BR122022020300B1 - Processo para aumentar o rendimento de uma planta de milho resistente a helminthosporium turcicum - Google Patents
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Abstract
A presente invenção se refere a uma resistência da planta ao Helminthosporium turcicum melhorada, em particular, uma planta de milho, que compreende um polinucleotídeo com um ou mais genes que conferem resistência, por exemplo, em um fragmento de cromossomo truncado do acesso Pepitilla, bem como uma célula, um tecido, uma parte, grão e semente dessa, um polinucleotídeo isolado, que compreende um ou mais genes que conferem resistência contra Helminthosporium turcicum, um vetor, e uma célula de planta transgênica e uma planta transgênica, contendo esse polinucleotídeo. Além disso, a invenção se refere também a marcadores adequados e seu uso para introduzir a resistência ou o transgene em uma planta, bem como a identificação de plantas de milho melhoradas, que apresentam um fragmento de cromossomo truncado.
Description
[001] A presente invenção se refere ao campo da modificação de plantas por meio de métodos de biologia molecular e tecnologia de marcadores e da engenharia genética. Essa se refere a uma nova planta resistente ao Helminthosporium turcicum, em particular, a uma planta de milho, que compreende um polinucleotídeo com um ou mais genes que conferem resistência em um fragmento de cromossomo modificado do acesso Pepitilla, bem como uma célula, um tecido, uma parte, grão e semente dessa, um polinucleotídeo isolado, que compreende um ou mais genes que conferem resistência contra Helminthosporium turcicum, um vetor, uma célula de planta transgênica e uma planta transgênica, contendo esse polinucleotídeo. Além disso, através da invenção também são compreendidos marcadores moleculares adequados e seu uso para introduzir o locus de resistência ou o transgene em uma planta, bem como a identificação de plantas de milho melhoradas, que apresentam um fragmento de cromossomo modificado.
[002] No milho (Zea mays L.) são encontrados inúmeros patógenos fúngicos que causam doenças foliares. O fungo, que em condições climáticas tropicais, mas também em temperadas, tais como predominam em grandes partes da Europa e América do Norte, mas também na África e Índia, que de longe pode provocar os maiores danos, é conhecido por Helminthosporium turcicum ou como sinônimo também Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs (Teleomorphe: Setosphaeria turcica (Luttrell) Leonard & Suggs). O H. turcicum é o causador da doença de manchas foliares 'Northern Corn Leaf Blight' (NCLB), que em anos úmidos pode ocorrer de forma altamente prejudicial como epidemia em relação às variedades de milho susceptíveis e, então, tem como consequência perdas de rendimento significativas de 30% e mais em grandes áreas (Perkins & Pedersen, 1987; Raymundo & Hooker, 1981a; Ullstrup & Miles, 1957). Desde os anos de 1970, por conseguinte, foram pesquisadas resistências naturais em material genético. Hoje são conhecidas resistências quantitativas e qualitativas. Enquanto a resistência quantitativa herdada oligo- e poligeneticamente ocorre de modo incompleto e inespecífico para raças no fenótipo e é influenciada por genes adicionais e parcialmente predominantes, a resistência qualitativa é tipicamente específica de raças e pode ser herdada por genes individuais, na maioria predominantes, tais como Ht1, Ht2, Ht3, Htm1 ou Htn1 (Lipps e colaboradores, 1997; Welz & Geiger, 2000). Através de retrocruzamentos em inúmeras linhagens endogâmicas de milho frequentemente usadas, tais como W22, A619, B37 ou B73, sucede a introgressão dos genes Ht, onde essas mostraram uma dominância parcial e uma expressão dependendo da respectiva origem genética (Welz, 1998).
[003] Apesar dessa complexa arquitetura genética da resistência ao NCLB no milho, até agora principalmente o uso do gene Ht1 no milho junto com uma resistência quantitativa parcial foi suficiente para controlar a helmintosporiose (Welz, 1998). O motivo para isso é que a raça 0 de H. turcicum é mundialmente predominante com cerca de 55% com distância (Lipps e colaboradores, 197; Ferguson & Carson, 2007), enquanto outras raças, tais como 2N e 23N, ao contrário, ocorrem apenas de modo raro e muitas vezes geograficamente limitadas (Moghaddan & Pataky, 1994; Jordan e colaboradores, 1983; Lipps & Hite, 1982; Thakur e colaboradores, 1989; Welz, 1998). Essa raça 0 é avirulenta em comparação com uma planta de milho com Ht1, de modo que essa, provida de uma resistência quantitativa adequada, mostra ao todo uma resistência suficiente ao NCLB. Contudo, inúmeros estudos relatam sobre uma crescente propagação das raças menos frequentes (Jordan e colaboradores, 1983; Welz, 1998, Pratt & Gordon, 2006). Os motivos para isso são encontrados na dinâmica da população de um patógeno, que através de novas mutações em genes avirulentos e novas combinações de genes virulentos presentes, permitem alterações na virulência dos patógenos. Por fim, isso pode levar ao surgimento de novas raças patogênicas adaptadas, em parte mais agressivas. No Brasil, por exemplo, a população de H. turcicum já parece ser nitidamente mais diversa com respeito à composição da raça do que, por exemplo, na América do Norte. Gianasi e colaboradores (1996) relatam sobre raças de H. turcicum que já romperam a resistência que é conferida pelo gene. Acresce, neste caso, também a instabilidade dos genes resistentes em relação a certos fatores ambientais, tais como temperatura e intensidade luminosa em algumas zonas climáticas (Thakur e colaboradores, 1989). Esse desenvolvimento tem como consequência que, visto de modo global, o uso dos genes de resistência ao Ht até agora pouco observados ou novos, é cada vez mais importante para a produção de plantas de milho comerciais, para levar ao alvo de uma resistência ampla e permanente contra o H. turcicum no milho. Os primeiros sinais para esse fim já foram apresentados por Pataky e colaboradores no ano de 1998. Através do uso de uma combinação de Ht1 e Htn1, a resistência ao NCLB em grãos de milho Elite pôde ser melhorada.
[004] Uma origem da resistência monogênica ao Htn1 é o Landrace mexicano 'Pepitilla' (Gevers, 1975). As linhagens de introgressão Htn1 mostram um mapeamento do gene no braço longo do cromossomo 8 aproximadamente 10 cM distal de Ht2 e 0,8 cM distal do marcador RFLP umc117 (bin 8,06) (Simcox & Bennetzen, 1993). Ao contrário dos genes de resistência ao Ht restantes, o Htn1 confere uma resistência através de um retardamento do início da esporulação e, dessa maneira, reage contra o desenvolvimento de lesões. No resultado, isso leva a menos lesões e menores, bem como a zonas reduzidas de esporulação (Raymundo e colaboradores, 1981b, Simcox & Bennetzen, 1993). Não são formadas lesões clorótico-necróticas, tais como ocorrem na resistência mediada pelo Ht1, Ht2 ou Ht3 (Gevers, 1975). Contudo, a reação de resistência no estado heterozigótico do gene Htn1 é nitidamente mais ineficaz do que no estado homozigótico (Raymundo e colaboradores, 1981b).
[005] Um manuseio de reprodução melhorado do gene Htn1 prevê o desenvolvimento de marcadores específicos adicionais, para simplificar ainda mais a determinação do genótipo. Através da tecnologia MAS (marker assisted-selection) é possível, então, de modo eficiente, um 'stacking' ou 'pyramiding' de vários genes de resistência (Min e colaboradores, 2012). Em muitos estudos para o mapeamento do locus de resistência e para a identificação a fonte de resistência, foram usadas as linhagens de introgressão B37Htn1 ou W22Htn1 (Raymundo e colaboradores, 1981a, b; Simsox & Bennetzen, 1993, Bar- Zur e colaboradores, 1998; Coates & White, 1998). Informações sobre marcadores, que poderiam ser usados para a seleção do locus de resistência para Htn1 do acesso Pepitilla, neste caso, contudo, estão presentes apenas de modo restrito (Simsox & Bennetzen, 1993). Os marcadores conhecidos para Htn1 funcionais e flanqueando em relação ao locus de resistência do acesso Pepitilla mapeiam ainda aproximadamente 22,2 cM separadamente, o que no melhor dos casos permite selecionar um grande fragmento de cromossomo. Nesse caso, há, contudo, muitas vezes o risco, de que dentro desse fragmento entre os marcadores se realiza uma recombinação genética dupla, o que poderia ter como consequência uma seleção falso-positiva para o locus de resistência ao Htn1. Além disso, em alguns casos, com o tamanho do fragmento de cromossomo introgressado, aumenta também a probabilidade de assumir regiões genéticas indesejáveis em uma linhagem de introgressão e levar as mesmas através de gerações de linhagens Elite. Tais regiões genéticas, em particular, quando essas são estreitamente acopladas com o locus Htn1 e levam a efeitos nitidamente negativos em uma ou várias características agronômicas, são designadas como linkage drag. A partir de estudos conhecidos, que pesquisaram e usaram as linhagens de introgressão com Htn1 da Pepitilla, contudo, não são conhecidos tais efeitos negativos. Também as extensas pesquisas de Welz (1998), que também foram realizadas, entre outras, em B37Htn1, postulam, que com respeito, por exemplo, ao rendimento e amadurecimento através da introgressão do locus Htn1, não há quaisquer desvantagens significativas. Assim, no estado da técnica também não são encontrados quaisquer esforços sérios para encurtar ainda especificamente o grande fragmento de cromossomo.
[006] Ao contrário, o documento WO 2011/163590 publica o genótipo PH99N como fonte alternativa para uma resistência ao NCLB no cromossomo 8 bin 5 que, contudo, não correspondente ao acesso Pepitilla. Para a população de retrocruzamento produzida de PH99N, foram identificadas essencialmente apenas resistências contra as raças de H. turcicum 0 e 1. O fenótipo de resistência também não foi determinado de forma clara. Não obstante, os autores concluem, que a resistência seja atribuída ao gene Htn1. De fato, para PH99N conseguiu-se limitar o locus de resistência para um fragmento de cromossomo com um comprimento de apenas ~224 kb, uma planta de milho resistente com o fragmento 224 kb e, dessa maneira, o suposto Htn1, contudo, não foi publicado. Além disso, o genótipo PH99N também não foi tornado acessível ao público através de depósito.
[007] Um princípio alternativo para o aproveitamento do gene Htn1 é a identificação e clonagem do gene de resistência e seu uso em um princípio transgênico.
[008] Com a intenção de identificar o gene de resistência para NCLB, Chung e colaboradores 2010 publicaram um estudo para o mapeamento fino do locus de resistência bin 8.06. O fragmento de cromossomo pesquisado, contudo, não se originou de Pepitilla, mas sim, do híbrido do milho DK888, que apresenta uma resistência múltipla à doença. Pesquisas para a especificidade da raça Helmithosporium sugerem inicialmente, que o locus de resistência de DK888, designado como qNLB8.06DK888 está estreitamente ligado ou funcionalmente ligado com o gene Ht2 e o gene Htn1, visto que as cepas de Helminthosporium 23 e 23N eram virulentas (Chung e colaboradores, 2008). Uma comprovação definitiva para a presença de Htn1, contudo, não foi realizada na ausência de um N-isolado puro de H. turcicum. Além disso, o fenótipo de resistência com qNLB8.06DK888 também não correspondeu ao fenótipo a ser esperado com respeito ao surgimento de lesões cloróticas e ao retardamento da formação de lesão. Estudos complementares adicionais em Chung e colaboradores (2010) forneceram, por fim, referências, de que qNLB8.06DK888 está ligado ou de forma idêntica, alélica, estreitamente ligado ou ligado de forma funcional com Ht2, mas não com Htn1. O locus de resistência qNLB8.06DK888 pôde ser atribuído a um fragmento de cromossomo de 0,46 Mb. Anotações genômicas desse fragmento de cromossomo apontaram para 12 quadros de leitura putativos abertos, dos quais três poderiam representar cada um gene semelhante à proteína quinase em tandem (GRMZM2G135202; GRMZM2G164612) ou um gene semelhante à proteína fosfatase (GRMZM2G119720) e cada um é favorecido do mesmo modo como gene candidato promissor para o gene de resistência ao Ht2 (Chung e colaboradores, 2010). Não é descrita uma comprovaçãofuncional.
[009] Além disso, o documento WO 2011/163590 A1 também anota o suposto gene Htn1 na fonte de resistência PH99N como um gene semelhante à proteína quinase em tandem (GRMZM2G451147) e publica sua sequência genética, mas também não comprova sua funcionalidade, por exemplo, em uma planta de milho transgênica.
[0010] A presente invenção foi realizada no contexto do estado da técnica descrito acima, sendo que o objetivo da presente invenção é fornecer uma planta de milho, que apresenta uma resistência contra o patógeno Helminthosporium turcicum do doador Pepitilla e, com respeito às características agronômicas, essa é superior às plantas de milho conhecidas com resistência do doador Pepitilla.
[0011] Por um lado, o objetivo é resolvido por uma planta de milho, e cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo do doador Pepitilla, sendo que o fragmento de cromossomo compreende um intervalo do doador (a seguir, mencionado de primeiro intervalo ou intervalo 1), que mostra alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2 e apresenta um polinucleotídeos, que confere resistência contra o Helminthosporium turcicum na planta de milho e em que o fragmento de cromossomo não contém um outro intervalo do doador (a seguir, mencionado de segundo intervalo ou intervalo 2) entre um marcador em uma primeira região do marcador (M1), que é flanqueada pelos marcadores SYN14136 e PZE-108076510 e um marcador na segunda região do marcador (M2), que é flanqueada pelos marcadores SYN24931 e PZE-108077560. Essa e as soluções alternativas do objetivo descritas abaixo podem se basear em um programa de cultivo para a integração do locus Htn1 de Pepitilla em linhagens de milho. Opcionalmente também podem ser aplicados princípios de engenharia genética, através dos quais as plantas da presente invenção podem ser produzidas. Por exemplo, os princípios de engenharia genética são expostos abaixo em detalhes. Para produzir as plantas da presente invenção, é possível recorrer a diversos genótipos do estado da técnica. Em particular, B37HTN1, que apresenta o locus de resistência do Landrace 'Pepitilla', foi usado como linhagem de partida. Além da própria Pepitilla e B37HTN1 (também conhecido do estado da técnica como B37HtN), é possível usar quase todos os genótipos de milho conhecidos para a integração do locus HTN1 para produzir uma planta de milho de acordo com a invenção, em cujo genoma, em particular, no cromossomo 8 bin 5 ou 6, foi inserida uma introgressão do locus de resistência ao HTN1 de Pepitilla. A partir do estado da técnica são conhecidos, aqui, inúmeros exemplos de genótipos, por exemplo: W22Htn (por exemplo, Bar-Zur e colaboradores, 1998); H6314Htn (por exemplo, Bar-Zur e colaboradores, 1998), B73HtN (por exemplo, Shimoni e colaboradores, Journal of Phytopathology 131:4 (1991), 315-321), B68Htn e A632Htn (por exemplo, Carson, Plant Disease 79 (1995), 717-720) e A619Htn (por exemplo, Stankovic e colaboradores, Genetika 39:2 (2007), 227-240). Em uma planta de milho de acordo com a invenção, o fragmento de cromossomo provém do doador Pepitilla, em uma forma de concretização preferida da planta de milho de acordo com a invenção, o fragmento de cromossomo provém do doador B37HTN1 ou de um outro genótipo de milho mencionado acima. O B37HTN1 pode ser encomendado, por exemplo, através do Maize Genetics COOP Stock Center com a cepa ID 65749.
[0012] O fragmento de cromossomo integrado no genoma da planta de milho de acordo com a invenção provém do doador Pepitilla que, como se sabe, apresenta o locus de resistência ao HTN1. A introgressão desse locus de resistência está localizado no braço longo do cromossomo 8, bin 8.05 - 8.06. O fragmento de cromossomo integrado compreende o primeiro intervalo do doador, que apresenta um polinucleotídeo, que confere resistência contra Helminthosporium turcicum à planta de milho de acordo com a invenção. Neste caso, o polinucleotídeo compreende um ou mais genes que conferem resistência do locus HTN1 de Pepitilla (tabela 1) ou alelos do gene da mesma. Em condições de infestação, o gene ou alelo do gene com H. turcicum pode causar um fenótipo de resistência com as características típicas de HTN1. Preferivelmente, o polinucleotídeo compreende um ou mais genes que conferem resistência do locus HTN1 de Pepitilla selecionados de RLK1 e EXT1 (veja a tabela 1) ou alelos do gene da mesma, que em condições de infestação com H. turcicum causam um fenótipo de resistência com as características típicas do HTN1. De modo particularmente preferido, o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos, que codifica um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 6 ou um homólogo de um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 6, que em condições de infestação com H. turcicum causam um fenótipo de resistência com as características típicas do HTN1. Nessas características típicas do HTN1 incluem-se, por exemplo, o início retardado da esporulação, desenvolvimento reduzido de lesões, desenvolvimento de lesões menores, zonas de esporulação reduzidas e/ou nenhuma lesão ou apenas lesões clorótico-necróticas isoladas. Estruturalmente, o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, (a) que apresenta uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15, (b) que apresenta uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% para uma das sequências de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15, preferivelmente em todo o comprimento da sequência, (c) que hibridiza com uma fita complementar de uma molécula de ácido nucleico de acordo com (a) ou (b) em condições rigorosas, (d) que um polipeptídeo codifica com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16, (e) que um polipeptídeo codifica com uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma das sequências de aminoácidos de acordo com (d) ou (f) que apresenta uma sequência parcial de um ácido nucleico de acordo com (a) até (e). Em uma forma de concretização preferida, o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que apresenta uma molécula de ácido nucleico, (aa) que apresenta uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou 5, (bb) que apresenta uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em relação a uma das sequências de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou 5, preferivelmente em todo o comprimento da sequência, (cc) que hibridiza com a fita complementar de uma molécula de ácido nucleico de acordo com (aa) ou (bb) em condições rigorosas, (dd) que um polipeptídeo codifica com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou 6, (ee) que um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica codifica com uma das sequências de aminoácidos de acordo com (dd) ou (forma farmacêutica) que apresenta uma sequência parcial de um ácido nucleico de acordo com (aa) até (ee). Uma sequência parcial de uma molécula de ácido nucleico no sentido da presente invenção pode compreender pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou pelo menos 100 nucleotídeos sucessivos, além disso, pelo menos 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 nucleotídeos sucessivos. O polinucleotídeo pode estar presente no estado de heterozigoto ou homozigoto no genoma da planta de milho de acordo com a invenção; preferivelmente, o polinucleotídeo está presente no estado homozigoto. Tabela 1: Genes potenciais que conferem resistência do locus HTN1 de Pepitilla; nome do gene (coluna 1); referência às correspondentes SEQ ID Nos da sequência exon genômica (coluna 2); referência às correspondentes SEQ ID Nos da sequência de aminoácidos/proteína mencionada acima (coluna 3); gene homólogo anotado do genoma de referência B73 (coluna 4).
[0013] Além disso, o primeiro intervalo no fragmento de cromossomo, que mostra alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2, é caracterizado pela sequência de alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2, mas não é restrito a essa sequência de alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2. Isso significa que o primeiro intervalo mostra pelo menos o alelo do doador, que descreve o gene que confere resistência da tabela 1, opcionalmente com o alelo do doador do marcador MA0008. Além disso, o primeiro intervalo mostra preferivelmente pelo menos os alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2 de MA0021 até MA0022 (isto é, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022) ou de MA0005 até MA0022 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012 e MA0022) ou de MA0005 até MA0013 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022 e MA0013) ou de MA0005 até MA0014 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013 e MA0014) ou de MA0005 até MA0015 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014 e MA0015) ou de MA0005 até MA0016 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015 e MA0016), de modo particularmente preferido de MA0005 até MA0017 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016 e MA0017), MA0005 até MA0018 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018 e PZE-108095998), MA0005 até PZE-108096011 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998 e PZE-108096011) ou MA0005 até MA0019 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011 e MA0019), de modo muito particularmente preferido, de MA0005 até PZE-10809610 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019 e PZE- 108096610), MA0005 até MA0020 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE- 108096011, MA0019 e PZE-108096610 e MA0020), MA0005 até PZE- 108096791 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019, PZE-108096610, MA0020 e PZE-108096791) ou MA0005 até MA0006 (isto é, MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-108096011, MA0019, PZE-108096610, MA0020, PZE-108096791 e MA0006). Esse haplótipo resistente permite uma especificação nítida e identificação da fonte de resistência Pepitilla. Em particular, o primeiro intervalo está localizado entre os marcadores MA0004 e PZE-108097482, entre os marcadores MA0004 e MA0022, entre os marcadores MA0005 e PZE- 108097482 ou entre os marcadores MA0005 e MA0022. Preferivelmente, o primeiro intervalo descreve uma porção do fragmento de cromossomo, que pode conferir a resistência típica ao HTN1. Como tal, esse é o portador do polinucleotídeo mencionado acima. Tabela 2: Haplótipo resistente de B37HTN1:
[0014] Além disso, cada planta de milho de acordo com a invenção é uma planta de milho resistente ao Ht. A resistência ao Ht conferida pela integração do fragmento de cromossomo pode ser quantificada por meio da determinação de notas de avaliação em experimentos de fenotipificação de acordo com o esquema de acordo com a tabela 3 e exemplo 1. A), sendo que o nível de resistência diminui de 1 para 9. Plantas de milho resistentes ao Ht de acordo com a invenção, mostram uma resistência aumentada contra H. turcicum de pelo menos 1 nota de avaliação, preferivelmente de pelo menos 2 notas de avaliação ou pelo menos 3 notas de avaliação e de modo particularmente preferido, de pelo menos 4 notas de avaliação. Preferivelmente, uma planta de milho de acordo com a invenção mostra resistência pelo menos contra uma raça de Helminthosporium turcicum, que não corresponde à especificidade de raças conhecida, tal como essa é conhecida do estado da técnica. Em uma forma de concretização particularmente preferida, uma planta de milho de acordo com a invenção pode ser resistente contra todas as raças de Helminthosporium turcicum conhecidas, isto é, a resistência conferida é inespecífica para raças e de modo particularmente vantajoso pode ser adequada para formar uma ampla resistência contra Helminthosporium turcicum. Tabela 3: Esquema de notas de avaliação para experimentos de fenotipificação em diversas localizações com inoculação de H. turcicum natural e artificial (de acordo com o Comitê Alemão de Milho (DMK); AG Sortenwesen 27.02.02; (DMK J. Rath; RP Freiburg H.J. Imgraben)
[0015] O relatório descritivo publica a estrutura genética ou molecular do locus HTN1 através da especificação de um haplótipo, através do mapeamento de marcadores proeminentes, bem como através da identificação de genes candidatos para a conferência da resistência contra o patógeno Helminthosporium turcicum.
[0016] Surpreendentemente, a planta de milho de acordo com a invenção provou ser agronomicamente superior em experimentos geno- e fenotipificados no campo e estufa. Pois enquanto outras linhagens convertidas de um programa de cultivo para a integração do locus Htn1 de Pepitilla, bem como linhagens convertidas conhecidas do estado da técnica, tais como B37HTN1, além da resistência ao Ht conferida em condições de não infestação com H. turcicum e em condições ambientais comparáveis (temperatura, fornecimento de nutrientes, localização e assim por diante), mostram um nítido retardamento no tempo da flor masculina e/ou feminina em comparação com a linhagem correspondente sem introgressão (por exemplo, linhagem isogênica ou linhagem de partida), o tempo da floração na planta de milho de acordo com a invenção corresponde àquele de uma planta de milho comparativa isogênica, em cujo genoma um fragmento de cromossomo do doador Pepitilla não está integrado. Tempos de floração correspondem uns aos outros, quando esses desviam uns dos outros em menos de 2 dias. A ordem de grandeza do retardamento observado, nesse caso, depende fortemente da variedade de milho ou do genótipo do milho, dos fatores ambientais predominantes, tais como, por exemplo, qualidade do solo, umidade, precipitação, temperatura e assim por diante e/ou de estresse biótico, tal como, por exemplo, infestação por patógenos não com H. turcicum. O retardamento perfez pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 5 dias ou pelo menos 7 dias. Essa diferença verificada no tempo da floração é atribuída à ligação gênica Drag como parte da introgressão, o que é particularmente surpreendente, visto que tais observações não são conhecidas do estado da técnica. O tempo de floração é uma característica agronômica importante. Esse pode influenciar direta e essencialmente o potencial de rendimento de uma planta de milho. Um tempo de floração atrasado leva, nesse caso, via de regra, a um rendimento reduzido.
[0017] Para esclarecer a causa genética dessa desvantagem e para identificar a ligação gênica Drags, foram realizados, por exemplo, programas de retrocruzamento estendidos, acompanhados por geno- e fenotipificações. Os trabalhos foram assistidos por um intenso desenvolvimento de marcadores moleculares mais precisos e específicos no fragmento de cromossomo que porta o HTN1. A tecnologia para a seleção assistida por marcadores (MAS) e a realização de programas de retrocruzamentos direcionados (por exemplo, para o 'map based cloning') pode ser deduzida do estado da técnica (Gupta & Varshney, 2013). O QTL com a resistência ao HTN1 do doador B37HTN1 ou Pepitilla foi localizado com auxílio do marcador SSR bnlg 1067, umc1121, MA0002, MA0003, bnlg 1782, umc1287, umc1960 e bnlg240 nas gerações filiais no cromossomo 8 (bin 8.06) entre os marcadores MA0002 (tabela 4) e umc1287 (tabela 5) em uma faixa de 23,1 cM (veja a Figura 1). Em plantas de milho com o tempo de floração retardado, a posição da porção de sequência do doador genômico, que é responsável pela identificação da ligação gênica Drag identificada do tempo da floração, consegue determinar nitidamente um outro segundo intervalo do doador no fragmento do cromossomo (exemplo 3B; Figura 3). Em uma planta de milho de acordo com a invenção está integrado um fragmento de cromossomo, que não contém o segundo intervalo do doador. Aqui, o segundo intervalo provém, por exemplo, de um progenitor recorrente, que não é o portador da ligação gênica Drags, do tempo de floração ou de um fragmento de DNA homólogo introduzido de modo exógeno, que não é o portador da ligação gênica Drags, em um vetor doador para a recombinação homóloga específica. O segundo intervalo está em posição proximal e estreitamente acoplado ao locus de resistência ao HTN1 ou ao primeiro intervalo. O segundo intervalo é um intervalo entre um marcador em uma primeira região do marcador (M1), que é flanqueado pelos marcadores SYN14136 e PZE-108076510 e um marcador em uma segunda região do marcador (M2), que é flanqueado pelos marcadores SYN24931 e PZE-108077560. Os marcadores flanqueados podem ser retirados da tabela 4. Os marcadores SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 e PZE-108077560 são marcadores SNP para o uso no sistema de KBioscience-KASP (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp-genotyping-reagents/kasp- overview/). Esses definem nitidamente as regiões dos marcadores M1 e M2, nos dois lados da porção de sequência, que porta a ligação gênica Drag do tempo de floração no doador B37HTN1 ou Pepitilla. Como marcadores polimorfos esses também são adequados, além disso, para serem distinguidos entre o alelo do doador de Pepitilla e, por exemplo, o alelo do progenitor recorrente. Todos os dados para o uso desses marcadores como marcadores KASP podem ser retirados da tabela 4. Parâmetros de hibridização de primers exemplares para os PCR são reproduzidos no exemplo 2. Além disso, um especialista também é capaz de determinar outros parâmetros de hibridização adequados. Além disso, a atividade rotineira de um especialista no conhecimento das regiões dos marcadores descritos é desenvolver outros marcadores, além dos marcadores mencionados, em particular, marcadores polimorfos, em M1 e/ou em M2. Usando os marcadores SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 e PZE-108077560 ou mesmo marcadores desenvolvidos em M1 e/ou M2, o especialista pode verificar facilmente se em uma planta de milho, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo com locus de resistência ao HTN1 do doador Pepitilla, está contido ou não está contido o segundo intervalo do doador descrito acima. O especialista também está ciente, de que, por exemplo, no decorrer de um processo de cultivo ou de um princípio de engenharia genética para a recombinação direcionada, um intervalo cromossomal do doador, que compreende, por exemplo, sequências genômicas, que representam a ligação gênica Drag, podem ser removidas do fragmento de cromossomo integrado através de recombinação genética/homóloga. Neste caso, o intervalo do doador Pepitilla pode ser substituído pelo intervalo correspondente do genoma progenitor recorrente ou pelo fragmento de DNA homólogo introduzido de modo exógeno. Os marcadores de modo geral e os marcadores aqui publicados em particular, podem ser usados, neste caso, particularmente, apoiando a seleção. A seguir, seja reproduzida, por exemplo, um possível uso de marcadores para detectar um alelo: a detecção de um alelo pode compreender, por exemplo, (a) o isolamento de pelo menos uma molécula de ácido nucleico do genoma de uma planta ou de uma célula de planta/planta de milho ou de uma célula de planta de milho e (b) a pesquisa da molécula de ácido nucleico isolada com pelo menos um marcador, bem como opcionalmente (d) a sequenciação do alelo em um e/ou vários genótipos, (d) a detecção de um e/ou vários polimorfismos e/ou (e) a restrição com uma endonuclease de restrição, que pode produzir fragmentos de diversos tamanhos em um alelo marcador.
[0018] Uma forma de concretização preferida da planta de milho de acordo com a invenção é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém o segundo intervalo do doador, que é flanqueado a) pelos marcadores SYN14136 e PZE-108077560, b) pelos marcadores PZE-108076510 e PZE-108077560, c) pelos marcadores SYN14136 e SYN24931 ou d) pelos marcadores PZE- 108076510 e SYN24931.
[0019] Em uma forma de concretização preferida, a planta de milho de acordo com a invenção mostra um tempo diferente da flor masculina e/ou feminina em comparação com a linhagem convertida com Pepitilla ou com a planta convertida com Pepitilla, tal como B37HTN1, que contém o intervalo 2 entre um marcador em uma primeira região do marcador (M1), que é flanqueada pelos marcadores SYN14136 e PZE- 108076510 e um marcador em uma segunda região do marcador (M2), que é flanqueada pelos marcadores SYN24931 e PZE-108077560, sendo que o tempo diferente significa, que a linhagem convertida ou a planta convertida apresenta um retardamento de pelo menos 2 dias, de pelo menos 3 dias, de pelo menos 5 dias ou de pelo menos 7 dias.
[0020] Uma outra forma de concretização preferida da planta de milho de acordo com a invenção, é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo, além disso, não contém um intervalo do doador (a seguir, mencionado de terceiro intervalo ou intervalo 3) entre um marcador na segunda região do marcador M2 e um marcador em uma terceira região do marcador M3, que é flanqueada pelos marcadores PZE-108093423 (tabela 4) e PZE-108093748 (tabela 4). Os marcadores PZE-108093423 e PZE-108093748 são marcadores SNP para serem usados no sistema KBioscience-KASP (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp-genotyping-reagents/kasp- overview.). Esses definem nitidamente a região do marcador M3. Como marcadores polimorfos, esses também são adequados, além disso, para diferenciar entre o alelo do doador e, por exemplo, o alelo do progenitor recorrente. Todos os dados para usar esses marcadores como marcadores KASP podem ser retirados da tabela 4. Os parâmetros de hibridização de primers exemplares para os PCR são mostrados no exemplo 2. Além disso, um especialista também é capaz, de determinar outros parâmetros de hibridização adequados. Além disso, a atividade rotineira de um especialista no conhecimento da região descrita do marcador, é desenvolver, além dos marcadores mencionados, outros marcadores, em particular, marcadores polimorfos, em M3. Usando os marcadores do M2 mencionados acima e os marcadores PZE- 108093423 e PZE-108093748 aqui citados ou mesmo os marcadores desenvolvidos em M3, o especialista pode verificar facilmente se o terceiro intervalo do doador descrito acima está contido ou não está contido em uma planta de milho, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo com locus de resistência ao HTN1 do doador Pepitilla.
[0021] Uma outra forma de concretização preferida da planta de milho de acordo com a invenção é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém uma porção genética, que compreende o segundo intervalo e o terceiro intervalo do doador e é flanqueado a) pelos marcadores SYN14136 e PZE-108093423, b) pelos marcadores PZE-108076510 e PZE-108093423, c) pelos marcadores SYN14136 e PZE-108093748 ou d) pelos marcadores PZE- 108076510 e PZE-108093748.
[0022] Em um outro aspecto, foi possível determinar outras porções genéticas no fragmento do cromossomo, que em condições de não infestação com H. turcicum podem causar uma influência negativa significativa sobre o potencial de rendimento de uma planta de milho, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo com locus de resistência ao HTN1 do doador Pepitilla. Assim, independentemente do retardamento do tempo de floração descrito acima, as linhagens convertidas, do mesmo modo como as linhagens convertidas conhecidas do estado da técnica, tais como B37HTN1 mostram, além da resistência conferida, um rendimento nitidamente reduzido, em particular, um rendimento nitidamente reduzido da silagem em comparação com as linhagens correspondentes sem introgressão (por exemplo, linhagens isogênicas ou linhagens de partida). Isso se aplica mesmo para linhagens, em cujos genomas não está mais presente uma porção genética do doador, que consiste em intervalo 2 (entre um marcador de M1 e M2) ou intervalo 2 e 3 (entre um marcador de M1 e M3). Um especialista não espera por tais observações, visto que ele não obtém qualquer referência do estado da técnica a respeito de uma tal ligação gênica Drag em linhagens de introgressão HTN1. Para esclarecer a origem genética dessa desvantagem agronômica foram realizados, por exemplo, programas estendidos de retrocruzamento, acompanhados por geno- e fenotipificação. Os trabalhos foram apoiados por um intenso desenvolvimento de marcadores moleculares mais precisos e específicos no fragmento de cromossomo que porta o HTN1. Em plantas de milho com o rendimento reduzido (rendimento da silagem), conseguiu-se determinar nitidamente a posição das porções de sequências genômicas, que são responsáveis pela ligação gênica Drag identificada do rendimento da silagem, em dois outros intervalos do doador (a seguir, mencionado de quarto intervalo ou intervalo 4 e quinto intervalo ou intervalo 5) no fragmento de cromossomo de Pepitilla (exemplo 3C; Figura 3). Uma planta de milho de acordo com a invenção, que no fragmento de introgressão HTN1 de Pepitilla, ao invés do quarto e/ou quinto intervalo do doador que porta a ligação gênica Drag, apresenta um intervalo correspondente sem a ligação gênica Drag, por exemplo, do progenitor recorrente, não mostra qualquer rendimento reduzido da silagem e, dessa maneira, um rendimento, em particular, um rendimento da silagem, que corresponde àquele de uma linhagem comparável sem introgressão (por exemplo, linhagem isogênica ou linhagem de partida). O rendimento da silagem de uma planta de milho de acordo com a invenção sem o quarto e/ou o quinto intervalo do doador em comparação com uma planta de milho comparável com ligação gênica Drag do rendimento da silagem, pode ser maior em mais de 2%, de 3%, de 4%, de 5%, de 6%, de 7%, de 8%, de 9%, de 10%, de 15% ou de 20%. O quarto intervalo está em posição proximal e estreitamente acoplado ao locus de resistência HTN1 ou ao primeiro intervalo. O quinto intervalo está em posição distal e estreitamente acoplado ao locus de resistência HTN1 ou ao primeiro intervalo.
[0023] Por conseguinte, uma forma de concretização particularmente preferida da planta de milho de acordo com a invenção, é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém, além disso, i) o quarto intervalo do doador entre um marcador na terceira região do marcador M3 e um marcador em uma quarta região do marcador M4, que é flanqueada pelos marcadores MA0004 e MA0005 ou não contém ii) uma porção genética com o quarto intervalo entre um marcador na terceira região do marcador M3 e um marcador em uma sétima região do marcador M7, que é flanqueada pelos marcadores MA0005 e MA0021 e/ou em que o fragmento de cromossomo não contém, além disso, i) o quinto intervalo do doador entre um marcador em uma quinta região do marcador M5, que é flanqueada pelos marcadores MA0006 e PZE-108097483 e um marcador em uma sexta região do marcador M6, que é flanqueada pelos marcadores PZE-108107671 e SYN4196 ou não contém ii) uma porção genética com o quinto intervalo entre um marcador em uma oitava região do marcador M8, que é flanqueada pelos marcadores MA0022 e MA0013 e um marcador em uma sexta região do marcador M6, que é flanqueada pelos marcadores PZE-108107671 e SYN4196. Os marcadores flanqueantes podem ser retirados da tabela 4. Os marcadores MA0004, MA0005, MA0006, MA0013, MA0021, MA0022, PZE-108097482, PZE-108107671 e SYN4196 são marcadores SNP para serem usados no sistema KBioscience-KASP (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp-genotyping-reagents/kasp- overview/). Esses definem nitidamente as regiões dos marcadores M4, M5, M6, M7 e M8, que estabelecem as porções das sequências juntamente com M3, que no doador B37HTN1 ou Pepitilla portam a ligação gênica Drag do rendimento da silagem. Como marcadores polimorfos, esses podem ser diferenciados, além disso, também de modo adequado, entre o alelo do doador e, por exemplo, o alelo do progenitor recorrente. Todos os dados para usar esses marcadores como marcadores KASP podem ser retirados da tabela 4. Parâmetros de hibridização de primers exemplares adequados para os PCR são mostrados no exemplo 2. Além disso, um especialista também é capaz de determinar outros parâmetros de hibridização adequados. Além disso, a atividade rotineira de um especialista no conhecimento das regiões dos marcadores descritos é desenvolver, além dos marcadores mencionados, outros marcadores, em particular, marcadores polimorfos, em M4, em M5, em M6, em M7 e/ou em M8. Usando os marcadores MA0004, MA0005, MA0006, MA0013, MA0021, MA0022, PZE-108097482, PZE0108107671 e SYN4196 aqui citados ou mesmo os marcadores desenvolvidos em M4, em M5, em M6, em M7 e/ou M8 juntamente com os marcadores em M3 descritos acima, o especialista determina facilmente se em uma planta de milho, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo com locus de resistência HTN1 do doador Pepitilla, o quarto intervalo do doador descrito acima e/ou o quinto intervalo descrito acima está contido ou não está contido.
[0024] Uma outra forma de concretização particularmente preferida da planta de milho de acordo com a invenção, é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento do cromossomo não contém (i) uma porção genética, que compreende o segundo intervalo, o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN14136 e MA0004, b) pelos marcadores PZE- 108076510 e MA0004, c) pelos marcadores SYN4136 e MA0005 ou d) pelos marcadores PZE-108076510 e MA0005 ou não contém (ii) uma porção genética, que compreende o segundo intervalo e o terceiro intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN14136 e PZE-108093423, b) pelos marcadores PZE-108093423, c) pelos marcadores SYN14136 e PZE-108093748 ou d) pelos marcadores PZE- 108076510 e PZE-108093748 e o quinto intervalo do doador ou não contém (iii) uma porção genética, que compreende o segundo intervalo, o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN14136 e MA0005 ou d) pelos marcadores PZE- 108076510 e MA0005 e o quinto intervalo do doador.
[0025] Uma outra forma de concretização particularmente preferida da planta de milho de acordo com a invenção é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento do cromossomo não contém (i) uma porção genética, que compreende o segundo intervalo, o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN14136 e MA0021 ou b) pelos marcadores PZE- 108076510 e MA0021 ou não contém (ii) uma porção genética, que compreende o segundo intervalo, o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN14136 e MA0021 ou b) pelos marcadores PZE-108076510 e MA0021 e o quinto intervalo do doador ou não contém (iii) uma porção genética, que compreende o segundo intervalo, o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN14136 e MA0021 ou b) pelos marcadores PZE-108076510 e MA0021 e não contém uma segunda porção genética, que compreende o quinto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores MA0022 e PZE-108107671, b) pelos marcadores MA0022 e SYN4196, c) pelos marcadores MA0013 e PZE- 108107671 ou pelos marcadores MA0022 e SYN4196, c) pelos marcadores MA0013 e PZE-10817671 ou pelos marcadores MA0013 e SYN4196 ou (iv) não contém uma porção genética, que compreende o segundo intervalo e o terceiro intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN14136 e PZE-108093423, b) pelos marcadores PZE-108076510 e PZE-108093423, c) pelos marcadores SYN14136 e PZE-108093748 ou d) pelos marcadores PZE-108076510 e PZE- 108093748 e não contém uma segunda porção genética, que compreende o quinto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores MA0022 e PZE-108107671, b) pelos marcadores MA0022 e SYN4196, c) pelos marcadores MA0013 e PZE-108107671 ou pelos marcadores MA0013 e SYN4196 ou (v) não contém uma porção genética, que compreende o segundo intervalo, o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN14136 e MA0021 ou b) pelos marcadores PZE-108076510 e MA0021 e não contém uma segunda porção genética, que compreende o quinto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores MA0022 e PZE-108107671, b) pelos marcadores MA0022 e SYN4196, c) pelos marcadores MA0013 e PZE-108107671 ou pelos marcadores MA0013 e SYN4196.
[0026] O objetivo que serve de base à presente invenção é resolvido de forma alternativa por uma planta de milho, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo do doador Pepitilla, em que o fragmento de cromossomo compreende o primeiro intervalo do doador, que mostra alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2 e apresenta o polinucleotídeo, que na planta de milho confere resistência contra i Helminthosporium turcicum e em que o fragmento de cromossomo não contém i) o quarto intervalo do doador entre um marcador na terceira região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores PZE-108093423 e PZE-108093748 e um marcador na quarta região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores MA0004 e MA0005 ou não contém ii) uma porção genética com o quarto intervalo entre um marcador na terceira região do marcador M3 e um marcador na sétima região do marcador M7, que é flanqueada pelos marcadores MA0005 e MA0021. A descrição acima com respeito, por exemplo, aos marcadores, ao polinucleotídeo ou à fenotipificação é válida de modo correspondente também para essa e qualquer outra solução alternativa do objetivo, bem como às formas de concretização publicadas.
[0027] Uma forma de concretização preferida dessa planta de milho de acordo com a invenção, é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém i) o quarto intervalo do doador, que é flanqueado a) pelos marcadores PZE-108093423 e MA0004, b) pelos marcadores PZE-108093748 e MA0004, c) pelos marcadores PZE-108093423 e MA0005 ou d) pelos marcadores PZE- 108093748 e MA0005 ou não contém uma porção genética, que compreende o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores PZE-108093423 e MA0021 ou b) pelos marcadores PZE- 108093748 e MA0021.
[0028] Uma outra forma de concretização preferida da planta de milho de acordo com a invenção, é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém, além disso, o terceiro intervalo do doador entre um marcador na segunda região do marcador M2 e um marcador na terceira região do marcador M3.
[0029] Uma outra forma de concretização preferida da planta de milho de acordo com a invenção, é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém uma porção genética, que compreende o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN24931 e MA0004, b) pelos marcadores PZE-108077560 e MA0004, c) pelos marcadores SYN24931 e MA0005, d) pelos marcadores PZE-108077560 e MA0005, e) pelos marcadores SYN24931 e MA0021 ou f) pelos marcadores PZE- 108077560 e MA0021.
[0030] Uma outra forma de concretização preferida da planta de milho de acordo com a invenção, é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém i) além disso, o quinto intervalo do doador entre um marcador na quinta região do marcador M5 e um marcador na sexta região do marcador M6 ou ii) uma porção genética com o quinto intervalo entre um marcador na oitava região do marcador M8 e um marcador na sexta região do marcador M6.
[0031] Uma outra forma de concretização particularmente preferida da planta de milho de acordo com a invenção, é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém i) uma porção genética, que compreende o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN24931 e MA0004, b) pelos marcadores PZE-108077560 e MA0004, c) pelos marcadores SYN24931 e MA0005 ou d) pelos marcadores PZE- 108077560 e MA0005 e o quinto intervalo ou não contém ii) uma porção genética, que compreende o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN24931 e MA0004, b) pelos marcadores PZE-108077560 e MA0004, c) pelos marcadores SYN24931 e MA0005 ou d) pelos marcadores PZE-108077560 e MA0005 e não contém uma segunda porção genética, que compreende o quinto intervalo e é flanqueada a) pelos marcadores MA0021 e SYN4196, b) pelos marcadores MA0022 e PZE-108107671, c) pelos marcadores MA0013 e SYN4196 ou pelos marcadores MA0013 e PZE- 108107671.
[0032] Uma outra forma de concretização particularmente preferida da planta de milho de acordo com a invenção, é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém i) uma porção genética, que compreende o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN24931 e MA0021 ou b) pelos marcadores PZE-108077560 e MA0021 e o quinto intervalo ou não contém ii) uma porção genética, que compreende o terceiro intervalo e o quarto intervalo do doador e é flanqueada a) pelos marcadores SYN24931 e MA0021 ou b) pelos marcadores PZE- 108077560 e MA0021 e uma segunda porção genética, que compreende o quinto intervalo e é flanqueada a) pelos marcadores MA0022 e PZE-108107671, b) pelos marcadores MA0022 e SYN4196, c) pelos marcadores MA0013 e PZE-108107671 ou pelos marcadores MA0013 e SYN4196.
[0033] O objetivo que serve de base à presente invenção é resolvido de modo alternativo, além disso, por uma planta de milho, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo do doador Pepitilla, em que o fragmento de cromossomo compreende o primeiro intervalo do doador, que mostra os alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2 e apresenta o polinucleotídeo, que na planta de milho confere a resistência contra o Helminthosporium turcicum e em que o fragmento de cromossomo não contém i) o quinto intervalo do doador entre um marcador na quinta região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores MA0006 e PZE-108097482 e um marcador na sexta região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores PZE-108107671 e SYN4196 ou não contém ii) uma porção genética com o quinto intervalo entre um marcador na oitava região do marcador M8, que é flanqueada pelos , marcadores MA0022 e MA0013 e um marcador na sexta região do marcador M6, que é flanqueada pelos marcadores PZE-108107671 e SYN4196.
[0034] Uma outra forma de concretização preferida da planta de milho de acordo com a invenção é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo não contém, além disso, o terceiro intervalo do doador entre um marcador na segunda região do marcador M2 e um marcador na terceira região do marcador M3.
[0035] Uma outra forma de concretização particularmente preferida da planta de milho de acordo com a invenção é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo é flanqueado a) por um marcador na segunda região do marcador M2 e um marcador na sexta região do marcador M6, b) por um marcador na terceira região do marcador M3 e um marcador na sexta região do marcador M6, c) por um marcador na quarta região do marcador M4 e um marcador na sexta região do marcador M6, d) por um marcador na sétima região do marcador M7 e um marcador na sexta região do marcador M6, e) por um marcador na região do marcador M1 e um marcador na região do marcador M5, f) por um marcador na segunda região do marcador M2 e um marcador na quinta região do marcador M5, g) por um marcador na terceira região do marcador M3 e um marcador na quinta região do marcador M5, h) por um marcador na quarta região do marcador M4 e um marcador na quinta região do marcador M5, i) por um marcador na sétima região do marcador M7 e um marcador na quinta região do marcador M5, j) por um marcador na região do marcador M1 e um marcador na região do marcador M8, k) por um marcador na segunda região do marcador M2 e um marcador na oitava região do marcador M8, l) por um marcador na terceira região do marcador M3 e um marcador na oitava região do marcador M8, m) por um marcador na quarta região do marcador M4 e um marcador na oitava região M8 ou n) por um marcador na sétima região do marcador M7 e um marcador na oitava região M8.
[0036] Uma outra forma de concretização muito particularmente preferida das plantas de milho de acordo com a invenção é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo é flanqueado a) pelos marcadores SYN24931 e SYN4196, b) pelos marcadoresPZE-108077560 e SYN4196, c) pelos marcadores SYN24931 e PZE-108107671, d) pelos marcadores PZE-108077560 e PZE-108107671, e) pelos marcadores PZE-108093423 e SYN4196, f) pelos marcadores PZE-108093748 e SYN4196, g) pelos marcadores PZE-108093423 e PZE-108107671, h) pelos marcadores PZE- 108093748 e PZE-108107671, i) pelos marcadores MA0004 e SYN4196, j) pelos marcadores MA0005 e SYN4196, k) pelos marcadores MA0004 e PZE-108107671, l) pelos marcadores MA0005 e PZE-108107671, m) pelos marcadores MA0021 e SYN4196, n) pelos marcadores MA0021 e PZE-108107671, o) pelos marcadores PZE- 108076510 e MA0006, p) pelos marcadores SYN14136 e MA0006, q) pelos marcadores PZE-108076510 e PZE-108097482, r) pelos marcadores SYN14136 e PZE-108097482, s) pelos marcadores SYN24931 e PZE-108097482, t) pelos marcadores PZE-108077560 e PZE-108097482, u) pelos marcadores SYN24931 e MA0006, v) pelos marcadores PZE-108077560 e MA0006, w) pelos marcadores PZE- 108093423 e PZE-108097482, x) pelos marcadores PZE-108093748 e PZE-108097482, y) pelos marcadores PZE-108093423 e MA0006, z) pelos marcadores PZE-108093748 e MA0006, aa) pelos marcadores MA0004 e PZE-108097482, ab) pelos marcadores MA0005 e PZE- 108097482, ac) pelos marcadores MA0004 e MA0006, ad) pelos marcadores MA0005 e MA0006, ae) pelos marcadores MA0021 e PZE- 108097482, af) pelos marcadores MA0021 e MA0006, ag) pelos marcadores PZE-108076510 e MA0013, ah) pelos marcadores SYN14136 e MA0013, ai) pelos marcadores PZE-108076510 e MA0022, aj) pelos marcadores SYN14136 e MA0022, ak) pelos marcadores SYN24931 e MA0013, al) pelos marcadores PZE- 108077560 e MA0013, am) pelos marcadores SYN24931 e MA0022, an) pelos marcadores PZE-108077560 e MA0022, ao) pelos marcadores PZE-108093423 e MA0013, ap) pelos marcadores PZE- 108093748 e MA0013, aq) pelos marcadores PZE-108093423 e MA0022, ar) pelos marcadores PZE-108093748 e MA0022, as) pelos marcadores MA0004 e MA0013, at) pelos marcadores MA0005 e MA0013, au) pelos marcadores MA0004 e MA0022, av) pelos marcadores MA0005 e MA0022, aw) pelos marcadores MA0021 e MA0013, ax) pelos marcadores MA0021 e MA0022.
[0037] Uma outra forma de concretização particularmente preferida das plantas de milho de acordo com a invenção é uma planta de milho descrita acima, em que o fragmento de cromossomo está localizado a) entre um marcador na segunda região do marcador M2 e um marcador na sexta região do marcador M6, b) entre um marcador na terceira região do marcador M3 e um marcador na sexta região do marcador M6, c) entre um marcador na quarta região do marcador M4 e um marcador na sexta região do marcador M6, d) entre um marcador na sétima região do marcador M7 e um marcador na sexta região do marcador M6, e) entre um marcador na primeira região do marcador M1 e um marcador na quinta região do marcador M5, f) entre um marcador na segunda região do marcador M2 e um marcador na quinta região do marcador M5, g) entre um marcador na terceira região do marcador M3 e um marcador na quinta região do marcador M5, h) entre um marcador na quarta região do marcador M4 e um marcador na quinta região do marcador M5, i) entre um marcador na sétima região do marcador M7 e um marcador na quinta região do marcador M5, j) entre um marcador na região do marcador M1 e um marcador na região do marcador M8, k) entre um marcador na segunda região do marcador M2 e um marcador na oitava rem M8, l) entre um marcador na terceira região do marcador M3 e um marcador na oitava região do marcador M8, m) entre um marcador na quarta região do marcador M4 e um marcador na oitava região do marcador M8 ou n) entre um marcador na sétima região do marcador M7 e um marcador na oitava região do marcador M8. Tabela 4: Sequências iniciadoras do marcador KASP e a relação com os alelos de doadores B37HTN1 provenientes do Landrace Pepitilla (alelo X e alelo Y: descrevem os valores bialélicos dos SNPs)
[0038] A presente invenção refere-se, além disso, a uma semente ou a um grão, a um tecido, um órgão, uma parte e uma célula das plantas de milho de acordo com a invenção descritas acima. Neste caso, a semente ou o grão é uma semente ou um grão, em cujo genoma o fragmento de cromossomo das formas de concretização da invenção é integrado.
[0039] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para a identificação de uma planta de milho resistente ao H. turcicum, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo do doador Pepitilla, compreendendo a detecção de pelo menos dois alelos no genoma da planta, sendo que pelo menos um alelo está localizado em uma porção genômica, que é flanqueada por um marcador na primeira região do marcador M1, na segunda região do marcador M2, na terceira região do marcador M3, na quarta região do marcador M4 ou na sétima região do marcador M7 e é flanqueada pelo polinucleotídeo descrito acima, que na planta de milho confere resistência contra o H. turcicum e sendo que pelo menos um alelo está localizado em uma porção genômica, que é flanqueada pelo polinucleotídeo e por um marcador na sexta região do marcador M6, na quinta região do marcador M5 ou na oitava região do marcador M8. As regiões dos marcadores, bem como, os marcadores nessas regiões dos marcadores são descritos acima. Preferivelmente, a planta de milho identificada é uma planta de milho de acordo com a invenção. A invenção refere-se, além disso, também a uma planta de milho, que foi identificada com o processo mencionado para a identificação.
[0040] Em um outro aspecto, a presente invenção compreende um processo para aumentar o rendimento de uma planta de milho resistente ao H. turcicum, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo do doador Pepitilla, sendo que o processo compreende uma etapa, que causa a remoção do segundo intervalo do doador, do quarto intervalo do doador ou do quinto intervalo do doador e sendo que o fragmento de cromossomo compreende o primeiro intervalo do doador descrito acima, que mostra alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2 e apresenta um polinucleotídeo, que na planta de milho confere resistência contra o Helminthosporium turcicum. Por exemplo, a remoção pode ser obtida através de recombinação genética durante um processo de cruzamento entre duas plantas de milho, sendo que uma planta de milho progenitora porta o locus de resistência HTN1 de Pepitilla. Além do uso de tecnologias de cultivo convencionais para produzir uma recombinação genética, que tem como resultado a substituição de pelo menos um dos intervalos de doadores identificados acima com ligação gênica Drag, por sequências genômicas do progenitor recorrente, que são preferivelmente livres de genes indesejáveis, a moderna biotecnologia põe à disposição do especialista diversas outras ferramentas, que permitem uma engenharia de genoma precisa. Às ferramentas conhecidas incluem-se, por exemplo, (meganucleases (Silva e colaboradores, 2011), endonucleases de Horning (Chevalier 2002), nucleases de dedo de zinco, nucleases TALE (documento WO 2010/079430; WO 2011/072246) ou CRISPR (Gaj e colaboradores, 2013). Aqui, trata-se de proteínas de fusão de nucleasse artificial, que são capazes de cortar especificamente moléculas de ácido nucleico de fita dupla, tais como DNA de plantas e, com isso, produzir rompimentos de fita dupla em posição desejadas no genoma. Através do aproveitamento dos mecanismos próprios da célula para reparar rompimentos induzidos da fita dupla, pode ser causada, então, uma recombinação homóloga ou um 'nonhomologous end-joining', que pode levar à remoção do intervalo do doador que porta a ligação gênica Drag. Sequências alvo adequadas no genoma para os domínios de reconhecimento das nucleases acima podem ser mostradas, por exemplo, nas informações de sequências em relação aos marcadores SNP (tabela 4) ou em seus intervalos. Contudo, um especialista também é capaz de identificar outras sequências, preferivelmente dentro ou entre as regiões dos seis marcadores descritas acima, que são adequadas como sequências alvo para os domínios de reconhecimento das nucleases.
[0041] A seguir, para esse fim, dois princípios de engenharia genética devem ser esclarecidos em detalhes, com cujo auxílio é apoiada ou diretamente obtida a eliminação das sequências de nucleotídeos portadores da ligação gênica Drag de um genoma de planta. Os seguintes processos, bem como também os processos de cultivo convencionais podem ser usados para produzir as plantas de milho de acordo com a invenção.
[0042] Tal como já citado, as ferramentas moleculares acima são capazes de induzir os rompimentos da fita dupla do DNA em locais definidos no genoma. Como particularmente vantajosa mostra-se aqui o uso de nucleases TALE (TALENs) ou nucleases de dedo de zinco (ZFNs). O domínio de reconhecimento TALE ou ZF permite ligar especificamente em locais arbitrários no genoma. Conhecendo a sequência na área alvo, o domínio de reconhecimento TALE ou ZF pode ser projetado sob medida, de modo que esse se liga exclusivamente no local desejado no genoma. Se a sequência de reconhecimento é fusionada, por exemplo, com uma endonucleases inespecífica, é possível induzir um rompimento da fita dupla (DSB) no local definido no genoma, o que permite uma engenharia de genoma direcionada (Tzfira e colaboradores, 2012; Li e colaboradores, 2011; Puchta and Hohn 2010). O especialista conhece a manipulação com endonucleases Fokl, bem como a criação de TALENs e ZFNs adequadas do estado da técnica.
[0043] Um rompimento induzido de fita dupla pode estimular, por exemplo, uma recombinação homóloga entre um locus do gene alvo endógeno (por exemplo, uma das regiões do marcador mencionadas acima) e de um fragmento de DNA homólogo introduzido de forma exógena, que, por exemplo, não é portador da ligação gênica Drag (por exemplo, em um vetor doador adequado). Esse chamado 'gene replacement' ou 'genome editing' pode ser realizado in vitro e não necessita de quaisquer etapas do cruzamento entre duas plantas. Para esse fim, as plantas a serem modificadas devem ser transformadas de modo transiente, por um lado, com ácidos nucleicos, que codificam as TALENs ou ZFNs projetadas e, por outro lado, com o fragmento de DNA exógeno. O fragmento de DNA pode ser proveniente, aqui, de uma planta da mesma espécie e corresponde, por exemplo, à porção cromossomal, que deve ser substituída, somente sem ligação gênica Drag. Após a conclusão da recombinação homóloga induzida, as células com genoma modificado podem ser regeneradas para plantas e dessa maneira, serem selecionadas, se a ligação gênica Drag foi removida com êxito e os elementos de DNA transformados previamente de modo transiente terem sido novamente perdidos no decorrer da divisão celular regenerativa. Para isso, também podem ser usados os marcadores descritos acima. Métodos para a transformação e regeneração são conhecidos do estado da técnica e também são novamente esclarecidos abaixo.
[0044] Além disso, as TALENs e ZFNs acima também podem ser usadas transgenicamente no processo de meiose, onde essas induzem rompimentos de fita dupla no genoma em locais predeterminados e, dessa maneira, aumentam a probabilidade para uma recombinação nesses locais na etapa do 'crossing over'. Com isso, a eliminação da ligação gênica Drag pode ser nitidamente favorecida. Um especialista sabe, como após a conclusão da meiose das células haploides ele produz plantas livres da ligação gênica Drag e livre de TALENs ou ZFNs. Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para a produção de uma planta de milho de acordo com a invenção, o qual compreende as seguintes etapas: (A) fornecimento de uma primeira planta de milho, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo do doador Pepitilla, em que o fragmento de cromossomo compreende um primeiro intervalo do doador, que mostra alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2 e apresenta um polinucleotídeos, que na planta de milho confere resistência contra o Helminthosporium turcicum e em que o fragmento de cromossomo contém um segundo intervalo do doador e/ou o quarto intervalo do doador e/ou o quinto intervalo do doador, (B) fornecimento de uma segunda planta de milho, (C) cruzamento da planta de milho de (A) com a planta de milho de (B) e (D) seleção de uma planta de milho de acordo com a invenção, preferivelmente usando pelo menos um marcador descrito acima. De modo alternativo, a presente invenção refere-se a um processo para a produção de uma planta de milho de acordo com a invenção, o qual compreende as seguintes etapas: (A) transformação transiente de uma célula de planta de milho com uma primeira sequência de nucleotídeos, que codifica uma primeira proteína com atividade de endonucleases (por exemplo, uma proteína de fusão de endonucleases TALE ou ZF), que é capaz de induzir, entre a região do marcador M2 e M4, um rompimento da fita dupla do DNA no genoma da célula da planta de milho e com uma segunda sequência de nucleotídeos, que codifica uma segunda proteína com atividade de endonucleases (por exemplo, uma proteína de fusão de endonucleases TALE ou ZF), que é capaz de induzir, entre a região do marcador M5 e M6, um rompimento da fita dupla do DNA no genoma da célula da planta de milho, (B) introdução transiente de um vetor doador na primeira célula da planta de milho, que porta um fragmento de cromossomo do doador Pepitilla, em que o fragmento de cromossomo compreende um primeiro intervalo do doador, que mostra alelos de doadores de acordo com o haplótipo de acordo com a tabela 2 e um polinucleotídeo, que na planta de milho confere resistência contra o Helminthosporium turcicum e em que o fragmento de cromossomo apresenta, além disso, as porções cromossomais do doador Pepitilla entre os locais dos rompimentos da fita dupla de (A), de modo que entre o genoma da primeira célula da planta de milho e o fragmento de cromossomo do vetor doador se realiza uma recombinação homóloga, (C) regeneração de uma planta de milho da célula da planta de milho, (D) identificação de uma planta de milho de acordo com a invenção, usando preferivelmente pelo menos um marcador descrito acima. De modo particularmente preferido, as primeiras e segundas sequências de ácido nucleico introduzidas de modo transiente e o vetor doador foram novamente perdidos. O especialista sabe como ele pode obter e comprovar isso.
[0045] Em um outro aspecto, a presente invenção abrange os marcadores descritos acima como oligonucleotídeos, em particular, os oligonucleotídeos iniciadores. Preferivelmente, os oligonucleotídeos são oligonucleotídeos isolados. Um oligonucleotídeo compreende uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, selecionada de uma das SEQ ID No: 41-49, 53-100 e 229-250. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de um oligonucleotídeo, que compreende uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos, selecionada de uma das SEQ ID No: 17-250, para a identificação de uma planta de milho resistente ao H. turcicum. A resistência provém preferivelmente do doador Pepitilla e é HTN1.
[0046] O objetivo que serve de base à presente invenção é resolvido, além disso, de modo alternativo por uma planta transgênica, em particular, uma planta de milho transgênica, que compreende uma célula de planta transgênica descrita abaixo. Além disso, a invenção refere-se também a uma parte dessa planta de acordo com a invenção, em que uma parte pode ser uma célula, um tecido, um órgão ou uma união de várias células, tecidos ou órgãos. Uma união de vários órgãos é, por exemplo, uma flor ou uma semente. Em uma forma de concretização particular, a invenção refere-se a uma semente da planta transgênica, sendo que a semente compreende o polinucleotídeo de acordo com a invenção descrito abaixo como transgene. Preferivelmente, uma planta transgênica da presente invenção mostra, em particular, uma planta da espécie Zea mays, uma resistência contra H. turcicum maior do que uma planta correspondente não transformada (planta isogênica sem o transgene). Uma planta transgênica resistente ao Ht de acordo com a invenção mostra uma resistência aumentada contra H. turcicum de pelo menos 1 nota de avaliação, preferivelmente de pelo menos 2 notas de avaliação ou pelo menos 3 notas de avaliação e de modo particularmente preferido, de pelo menos 4 notas de avaliação (veja o esquema de avaliação na tabela 3).
[0047] Além disso, a invenção põe um processo à disposição para a produção de uma planta transgênica, que compreende uma etapa da introdução do polinucleotídeo de acordo com a invenção ou do vetor descrito abaixo da presente invenção em uma célula de planta e opcionalmente uma etapa da seleção de uma célula de planta transgênica. Além disso, um tal processo para a produção de uma planta transgênica é caraterizado por uma etapa seguinte, que inclui a regeneração da planta transgênica da célula de planta transgênica produzida na primeira etapa. Os métodos para a regeneração são conhecidos pelo especialista do estado da técnica.
[0048] Em um aspecto adicional, a presente invenção revela o polinucleotídeo, que compreende um ou mais genes do locus HTN1 de Pepitilla que conferem resistência (tabela 1) ou selecionados de RLK1 e EXT1 (veja a tabela 1) ou alelos do gene dos mesmos. Gene ou alelo do gene podem causar um fenótipo de resistência com as características típicas do HTN1 em condições de infestação com o H. turcicum. Estruturalmente o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico (a) que apresenta uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15, (b) que apresenta uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em relação a uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15, preferivelmente em todo o comprimento da sequência, (c) que hibridiza com a fita complementar de uma molécula de ácido nucleico de acordo com (a) ou (b) em condições rigorosas, (d) que o polipeptídeo codifica com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16 ou (e) que um polipeptídeo codifica com uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à uma das sequências de aminoácidos de acordo com (d). Em uma forma de concretização preferida, o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico (aa) que apresenta uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1 ou 5, (bb) que apresenta uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em relação a uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1 ou 5, preferivelmente em todo o comprimento da sequência, (cc) que hibridiza com a fita complementar de uma molécula de ácido nucleico de acordo com (aa) ou (bb) em condições rigorosas, (dd) que um polipeptídeo codifica com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2 ou 6 ou (e) que um polipeptídeo codifica com uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à uma das sequência de aminoácidos de acordo com (dd). Preferivelmente, o polinucleotídeo pode ser isolado e/ou purificado de sua origem genética natural ou está presente em forma essencialmente pura ou homogênea. Preferivelmente, o polinucleotídeos é DNA e de modo particularmente preferido, cDNA, isto é, o polinucleotídeo compreende o cDNA de um ou vários dos genes que conferem resistência (tabela 1). Mas esse também pode estar presente como RNA. O especialista sabe, como ele pode derivar a sequência genômica de DNA da informação de sequência aqui publicada. Um polinucleotídeo de acordo com a invenção codifica pelo menos um polipeptídeo, que é capaz de conferir uma resistência contra o patógeno Helminthosporium turcicum em uma planta, na qual o polipeptídeo é expresso. Preferivelmente, o polipeptídeo, que é codificado pelo polinucleotídeo de acordo com a invenção ou de partes do mesmo, confere uma resistência contra o patógeno Helminthosporium turcicum em particular em uma planta do gênero Zea ou em uma planta da espécie Zea mays.
[0049] Além disso, a presente invenção refere-se também a um polipeptídeo, que é capaz de conferir uma resistência contra o H. turcicum em uma planta, na qual o polipeptídeo é expresso e que é codificado pelo polinucleotídeo de acordo com a invenção ou por uma parte do mesmo. O polipeptídeo apresenta preferivelmente uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2, 4, 6, 8,10, 12, 14 ou 16 ou de modo particularmente preferido, uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2 ou 6. No caso do polipeptídeo pode se tratar de um polipeptídeo isolado.
[0050] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor, que compreende o polinucleotídeo de acordo com a invenção. No caso do vetor pode se tratar de um plasmídeo, um cosmídeo, de um fago ou de um vetor de expressão, de um vetor de transformação, vetor de transporte ou vetor de clonagem, esse pode ser de fita dupla ou simples, linear ou circular ou pode transformar um hospedeiro procariótico ou eucariótico ou através de integração em seu genoma ou de modo extracromossomal. Preferivelmente, o polinucleotídeo de acordo com a invenção está ligado de modo operacional em um vetor de expressão com uma ou várias sequências reguladoras, que permitem a transcrição e opcionalmente a expressão em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. Por exemplo, o polinucleotídeo está sob o controle de um promotor adequado ou de um terminador. Promotores adequados podem ser promotores, que são induzidos de modo constitutivo (exemplo: promotor 35S do "Cauliflower mosaic vírus" (Odell e colaboradores, 1985), particularmente adequados são aqueles promotores, que podem ser induzidos de modo patogênico (exemplo: promotor PR1 da salsa (Rushton e colaboradores, 1996). Promotores particularmente adequados que podem ser induzidos por patógenos são promotores sintéticos ou quiméricos, que não ocorrem na natureza, são compostos de vários elementos e contêm um promotor mínimo, bem como apresentam pelo menos um elemento cis regulador a montante do promotor mínimo, que serve como local de ligação para fatores de transcrição especiais. Promotores quiméricos são concebidos de acordo com as exigências desejadas e são induzidos ou reprimidos por diferentes fatores. Exemplos de tais promotores são encontrados no documento WO 2002/29592 e WO 2007/147395. Um terminador adequado é, por exemplo, o terminador nos (Depicker e colaboradores, 1982).
[0051] Adicionalmente aos vetores descritos acima, a presente invenção põe também um processo à disposição, que compreende a introdução de um vetor descrito em uma célula hospedeira. O vetor pode ser introduzido, por exemplo, através de conjugação, mobilização, transformação biolística, transformação mediada por Agrobacterium, transfecção, transdução, infiltração por vácuo ou eletroporação. Tais processos, do mesmo modo como os processos para a preparação de vetores descritos, são comuns ao especialista (Sambrook e colaboradores, 2001).
[0052] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira, que compreende o polinucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor da presente invenção. Uma célula hospedeira no sentido da invenção pode ser uma célula procariótica (por exemplo, bacteriana) ou eucariótica (por exemplo, uma célula de planta ou uma célula de levedura). A célula hospedeira é preferivelmente um Agrobacterium, tal como Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes ou uma célula de planta, que compreendem o polinucleotídeo ou o vetor da presente invenção. O especialista conhece tanto inúmeros métodos, tais como a conjugação ou eletroporação, com os quais ele pode introduzir o polinucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor da presente invenção em um Agrobacterium, como também métodos, tais como diversos processos de transformação (transformação biolística, transformação mediadora de Agrobacterium), com os quais ele pode introduzir o polinucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor da presente invenção em uma célula de planta (Sambrook e colaboradores, 2001).
[0053] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de planta transgênica, que compreende o polinucleotídeo de acordo com a invenção como transgene ou o vetor da presente invenção. Uma tal célula de planta transgênica é, por exemplo, uma célula de planta, que é transformada com o polinucleotídeo de acordo com a invenção ou com o vetor da presente invenção, preferivelmente de forma estável. Em uma forma de concretização preferida da célula de planta transgênica, o polinucleotídeo está ligado de modo operacional com uma ou várias sequências reguladoras, que permitem a transcrição e opcionalmente a expressão na célula de planta. A construção total a partir do polinucleotídeos de acordo com a invenção e da/das sequência(s) reguladora(s) podem representar, então, o transgene. Tais sequências reguladoras são, por exemplo, um promotor ou um terminador. O especialista conhece inúmeros promotores e terminadores funcionais, que podem ser usados em plantas. Uma célula de planta transgênica da presente invenção, em particular, uma célula de uma planta da espécie Zea mays mostra uma resistência maior contra H. turcicum do que uma célula de planta não transformada correspondente (a célula de planta (isogênica) sem o transgene). Células de plantas transgênicas resistentes ao Ht de acordo com a invenção mostram um aumento da resistência contra H. turcicum de pelo menos uma nota de avaliação, preferivelmente de pelo menos 2 notas de avaliação ou pelo menos 3 notas de avaliação e de modo particularmente preferido, de pelo menos 4 notas de avaliação (veja o esquema de avaliação na tabela 3). Além disso, a presente invenção refere-se também a um processo para a produção de uma célula de planta transgênica da presente invenção, que compreende uma etapa da introdução do polinucleotídeo de acordo com a invenção ou do vetor da presente invenção em uma célula de planta. Por exemplo, a introdução pode se realizar através de transformação, preferivelmente através de transformação estável. As tecnologias adequadas para a introdução, tais como transformação biolística, transformação mediada pelo Agrobakterium ou eletroporação, são conhecidas pelo especialista (Sambrook e colaboradores, 2001).
[0054] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se também a um processo para conferir ou aumentar uma resistência contra H. turcicum em uma planta, preferivelmente de uma planta da espécie Zea mays, que compreende uma etapa da mutação de uma célula de planta com o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção ou com vetor da presente invenção. Preferivelmente, o método resulta em uma resistência aumentada contra o H. turcicum por pelo menos uma nota de avaliação, preferencialmente pelo menos 2 notas de avaliação ou pelo menos 3 notas de avaliação e, particularmente, preferencialmente pelo menos 4 notas de avaliação (ver o esquema de avaliações na Tabela 3).
[0055] Em um aspecto adicional, a presente invenção inclui um processo para modificação do fenótipo de resistência de uma planta, particularmente uma planta de milho contra o patógeno Helminthosporium turcicum, que compreende uma etapa de mutação do gene que confere resistência do locus HTN1 de Peptilla ou de um alelo do gene do mesmo. Preferivelmente, o gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla codifica um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2 ou um homólogo de um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2, que em condições de infestação com H. turcicum, causa um fenótipo de resistência com as características típicas de HTN1. O gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla ou de um alelo do gene do mesmo pode estar presente no genoma da planta em forma transgênica ou endógena. A modificação do fenótipo de resistência pode significar uma alteração da especificidade de raça do patógeno e/ou uma alteração do nível de resistência medido como nota de avaliação com base em características fenotípicas, tais como, por exemplo, a área da folha atingida (veja tabela 3) ou medida como valor AUDPC (veja o exemplo 1 C). Preferivelmente, o nível de resistência após a modificação do fenótipo de resistência situa-se entre o nível de resistência de uma planta, que exprime o gene não mutado que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla e o nível de resistência de uma plana isogênica, que não exprime o gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla; mas esse também pode se situar acima do nível de resistência de uma planta, que exprime o gene não mutado que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla. De modo particularmente preferido, o nível de resistência situa-se entre o nível de resistência de uma planta, que exprime o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2 e o nível de resistência de uma planta isogênica, que não exprime o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2; mas esse também pode situar-se acima do nível de resistência de uma planta, que exprime o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2. A expressão mutação pode ser entendida, aqui, como uma alteração da sequência genética (mutação) realizada pelo indivíduo. Exemplos para esse fim são, que as plantas, células de plantas ou partes de plantas são expostas a uma alta dose de agentes mutagênicos químicos, radiológicos ou outros e, em seguida, são selecionados em mutantes. De modo alternativo, a mutação também pode ser realizada, por exemplo, com auxílio de tilling, nucleases TALE, nucleases de depois de zinco ou por um sistema CRISPR/Cas ou através de fusão, inserção, deleção ou substituições na sequência de DNA ou na sequência de aminoácidos. Para realizar a etapa da mutação, o especialista recebe de conhecidos estados da técnica um guia técnico suficiente para manipular. Preferivelmente, a mutação do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla leva a pelo menos uma substituição de aminoácidos, a pelo menos duas substituições de aminoácidos, a pelo menos três substituições de aminoácidos, a pelo menos cinco ou mais substituições de aminoácidos. No caso de várias substituições de aminoácidos, essas também podem estar presentes em diferentes alelos de genes do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla, isto é, a mutação pode ser heterozigótica, mas também homozigótica.
[0056] Em uma forma de concretização preferida do processo para a modificação do fenótipo de resistência de uma planta, a mutação do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla leva a uma mutação pontual na sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1 na posição 1365 com a substituição de base de um G para um A ou na posição 1490 com a substituição de base de um G para um A. Além disso, essa forma de concretização refere-se também à mutação, que leva a uma substituição de aminoácidos na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2 na posição 455 de M (metionina) para I (isoleucina) ou na posição 497 de G (glicina) para E (ácido glutâmico). Em uma outra forma de concretização preferida do processo, a mutação do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla leva a uma mutação pontual, que tem como consequência uma substituição de aminoácidos, na sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1 entre a posição 1365 e a posição 1490 ou a forma de concretização refere-se à mutação, que leva a uma substituição de aminoácidos na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2 entre a posição 455 e a posição 497.
[0057] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a produção de uma planta, em particular, a uma planta de milho, com um fenótipo de resistência modificado contra o patógeno Helminthosporium turcicum, que compreende uma etapa da mutação do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla ou de um alelo do gene do mesmo em pelo menos uma célula da planta ou em pelo menos uma célula, a partir da qual a planta é regenerada. Além disso, o processo, dessa maneira, compreende uma etapa da regeneração de pelo menos uma planta da pelo menos uma célula mutada e seleção das plantas regeneradas à base do fenótipo de resistência modificado contra o patógeno Helminthosporium turcicum. Preferivelmente, o gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla codifica um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2 ou um homólogo de um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2, que em condições de infestação com H. turcicum causa um fenótipo de resistência com as características típicas do HTN1. O gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla ou de um alelo do gene pode estar presente no genoma da planta de forma transgênica ou endógena. Um fenótipo de resistência modificado pode significar uma alteração da especificidade de raça do patógeno e/ou uma alteração do nível de resistência medido como nota de avaliação com base nos sinais fenotípicos, tais como, por exemplo, a área da folha atingida (veja a tabela 3) ou medido como valor AUDPC (veja o exemplo 1 C). Preferivelmente, o nível de resistência do fenótipo de resistência modificado situa-se entre o nível de resistência de uma planta, que exprime o gene que confere resistência não mutado do locus HTN1 de Pepitilla e o nível de resistência de uma planta isogênica, que não exprime o gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla; mas pode situar-se também acima do nível de resistência de uma planta, que exprime o gene que confere resistência não mutado do locus HTN1 de Pepitilla. De modo particularmente preferido, o nível de resistência situa-se entre o nível de resistência de uma planta, que exprime o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2 e o nível de resistência de uma planta isogênica, que não exprime o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2; mas esse também pode situar-se acima do nível de resistência de uma planta, que exprime o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2. A expressão mutação pode ser entendida, aqui, como uma alteração da sequência genética realizada pelo homem (mutação). Exemplos são que as plantas, células de plantas ou partes de plantas são submetidas a uma dose elevada de mutagênicos químicos, radiológicos ou outros e, em seguida, seleciona- se para mutantes. De modo alternativo, a mutação pode ser realizada também, por exemplo, com auxílio de tilling, nucleases TALE, nucleases de dedo de zinco ou com um sistema CRISPR/Cas ou através de fusão, inserção, deleção ou substituição na sequência de DNA ou na sequência de aminoácidos. Para realizar a etapa da mutação, o especialista obtém de estados da técnica conhecidos uma instrução técnica satisfatória para a manipulação. Preferivelmente, a mutação do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla leva a pelo menos uma substituição de aminoácidos, a pelo menos duas substituições de aminoácidos, a pelo menos três substituições de aminoácidos, a pelo menos ou mais substituições de aminoácidos. No caso de várias substituições de aminoácidos, essas também podem estar presentes em diferentes alelos de genes do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla, isto é, a mutação pode ser heterozigótica, mas também homozigótica.
[0058] Em uma forma de concretização preferida do processo para a produção de uma planta com um fenótipo de resistência modificado contra o patógeno Helminthosporium turcicum, a mutação do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla leva a uma mutação pontual na sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1 na posição 1365 com a substituição de base de um G para um A ou na posição 1490 com a substituição de base de um G para um A. Além disso, essa forma de concretização refere-se também à mutação, que leva a uma substituição de aminoácidos na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2 na posição 455 de M (metionina) para I (isoleucina) ou na posição 497 de G (glicina) para E (ácido glutâmico). Em uma outra forma de concretização preferida do processo, a mutação do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla leva a uma mutação pontual, que tem como consequência uma substituição de aminoácidos, na qual a sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1 situa-se entre a posição 1365 e a posição 1490 ou a forma de concretização refere-se à mutação, que leva a uma substituição de aminoácidos na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2 entre a posição 455 e a posição 497.
[0059] A invenção também compreende plantas ou uma parte destas, que pode ser produzida por um processo para a produção de uma planta com um fenótipo de resistência modificado contra o patógeno Helminthosporium turcicum.
[0060] A invenção abrange, além disso, uma planta ou uma parte da mesma, que apresenta uma mutação no gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla ou de um alelo do gene do mesmo. A mutação leva preferivelmente a um fenótipo de resistência modificado, tal como descrito acima. Preferivelmente, o gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla codifica um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2 ou um homólogo de um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID No: 2, que em condições de infestação com H. turcicum, causa um fenótipo de resistência com as características típicas do HTN1. O gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla ou de um alelo do gene do mesmo pode estar presente no genoma da planta de forma transgênica ou endógena. Em uma forma de concretização preferida da planta ou da parte da mesma, a mutação é uma mutação pontual na sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1 na posição 1365 com a substituição de base de um G para um A ou na posição 1490 com a substituição de base de um G para um A. Além disso, essa forma de concretização refere-se também a uma mutação, que leva a uma substituição de aminoácidos na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2 na posição 455 de M (metionina) para I (isoleucina) ou na posição 497 de G (glicina) para E (ácido glutâmico). Em uma outra forma de concretização preferida da planta ou da parte da mesma, a mutação do gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla é uma mutação pontual, que tem como consequência uma substituição de aminoácidos, na qual a sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID No: 1 situa-se entre a posição 1365 e a posição 1490 ou a forma de concretização refere-se a uma mutação, que leva a uma substituição de aminoácidos na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No: 2 entre a posição 455 e a posição 497.
[0061] Alguns dos termos usados nesse pedido são esclarecidos em detalhes abaixo:
[0062] O termo "alelo" se refere a uma ou duas ou mais sequências de nucleotídeos em um determinado locus no genoma. Um primeiro alelo se localiza em um cromossomo, um segundo em um segundo cromossomo na mesma posição. Se os dois alelos são diferentes, esses são heterozigotos, se são os mesmos alelos, esses são homozigotos. Diferentes alelos de um gene (alelos do gene) diferenciam-se em pelo menos um SNP. De acordo com o contexto do relatório descrito, um alelo significa também apenas um único SNP que permite, por exemplo, uma distinção entre doador de HTN1 (Pepitilla) e progenitor recorrente.
[0063] A expressão "fragmento de cromossomo" é uma porção de DNA cromossomal específica de um determinado cromossomo, que compreende pelo menos um gene. Um fragmento de cromossomo integrado provém de uma fonte doadora. No sentido da invenção, a ordem sequencial dos genes dentro de um fragmento de cromossomo integrado pode corresponder àquela ordem, tal como se apresenta no fragmento de cromossomo original da fonte doadora. Dessa maneira, o fragmento de cromossomo integrado pode estar presente na fonte doadora inalterado em todo o comprimento em relação ao fragmento de cromossomo correspondente. Um fragmento de cromossomo ou uma parte do mesmo pode representar um "haplótipo", em que o fragmento de cromossomo apresenta, então, certos SNPs, através dos quais o haplótipo também pode ser nitidamente especificado e identificado.
[0064] Os termos "distal" e "proximal" designam as posições de um intervalo cromossomal ou de uma porção genética em relação a um certo local de referência (por exemplo, de um certo polinucleotídeo, de um outro intervalo cromossomal ou de um gene) em um cromossomo total, sendo que distal significa, que o intervalo ou a porção está localizado no lado desviado do centrômero do cromossomo do local de referência e proximal significa que o intervalo ou a porção está localizado no lado voltado para o centrômero do cromossomo do local de referência.
[0065] "Estreitamente acoplado" ou "estreitamente ligado" significa dois loci, dois intervalos, duas porções genéticas ou dois marcadores (loci marcadores), que são afastados uns dos outros em menos de 15 cM, menos de 12 cM, os quais são afastados em menos de 10 cM, os quais são afastados em menos de 8 cM, os quais são afastados em menos de 7 cM, os quais são afastados em menos de 6 cM, os quais são afastados em menos de 5 cM, os quais são afastados em menos de 4 cM, os quais são afastados em menos de 3 cM, os quais são afastados em menos de 2 cM, os quais são afastados em menos de 1 cM, os quais são afastados em menos de 0,5 cM, os quais são afastados em menos de 0,2 cM, os quais são afastados em menos de 0,1 cM, determinado pelos IBM2 neighboors 4 genetic map publicamente acessível no website Maize GDB.
[0066] O termo "rendimento" no sentido da presente invenção refere-se à produtividade por unidade de área de um certo produto de planta com valor comercial. Por exemplo, o rendimento do milho é geralmente medido em toneladas de biomassa seca por hectare (ha) e temporada. Conquanto não seja expressamente indicado ou especificado de outro modo, o rendimento pode se referir à massa fresca ou seca absoluta, à massa fresca ou seca relativa, ao rendimento da silagem (mencionado também como rendimento do milho ensilado ou total dry matter yield) ou ao rendimento do grão. O rendimento é influenciado por fatores genéticos e ambientais e compõe-se, em princípio, de inúmeras propriedades agronômicas, que representam as características de uma planta que se baseiam em elementos genéticos e no decorrer da temporada contribuem para o rendimento final. Nessas propriedades agronômicas individuais incluem-se, por exemplo, a emergência da semente, a vitalidade vegetativa, tolerância ao estresse, resistência ou tolerância a doenças, resistência aos herbicidas, tendência à ramificação, tempo de floração, produção de sementes, densidade da semente, estabilidade e tendência à inclinação, capacidade para debulhar (amadurecimento uniforme) e assim por diante
[0067] A expressão "porção genética com" um intervalo especificado em detalhes deve ser entendida como sendo uma porção genética, que inclui ou compreende um intervalo especificado em detalhes, isto é, não é limitada ao intervalo especificado em detalhes. Por exemplo, a porção genética com o quinto intervalo entre um marcador na oitava região do marcador M8, que é flanqueada pelos marcadores MA0022 e MA0013 e um marcador na sexta região do marcador M6, que é flanqueada pelos marcadores PZE-108107671 e SYN4196, significa que a porção genética compreende o quinto intervalo e a porção genética está localizada entre um marcador na oitava região do marcador M8, que é flanqueada pelos marcadores MA0022 e MA0013 e um marcador da sexta região do marcador M6, que é flanqueada pelos marcadores PZE-108107671 e SYN4196.
[0068] Por "hibridizar" ou "hibridização" é entendido um processo, no qual uma molécula de ácido nucleico de fita única se deposita tanto quanto possível em uma fita de ácido nucleico complementar, isto é, corre junto com esses emparelhamentos de bases. Processos padrão para a hibridização são descritos, por exemplo, em Sambrook e colaboradores, 2001). Dentre esses entende-se preferivelmente que pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, 70%, 75%, 80% ou 85%, de modo particularmente preferido 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases da molécula de ácido nucleico correm juntos tanto quanto possível com a fita de ácido nucleico complementar. A possibilidade de uma tal deposição depende do rigor das condições de hibridização. O termo "rigor" refere-se às condições de hibridização. Alto rigor é dado, então, quanto um emparelhamento de bases é dificultado, baixo rigor, quando um emparelhamento de bases é facilitado. O rigor das condições de hibridização depende, por exemplo, da concentração de sal ou da força iônica e da temperatura. Em geral, o rigor pode ser aumentado através do aumento da temperatura e/ou uma redução do teor de sal. Por "condições rigorosas de hibridização" devem ser entendidas aquelas condições, nas quais uma hibridização se realiza principalmente apenas entre as moléculas homólogas de ácido nucleico. O termo "condições de hibridização" não se refere, nesse caso, apenas às condições predominantes na própria deposição dos ácidos nucleicos, mas sim, também às condições predominantes nas subsequentes etapas de lavagem. Condições de hibridização rigorosas são, por exemplo, condições, nas quais hibridizam predominantemente apenas aquelas moléculas de ácido nucleico, que apresentam pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade sequencial. Condições de hibridização rigorosas são, por exemplo: hibridizar em 4 x SSC a 65oC e subsequente lavagem múltipla em 0,1 x SSC a 65oC durante um total de cerca de 1 hora. O termo "condições de hibridização rigorosas" também pode significar: hibridizar a 68oC em fosfato de sódio 0,25 M, pH 7,2, 7% de SDS, 1 mM de EDTA e 1% de BSA durante 16 horas e subsequente lavagem dupla com 2 x SSC e 0,1% de SDS a 68oC. Preferivelmente, uma hibridização se realiza em condições rigorosas.
[0069] O termo "intervalo" ou "intervalo cromossomal" significa uma porção linear contínua em um DNA genômico, que está presente em um cromossomo único na planta ou em um fragmento de cromossomo e que normalmente é definido pela indicação de dois marcadores, que representam os pontos finais do intervalo para o lado distal e proximal. Neste caso, os próprios marcadores, que definem o intervalo na posição final, podem ser também parte do intervalo. Além disso, dois diferentes intervalos também podem se sobrepor. No relatório descritivo, um intervalo é especificado pela indicação "entre o marcador A e o marcador B". Um marcador na posição final de um intervalo também pode estar localizado em uma região definida do marcador em um lado do intervalo. Uma região do marcador é definida, então, pela indicação de dois marcadores flanqueantes e representa uma porção cromossomal, na qual, além dos marcadores flanqueantes, ainda podem estar outros marcadores. Marcadores flanqueantes determinam os pontos finais de uma região do marcador e eles próprios ainda são parte da região do marcador. Se os dois marcadores em posição final de um intervalo são marcadores em diferentes regiões de marcadores nos dois lados de um intervalo, no relatório descritivo um intervalo é especificado pela indicação "entre um marcador em uma região do marcador X, que é flanqueada pelos marcadores C e D e um marcador em uma região do marcador Y, que é flanqueada pelos marcadores E e F". Uma região do marcador pode se estender acima de 500.000 pares de bases (bp), pode ser entre 100.000 e 400.000 bp ou de modo particularmente preferido, pode ser entre 140.000 e 315.000 bp.
[0070] Por "introgressão" no contexto com a presente invenção é entendida a transmissão de pelo menos um alelo do gene desejado em um locus genético de um fundo genético para um outro. Por exemplo, uma introgressão de um alelo do gene desejado em um locus específico pode ser transmitido para um descendente através de cruzamento sexual entre dois progenitores da mesma espécie. De modo alternativo, por exemplo, a transmissão de um alelo do gene pode ocorrer também através da recombinação entre dois genomas doadores em um protoplastos fusionado, sendo que pelo menos um protoplasto doador porta o alelo do gene desejado em seu genoma. Em cada caso, os descendentes, que compreendem, então, o alelo do gene desejado, podem ser retrocruzados, em seguida, repetidamente com uma linha, que apresenta o fundo genético preferido e selecionados para o alelo do gene desejado. O resultado é uma fixação do alelo do gene desejado em um fundo genético selecionado.
[0071] Por uma "molécula isolada de ácido nucleico" ou "polinucleotídeo isolado" é entendida uma molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo separado de seu ambiente natural ou original. O termo compreende também uma molécula de ácido nucleico produzida sinteticamente. Por um "polipeptídeo isolado" é entendido um polipeptídeo separado de seu ambiente natural ou original. O termo compreende também um polipeptídeo produzido sinteticamente.
[0072] Por uma "infecção patogênica" deve ser entendido o primeiro tempo, no qual um patógeno interage com um tecido hospedeiro de planta. Por exemplo, os fungos, tais como ascomicetos ou oomicetos incluem o crescimento de hifas ou a formação de estruturas infecciosas específicas, tais como hifas de penetração e apressórios. A infecção por Helminthosporium turcicum já pode ser pesquisada em detalhes por meio de diversas técnicas de tingimento (por exemplo, azul tripano) (Chung e colaboradores, BMC Plant Biology 10 (2010), 103; Walsh e colaboradores (2008), Posterprasentation P192, 50th Maize Genetics Conference em Washington D.C.).
[0073] "Doador Pepitilla", "acesso Pepitilla" ou "Pepitilla" significa, além do Landrace Pepitilla, mesmo também outros genótipos de milho, em cujo genoma, em particular, no cromossomo 8 bin 5 ou 6, foi inserida uma introgressão do locus de resistência HTN1 preferivelmente de Pepitilla. Esses são, por exemplo, W22Htn (por exemplo, Bar-Zur e colaboradores, 1998), H6314 Htn (por exemplo, Bar-Zur e colaboradores, 1998), B73Htn (por exemplo, Shimoni e colaboradores, Journal of Phytopathology 131:4 (1991), 315-321), B68Htn e A632Htn (por exemplo, Carson, Plant Disease 79 (1995), 717-720) e A619Htn (por exemplo, Stankovic e colaboradores, Genetika 39:2 (2007), 227240). Além disso, a Pepitilla fecha todas as fontes de resistência, que conferem o fenótipo de resistência com as características típicas do HTN1 após a introgressão em uma linhagem de milho/planta de milho suscetível. Nessas características típicas do HTN1 são incluídas, por exemplo, o início retardado da esporulação, desenvolvimento reduzido de lesões, desenvolvimento de lesões menores, zonas de esporulação reduzidas e/ou não há ou há apenas lesões clorótico-necróticas isoladas.
[0074] Um "locus" é uma posição em um cromossomo, onde se localizam um ou mais genes, que causam ou influenciam uma característica agronômica. Locus significa, aqui, particularmente, o locus de resistência HTN1, que confere resistência contra o patógeno Helminthosporium turcicum ou pelo menos contra uma raça de Helminthosporium turcicum.
[0075] Uma "planta de milho" é uma planta da espécie Zea mays, bem como suas subespécies, tais como, por exemplo, Zea mays ssp. mays, Zea mays spp. mexicana ou Zea mays spp. parviglumis.
[0076] Um "marcador" é uma sequência de nucleotídeos, que é usada como ponto de referência ou orientação. Um marcador para reconhecer um evento de recombinação deveria ser adequado para monitorar diferenças ou polimorfismos dentro de uma população de plantas. Para os marcadores, essas diferenças são encontradas no plano do DNA e são, por exemplo, SSRs (simple sequence repeats), RFLPs (restriction fragmente length polymorphisms), FLPs (fragmente length polymorphisms) ou SNPs (single nucleotide polymorphisms). Os marcadores podem ser provenientes de ácidos nucleicos genômicos ou expressos, tais como, por exemplo, RNA entrançado, cDNA ou ESTs e podem se referir também aos ácidos nucleicos, que são usados como sondas ou pares iniciadores e ser adequados como tais para amplificar um fragmento de sequência usando processos à base de PCR. Marcadores, que se referem aos polimorfismos genéticos entre partes de uma população, podem ser detectados por meio de processos estabelecidos do estado da técnica (An Introduction to Genetic Analysis. 7th Edition, Griffiths, Miller, Suzuki e colaboradores, 2000). Nesses são incluídos, por exemplo: a sequenciação de DNA, a amplificação específica de sequências, à base de PCR, comprovação de RFLPs, comprovação de polimorfismos de polinucleotídeos por meio de hibridização específica de alelos ASH), detecção de SSRs, SNPs ou AFLPs. Além disso, também são conhecidos processos para detectar ESTs (expressed sequence tags) e RAPD (randomly amplified polymorphic DNA). Dependendo do contexto, o termo marcador no relatório descritivo pode significar também uma posição específica do cromossomo no genoma de uma espécie, onde pode ser encontrado um marcador específico (por exemplo, SNP). Uma tal posição do marcador pode ser utilizada, para acompanhar a presença de um locus acoplado, por exemplo, um locus acoplado, que contribui para a expressão de uma certa característica fenotípica (por exemplo, HTN1 ou ligação gênica Drag). Por exemplo, o locus do marcador também pode ser utilizado, para observar a segregação de alelos em um locus (QTL ou gene único), que são estreitamente acoplados genetica ou fisicamente com a posição do marcador.
[0077] "Ligado operacionalmente" significa unido em uma molécula de ácido nucleico comum, de uma maneira, que os elementos unidos são posicionados e orientados uns em relação aos outros, para que possa se realizar uma transcrição da molécula de ácido nucleico. Um DNA, que está ligado operacionalmente com um promotor, está sob o controle transcripcional desse promotor.
[0078] "Órgãos" de plantas significam, por exemplo, folhas, caule, tronco, raízes, brotos vegetativos, meristemas, embriões, anteras, óvulos ou frutos. "Partes" de plantas significam uma fusão de vários órgãos, por exemplo, uma flor ou uma semente ou uma parte de um órgão, por exemplo, um corte transversal do caule. "Tecidos" de plantas são, por exemplo, tecidos de calo, tecidos armazenadores, tecidos meristemáticos, tecido da folha, tecido do broto, tecidos da raiz, tecidos de tumor de plantas ou tecido reprodutivo. Por "células" de plantas devem ser entendidas, por exemplo, células isoladas com uma parede celular ou agregados das mesmas ou protoplastos.
[0079] Uma "planta" no sentido da invenção, conquanto não seja indicado de outro modo, pode ser de cada espécie das plantas dicotiledôneas, monocotiledôneas ou gimnospermas. Preferivelmente, as plantas são monocotiledôneas e são interessantes na agricultura ou horticultura ou para a produção de bioenergia (bioetanol, biogás e assim por diante). Essas incluem, por exemplo, Gossypium sp., Zea mays, Brachypodium distachyon, Triticum sp., Hordeum vulgare, Oryza sativa, Sorghum sp., Musa sp., Saccharum officinarum, Secale cereale, Avena sp., gramado e gramínea forrageira. Uma planta de acordo com a invenção é preferivelmente uma planta do gênero Zea, em particular, da espécie Zea mays ou Sorghum.
[0080] No contexto com a presente invenção, o termo "sequência reguladora" refere-se a uma sequência de nucleotídeos, que influencia a especificidade e/ou a intensidade de expressão, por exemplo, em que a sequência reguladora confere uma certa especificidade tecidual. Uma tal sequência reguladora pode estar localizada a montante do ponto de iniciação da transcrição de um promotor mínimo, mas também a jusante do mesmo, tal como, por exemplo, em uma sequência líder transcrita, mas não transladada ou dentro de um intron.
[0081] A expressão "resistência" ou "resistente" contra um patógeno deve ser entendida como a força de resistência de uma planta ou célula de planta contra as influências prejudiciais do patógeno e estende-se de um retardamento no desenvolvimento da doença até uma completasupressão do desenvolvimento da doença. No contexto com a presente invenção, uma planta/célula de planta é resistente ou uma planta/célula de planta possui uma resistência contra o patógeno Helminthosporium turcicum (H. turcicum ou Gene que confere resistência do locus HTN1 de Pepitilla), isto é, dessa maneira, contra a doença foliar Northern Corn Leaf Blight (NCLB). A resistência é conferida por uma ou mais proteínas, que são codificadas por um gene ou por genes (genes que conferem resistência) do acesso Pepitilla. A resistência pode ser completa ou parcial e pode ser pronunciada especificamente às raças de patógenos ou especificamente às raças de não-patógenos. No caso de uma resistência específica às raças de patógenos podem ser incluídas às raças virulentas de Helminthosporium turcicum, por exemplo, N, 1N, 2N, 23N ou 123N, às raças avirulentas, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 12, 23 ou 123. Uma resistência conferida pode ser uma resistência recém-adquirida ou aumento de uma resistência parcial já existente.
[0082] Uma "planta transgênica" refere-se a uma planta, em cujo genoma está integrado pelo menos um polinucleotídeo, preferivelmente um polinucleotídeo heterólogo. Preferivelmente, o polinucleotídeo está integrado de forma estável, o que significa, que o polinucleotídeo integrado na planta permanece estável, é expresso e também pode ser legado de forma estável aos descendentes. A introdução estável de um polinucleotídeo no genoma de uma planta inclui também a integração de uma geração parental precedente no genoma de uma planta, sendo que o polinucleotídeo pode ser ulteriormente legado de forma estável. O termo "heterólogo" significa, que o polinucleotídeo introduzido provém, por exemplo, de uma célula ou um organismo com um outro fundo genético da mesma espécie ou de uma outra espécie ou é homólogo à célula hospedeira procariótica ou eucariótica, mas então, está localizado em um ambiente genético diferente e assim se diferencia de um polinucleotídeo correspondente opcionalmente naturalmente presente. Um polinucleotídeo heterólogo pode estar presente em adição a um gene endógeno correspondente.
[0083] Formas de concretização e formas de execução da presente invenção são descritas de maneira exemplar com referência às figuras e sequências anexas:
[0084] Figura 1: Faixa QTL calculada de 23,1 cM para cromossomo 8 por meio de 8 marcadores em 528 indivíduos F2 do cruzamento RP1 x RP1HTN1. A barra preta (HtN) mostra o intervalo confidence. Indicações de posição dos marcadores em cM.
[0085] Figura 2: Ensaio de rendimento de silagem de 5 localização na Alemanha e em duas repetições com o progenitor recorrente RP3 e a versão A do fragmento do doador de B37HTN1 (RP3HTNA) e a versão K do fragmento do doador de B37HTN1 (RP3HTNK). As barras representam diferenças significativas de acordo com o teste t com p=0,05.
[0086] Figura 3: Descrição das regiões dos marcadores M1 até M6, que definem os intervalos cromossomais (Int. 1 até Int. 5), que apresentam o polinucleotídeo que confere resistência nas linhas de introgressão e portam a ligação gênica Drag no fragmento de cromossomo proveniente do doador. Porções cromossomais do doador 'Pepitilla' são pontilhadas, aquelas do progenitor recorrente(sem ligação gênica Drag) são representadas tracejadas diagonalmente. O intervalo 1 (Int. 1) compreende o locus de resistência HTN1, o intervalo 2 (Int. 2) compreende faixas de sequências, que no doador são responsáveis pela ligação gênica Drag do tempo da floração, os intervalos 4 e 5 (Int. 4 e Int. 5) compreendem faixas de sequências, que no doador são responsáveis pela ligação gênica Drag do rendimento da silagem.
[0087] Figura 4: BAC-contig em seu banco BAC de RP4HTN1 com sequência correspondente scaffold e anotações de genes. Genes candidatos são representados como caixinhas quadriculadas. As setas pretas representam outros genes anotados, que não são genes candidatos de resistência HTN.
[0088] Em um local foram plantados respectivamente pelo menos 20 indivíduos em uma série por genótipo de milho a ser pesquisado. A inoculação foi realizada natural ou artificialmente. A vacinação/infecção natural foi realizada através de esporos que ocorrem naturalmente de H. turcicum. A vacinação/infecção artificial foi realizada por meio de material foliar infectado e moído, que foi colocado nas plantas a serem pesquisadas. O último tipo de inoculação permitiu a simulação de uma infestação por H. turcicum comparável em diferentes anos de ensaio e em diferentes locais, independentemente das condições de infestação naturais respectivamente predominantes. Como genótipos de controle cultivou-se um progenitor suscetível e um progenitor com introgressão HtN1 do doador B37HTN1 de acordo com a população de cruzamento pesquisada. A avaliação da característica de resistência ao HT foi realizada em pelo menos três tempos durante o período de vegetação. O esquema de avaliação usado uniformemente é mostrado na tabela 3.
[0089] O doador B37HTN1 como fonte da resistência ao HT foi cruzado em diferentes fundos genéticos de linhagens Elite com diferentes suscetibilidades fortemente pronunciadas contra H. turcicum e foram desenvolvidas linhagens isogênicas próximas, que se diferenciam das linhagens de partida suscetíveis essencialmente apenas através da introgressão de B37HTN1. Em experimentos de fenotipificação, após a inoculação artificial, tal como descrito acima, foram selecionadas aquelas linhagens que, através da introdução da introgressão de B37HTN1 que confere resistência, mostraram uma melhora da resistência ao HT em torno de pelo menos 2 a 3 notas de avaliação, preferivelmente de 3 a 4 notas de avaliação. Por exemplo, a presente invenção é descrita, além disso, em mais detalhes nos dois progenitores RP1 e RP3 recorrentes selecionados. Os resultados dos experimentos de fenotipificação são resumidos na tabela 5. O progenitor recorrente RP1 sem introgressão mostrou notas de avaliação médias de 7 a 9, que foram melhoradas através da introgressão de B37HTN1 em 3 a 4 notas. O progenitor recorrente RP3 mostrou notas de avaliação entre 4 e 6 sem introgressão e uma melhora em torno de 2 a 3 notas de avaliação através da introgressão. O progenitor recorrente RP4 mostrou notas de avaliação de 6 sem introgressão e uma melhora em torno de 2 a 3 notas de avaliação através da introgressão. Tabela 5: Dados de fenotipificação para a resistência ao HT de genótipos RP1, RP3 e RP4 com e sem introgressão de B37HTN1 que confere resistência (as notas de avaliação foram avaliadas de acordo com o esquema da tabela 3).
[0090] Além da resistência ao HT, para cada genótipo foi abrangido o tempo da flor feminina e masculina em dias após a semeação. O tempo da flor feminina é determinado pelo aparecimento da seda, o da flor masculina pelo aparecimento da panícula. Os resultados são mostrados em detalhes no exemplo 3. B).
[0091] Além dos dados acima para a resistência ao HT e tempo de floração, foram determinados os dados de rendimento para RP3, contendo fragmentos de introgressão de diferente comprimento, que conferem resistência de B37HTN1 ou Pepitilla e para uma linhagem Elite comparativa. As linhagens RP3, RP3HTNA e RP3HTNK foram polvilhadas com um provador (Flintmais, interpool Einfachkreuzung) da associação de genes (genpool) complementar (Flintmais), para produzir sementes de híbridos de teste. Esses híbridos de teste foram plantados respectivamente duas vezes em um ensaio de campo e cinco locais representativos para o plantio de milho na Alemanha. Os híbridos de teste são bem adaptados nessa região de plantio em relação ao amadurecimento. O ensaio de campo foi realizado com duas repetições em parcelas de 4 fileiras com 6 m de comprimento e 0,75 m de distância entre as fileiras. A densidade de povoamento perfez 9 plantas por m2 na primeira repetição e 11 plantas por m2 na segunda repetição. No tempo do amadurecimento do milho no silo foram colhidas apenas as fileiras do meio de cada parcela, para minimizar os efeitos de concorrência. O peso de cada parcela e o teor de água foram determinados na colheita, para calcular o rendimento do milho no silo (também rendimento da silagem ou total dry matter yield) e o teor de substância seca (total dry matter contente).
[0092] 20 indivíduos por genótipo foram cultivados em vasos. Como controles dependendo do cruzamento, serviram genótipos de um progenitor suscetível e um progenitor quase-isogênico (NIL) com introgressão que confere resistência de B37HTN1. 14 dias após a semeação realizou-se uma infecção artificial (veja acima). Depois de mais 2 a 3 semanas desenvolveram-se os primeiros sintomas da doença. A partir do tempo da manifestação dos primeiros sintomas, registraram-se a cada dois dias as avaliações da característica de resistência ao HT, bem como o número de plantas com sintomas. Desses dados determinou-se, então, o AUDPC (area under disease progress curve). A incidência da doença (em %/tempo x período) foi usada para distribuir as plantas pesquisadas, sendo que AUDPC de 0 a 100 corresponde a resistente, de 101 a 450 a heterozigoto e > 450 a suscetível.
[0093] Além dos ensaios de avaliação, a região alvo foi pesquisada mais detalhadamente em torno do locus de resistência HTN1 para cromossomo 8 (bin 8.06) em inúmeros genótipos por meio de marcadores moleculares novos e/ou otimizados e mapeada em mais detalhes. Para isso, desenvolveram-se marcadores moleculares usados com base em polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) ou marcadores já disponíveis publicamente simple sequence repeat (SSR):
[0094] Os DNA dos genótipos para a aplicação dos marcadores foram isolados ou por meio do método NucleoSpin 96 Plant II de acordo com dados de fabricantes (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Alemanha) ou por meio do método Klear Gene DNA Extraction 384 (LGC Genomics GmbH, Alemanha).
[0095] As sequências iniciadoras dos marcadores SSR já eram conhecidas do banco de dados público do National Center for Biotechnology Information (NCBI) em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists; as sequências iniciadoras dos marcadores bnlg 1782, umc 1960, bnlg240, umc1121, bnlg1067 e umc1287, que foram usados para pesquisar a região alvo, junto com as modificações realizadas são resumidos na tabela 6. Tabela 6: Sequências iniciadoras dos marcadores SSR (NED: 2'-cloro- 5'-fluor-7',8'-fenil unido-1,4-dicloro-6-carboxifluoresceína; FAM: 6- carboxifluoresceína; M13: sequência nuclear do fago M13)
[0096] A mistura de reação PCR de bnlg1782, umc1960, bnlg240, umc1121 e bnlg1067 compreendeu 10 μl e consistiu em uma concentração simples do 4x tampão B (Solis BioDyne, Estland), 0,5 pmol do primer de avanço (forward primer), 0,5 pmol do primer reverso, 10-30 ng de DNA, 0,25 unidades de HotFirepol TAQ-Polymerase (Solis BioDyne, Estland). A mistura de reação de umc1287 compreendeu 10 μl e consistiu em uma concentração simples do 4x tampão B (Solis BioDyne, Estland), 0,5 pmol do primer de avanço (forward primer), 2,5 pmol do primer reverso, 0,3 pmol do primer adicional M13, 10-30 ng de DNA, 0,25 unidades de TAQ-Polymerase (Solis BioDyne, Estland).
[0097] A reação de PCR foi realizada com um tempo de desnaturação inicial de 900 segundos a 94oC, um ciclo de amplificação de 25-40 ciclos com 15 segundos a 94oC, 30 segundos a 50-55oC e 120 segundos a 72oC e com uma etapa final durante 300 segundos a 72oC. No final, realizou-se uma incubação da reação de PCR de 2 horas a 65oC. A separação dos produtos de PCR foi realizada em um ABI3730xl (Life TechnologiesTM, EUA) de acordo com os dados do fabricante para a separação de fragmentos de 50-400 bp.
[0098] Os marcadores SNP foram desenvolvidos e usados ou (a) a partir de fontes publicamente disponíveis, (b) a partir de uma sequenciação de Amplicon comparativa ou (c) a partir de uma comparação de sequência de sequências BAC de RP4HTN1 (veja seção de análise molecular) e B73 Referenz-Genom AGPv02 (www.maizsequece.org).
[0099] (a) A partir da fonte SNP publicamente disponível do Mais Community 50K-Illumina-Chip (Ganal e colaboradores, 2011) os SNPs foram transformados em marcadores KASP (LGC Genomics GmbH, Alemanha). Para isso, foram desenvolvidos novos iniciadores, que garantiram a amplificação dos alelos decisivos no ensaio do marcador KASP (veja a tabela 4). Todo o decurso do trabalho foi realizado com o software KrakenTM (LGC Genomics GmbH, Alemanha). Para um ensaio de marcador KASP foram usados 5-20 ng de DNA, 0,02 μl de uma mistura de ensaio oligo (12 μM de Primer Allele 1 (forward); 12 μM de Primer Allele 2 (forward); 30 μM de reverse Primer) e 1,5 μl de um kit de reagente 1xKASPar para 1536 placas. Um setup de PCR padrão consistiu em 94oC durante 15 minutos, 10 ciclos com 94oC durante 20 segundos, 61-55oC touch down durante 1 minuto, 26 ciclos com 94oC durante 20 segundos e 55oC durante 1 minuto. A avaliação dos alelos por genótipo foi realizada por meio do software KrakenTM (LGC Genomics GmbH, Alemanha).
[00100] (b) A sequenciação Amplicon comparativa foi realizada por meio da sequenciação Sanger. Os genótipos na sequenciação comparativa compreenderam respectivamente o doador B37HTN1, bem como B37, RP1, RP1HTN1, RP3, RP3HTN1 (versões A, B, K), RP4, RP4HTN1. Os DNA foram isolados de grãos moídos por meio do método CTAB (Maniatis e colaboradores, 1982). As sequências iniciadoras para a sequenciação Amplicon são listadas na tabela 4. Um protocolo de PCR padrão para a amplificação das faixas correspondentes consistiu em uma desnaturação a 94oC durante 5 minutos, 35 ciclos com respectivamente 94oC durante 1 minuto, 60oC durante 1 minuto e 72oC durante 2 minutos e em uma etapa final a 72oC durante 10 minutos. Os produtos de PCR foram sequenciados com o método Sanger (Sanger & Coulson, 1975). A avaliação da sequenciação foi realizada com o software DNAStar Lasergene (DNASTAR Inc. EUA). Os polimorfismos detectados foram transformados em marcadores KASP, tal como descrito em (a).
[00101] (c) Os contigs de sequências BAC (Bac-sequence-contigs) foram projetados por meio do algoritmo blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) contra o genoma de referência B73 AGPv02, para detectar os polimorfismos de nucleotídeo único (SNP). Os polimorfismos foram detectados com o software Lasergene (DNASTAR Inc., EUA) e são enumerados na tabela 4 junto com as sequências flanqueadoras. Para as sequências flanqueadoras de um SNP foram desenvolvidos iniciadores e os SNPs identificados foram transformados em marcadores KASP, tal como descrito em (a).
[00102] O locus de resistência HTN1 dos doadores B37HTN1 foi bloqueado em linhagens Elite, tal como descrito no exemplo 1.A) e com auxílio dos marcadores SSR e SNP do exemplo 2., foi localizado no cromossomo 8 (bin 8,06) (veja a Figura 1). NILs dos cruzamentos RP1 x RP1HTN1 e RP3 x RP3HTN1 foram fenotipificados em dois locais durante vários anos com duas repetições em condições naturais de infecção de acordo com o esquema de avaliação conforma a tabela 3. Os NILs mostraram em média uma resposta de resistência melhor em 4 notas de avaliação em comparação com a linhagem original. O desenvolvimento das lesões locais nas folhas foi adiado em torno de aproximadamente 2 semanas em comparação com o genótipo suscetível. Um mapeamento QTL foi realizado com 528 F2 indivíduos (cruzamento de RP1 x RP1HTN1) usando os 8 marcadores (da Figura 1 mapeamento QTL - os marcadores são enumerados nas tabelas 4 e 6). A faixa QTL, que compreende o locus de resistência HTN1, foi localizada no cromossomo 8 entre os marcadores MA0002 e umc1287 em uma faixa de 23,1 cM.
[00103] O doador B37HTN1 foi cruzado com o KWS.elite de uma linhagem de milho Elite da KWS SAAT AG (Alemanha) e esse foi prosseguido durante cinco gerações retrocruzando com KWS.elite. Em cada geração de retrocruzamento foram utilizados marcadores moleculares para selecionar plantas, que eram heterozigotas para a região alvo HTN. Em seguida, uma planta selecionada da quinta geração de retrocruzamento foi continuamente autofecundada e com os marcadores moleculares foram identificadas plantas homozigotas para a região alvo HTN.
[00104] Essas linhagens foram testadas em ensaios de campo em vários locais. Nesse caso, para os genótipos B37HTN1, KWS.elite e KWS.elite.B37HTN1, tal como descrito no exemplo 1., registraram-se os dados fenotipificados da resistência ao HT e os tempos de floração. Os genótipos com introgressão de HTN1 mostraram a resistência esperada ao HT com notas de avaliação de 1 a 3, enquanto as linhagens de partida KWS.elite obtiveram notas de avaliação de 5 a 7. De maneira inesperada, o KWS.elite. B37HTN1 apresentou, além disso, em comparação com o KWS.elite, um tempo adiado em pelo menos 2 dias, tanto da flor feminina, quanto também da flor masculina. Esses tempos de floração adiados representam uma característica agronômica negativa, que se baseia na ligação gênica Drag, que ainda não foi descrita nessa forma após a introgressão da resistência ao HT de B37HTN1. As análises dos marcadores permitem a localização da ligação gênica Drags, que é responsável pelo tempo de floração adiado, em uma faixa entre duas regiões de marcadores na introgressão de B37HTN1, entre M1 e M2. Para isso, os genótipos B37HTN1, KWS.elite e KWS.elite. B37HTN1 foram analisados, por exemplo, com os marcadores KASP SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 e PZE- 108077560 (veja a Figura 3 e tabela 4). SYN14136 e PZE-108076510 foram usados para a detecção específica da região do marcador M1, SYN24931 e PZE-108077560 para a detecção específica da região M2. De acordo com esses, localiza-se a região do marcador M1 5' do locus da ligação gênica Drags e a região do marcador M2 3'. A análise do marcador mostrou, que B37HTN1 e KWS.elite. B37HTN1, ambos com uma floração atrasada em 2 dias, mostraram alelos comuns para as regiões M1 e M2, bem como o intervalo entre essas regiões, enquanto o KWS.elite com um tempo de floração normal mostraram outros alelos para as regiões M1 e M2 e o intervalo entre esses.
[00105] O doador B37HTN1 foi cruzado com RP3 e prosseguido por três gerações retrocruzado com RP3. Em cada geração de retrocruzamento foram utilizados marcadores moleculares. Inicialmente, foram selecionadas plantas, que eram heterozigotas para a região alvo HTN1 e, em seguida, essas plantas foram pesquisadas com marcadores uniformemente distribuídos ao longo do genoma, para selecionar contra o genoma doador. Em seguida, uma planta selecionada da terceira geração de retrocruzamento foi continuamente autofecundada e com os marcadores moleculares foram identificadas as plantas homozigotas para a região alvo HTN1.
[00106] Além disso, o doador B37HTN1 também foi cruzado com os progenitores recorrentes RP3 e RP4 e produzida uma linhagem RP3HTNA e RP4HTNA durante várias etapas do retrocruzamento. A fenotipificação para resistência ao HT mostrou uma melhora das notas de avaliação de 5 para 7 para a linhagem de partida RP3 de 1 a 3 para RP3HTNA e uma melhora das notas de avaliação de 6 para a linhagem de partida RP4 para 2 a 3 para RP4HTNA. A fenotipificação para os tempos de floração mostrou tempos de floração comparáveis para RP3 e RP3HTNA e RP4 e RP4HTNA. Usando os marcadores KASP SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 e PZE-108077560, foi possível comprovar, que RP3 e RP3HTNA portam alelos comuns para as regiões M1 e M2. Esses não corresponderam ao doador B37HTN1. No resultado, a porção cromossomal da introgressão de B37HTN1 que retarda, dessa maneira, o tempo de floração no intervalo cromossomal situa-se entre as regiões dos marcadores M1 e M2. Com a linhagem RP3HTNA conseguiu-se, dessa maneira, remover essa ligação gênica Drag. Os marcadores KASP SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 e PZE-108077560 usados estão disponíveis como ferramenta eficaz para a "seleção assistida".
[00107] A fenotipificação dos RP3 e RP3HTNA compreendeu, além disso, também o registro do rendimento do grão e da silagem. Enquanto o rendimento do grão nos genótipos não era significativamente diferente, a característica rendimento da silagem no RP3HTNA mostrou uma nítida redução estatisticamente comprovável em torno de pelo menos 14 decitoneladas por hectare (dt/ha) em relação ao RP3 ou uma redução em mais de 5%.
[00108] Com auxílio dos marcadores KASP SYN14136, PZE- 108076510, SYN24931 e PZE-108077560 desenvolvidos, a partir do cruzamento de B37HTN1 e um progenitor recorrente RP1 foi possível selecionar uma linhagem RP1HTN1, que não apresentou mais qualquer linhagem retardadora do tempo de floração, mas, do mesmo modo, mostrou uma redução do rendimento da silagem, tal como foi observado para RP3HTNA. Para a caracterização molecular melhorada, o RP1HTN1 foi adicionalmente desenvolvido e criada uma população F2 com 724 indivíduos do cruzamento de RP1 x RP1HTN1. Em seguida, a geração F3 foi autofecundada e as plantas F4 selecionadas foram geno- e fenotipificadas. A genotipificação foi realizada por meio de marcadores da tabela 6 na faixa QLT detectada de 23,1 cM. A fenotipificação foi realizada em vários locais em duas repetições (veja o exemplo 1.). As plantas recombinadas para a faixa QTL foram selecionadas e correlacionadas com os dados fenotípicos. A seleção compreendeu plantas, que cobriram diferentes faixas da região alvo, bem como plantas heterozigotas, com o objetivo de obter novas plantas recombinantes. Em cada ano foram realizados dois retrocruzamentos com RP1 e plantas únicas selecionadas e, dessa maneira, criados novos recombinantes. Os novos recombinantes foram fenotipificados no ensaio de campo e de estufa (veja em 1.) e genotipificados para o desenvolvimento de novos marcadores moleculares de acordo com 2.
[00109] A aplicação desses novos marcadores no genótipo RP3HTNA permitiu a identificação de uma região do marcador M3, que limita a introgressão na faixa 5' e que pode ser descrita com os marcadores flanqueantes PZE-108093423 e PZE-108093748. Neste caso, o PZE-108093423 deveria apresentar o alelo do progenitor recorrente RP3 e o PZE-108093748 o alelo do doador B37HTN1. Na faixa 3' a introgressão de RP3HTNA dos marcadores PZE-108107671 e SYN4196 é descrita em uma outra região do marcador M6 (veja a Figura 3). Neste caso, o PZE-108107671 porta o alelo do doador B37HTN1 e SYN4196 porta o alelo do progenitor recorrente RP3. A introgressão de RP3HTNA (a seguir, mencionado de versão A) entre as regiões dos marcadores M3 e M6 corresponde ao doador B37HTN1, mas fora dessa faixa, ao progenitor recorrente ou a uma outra linhagem, que não porta os alelos na faixa entre M1 e M2 do doador B37HTN1. Essa versão A foi introduzida em diversos outros fundos genéticos e submetida novamente a testes de rendimento, fenotipificações de resistência e determinação de tempos de floração. Os resultados eram comparáveis àqueles descritos para RP3HTNA. Assim, o tempo de floração não foi adiado em comparação com as linhagens correspondentes sem introgressão e as linhagens mostraram uma melhor resistência contra Helminthosporium turcicum, em comparação com a linhagem de partida, contudo, além disso, a redução do rendimento da silagem.
[00110] Como doador foi usada a linhagem RP3HTNA. Essa foi cruzada com RP3 e continuamente autofecundada durante seis gerações. Em cada geração de autofecundação foram utilizados marcadores moleculares na faixa alvo, para diminuir o fragmento do doador. Visto que todas as regiões do genoma fora da região alvo já tinham sido selecionadas na linhagem RP3HTNA para RP3, apenas a faixa em torno da região alvo HTN foi pesquisada com os marcadores. Neste caso, as plantas homozigotas foram identificadas para uma região alvo HTN diminuída. Paralelamente, realizou-se um intenso desenvolvimento de marcadores na faixa alvo. Além de muitos outros, conseguiu-se identificar uma linhagem RP3HTNK, que porta o fragmento do doador B37HTN1 de uma região do marcador M4, flanqueada pelos marcadores MA0004 e MA0005, sendo que MA0004 descreve o alelo do progenitor recorrente RP3 e MA0005, o alelo do doador B37HTN1 em RP3HTNK, até uma região do marcador M5, flanqueada pelos marcadores MA0006 e PZE-108097482, sendo que MA0006 descreve o alelo do doador B37HTN1 e PZE-108097482 descreve o alelo do progenitor recorrente RP3. A introgressão de RP3HTNK (a seguir, mencionada de versão K) causa em RP3HTNK uma melhor resistência ao HTN1 em torno de 3 a 4 notas de avaliação, em comparação com RP3, um tempo de floração igual, tal como sua linha de partida RP3 (nenhum retardamento na flor) e nenhuma redução significativa do rendimento do rendimento da silagem (veja a Figura 2). Com auxílio dos marcadores descritos, a partir da linhagem de partida RP1 através de cruzamento, também puderam ser criadas ligações gênicas de linhagens livres de Drag, que apresentam a versão K da introgressão.
[00111] A versão K possui um haplótipo de B37HTN1 ou Pepitilla, que porta os alelos de doadores descritos na tabela 4 nas posições físicas em relação a B73 AGPv02 em bp. A descrição do haplótipo é descrita aqui, por meio de exemplos, em marcadores MA0008: usando o marcador MA0008 e determinando os alelos para B37HTN1, RP3, RP3HTNA, RP3HTNK, então o alelo "T" é determinado para B37HTN1, RP3HTNA, RP3HTNK e o alelo "C" para RP3. Esse marcador diferencia para esse locus igualmente a fonte de resistência HTN1 suspeita PH99N (WO 2011/163590), que nessa posição contém igualmente um alelo "C", da fonte de resistência usada para esse caso.
[00112] Além disso, o fragmento de cromossomo inserido e truncado através de introgressão, foi analisado molecularmente. O locus de resistência Htn1 do acesso Pepitilla foi reduzido, dessa maneira, para uma região alvo distinta, um intervalo cromossomal de 700 kb e sequenciado no genótipo RP4HTN1. Tal como é citado a seguir em mais detalhes, o clone BAC de RP4HTN1 foi isolado, sequenciado e montado em uma sequência Scaffold. A sequência Scaffold foi anotada e informações de sequências EST/cDNA foram comparadas com os genes anotados desse intervalo. A partir do grande número de genes anotados identificaram-se, depois, os genes candidatos através de estudos de expressão diferenciais (veja a tabela 1).
[00113] Um banco BAC foi criado a partir do genótipo RP4HTN1. Seguiu-se a criação do banco BAC e do conjunto de matriz 3D de material foliar, bem como a classificação do conjunto de matriz 3D. Os iniciadores para a classificação do conjunto de matriz 3D foram à base da sequência B73AGPv01 de 149957158 bp até 152977351 bp para o cromossomo 8 (www.maizesequence.org) e do programa Primer 3 (http://simgene.com/Primer3;Rozen&Skaletsky, 2000). Os parâmetros para a seleção dos iniciadores foram um teor GC médio de 50%, comprimento do iniciador de 20 a 25 bp, temperatura de fusão entre 70 e 90oC e comprimento amplicon entre 70 e 80 bp. Com os pares de iniciadores na tabela 7, os conjuntos 3D foram classificados por meio de RT-PCR. Os valores dos dois parâmetros fusão-temperatura e valor CP são indicados para os clones BAC. Foi possível identificar 26 clones BAC para a faixa selecionada. Todos os clones BAC foram isolados do banco BAC e utilizados como cultura de E. coli para o isolamento do DNA e a sequenciação. A sequenciação foi realizada com um padrão GS-FLX Titanium Laufs (454 Life Sciences, EUA). A informação de sequência obtida dos clones BAC 144N24, 11pF13, 219G11, 86N21, 16B06, 84L18, 128D02, 25M23, 96H10, 19J24, 136A01, 75H06, 135F07 está resumida na tabela 8. Tabela 7: Pares de iniciadores para a detecção de clones BAC do banco BAC de RP4HTN
Tabela 8: Teor da sequência de 13 clones BAC analisados
[00114] Criação de uma sequência scaffolds: Os clones BAC 144N24, 119F13, 219G11, 86N21, 16B06, 84L18, 128D02, 25M23, 19J24, 96H10, 136a01, 75H06, 137F07 foram sequenciados por meio da técnica 454 (Margulies e colaboradores, 2005).
[00115] A montagem automática das sequências brutas dos clones BAC foi realizada com o software "Newbler" (454 runAssembly Software, Software Release 2.3). Os contigs de sequência produzidos dessa maneira por BAC foram dispostos corretamente em análise manual, sendo aplicadas as seguintes técnicas:
[00116] 1. Sequências de BACs sobrepostas puderam ser divididas de maneira grosseira em faixas sobrepostas e não sobrepostas.
[00117] 2. Contigs de sequências de diversos BACs sobrepostos foram comparados nas faixas sobrepostas. Cerca de 20% dos contigs de sequências puderam ser dispostos de tal modo e lacunas entre esses foram fechadas (por exemplo, quando um contig de um dos BAC cobre ou une o outro BAC).
[00118] 3. Todos os contigs de sequências foram anotados manualmente. Aqui, foram inicialmente anotados apenas elementos repetitivos (transposons e retrotransposons, de forma abreviada "TEs"). Visto que lacunas de sequências ocorrem principalmente em TEs, a anotação TE pode auxiliar para dispor os contigs de sequências corretamente. Isto é, quando uma das extremidades de um TEs se situa em um contig de sequência e a outra extremidade em um outro, os dois contigs podem estar dispostos de modo correspondente. Nesses casos, foi introduzida respectivamente uma sequência de 100 Ns, para encher as lacunas entre os contigs de sequências. Também a informação de TEs, que são intercalados (isto é, TEs, que se inseriram em outros TEs) foram usados, para dispor os contigs de sequências.
[00119] 4. Em algumas faixas não puderam ser usadas nem informações sobre BACs sobrepostos, nem anotações de TE (esse foi principalmente o caso em faixas, que foram cobertas apenas por um BAC). Ali, os contigs de sequências foram dispostos aleatoriamente e as lacunas entre esses foram cheias com sequências de 200 Ns.
[00120] 5. Muitos dos TEs no genoma do milho são retrotransposons "Ling Terminal Repeat" (LTR), que são flanqueados por sequências LTR longas (1-2 kb). Esses LTR podem ser idênticos em até 100%. Em alguns casos, foram montadas, por conseguinte, sequências brutas dos dois LTR em uma sequência de consenso (isto é, uma cópia do LTR não está presente na montagem. Nesses casos, as lacunas de sequências foram cheias com o número de N's, que corresponderiam ao comprimento do segundo LTR.
[00121] 6. Os genes foram anotados manualmente. Para esse fim, as sequências de codificação (CDS) do genoma do milho B37 publicado foram utilizadas como referência (http://www.maizegdb.org/gene_model.php). As CDS foram alinhadas através de DotPlot (http://www.dotplot.org/) com a sequência RP4HTN e, dessa maneira, determinadas as posições de exons e introns. Os genes candidatos foram determinados, por um lado, através da descrição de sua função (caso seja publicamente conhecida). Por outro lado, as CDS do RP4HTN resistente foram comparadas com os B73AGPv02 suscetíveis. Se foram encontradas diferenças, o respectivo gene foi incorporado na lista dos candidatos. A sequência pronta tem um comprimento de 1'328'253 bp. A lista dos genes candidatos é mostrada na tabela 1.
[00122] Análise de expressão: A expressão dos diversos genes candidatos foi testada em plantas não infectadas, de 21 dias (depois da semeação) (dia da infecção = 0 dpi), como também em plantas de 36 infectadas e não infectadas com H. turcicum (15 dias depois da infecção = 15 dpi inf/ni).
[00123] O RNA da segunda folha foi extraído das plantas de milho testadas, submetido a uma transcrição reversa em cDNA e a expressão foi medida por meio de qPCR. Respectivamente a segunda folha foi colhida, congelada e o RNA foi extraído com o kit SV Total RNA Isolation System (Z3100; Promega, Dübendorf, Suiça), do mesmo modo como foi descrito (Brunner e colaboradores, 2011; Risk e colaboradores, 2012), quantificado e testado para qualidade e pureza.
[00124] 1 μg de RNA foi submetido a uma transcrição reversa com o iScript RT Supermix (170-8841; Rio-Rad, Cressier, Suíça) em um volume de reação de 20 μl de acordo com os dados do fabricante. Para excluir uma possível contaminação através do DNA genômico (RT menos), uma reação sem a adição da transcriptase reversa foi incubada junto, paralelamente de cada amostra.
[00125] O tempo quantitativo real de PCR (RY-qPCR) foi realizado em triplicados ou duplicados técnicos em um volume de reação de 10 μl e adição de 4 μl 1:10 de cDNA diluído (10 mM de tris HCl pH 8, 0,1 mM de EDTA) em 5 μl de SsoFast EvaGreen®Supermix (172-5201; Bio-Rad, Suíça) e com uma concentração do iniciador de 400 nM no C1000 Touch Cycler (Bio-Rad, Suíça). Para a amplificação foi usado o seguinte programa: 95oC durante 30 segundos, seguidos de 40 ciclos a 95oC durante 3 segundos, depois 60 a 63oC (de acordo com a tabela 2) durante 5 segundos. Para a análise da curva de fusão (exclusivamente de dímeros iniciadores), o produto de PCR foi aquecido em etapas de 0,5oC de 65oC para 95oC. As curvas de amplificação e as curvas de fusão foram revistas no programa CFX Manager V 3,0 (Bio-Rad, Suíça) e os valores Cq (quantification cycle) exportadas para o programa qbase PLUS V 2.3 (Biogaszelle, Zwijnaarde, Bélgica) para determinar a expressão relativa.
[00126] Os iniciadores para os genes candidatos foram determinados com o auxílio de Primer-BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), para excluir a possível amplificação inespecífica em transcritos já conhecidos. Para avaliar os amplicons adequados, os produtos de PCR foram separados por meio de eletroforese em gel de agarose e testados para uma banda única e para seu tamanho. Além do mais, os amplicons de acordo com a tabela 1 de RP1HtN como também os NILHtn foram sequenciados. Para normalizar os dados de expressão foram usados 1 a 3 genes de referência (LUG, MEP, FPGS) (Manoli e colaboradores, 2012).
[00127] Todos os genes candidatos são expressos no genótipo suscetível RP1 e no genótipo resistente RP1HTM. Foi possível mostrar uma expressão diferencial entre RP1 e RP1HTN. O RLK1 nas plantas suscetíveis é expresso até 4 vezes mais forte do que nas plantas resistentes. Tabela 9: Pares de iniciadores para os genes candidatos com seu comprimento amplicon em bp e com a temperatura de hibridização adequada.
[00128] Classificação da população tilling e detecção de mutantes: Para os genes candidatos (tabela 1) pode ser classificada uma população tilling de 10000 plantas, que porta a introgressão de Pepitilla no cromossomo 8 na faixa de 151688552 - 153139596 bp em comparação com a referência B73 AGPv02 (www.maizesequence.org) e apresenta uma resistência contra Helminthosporium turcicum. As mutações podem ser ou substituições silenciosas de nucleotídeos, substituições de aminoácidos ou cordões de parada e servem para comprovar a função do gene candidato.
[00129] Transformação: Os genes candidatos podem ser introduzidos, por exemplo, no genótipo suscetível A188 através de transformação que confere o Agrobacterium tumefaciens. Esse genótipo destaca-se por valores AUDPC de 702 no teste GWH (n=18 plantas), de modo que uma transformação com o gene de resistência fornece uma resposta nítida de resistência.
[00130] O rastreamento dos genótipos com o gene HtN é realizado em muitos locais em todas as regiões de infestação da Europa. Até agora, essa resistência ainda não foi rompida, de modo que se parte do fato, de que até agora essa age em raças inespecíficas, por tanto tempo, até ser encontrada uma raça N. Na Europa predomina a raça 1, sendo que em algumas regiões já puderam ser provadas as raças 2 ou 3 ou uma combinação dessas (Hanekamp e colaboradores, 2013).
[00131] Novas plantas recombinantes para a faixa QTL foram selecionadas e correlacionadas com os dados fenotípicos. A seleção compreendeu plantas, que cobriram diferentes faixas da região alvo. Foi possível identificar plantas recombinantes, que entre os marcadores MA0005 e MA0021 - região do marcador do marcador M7 e os marcadores MA0013 e MA0022 - região do marcador M8, apresentam uma introgressão do doador B37HTN1 no fundo genético de RP1. Na figura 4 é mostrado, que essa faixa compreende unicamente os três genes RLK4, EXT1 e RLK1. Essas plantas recombinantes, que compreendem a faixa M7 - M8, mostram o fenótipo resistente, tanto no campo em inoculação artificial, como também no teste em estufa.
[00132] Para identificar o gene que confere resistência, a população tilling de 10000 plantas foi classificada, que porta a introgressão de Pepitilla no cromossomo 8 na faixa de 151688552 - 153139596 bp em comparação com a referência B73 AGPv02 (http://genome.arizona.edu) (RP3HTN1) e apresenta uma resistência contra Helminthosporium turcicum.
[00133] Para os genes RLK4 e RLK1 foram desenvolvidos amplicons (tabela 10) e após a amplificação dos DNA de plantas únicas da população tilling esses foram sequenciados por meio da sequenciação de Sanger. Tabela 10: Sequências iniciadoras dos amplicons
[00134] As sequências de amplicon foram avaliadas com o software DNASTAR Lasergene e identificadas as mutações de bases. Na tabela 11 está listada uma seleção de mutações encontradas. Tabela 11: Mutações identificadas para os genes RLK4 e RLK1
[00135] Os mutantes identificados foram autofecundados na estufa e as sementes das plantas homozigotas com um alelo de tipo selvagem e o alelo de mutação por evento de mutação foram conhecidas para um teste fenotípico.
[00136] Respectivamente 15 plantas homozigotas únicas com alelo de tipo selvagem e alelo de mutação dos mutantes RLK1, RLK1d, RLK4d e RLK4f e os controles RP1 e RP1HTN1 foram inoculados, tal como descrito acima, na estufa com H. turcicum. No período de 11 a 25 dias depois da inoculação, determinou-se a infestação em cada dia. Os valores de AUDPC de todas as plantas testadas são resumidas na tabela 12. Através da alteração do aminoácido no progenitor resistente da população tilling RP3HTN1, espera-se uma suscetibilidade dos mutantes homozigotos. Tabela 12: Valores de AUDPC das plantas homozigotas com alelo de tipo selvagem e alelo de mutação dos genes RLK1 e RLK4. Na coluna fenótipo, 0 - 100 significa resistente, 101 - 450, heterozigoto e > 450, suscetível Referências Bar-Zur, A. Tadmor, Y. Juvik, JA, Shimoni, M. & Reuveni, R (1998). "Resistance to northern leaf blight in maize (Zea mays) conditioned by the HtN gene and the association with isoperoxidases". 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Claims (2)
1. Processo para aumentar o rendimento de uma planta de milho resistente a Helminthosporium turcicum, em cujo genoma está integrado um fragmento de cromossomo do doador Pepitilla, sendo que o fragmento de cromossomo compreende um intervalo do doador, que apresenta um polinucleotídeo, que confere resistência contra H. turcicum, na planta de milho, e pelo menos um alelo doador do marcador MA0008 de acordo com as SEQ ID NOs 62 e 63, o referido processo sendo caracterizado pelo fato de que compreende usar reprodução assistida por marcadores para remover um ou mais intervalo selecionado de: (a) de um intervalo do doador entre um marcador em uma primeira região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores SYN14136 de acordo com as SEQ ID NOs 17 e 18 e PZE-108076510 de acordo com as SEQ ID NOs 20 e 21 e por um marcador em uma segunda região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores SYN24931 de acordo com as SEQ ID NOs 23 e 24 e PZE-108077560 de acordo com as SEQ ID NOs 26 e 27; (b) de um intervalo do doador entre um marcador em uma terceira região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores PZE- 108093423 de acordo com as SEQ ID NOs 29 e 30 e PZE-108093748 de acordo com as SEQ ID NOs 32 e 33 e um marcador na quarta região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores MA0004 de acordo com as SEQ ID NOs 41 e 42 e MA0005 de acordo com as SEQ ID NOs 44 e 45; e (c) de um intervalo do doador entre um marcador em uma quinta região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores MA0006 de acordo com as SEQ ID NOs 47 e 48 e PZE-108097482 de acordo com as SEQ ID NOs 50 e 51 e um marcador na sexta região do marcador, que é flanqueada pelos marcadores PZE-108107671 de acordo com as SEQ ID NOs 35 e 36 e SYN4196 de acordo com as SEQ ID NOs 38 e 39, sendo que o polinucleotídeo, que confere resistência contra H. turcicum, é uma molécula de ácido nucleico: - que apresenta uma sequência de nucleotídeos de cDNA de acordo com a SEQ ID NO: 1, - que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de cromossomo compreende um intervalo do doador, que apresenta adicionalmente pelo menos os alelos doadores de MA0021 de acordo com as SEQ ID NOs 241 e 242, MA0007 de acordo com as SEQ ID NOs 59 e 60, MA0009 de acordo com as SEQ ID NOs 65 e 66, MA0010 de acordo com as SEQ ID NOs 68 e 69, MA0011 de acordo com as SEQ ID NOs 71 e 72, MA0012 de acordo com as SEQ ID NOs 74 e 75 e MA0022 de acordo com as SEQ ID NOs 244 e 245.
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