可能マーカーについてホモ接合である、請求項３５に記載の方法。
- 前記選択可能マーカーは、ＧＵＳ、ＰＭＩ、ＰＡＴ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、Ｂ１、ＣＩ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＣＣ３、ＡＡＤＡ、高油分、Ｒ－ｎａｖａｊｏ（Ｒ－ｎｊ）、Ｒ１－ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ（Ｒ１－ＳＣＭ２）、及び／又はアントシアニン色素のいずれか１つである、請求項３６に記載の方法。
- 前記選択可能マーカーは、第１０染色体上のＲ１遺伝子座のＲ１－ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ（Ｒ１－ＳＣＭ２）対立遺伝子である、請求項３７に記載の方法。
- ステップｅの選択された子孫は、Ｂ７３ｖ５参照ゲノムにおける８Ｍｂ～１０Ｍｂの位置で第９染色体上に位置する色阻害遺伝子座に相当する、前記選択された子孫における色阻害遺伝子座の野生型対立遺伝子について、ホモ接合である、請求項３８に記載の方法。
- 形質転換されたトウモロコシ植物を得る方法であって、目的の配列をコードする異種ＤＮＡ分子を、請求項１に記載のトウモロコシ植物に形質転換することを含む方法。
- 前記異種ＤＮＡ分子を前記トウモロコシ植物に形質転換することは、パーティクルガン法、アグロバクテリウム介在性の形質転換、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）介在性の形質転換、又はグリコール介在性の形質転換によって行われる、請求項４０に記載の方法。
- ヌクレオチド配列の少なくとも１つは、ＢＡＢＹ ＢＯＯＭ（ＢＢＭ）、ＢＢＭ様、ＥＭＢＲＹＯＭＡＫＥＲ（ＥＭＫ）、ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＡ（ＡＮＴ）、ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＡ－ＬＩＫＥ（ＡＩＬ）、ＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）、ＷＵＳＣＨＥＬ（ＷＵＳ）又はＷＵＳホメオボックス（Ｗｏｘ）、ＧＲＦ（成長調節因子）、ＳＨＯＯＴ ＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ（ＳＴＭ）、ＡＧＡＭＯＵＳ様（ＡＧＬ）、ＭＹＢ１１５、ＭＹＢ１１８、体細胞胚形成受容体様キナーゼ（ＳＥＲＫ）、ＳＯＭＡＴＩＣ ＥＭＢＲＹＯ ＲＥＬＡＴＥＤ ＦＡＣＴＯＲ（ＳＥＲＦ）、ＯＶＵＬＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＰＲＯＴＥＩＮ（ＯＤＰ）、及びＡＴ－ＨＯＯＫ ＭＯＴＩＦ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＮＵＣＬＥＡＲ ＬＯＣＡＬＩＺＥＤ（ＡＨＬ）の群から選択される１種以上の形態形成因子をコードする、請求項４０又は４１に記載の方法。
- 前記異種ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ修飾酵素をコードし、任意に、少なくとも１つのガイド核酸をコードする、請求項４０に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ修飾酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｄＣａｓ９－Ｆｏｋｌ、ｄＣａｓ１２ａ－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮｌ－ＦｏｋＩ、ＭｅｇａＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非Ｆｏｋｌヌクレアーゼ、ｄＣａｓ１２ａ非Ｆｏｋｌヌクレアーゼ、キメラＣａｓ１２ａ－シチジンデアミナーゼ、及びＣａｓ１２ａ－アデニンデアミナーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼである、請求項４３に記載の方法。
- 植物ゲノムＤＮＡを編集する方法であって、
ａ．編集されることになる植物ゲノムＤＮＡを含む標的植物を提供すること；
ｂ．請求項１に記載のトウモロコシ植物からの花粉により前記標的植物を受粉させることであって、前記トウモロコシ植物は、ＤＮＡ修飾酵素を発現することができ、任意に、少なくとも１つのガイド核酸を発現することができる、受粉させること；並びに
ｃ．ステップｃによって産生される少なくとも１つの半数体の子孫を選択することであって、前記半数体の子孫は、前記標的植物のゲノムを含み且つ前記トウモロコシ植物のゲノムを含まず、前記半数体の子孫のゲノムは、前記トウモロコシ植物によって送達される前記ＤＮＡ修飾酵素及び任意のガイド核酸によって修飾されている、選択すること
を含む方法。
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