CN112126707B - 来自玉米事件ca09328的核酸分子及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法，用于检测该核酸分子的引物组、探针及试剂盒，以及产生自玉米事件CA09328的玉米制品。本发明的玉米事件CA09328可稳定表达目的基因且表达量强，全生育期抗玉米螟效果优秀，且具有良好的安全性。

Description

来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年9月24日提交的申请号为CN202011021485.4、发明名称为“来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法”的专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及植物分子生物学、植物转化、以及植物育种的领域，具体涉及来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法。

背景技术

玉米(拉丁学名：Zea mays L.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物。通过生物技术改善玉米的农艺性状和品质已有相关研究。其中，如何在玉米中产生昆虫抗性，特别是对玉米螟虫、棉铃虫、黏虫等的抗性，同时对环境不产生有害作用，是一个重要的研究方向。其中，一种实现的方法是通过转基因的方式将特定的昆虫抗性基因在玉米植物中表达从而使玉米植物获得相应的昆虫抗性。例如国际公开号为WO2005059103A1、WO2013169923A1公开的技术等。

然而，外源基因在植物中的表达以及是否能实现抗虫效果受到该基因在植物染色体中的具体位置的影响。具体而言，外源基因在染色体上的位置不同，会对该外源基因是否表达以及相应的表达量也会有很大差异，在表达的空间和时间模式上也可能存在差异，例如不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。其原因可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。因此，为了得到最优的表达，通常需要筛选大量的玉米事件，如此才可能鉴定出可以商业化的事件，即以商业化为目的从大量的事件中筛选出具有目标基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期转基因表达量和表达模式的事件可以采用常规的育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中，通过杂交的方式产生的后代可以保持原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好地适应当地的生长条件。

因此，鉴定外源基因在基因组中的整合位点对转基因作物的应用具有重要意义。能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。在转基因安全评价中，外源基因在基因组中的整合位点是必须提供的信息。整合位点是通过与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(或基因组DNA)的序列(即，侧翼DNA序列)来表征的。

目前，主要通过PCR技术鉴定分析外源基因的整合位点，包括质粒拯救法、反向PCR(IPCR)法、TAIL-PCR(热不对称交错PCR)法、PCR-walking法等等。TAIL-PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物特异性好，重复性好，应用较为广泛。例如Xu等通过TAIL-PCR方法分离了水稻转基因事件Bt-ZJ22中外源基因整合位点3'端旁侧序列，并根据旁侧序列建立了TaqMan实时定量PCR鉴定方法(Xu J等，Qualitative detection and quantification ofa Cry1A(b)transgene present in rice cv.Zhejing 22,European food research andtechnology,2011,233:259-266)。

对于有性杂交的后代以及用其制备的产品，需要检测其是否包含特定的玉米事件的存在，以便确定有性杂交的后代是否包含目的基因。例如来源于基因重组农作物的食物在投放入市场前需要获得正式批准和进行标记。可以通过多种现有的多核苷酸的检测方法来检测植物中转基因的存在，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或者利用多核苷酸探针的DNA杂交。

本发明人的中国专利ZL201010552618.0中已公开了一种人工合成Bt抗虫基因Cry1Ab-t。该专利提供了一种编码来自于苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的Bt编码基因Cry1Ab，该基因在作物中可以稳定表达，具有较好的抗虫效果。但是，该专利并未对其提供的Bt抗虫基因Cry1Ab-t在染色体上的不同位置对表达量所造成的影响进行研究，因此，缺乏该抗虫基因在染色体上的不同位置对玉米抗虫能力影响的评估。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人对该Cry1Ab-t基因继续进行研究，得到具有单拷贝转基因、良好的遗传稳定性、高抗亚洲玉米螟、双丙胺磷除草剂耐受性等优秀特性的玉米事件CA09328。因此，本发明的目的是提供一种来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法，其可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定转基因玉米事件CA09328的DNA分子。

为实现上述目的，本发明提供了如下方面的技术方案。

在本发明的第一方面，提供了一种核酸分子，其来自玉米事件CA09328，所述核酸分子包括：SEQ ID NO：1或其互补序列、和/或SEQ ID NO：2或其互补序列；其中，所述玉米事件CA09328中包括异源DNA分子，所述异源DNA分子包括Cry1Ab-t基因表达盒和bar基因表达盒；所述Cry1Ab-t基因表达盒包括：用作Cry1Ab-t基因启动子的CaMV35S启动子、Cry1Ab-t基因编码框、用作Cry1Ab-t基因终止子的T-Nos终止子；所述bar基因表达盒包括：用作bar基因启动子的CaMV35S启动子、bar基因编码框、作为bar基因终止子的CaMV poly(A)信号。

SEQ ID NO：1为玉米事件CA09328中插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为20个核苷酸的DNA序列，其中依次包括10个来自于玉米基因组的核苷酸和10个来自于插入的异源DNA分子(即T-DNA)的核苷酸，因此，所述SEQ ID NO：1或其互补序列跨越了玉米事件CA09328中异源DNA分子插入位点的侧翼基因组DNA序列和异源DNA分子的5’末端序列，并且包含所述SEQ ID NO：1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CA09328的存在。类似地，SEQ ID NO：2为玉米事件CA09328中插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为20个核苷酸的DNA序列，其中依次包括10个来自于插入的异源DNA分子(即T-DNA)的核苷酸和10个来自于玉米基因组的核苷酸，因此，所述SEQ ID NO：2或其互补序列跨越了玉米事件CA09328中异源DNA分子插入位点的异源DNA分子的3’末端序列和侧翼基因组DNA序列，并且包含所述SEQ ID NO：2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CA09328的存在。

进一步地，本发明所提供的核酸分子进一步包括SEQ ID NO：3或其互补序列、和SEQ ID NO：4或其互补序列。

SEQ ID NO：3是玉米事件CA09328中插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的长度为1726个核苷酸的DNA序列，其中SEQ ID NO：3的碱基1-1248属于插入接合部位附近的玉米基因组，碱基1249-1726属于插入接合部位附近的异源DNA分子(即T-DNA)的核苷酸的5’末端，因此，所述SEQ ID NO：3或其互补序列跨越了玉米事件CA09328中异源DNA分子插入位点的侧翼基因组DNA序列和异源DNA分子的5’末端序列，并且包含所述SEQ ID NO：3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CA09328的存在。类似地，SEQ ID NO：4是玉米事件CA09328中插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的长度为1113个核苷酸的DNA序列，其中SEQ ID NO：4的碱基1-832属于插入接合部位附近的异源DNA分子(即T-DNA)的核苷酸的3’末端，碱基833-1113属于插入接合部位附近的玉米基因组，因此，所述SEQ ID NO：4或其互补序列跨越了异源DNA分子的3’末端序列和玉米事件CA09328中异源DNA分子插入位点的侧翼基因组DNA序列，并且包含所述SEQ ID NO：4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CA09328的存在。

进一步地，本发明所提供的核酸分子进一步包括SEQ ID NO：5或其互补序列。本发明的SEQ ID NO：5包括了整个T-DNA序列及其5’和3’末端的侧翼玉米基因组序列。具体来说，在SEQ ID NO：5中，碱基1-1248属于T-DNA序列的5’末端的侧翼玉米基因组序列，碱基6341-6621属于T-DNA序列的3’末端的侧翼玉米基因组序列，碱基1249-6340为T-DNA序列。关于T-DNA的结构，更具体而言，在SEQ ID NO：5中，碱基1490-2341为用作Cry1Ab-t基因启动子的CaMV35S启动子，碱基2355-4202为Cry1Ab-t基因编码框，碱基4203-4479为用作Cry1Ab-t基因终止子的T-Nos终止子，碱基4480-5506为用作bar基因启动子的CaMV35S启动子，碱基5519-6070为bar基因编码框，碱基6077-6251为用作bar基因终止子的CaMV poly(A)信号。

进一步地，本发明中所述的玉米事件CA09328以保藏号CGMCC No.19967保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明第一方面提供了玉米事件CA09328所特有的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列可用于表征玉米事件CA09328，从而可用于检测样品中是否存在玉米事件CA09328。具体而言，样品中SEQ ID NO：1-5中的一者或多者所示的核酸分子的存在表明该样品中存在玉米事件CA09328。优选地，样品中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核酸分子的存在表明该样品中存在玉米事件CA09328。更优选地，样品中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核酸分子的存在表明该样品中存在玉米事件CA09328。最优选地，样品中SEQ ID NO：5所示的核酸分子的存在表明该样品中存在玉米事件CA09328。本领域技术人员容易理解的是，与上述方案类似，样品中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示的核酸分子的存在也可以表明该样品中存在玉米事件CA09328，或者样品中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核酸分子的存在也可以表明该样品中存在玉米事件CA09328。

根据本发明的第二方面，提供了一种用于检测样品中存在来自玉米事件CA09328的核酸分子方法，该方法包括如下步骤：(1)使所述样品与第一引物组和第二引物组接触，并进行核酸扩增反应；(2)检测核酸扩增所得到的扩增子中是否含有SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：2所示的核酸分子；其中所述第一引物组包含引物1F和引物1R，第二引物组包含引物2F和引物2R，并且同时满足下列条件：(1)所述引物1F为SEQ ID NO：3的碱基1-1248中连续的11-30个碱基(优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基)，并且所述引物1R为SEQ ID NO：3的碱基1249-1726中连续的11-30个碱基(优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基)的反向互补序列，并且所述第一引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO：1；以及(2)所述引物2F为SEQ ID NO：4的碱基1-832中连续的11-30个碱基(优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基)，并且所述引物2R为SEQ ID NO：4的碱基833-1113中连续的11-30个碱基(优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基)的反向互补序列，并且所述第二引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO：2。

进一步地，本发明提供了用于上述方法的引物组，其结构满足上段内容所描述的条件。

引物设计的方法属于本领域技术人员所熟知的技术，例如可以通过Oligo 6、BLAST、Primer Premier等工具完成并进行验证。例如通过Elizabeth van Pelt-Verkuil等所著的《Principles and Technical Aspects of PCR Amplification》的第64-74页(Springer Science&Business Media,2008年3月14日)中所介绍的方法完成，该文献公开的内容通过引用并入本文。

因此，本发明也提供了一种扩增子，其包括SEQ ID NO：1-5中的一者或多者，优选地，其包括SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2。

根据本发明的第三方面，提供了一种用于检测样品中存在来自玉米事件CA09328的核酸分子方法，所述方法包括：(1)使所述样品与第一探针和第二探针接触；(2)使所述样品和所述第一探针以及第二探针在严格杂交条件下杂交；(3)检测所述样品和所述探针的杂交情况；其中所述第一探针和第二探针的长度均为11-30个核苷酸，所述第一探针包含SEQ ID NO：1或其互补序列中任意的11-20个连续核苷酸，并且所述第二探针包含SEQ IDNO：2或其互补序列中任意的11-20个连续核苷酸，并且所述第一探针和第二探针各自用至少一种荧光基团标记；优选地，所述第一探针包含SEQ ID NO：1或其互补序列，并且所述第二探针包含SEQ ID NO：2或其互补序列，并且所述第一探针和第二探针各自用至少一种荧光基团标记。

进一步地，本发明提供了用于上述方法的探针组，该探针组包括如上段所述的第一探针和第二探针，其各自的结构满足上段内容所描述的条件。

本发明所述的严格条件例如可以是在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种用于检测样品中存在来自玉米事件CA09328的核酸分子的试剂盒，其中该试剂盒包括根据本发明的第二方面所提供的引物组或者根据本发明的第三方面所提供的探针。

在本发明的第二、第三、第四方面中，所述的样品选自：(1)玉米植株的整体或包含玉米遗传物质的任何组成部分，或(2)玉米制品；其中所述包含玉米遗传物质的任何组成部分选自玉米根、玉米茎、玉米叶、玉米雌花、玉米雄花、玉米种子、玉米胚；所述玉米制品为包含玉米成分的食品、化妆品、辅料(如药物辅料)以及由玉米的任何组成部分制备的其他制品。

根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种产生自玉米事件CA09328的玉米制品，并且所述玉米制品为玉米粉、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、含玉米成分的化妆品、或者含玉米成分的辅料。

本发明的玉米事件CA09328及含有该事件的玉米植物相对于现有技术具有明显的优势：1)不同世代的转基因材料抗虫性方面，经过连续三代分析，目的基因整合及遗传、目的基因表达、目标性状不同世代间均表现非常稳定；2)目的基因Cry1Ab-t的目标蛋白在玉米叶片、花丝、穗部等器官表达量非常强；3)该玉米事件在全生育期抗玉米螟效果极好，均表现为高抗性。

附图说明

图1是pCAMBIA3300+35S-Cry1Ab-t载体结构示意图。

图2是异源基因插入玉米基因组后插入位点的结构示意图；并且示意性的标注了本发明中SEQ ID NO:1-5的序列的相对位置。

图3为TAIL-PCR扩增产物的电泳图。

图4为玉米事件CA09328苗期叶片亚洲玉米螟抗性室内生测鉴定结果的示意图，包括T2、T3、T4代叶片玉米螟抗虫性室内检测结果。其中，1：T2转基因材料；2：T2对照材料；3：T3转基因材料；4：T3对照材料；5：T4转基因材料；6：T4对照材料。

图5为玉米事件CA09328的叶片人工接虫田间玉米螟抗性鉴定结果的示意图，包括T2、T3、T4代叶片人工接种亚洲玉米螟田间抗性鉴定结果。

具体实施方式

以下将参照附图更完整地描述本发明，其中显示了本发明部分但并非全部的实施方案。实际上，可以以许多不同的形式实施本发明，而不应当理解为限制至本文所列出的实施方案。下列定义和方法将更好地定义本发明并且指导本领域的普通技术人员实施本发明。本发明所属领域的技术人员可根据本文的描述和相关附图中的信息的教导提出的本发明的许多修改和其它实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，基于本发明的教导所提出的修改方案和其它实施方案也包括在所附权利要求的范围之内。

除非另作说明，此处所使用的术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。

如本文所用，术语“玉米”指玉蜀黍(Zea mays)并且包括可以用玉米培育的所有植物品种，包含野生玉蜀黍种类。

如本文所用，属于“包含”与“包括”、“含有”、“含”同义，并且均意味着“包括但不限于”。

如本文所用，术语“事件”(event)与“转化体”在本文中可互换使用，均指通过用异源DNA(例如，包括相关基因的表达盒)转化和再生植物细胞或组织而产生的重组植物。术语“事件”是指包含异源DNA的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也指在转化体与另一玉米系之间通过有性异型杂交而产生的子代。即使在重复与回归亲本回交后，来自该转化的亲本的插入DNA和侧翼DNA存在于在该杂交子代的同样的染色体位置。术语“事件”也指来自原始转化体的DNA，包含该插入DNA以及直接邻近该插入DNA的侧翼基因组序列，其预期将被转移至子代中，该子代作为包含该插入DNA(例如，该原始转化体及由自交产生的子代)的亲本品系与不含该插入DNA的亲本品系的有性杂交的结果而接收了包含相关转基因的插入DNA。通常，植物组织的转化产生多个事件，每个事件代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组的不同位置上。基于该转基因的表达或其他希望的特征，选择特定的事件。因此，“事件CA09328”、“CA09328”或者“CA09328事件”可以互换地使用。

术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

本发明中“异源的”(在本文中可与“外源的”互换使用)是指自然界中第一分子通常不被发现与第二分子组合。例如，分子可以源自第一物种并插入到第二物种的基因组中。因此这种分子对于宿主是异源的并被人工引入宿主细胞的基因组中。

“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的异源DNA(在本文中可与“外源DNA”互换使用)，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“左边界侧翼”或“3’侧翼”或“3’基因组边界区”或“基因组3’边界序列”等。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“5’侧翼”或“5’基因组边界区”或“基因组5’边界序列”等。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类，优选为荧光基团。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件CA09328基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因玉米事件CA09328或种子还是来源于转基因玉米事件CA09328的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是15个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有完全的DNA序列同一性。

基于本发明的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件CA09328的植物材料中分离相应的DNA分子，并确定该DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含转基因插入序列和玉米基因组侧翼区域，所述DNA分子的片段可以用作引物或探针。

热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，简称Tail-PCR)是一种建立在PCR反应基础上，用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术以基因组DNA为模板，使用高退火温度的长特异性引物和短的低退火温度的简并引物，通过特殊的热不对称(高严谨性PCR和低严谨性PCR)循环程序，有效扩增特异产物。该方法已被研究者广泛应用，成为分子生物学研究中常用的克隆基因侧翼序列的技术，其原理为：以基因组DNA作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3个较高退火温度的嵌套特异性引物(special primer,SP)和一个较短且Tm值较低的随机简并(arbitrary degenerate,AD)引物组合，通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增，获得已知序列的侧翼序列。

如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件CA09328通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件CA09328，或玉米提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因玉米事件CA09328，从玉米植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因玉米事件CA09328的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因玉米事件CA09328也是诊断性的。扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。

目的基因Cry1Ab-t(SEQ ID NO:1)为本发明人的专利ZL 201010552618.0中公开的新型Bt基因，其所编码的杀虫蛋白可以抑制和杀死鳞翅目昆虫玉米螟，CDS区为1848bp，可编码一个含615个氨基酸的蛋白。该基因是采用蛋白质可变区进化生物信息学分析、密码子优化等分子设计方法，对Bt蛋白进行定向改造，获得的新型抗虫基因，与已报道的Cry1Ab基因最大同源性为66.2％。

目的基因bar的CDS区为570bp，可编码一个含189个氨基酸的蛋白。该基因来源于吸水链霉菌(Streptomyces Hygroscopicus)，它编码草铵膦乙酰转移酶PAT(phosphinothricin acetyltransferase)，PAT通过催化乙酰辅酶A与草铵膦游离氨基结合，使草铵膦失去活性。

DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的DNA分子。DNA构建体中所含有的表达盒包括提供信使RNA的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。

以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1pCAMBIA3300+35S-CryAb-t表达载体构建

采用标准基因克隆技术，构建重组表达载体(如图1所示)。具体步骤如下：

步骤1：将人工改造合成的抗虫基因Cry1Ab-t基因设计XbaI、SacI酶切位点(5’端加XbaI酶切位点、3’端加SacI酶切位点)(由生工生物工程(上海)公司合成)，其中所述的抗虫基因采用本发明人的专利ZL201010552618.0中公开的人工合成Bt抗虫基因Cry1Ab-t，其核苷酸序列如专利ZL201010552618.0中记载的SEQ ID NO:1所示，该专利文献通过引用视为全部并入本文；

步骤2：用XbaI和SacI双酶切合成的Cry1Ab-t基因，然后回收载体片段，连入用同样的限制酶(XbaI、SacI)双酶切的用于遗传转化的高效植物表达载体pCAMBIA3300+35S+MCS+TNos+35S+bar+Nos PolyA上，形成pCAMBIA3300+35S+Cry1Ab-t+TNos+35S+bar+NosPolyA，称为pCAMBIA3300+35S-Cry1Ab-t。其中，pCAMBIA3300作为基础载体，其T-DNA来源于Ti质粒pti37的T-DNA区，但已去除了致瘤基因和与T-DNA转移无关的序列，只保留了T-DNA转移所必须的右边界序列(RB)和左边界序列(LB)。pCAMBIA3300+35S-CryAb-t为用于遗传转化的表达载体，其在pCAMBIA3300质粒基础上构建并包含两个串联转基因表达盒：目的基因CryAb-t基因表达盒(CaMV35S启动子-Cry1Ab-t基因-“T-nos”)，以及标记基因bar基因表达盒(CaMV35S启动子-bar基因-CaMV poly(A))。T-DNA以外的质粒骨架包括质粒在大肠杆菌中复制和保持的复制起点OR-ori和质粒骨架序列等没有被整合入基因组。

步骤3：重组质粒pCAMBIA3300+35S-Cry1Ab-t经过XbaI和SacI双酶切验证后转化至农杆菌EHA105中，筛选阳性菌株，得Cry1Ab-t基因的重组表达菌，低温保藏，用于后续试验。

实施例2采用农杆菌侵染法进行玉米植物的转化

采用农杆菌侵染法将插入序列导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得转基因植株。具体方法如下：

步骤1：剥离玉米幼胚：去除苞叶。切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子当作把手，有利于操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一个烧杯里放4-6个果穗；向烧杯里加约700mL的消毒液(50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴Tween 20)用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果，消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚；把消毒过果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部(1.5-1.8mm)，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等；用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基，胚的密度大约是2×2cm(30个/皿)；封口膜封住培养皿，28℃暗培养2-3天。

步骤2：农杆菌浸染：取实施例1中构建的重组农杆菌在YEP(含Kan 50mg/L和Str100mg/L抗生素)培养基上提前一周培养，并在4℃冰箱保存一个月左右，长期保存要在-80℃甘油保存；农杆菌要在YEP培养基上在19℃培养3天，同时加Kan(50mg/L)，Str(50mg/L)；3天以后，挑取农杆菌放入含有5mL浸染培养基的50mL离心管中，同时加100uM AS(inf+AS)，在室温(25℃)转速75rpm摇菌2-4个小时；浸染幼胚，把刚剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基(2mL)的离心管中，每管约20-100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1-1.5mL特定浓度(OD550＝0.3-0.4)的农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5分钟，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡。

步骤3：共培养：浸染后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基(co-cultivationmedium)，使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时驱除培养基表面多余的农杆菌；用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天。

步骤4：静息：共培养3天后，把幼胚转移到静息培养基上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。

步骤5：选择：7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基上面(35个每皿)，培养两周，选择培养基含有双丙胺磷1.5mg/L，两周后再进行亚培养，双丙胺磷的浓度可以上升到3mg/L，浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的II型愈伤。

步骤6：转基因植株的再生：在再生培养基I上面长3周，然后在再生培养基II上面发芽(在光照培养室)；待再生苗生长出3-4片叶时，将其转移到温室，并进行检查，阳性植株保留，待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。

实施例3转基因事件的鉴定和筛选

共计获得的独立转化事件256个。在温室下对各个转化体的表达量进行了检测，从中筛选叶片、茎秆、花丝、果穗中Cry1Ab-t杀虫毒蛋白均高表达的8个转化体，同时将这些转化体通过同季回交和自交快速转育到郑单958的亲本自交郑58和昌7-2中，并对其后代进行遗传稳定性检测，包括三代DNA水平、蛋白水平检测。根据目的基因的拷贝数、良好的昆虫抗性、双丙胺磷除草剂耐受性、以及农艺性状表现，最终选定事件CA09328是优异的，其具有单拷贝转基因、良好的遗传稳定性、高抗亚洲玉米螟、双丙胺磷除草剂耐受性、对非靶标生物无影响，以及具有良好的农艺性状表现。

实施例4通过southern杂交检测外源插入片段整合进植物基因组的拷贝数

通过Southern杂交对目标基因CryAb-t、选择标记基因bar进行拷贝数分析。根据Southern杂交分析确定了玉米转化体CA09328株系中插入序列均为单拷贝。实验材料为转基因玉米CA09328，同时以郑58鲜嫩叶片作为阴性对照。

采用CTAB法提取玉米转化体CA09328和相应对照玉米基因组DNA，考虑到T-DNA插入序列含有限制性内切酶KpnI和HindIII的一个酶切位点，而另一位点在插入序列旁侧的玉米基因组中。本研究分别使用Kpn I和HindIII限制性内切酶消化各个转化体基因组DNA，通过彻底酶切和电泳、转膜、分子杂交、呈色反应而准确确定插入基因拷贝数；用CryAb-t的基因内部引物扩增转化体玉米基因组DNA，将扩增得到的阳性PCR产物制成CryAb-t探针；将阳性植株用HindIII、KpnI分别进行单酶切，电泳后转移至尼龙膜上，利用地高辛(罗氏地高辛II(发光))标记转化体目标基因CryAb-t，进行Southern杂交检测。同理，用bar基因内部引物扩增玉米基因组DNA，将扩增得到的阳性PCR产物制成bar探针；酶切后的DNA片段电泳后转移至尼龙膜，利用地高辛(罗氏地高辛II(发光))标记转化体标记基因bar，然后进行杂交检测。其中探针的制备是利用Roche公司生产的引物试剂盒进行标记，方法参照Roche公司的使用说明书。为了证明插入片段的稳定性，选择了玉米转化体CA09328高世代植株T2、T3、T4三个世代进行了Southern印迹杂交分析。

结果显示，转化体CA09328三个世代的Southern杂交均有杂交信号，且均只有一个杂交条带，对照非转基因植株没有显示出杂交信号。证明外源基因CryAb-t和bar已稳定地整合到玉米基因组中，且都是单拷贝插入。

实施例5转基因玉米事件CA09328的检测

5.1基因组DNA的提取

按照如下方法提取DNA：(1)取CTAB溶液，预先65℃水浴；(2)取约0.1g新鲜玉米叶片，剪成碎块，放在预冷的研钵当中，在液氮中迅速研磨成粉末状并立即转入预冷的2mL EP管中(一般不超过1/2管体积)；(3)迅速向EP管中加入0.8mL 65℃温浴的CTAB缓冲液，轻轻摇荡均匀，65℃水浴30min，并不时轻摇；(4)放置于通风橱约15min，冷却至室温；(5)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，轻微振荡15min；(6)室温下，12000rpm离心8min；(7)吸取上清液至新的1.5mL EP管；(8)加入等体积预冷的异丙醇(4℃预冷)；(9)室温下，12000rpm离心8min；(10)弃上清，用力加入75％乙醇1mL，混匀，弃上清(乙醇沉淀)；(11)在通风橱放置直至乙醇完全挥发(1～2h)；(12)用300μL的TE Buffer溶解DNA，4℃过夜备用。

5.2侧翼DNA序列的分析

采用TAIL-PCR的方法克隆异源基因侧翼DNA序列并进行测序。其中所采用的特异性引物和通用引物如表1所示。其中GW060-LB-F1、GW060-LB-F2、GW060-LB-F3为测定LB侧翼的特异性引物，GW060-RB-R5、GW060-RB-R6、GW060-RB-R7为测定RB侧翼的特异性引物，AC1为通用引物。

表1 TAIL-PCR中所采用的引物

采用实施例5.1中提取的基因组DNA，按照表2中的反应体系和表3中的循环条件进行PCR反应。

表2 TAIL-PCR的反应体系

表3 TAIL-PCR的循环条件

产物的电泳图如图3所示，其中1为1-RB扩增结果；2为5-RB扩增结果；3为7-RB扩增结果；4为11-RB扩增结果；5为13-RB扩增结果；6为MA5-RB扩增结果；7为MA6-RB扩增结果；8为MA7-RB扩增结果；9为MA8-RB扩增结果；10为1-LB扩增结果；11为2-LB扩增结果；12为5-LB扩增结果；13为7-LB扩增结果；14为8-LB扩增结果；15为9-LB扩增结果；16为10-LB扩增结果；17为11-LB扩增结果；18为12-LB扩增结果；19为14-LB扩增结果；20为15-LB扩增结果；21为16-LB扩增结果；22为17-LB扩增结果；23为18-LB扩增结果；24为19-LB扩增结果；25为21-LB扩增结果；26为22-LB扩增结果；27为MA1-LB扩增结果；28为MA3-LB扩增结果；29为MA6-LB扩增结果。

连接产物转化：制备感受态细胞(SK2301)，转化步骤如下：1)100μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。2)加入10μl连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。3)42℃水浴热激60秒。冰上放置10～15分钟。4)加400μl LB培养基，37℃200～250rpm振荡培养1小时。5)室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。6)将细菌涂布在预先用20μl 100mM IPTG和100μl 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上，倒置培养过夜。

菌落PCR及测序：以pMD18-T载上的通用引物进行PCR，并对PCR产物进行克隆测序。

将测序结果与玉米基因组进行比对，确定本发明的异源基因插入玉米基因组的位点。经鉴定，玉米事件CA09328作为异源基因插入玉米基因组后的5’侧翼序列以及与其接合的部分异源基因序列如SEQ ID NO：3所示，玉米事件CA09328作为异源基因插入玉米基因组后的3’侧翼序列以及与其接合的部分异源基因序列如SEQ ID NO：4所示，玉米事件CA09328作为异源基因插入玉米基因组后整个T-DNA序列以及5'和3'的侧翼玉米基因组序列的序列如SEQ ID NO：5所示。

实施例6转化体目标性状抗虫性鉴定

以叶片为例，分别取转Cry1Ab-t抗虫基因玉米进行玉米螟抗性鉴定。

(1)室内生测鉴定：取T2、T3、T4代植株幼苗生长至5～8叶期玉米植株地上部分带回室内，取未展开的幼嫩心叶，用消毒剪刀剪成2～3cm大小，放在24孔细胞培养板中，每孔接3头初孵幼虫。玉米事件CA09328的结果分别如图4所示，可以看出玉米事件CA09328表现为高抗。

(2)人工接虫田间玉米螟抗性鉴定：

在玉米生长一个月后，一般为6-8叶期，株高在30公分左右，开始人工接虫玉米螟。每个离心管放2-3枚卵块，将装好虫卵的离心管放入28℃的培养箱中培养；接种时，打开刚刚孵化出幼虫的离心管，将离心管插入受体材料郑58、玉米事件CA09328玉米心叶中。于接虫后20-25天调查食叶级别。T2-T4三个连续世代抗虫鉴定结果表明：非转基因对照材料郑58虫食严重，玉米事件CA09328抗虫效果显著，进一步对该转化体进行抗虫性比较，分析玉米事件CA09328及其相应对照食叶级别和虫害级别，并对该事件的抗虫性进行抗性评价，分析结果如下：对照材料郑58的虫害级别达到7级，其食叶级别在0.05水平上显著高于相应的转基因材料，后者达到高抗水平，转基因玉米的叶片抗虫能力在不同世代稳定遗传(参见图5)。具体结果如表4所示。

表4人工接虫田间玉米螟抗性鉴定结果

注：表中不同小写字母间5％水平上差异显著，表中数值为平均值±SE。

此外，本发明人对转Cry1Ab-t抗虫基因玉米的花丝、茎秆及果穗玉米螟抗性也进行了鉴定，标准参照农业部953号公告-10.1-2007，同样得到了类似的结果，即非转基因对照材料郑58的花丝、茎杆和果穗虫食严重，表现为感病；而玉米事件CA09328的花丝、茎秆及果穗的抗虫效果明显，均达到高抗水平，田间抗虫性表现稳定。

综上所述可以看出，本发明转基因玉米事件CA09328对玉米螟具有高抗性。根据本发明记载的技术方案，本领域技术人员可以实施对玉米事件CA09328的检测。

序列表

<110> 广州哈维种业有限公司

<120> 来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法

<130> PD180084N

<160> 7

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAO9328中5'转基因片段的插入位点和玉米基因组DNA的每一侧的10个核苷酸

<400> 1

catctggccc tcaaacactg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAO9328中3'转基因片段的插入位点和玉米基因组DNA的每一侧的10个核苷酸

<400> 2

atatatcctg tcattcgccc 20

<210> 3

<211> 1726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAO9328中在插入序列的5'末端位于接合部位附近的核苷酸序列

<400> 3

gagtcgagcg ccataacaga cccctagagg aactaatccc atctttgtat cctaggtcag 60

caccatggca cacgacatcg aaattgcaca tctcggcgcc ataacctatc ctcagatgaa 120

ataattccat atttggaccc tcatggtcag tgttattgca tatggtgccc aaattacatg 180

tcttgacatc ataggttacg acaccaaggt gtcacaccac ttttagtgtg gaggcgacaa 240

tggacaagat ctatggcatt gaggtcctac cctaactgct cgtcatcatc ttctctctcg 300

tttctctcac tcccttctac ccttaccttt tgaccacacg tagctcccgt ccactggtca 360

tagtgctaca cccctgtcta aaccctaaaa ccctaaaccc taaaccctac cagagcttgc 420

tagccacacc attggaccca caaatgccat tattttccct cctgctgcac aatgcctagc 480

actatcagcc atcattccta cgcccaaggt atgccgcagg cccatgttca tcatcacccc 540

aaagagaaca acatcgacca ttgaactcga gcatggtacg accaagcgaa gtactagtgc 600

acattgtcaa tcgtgttagc accgacccta catgtcgttg tcccactcgc tactttgacc 660

ccaatgtcga ccctcaccca ttgttttggc ccttgcaccg ccctgtcagg tgaaggttag 720

ttttgtattc ttcactaact taattataaa cttagttagt gatatacttt tgttagtcag 780

ctatataact agtaagtggc ttggctcgtg acctagttag tagtagtagt atttattagt 840

agtttgggag ttagagcaac tccaaaaagg tctctaactg agtcatatct cgaaatatag 900

gactcaaggc taaaaaagct tccaacagat atcctattta taaaattttg tcaaacatgt 960

tgagtacggc ctatgggtcc tatcttattt ctgccacgct cctaccttcc cgtgaaattt 1020

catcctacct tccaacagat attctacttc ggtgactttc ttctgaatcc ttttgaatcc 1080

ttctgaaggt aaaaatgctg attctccctc tctctcttat cccttctact gcaatgtgga 1140

gccgccgtca catacgaaca ggtcgtggcc gcaccgcgct cacacgcaac atccgatagt 1200

tggcgtggca attggtccca tcgttcttcc atgagttcca tctggccctc aaacactgat 1260

agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgatccaagc tcaagctgct ctagcattcg 1320

ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 1380

cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 1440

cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca ggtccccaga 1500

ttagcctttt caatttcaga aagaatgcta acccacagat ggttagagag gcttacgcag 1560

caggtctcat caagacgatc tacccgagca ataatctcca ggaaatcaaa taccttccca 1620

agaaggttaa agatgcagtc aaaagattca ggactaactg catcaagaac acagagaaag 1680

atatatttct caagatcaga agtactattc cagtatggac gattca 1726

<210> 4

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAO9328中在插入序列的3'末端位于接合部位附近的核苷酸序列

<400> 4

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

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aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

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taaaatccag atcccccgaa ttaattcggc gttaattcag tacattaaaa acgtccgcaa 780

tgtgttatta agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgtcattcgc 840

ccctcagctc cgtcccctgc agcgccattt ctcagcaagc cgctaagctg cgctctcttg 900

ctccatccag gcgtcagcgt gacacctgtt cgtgctgcgt ttccctccgt tccccacgcc 960

gccagatctc gtcacatacg aggaggccgc cacaccgtgt tttctgacga cgaggagcag 1020

ctccgagcgg cagctgttgc acgggattgt cggctccgcc agggccgttg tattcttggc 1080

gttagggccg ttgcattctt accgaaaaac cgc 1113

<210> 5

<211> 6621

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 整个T-DNA序列、5'和3'的侧翼玉米基因组序列

<400> 5

gagtcgagcg ccataacaga cccctagagg aactaatccc atctttgtat cctaggtcag 60

caccatggca cacgacatcg aaattgcaca tctcggcgcc ataacctatc ctcagatgaa 120

ataattccat atttggaccc tcatggtcag tgttattgca tatggtgccc aaattacatg 180

tcttgacatc ataggttacg acaccaaggt gtcacaccac ttttagtgtg gaggcgacaa 240

tggacaagat ctatggcatt gaggtcctac cctaactgct cgtcatcatc ttctctctcg 300

tttctctcac tcccttctac ccttaccttt tgaccacacg tagctcccgt ccactggtca 360

tagtgctaca cccctgtcta aaccctaaaa ccctaaaccc taaaccctac cagagcttgc 420

tagccacacc attggaccca caaatgccat tattttccct cctgctgcac aatgcctagc 480

actatcagcc atcattccta cgcccaaggt atgccgcagg cccatgttca tcatcacccc 540

aaagagaaca acatcgacca ttgaactcga gcatggtacg accaagcgaa gtactagtgc 600

acattgtcaa tcgtgttagc accgacccta catgtcgttg tcccactcgc tactttgacc 660

ccaatgtcga ccctcaccca ttgttttggc ccttgcaccg ccctgtcagg tgaaggttag 720

ttttgtattc ttcactaact taattataaa cttagttagt gatatacttt tgttagtcag 780

ctatataact agtaagtggc ttggctcgtg acctagttag tagtagtagt atttattagt 840

agtttgggag ttagagcaac tccaaaaagg tctctaactg agtcatatct cgaaatatag 900

gactcaaggc taaaaaagct tccaacagat atcctattta taaaattttg tcaaacatgt 960

tgagtacggc ctatgggtcc tatcttattt ctgccacgct cctaccttcc cgtgaaattt 1020

catcctacct tccaacagat attctacttc ggtgactttc ttctgaatcc ttttgaatcc 1080

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gccgccgtca catacgaaca ggtcgtggcc gcaccgcgct cacacgcaac atccgatagt 1200

tggcgtggca attggtccca tcgttcttcc atgagttcca tctggccctc aaacactgat 1260

agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgatccaagc tcaagctgct ctagcattcg 1320

ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 1380

cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 1440

cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca ggtccccaga 1500

ttagcctttt caatttcaga aagaatgcta acccacagat ggttagagag gcttacgcag 1560

caggtctcat caagacgatc tacccgagca ataatctcca ggaaatcaaa taccttccca 1620

agaaggttaa agatgcagtc aaaagattca ggactaactg catcaagaac acagagaaag 1680

atatatttct caagatcaga agtactattc cagtatggac gattcaaggc ttgcttcaca 1740

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gatcgagcag ctgatcaacc agcgcatcga ggagttcgct cgcaaccagg cgatcagccg 2640

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cgtctatgtg caggccgcca acctgcatct gtcggtcctc cgcgacgtca gcgtcttcgg 2880

ccagcgctgg ggcttcgacg ccgccacgat caactctcgc tacaatgatc tgacccgcct 2940

gatcggcaac tacactgacc acgccgtgcg ctggtacaac accggtctgg aacgcgtgtg 3000

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tgtgctcgat atcgtcagcc tgttccccaa ctacgacagc cgcacatacc ccatccgcac 3120

cgtgagccag ctgacgcgcg agatttacac caaccccgtg ctggagaact tcgacggctc 3180

cttccgcggc agcgcgcagg gcatcgaggg gagcatccgc tccccccacc tgatggacat 3240

cctcaactcg atcaccatct acacggacgc ccaccgcggc gagtactatt ggagcggcca 3300

ccagatcatg gccagccccg tcggcttctc gggccctgag ttcacgttcc ccctgtacgg 3360

caccatgggc aacgctgcac ctcagcagcg catcgtggca cagctgggcc agggagtgta 3420

ccgcacgctc agcagcacgc tgtaccgtcg tcctttcaac ataggcatca acaaccaaca 3480

gctgagcgtg ctggatggca ccgagttcgc gtatggcacg agcagcaacc tgcccagcgc 3540

cgtgtaccgc aagtcgggca cggtggacag cctggatgag atcccccctc agaacaacaa 3600

cgtcccgcct cgacagggct tcagccatcg tctgtcgcat gtcagcatgt tccgcagtgg 3660

cttcagcaac tccagcgtct cgatcatccg tgcaccgatg ttcagctgga tccaccgctc 3720

ggccgaattc aacaacatca tccccagcag ccagatcacg cagatccccc tgacgaagag 3780

cacgaacctg ggcagcggca ccagcgtggt caagggcccc gggttcaccg gcggcgacat 3840

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gagccagcgc taccgcgtcc gcatccgcta cgccagcacg accaacctgc agttccacac 3960

cagcatcgac ggccgcccca tcaaccaggg caacttcagc gccacgatga gttcggggtc 4020

gaacctgcag agcggttcgt tccgcacggt aggcttcacc acccccttca acttcagcaa 4080

tggcagctcg gtgttcacgc tgagcgccca cgtcttcaac agcggcaacg aggtgtacat 4140

cgatcgcatc gagttcgtcc ccgcggaggt tacattcgag gctgagtact aggagctcga 4200

atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg 4260

gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 4320

tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 4380

tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg 4440

tgtcatctat gttactagat cgggaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 4500

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 4560

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 4620

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 4680

ggtttgcgta ttggctagag cagcttgcca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact 4740

ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa 4800

gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa 4860

ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta 4920

tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca 4980

tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgataaca 5040

tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc tcagaagacc 5100

aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc ggattccatt 5160

gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa aggaaggtgg cacctacaaa 5220

tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc 5280

aaagatggac ccccacccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc 5340

ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca 5400

ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agaggacacg 5460

ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctcg agtctaccat gagcccagaa 5520

cgacgcccgg ccgacatccg ccgtgccacc gaggcggaca tgccggcggt ctgcaccatc 5580

gtcaaccact acatcgagac aagcacggtc aacttccgta ccgagccgca ggaaccgcag 5640

gagtggacgg acgacctcgt ccgtctgcgg gagcgctatc cctggctcgt cgccgaggtg 5700

gacggcgagg tcgccggcat cgcctacgcg ggcccctgga aggcacgcaa cgcctacgac 5760

tggacggccg agtcgaccgt gtacgtctcc ccccgccacc agcggacggg actgggctcc 5820

acgctctaca cccacctgct gaagtccctg gaggcacagg gcttcaagag cgtggtcgct 5880

gtcatcgggc tgcccaacga cccgagcgtg cgcatgcacg aggcgctcgg atatgccccc 5940

cgcggcatgc tgcgggcggc cggcttcaag cacgggaact ggcatgacgt gggtttctgg 6000

cagctggact tcagcctgcc ggtaccgccc cgtccggtcc tgcccgtcac cgagatttga 6060

ctcgagtttc tccataataa tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta gggttcctat 6120

agggtttcgc tcatgtgttg agcatataag aaacccttag tatgtatttg tatttgtaaa 6180

atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta aaatccagat 6240

cccccgaatt aattcggcgt taattcagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag 6300

ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca atatatcctg tcattcgccc ctcagctccg 6360

tcccctgcag cgccatttct cagcaagccg ctaagctgcg ctctcttgct ccatccaggc 6420

gtcagcgtga cacctgttcg tgctgcgttt ccctccgttc cccacgccgc cagatctcgt 6480

cacatacgag gaggccgcca caccgtgttt tctgacgacg aggagcagct ccgagcggca 6540

gctgttgcac gggattgtcg gctccgccag ggccgttgta ttcttggcgt tagggccgtt 6600

gcattcttac cgaaaaaccg c 6621

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物GW060-LB-F1

<400> 6

agttcccaga taagggaatt agggttccta 30

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物GW060-LB-F2

<400> 7

acgatggact ccagtccggc cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct t 51

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物GW060-LB-F3

<400> 8

tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc aga 33

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物GW060-RB-R5

<400> 9

attgaaaagg ctaatctggg ga 22

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物GW060-RB-R6

<400> 10

acgatggact ccagtccggc cgaaaaccct ggcgttaccc aactt 45

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物GW060-RB-R7

<400> 11

agcacatccc cctttcgcca 20

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物AC1

<400> 12

acgatggact ccagag 16

Claims (10)

1.一种核酸分子，其来自玉米事件CA09328，所述核酸分子包括：SEQ ID NO：1或其互补序列、和/或SEQ ID NO：2或其互补序列；

其中，所述玉米事件CA09328中包括异源DNA分子，所述异源DNA分子包括Cry1Ab-t基因表达盒和bar基因表达盒；

所述Cry1Ab-t基因表达盒包括：用作Cry1Ab-t基因启动子的CaMV35S启动子、Cry1Ab-t基因编码框、用作Cry1Ab-t基因终止子的T-Nos终止子；所述bar基因表达盒包括：用作bar基因启动子的CaMV35S启动子、bar基因编码框、作为bar基因终止子的CaMV poly(A)信号；

所述玉米事件CA09328以保藏号CGMCC No.19967保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其包括：SEQ ID NO：3或其互补序列、和SEQ ID NO：4或其互补序列。

3.根据权利要求1所述的核酸分子，其包括SEQ ID NO：5或其互补序列。

4.一种引物组，所述引物组中包括第一引物组和第二引物组，其中所述第一引物组包含引物1F和引物1R，所述第二引物组包含引物2F和引物2R，并且同时满足下列条件：

（i）所述引物1F为SEQ ID NO：3的碱基1-1248中连续的11-30个碱基，并且所述引物1R为SEQ ID NO：3的碱基1249-1726中连续的11-30个碱基的反向互补序列，并且所述第一引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO：1；以及

（ii）所述引物2F为SEQ ID NO：4的碱基1-832中连续的11-30个碱基，并且所述引物2R为SEQ ID NO：4的碱基833-1113中连续的11-30个碱基，并且所述第二引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO：2。

5.一种引物组，所述引物组中包括第一引物组和第二引物组，其中所述第一引物组包含引物1F和引物1R，所述第二引物组包含引物2F和引物2R，并且同时满足下列条件：

（i）所述引物1F为SEQ ID NO：3的碱基1-1248中连续的15-30个碱基，并且所述引物1R为SEQ ID NO：3的碱基1249-1726中连续的15-30个碱基的反向互补序列，并且所述第一引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO：1；以及

（ii）所述引物2F为SEQ ID NO：4的碱基1-832中连续的15-30个碱，并且所述引物2R为SEQ ID NO：4的碱基833-1113中连续的15-30个碱基的反向互补序列，并且所述第二引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO：2。

6.一种引物组，所述引物组中包括第一引物组和第二引物组，其中所述第一引物组包含引物1F和引物1R，所述第二引物组包含引物2F和引物2R，并且同时满足下列条件：

（i）所述引物1F为SEQ ID NO：3的碱基1-1248中连续的18-27个碱基，并且所述引物1R为SEQ ID NO：3的碱基1249-1726中连续的18-27个碱基的反向互补序列，并且所述第一引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO：1；以及

（ii）所述引物2F为SEQ ID NO：4的碱基1-832中连续的18-27个碱，并且所述引物2R为SEQ ID NO：4的碱基833-1113中连续的18-27个碱基的反向互补序列，并且所述第二引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO：2。

7.一种用于检测样品中存在根据权利要求1-3中任一项所述的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）使所述样品与权利要求4~6任一项所述的引物组接触，并进行核酸扩增反应；

（2）检测核酸扩增所得到的扩增子中是否含有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的核酸分子。

8.一种用于检测样品中存在根据权利要求1-3中任一项所述的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）使所述样品与第一探针和第二探针接触；

（2）使所述样品和所述第一探针以及第二探针在严格杂交条件下杂交；

（3）检测所述样品和所述探针的杂交情况；

其中，所述第一探针和第二探针的长度均为30个核苷酸，或更多个核苷酸，所述第一探针和第二探针各自用至少一种荧光基团标记，并且同时满足下列条件：

（i）所述第一探针包含SEQ ID NO：1或其互补序列中任意的20个连续核苷酸；

（ii）所述第二探针包含SEQ ID NO：2或其互补序列中任意的20个连续核苷酸

所述第一探针和第二探针均能够与来自转基因玉米事件CA09328基因组的一条DNA链互补。

9.一种用于根据权利要求8所述的方法的探针组，所述探针组包括第一探针和第二探针；

其中，所述第一探针和第二探针的长度均为30个核苷酸个核苷酸，所述第一探针和第二探针各自用至少一种荧光基团标记，并且同时满足下列条件：

（i）所述第一探针包含SEQ ID NO：1或其互补序列中任意的20个连续核苷酸；

（ii）所述第二探针包含SEQ ID NO：2或其互补序列中任意的20个连续核苷酸；

所述第一探针和第二探针均能够与来自转基因玉米事件CA09328基因组的一条DNA链互补。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述的样品选自：（1）玉米植株的整体或包含玉米遗传物质的任何组成部分，或（2）玉米制品；其中所述包含玉米遗传物质的任何组成部分选自玉米根、玉米茎、玉米叶、玉米雌花、玉米雄花、玉米种子、玉米胚；所述玉米制品为包含玉米成分的食品、化妆品、辅料。

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