JP2013537412A - 植物形質転換率を高めるように改変されたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株 - Google Patents

植物形質転換率を高めるように改変されたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株 Download PDF

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Abstract

アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体、Ｔｉプラスミド、および植物形質転換バイナリーベクターから独立して複製可能なプラスミド上の形質転換促進遺伝子を保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株、ならびにこれらのアグロバクテリウム（Agrobacterium）株の使用を提供する。さらに、植物形質転換バイナリーベクターの不安定性または再構成につながるＤＮＡ組換え機能を欠損しており、アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体、Ｔｉプラスミド、および植物形質転換バイナリーベクターから独立して複製可能なプラスミド上の形質転換促進遺伝子を保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株、ならびにこれらの株の使用も提供する。アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の通常の増殖および植物形質転換能力を妨げないか、または他の方法で損なわないアグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体の遺伝子座へ組み込まれている形質転換促進遺伝子を保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株、およびこれらのアグロバクテリウム（Agrobacterium）株の使用をさらに包含する。これらのアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して作出される植物も記載する。

Description

本願は、２０１０年７月２９日に出願した米国特許仮出願第６１／３６８，９６５号の優先権を主張する。先行出願の開示は本願の開示の一部とみなされる。
一般に、植物形質転換は、外来遺伝子を安定に維持し発現する稔性後代植物が得られるように、植物細胞へ植物で発現可能な外来遺伝子を導入するのに必要とされ利用される方法を包含する。単子葉植物および双子葉植物の分類に属する多数の植物が形質転換された。トランスジェニック農作物ならびにフルーツおよび野菜は、経済的に興味深い。そのような作物としては、トウモロコシ、イネ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、ピーナッツ、トマト、ジャガイモなどが挙げられるが、これらに限定されない。植物で発現可能な外来遺伝子を植物細胞に導入する植物形質転換系が開発されているにもかかわらず、外来遺伝子で植物を形質転換する場合に、形質転換効率を高め、かつ操作上の欠点の解消に大きな利点を提供することができる、さらなる改良が望まれている。
植物細胞への外来遺伝物質の導入に関して、また、導入遺伝子を安定に維持し発現する植物の取得に関して、いくつかの技術が知られている。そのような技術としては、微粒子上にコーティングされた遺伝物質の細胞への直接的な促進が挙げられる（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号および米国特許第５，１４１，１３１号）。別の形質転換技術としては、炭化ケイ素技術またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術が挙げられる。例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および米国特許第５，４６４，７６５号を参照されたい。エレクトロポレーション技術も植物の形質転換に使用されている。例えば、国際公開第８７／０６６１４、米国特許第５，４７２，８６９号、米国特許第５，３８４，２５３号、国際公開第９２／０９６９６、および国際公開第９３／２１３３５を参照されたい。さらに、送達しようとするＤＮＡを含有するリポソームと植物プロトプラストとの融合、ＤＮＡの直接注入、ならびに可能な別の方法を使用することができる。
挿入ＤＮＡが植物ゲノムへ組み込まれると、通常、それは次世代にわたって比較的安定している。形質転換細胞は、通常の方法で植物の内部で増殖する。これらは生殖細胞を形成し、後代植物に１つまたは複数の形質転換形質を伝えることができる。そのような植物は普通の方法で成長することが可能であり、同一の形質転換遺伝要因または別の遺伝要因を有する植物と交配させることができる。得られたハイブリッド個体は、対応する表現型特性、例えば、植物害虫の食害を防除する能力を有する。
宿主植物細胞にＤＮＡを挿入するにあたって、多くの代替技術を使用することもできる。これらの技術としては、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）により送達されるＴ−ＤＮＡによる形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，１７７，０１０号、米国特許第５，１０４，３１０号、欧州特許出願第０１３１６２４Ｂ１号、欧州特許出願第１２０５１６号、欧州特許出願第１５９４１８Ｂ１号、欧州特許出願第１７６１１２号、米国特許第５，１４９，６４５号、米国特許第５，４６９，９７６号、米国特許第５，４６４，７６３号、米国特許第４，９４０，８３８号、米国特許第４，６９３，９７６号、欧州特許出願第１１６７１８号、欧州特許出願第２９０７９９号、欧州特許出願第３２０５００号、欧州特許出願第６０４６６２号、欧州特許出願第６２７７５２号、欧州特許出願第０２６７１５９号、欧州特許出願第０２９２４３５号、米国特許第５，２３１，０１９号、米国特許第５，４６３，１７４号、米国特許第４，７６２，７８５号、米国特許第５，００４，８６３号、および米国特許第５，１５９，１３５号に記載されているように、植物はアグロバクテリウム（Agrobacterium）技術を用いて形質転換することができる。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡ含有ベクターの使用については、欧州特許出願第１２０５１６号；Anら、（1985, EMBO J. 4:277-284）、Fraleyら、（1986, Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46）、ならびにLeeおよびGelvin （2008, Plant Physiol. 146: 325-332）において詳しく研究され、十分に記載されており、また本分野で十分に確立されている。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）から植物細胞へのＴ−ＤＮＡ移入に関する生物学は知られている。例えば、Gelvin （2003）Microbiol. Molec. Biol. Rev. 67:16-37；およびGelvin （2009） Plant Physiol. 150:1665-1676を参照されたい。最低でも、ＴｉまたはＲｉプラスミドの少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ右側境界反復（しかし、多くの場合、右側境界反復および左側境界反復）が、植物細胞に挿入されることが望まれる遺伝子の隣接領域として連結される。Ｔ−ＤＮＡ左側境界反復およびＴ−ＤＮＡ右側境界反復は、Ｔ−ＤＮＡ移入に必要とされる重要なシス作用配列である。各種のトランス作用成分は、全アグロバクテリウム（Agrobacterium）ゲノム内にコードされている。これらのうち主要であるのはｖｉｒ遺伝子によりコードされているタンパク質であって、通常、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド上で一連のオペロンとして確認される。各種のＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドは、ｖｉｒ遺伝子の補体において多少異なり、例えば、ｖｉｒＦは必ずしも存在するとは限らない。ｖｉｒ遺伝子によりコードされているタンパク質は様々な機能を果たす。例えば、数例挙げると、植物細胞／細菌相互作用の認識およびシグナル伝達、ｖｉｒ遺伝子転写の誘導、ＩＶ型分泌チャネルの形成、Ｔ−ＤＮＡ境界反復の認識、Ｔ−鎖の形成、Ｔ−鎖の植物細胞への移入、Ｔ−鎖の植物細胞核への取り込み、およびＴ−鎖の植物核染色体への組込みなどがある。例えば、TzfiraおよびCitovsky （2006） Curr. Opin. Biotechnol. 17:147-154を参照されたい。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）株が形質転換を使用する場合、植物細胞に挿入されるＤＮＡは特別なプラスミドへ、例えば、介在（シャトル）ベクター、またはバイナリーベクターのいずれかへクローニングすることができる。介在ベクターはアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞では独立して複製できないが、一般的な大腸菌（Escherichia coli）分子クローニング株ではマニピュレートされ自己複製することができる。このような介在ベクターは、一般にＴ−ＤＮＡ右側境界反復および左境界反復領域により囲まれている配列を含み、それには、例えば、形質転換植物細胞の選択に機能のある選択可能な標識遺伝子、クローニングリンカー、クローニングポリリンカー、または植物細胞形質転換をする予定の遺伝子に対して導入部位として機能し得る別の配列が含まれる。したがって、植物への移入が望まれる遺伝子のクローニングおよび操作は、クローニングベクターとしてシャトルベクターを使用し、大腸菌（E. coli）における標準方法よって容易に行うことができる。最終的にマニピュレートされたシャトルベクターは、さらなる試験のためにアグロバクテリウム（Agrobacterium）植物形質転換株へ導入することができる。介在シャトルベクターは、（細菌接合を介した）ヘルパープラスミドにより、エレクトロポレーションにより、化学的介在型の直接ＤＮＡ形質転換により、または知られている別の方法によりアグロバクテリウム（Agrobacterium）へ移入させることができる。シャトルベクターは、ＴｉプラスミドもしくはＲｉプラスミドまたはそれらの誘導体と介在プラスミドの間で相同である配列に基づく相同組換えによって、ＴｉプラスミドもしくはＲｉプラスミドまたはそれらの誘導体へ組み込むことができる。それによって、この相同組換え（すなわちプラスミド組込み）事象は、複製開始点および同時組込み体プラスミド（co-integrant plasmid）のＴｉプラスミド部分またはＲｉプラスミド部分によって提供される別のプラスミド維持機能を含む、アグロバクテリウム（Agrobacterium）中の改変シャトルベクターを安定に維持する手段を提供する。またＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの移入に必要なｖｉｒ遺伝子を含むｖｉｒ領域を含む。一般に、ｖｉｒ領域を保有するプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ右側境界および左境界反復を含むＴ−ＤＮＡ領域が欠失した、変異型ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド（ヘルパープラスミド）である。機能ｖｉｒ遺伝子を有し、Ｔ領域および関連のエレメントの全部または実質的に全部を欠失しているそのようなｐＴｉ−誘導プラスミドは、本明細書ではヘルパープラスミドと記述的に呼ぶ。
スーパーバイナリー系は、シャトルベクター／相同組換え系の特殊な例である（Komariら（2006）による論説：Methods in Molecular Biology （K. Wang, ed.） No. 343: Agrobacterium Protocols （2nd Edition, Vol. 1） HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41；およびKomoriら、（2007） Plant Physiol. 145:1155-1160）。スーパーバイナリー系で用いられるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主株はＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）である。ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）株は、独立して自己複製する２つのプラスミド、ｐＡＬ４４０４およびｐＳＢ１を持つ。ｐＡＬ４４０４は、（ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５由来の）完全なセットのｖｉｒ遺伝子を含有しているが、Ｔ−ＤＮＡ領域を有していない（したがって、Ｔ−ＤＮＡ左側境界および右側境界反復配列を有していない）、Ｔｉ−プラスミド誘導ヘルパープラスミドである。プラスミドｐＳＢ１は、ｐＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒ遺伝子のさらなる部分的なセットを提供する；この部分的なｖｉｒ遺伝子セットは、ｖｉｒＢオペロンおよびｖｉｒＣオペロン、ならびに遺伝子ｖｉｒＧおよびｖｉｒＤ１を含む。スーパーバイナリー系で用いられるシャトルベクターの一例はｐＳＢ１１であるが、これは、Ｔ−ＤＮＡ右側境界および左側境界の反復領域に隣接されている、植物細胞形質転換が予定されている遺伝子に対して導入部位として機能するクローニングポリリンカーを含有する。シャトルベクターｐＳＢ１１は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）では独立した複製ができないが、ｐＳＢ１およびｐＳＢ１１上に存在する共通配列間の相同組換えによってｐＳＢ１へ組み込まれた場合、同時組込み体プラスミドとして安定に維持される。したがって、改変ｐＳＢ１１ベクター上でＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）へ導入された完全改変型Ｔ−ＤＮＡ領域は、２つの異なるアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔｉプラスミド源（ｐＴｉＡＣＨ５およびｐＴｉＢｏ５４２）に由来するＶｉｒタンパク質によって、植物細胞に生産的に作用され、植物細胞へ移入される。スーパーバイナリー系は、単子葉植物種の形質転換において特に有用であることが分かった。Hieiら、（1994） Plant J. （6:271-282、およびIshidaら、（1996） Nat. Biotechnol. 14:745-750を参照されたい。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔｉプラスミドによって保持されているｖｉｒ遺伝子に加えて、別の染色体上の病原性調節遺伝子（ｃｈｖ遺伝子と呼称される）がアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞と植物細胞の相互作用の特定の態様を調節すること知られており、そのため、全体的な植物形質転換率に影響する（Panら、（1995） Molec. Microbiol. 17:259-269）。病原性および付着に必要とされる染色体介在性遺伝子のいくつかは、２９キロ塩基に及ぶ染色体座中にまとめてグループ化されている（Matthysseら、（2000）Biochim. Biophys. Acta 1490:208-212）。
用いられる特定のプラスミド系にかかわらず、そのように形質転換されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞は植物細胞の形質転換に使用される。植物移植片（例えば、葉片、茎の部分、根、またプロトプラストもしくは懸濁液−培養細胞）は、植物細胞へＤＮＡを移入するために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と一緒に培養することが有利であり得る。次いで、全植物を適切な増殖条件および栽培培地（形質転換植物細胞を選択するために抗生物質または除草剤を含有していてもよい）に置いて、感染させた植物原料から再発生させることができる。次いで、そのようにして得られた植物は、挿入ＤＮＡの存在に関して試験を行うことができる。
外来の遺伝物質を植物へ導入するこれらの技術は、有益な形質を植物へ導入するために使用することができる。例えば、数十億ドルが害虫の防除に毎年支払われており、これらが与える被害にさらに何十億もの損失がある。合成有機化学物質系殺虫剤が害虫の防除に使用される主要な手段であったが、生物系殺虫剤、例えば、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）由来の殺虫性タンパク質などが一部の地域において重要な役割を果たしている。Ｂｔの殺虫性タンパク質遺伝子の導入によって昆虫耐性植物を生産する能力は、現代農業を革新し、殺虫性タンパク質およびそれらの遺伝子の重要性および価値を高めてきた。
いくつかのＢｔタンパク質が昆虫耐性トランスジェニック植物の作製に使用されており、それらは順調に開発され、多くの場合、登録済みで商品化されている。これらの例としては、トウモロコシにおけるＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ３Ｂｂ、ワタにおけるＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ、およびジャガイモにおけるＣｒｙ３Ａが挙げられる。
Ｂｔタンパク質を発現する商品は、２種のタンパク質を組み合わせた殺虫スペクトルが望まれる場合（例えば、鱗翅目の有害生物と根切り虫に対する耐性をそれぞれ提供するために組み合わせたトウモロコシにおけるＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ３Ｂｂ）あるいは、タンパク質の独立作用が、感受性のある昆虫群で耐性が獲得されるのを遅延するための手段としてそれらが有用となる場合（例えば、オオタバコガ幼虫に対する耐性管理を提供するために組み合わせたワタにおけるＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ）を除いては、単一タンパク質を発現する。
すなわち、急速かつ広範囲にこの技術が採用されるに至った昆虫耐性トランスジェニック植物の特性の一部では、これらの植物により産生された殺虫性タンパク質に対する耐性を有害生物群が獲得するという問題も発生させる。Ｂｔ系の昆虫耐性形質の有用性を維持するためにいくつかの手法が提案されてきた。例えば、保護区（refuge）、ならびに、異なる毒素との置き換え、または異なる毒素の同時展開と組み合わせて高用量でタンパク質を展開することなどが挙げられる（McGaugheyら、1998, Nature Biotechnol.16:144-146）。
Ｂｔタンパク質が組み合わせ使用において選択される場合、これらは、１種のタンパク質に開発された耐性が第２のタンパク質に対する耐性を付与しないように殺虫効果を独立して及ぼす必要がある（すなわち、それらのタンパク質に対する交差耐性がない）。交差耐性のロバスト性評価は、典型的には、殺虫タンパク質に対する耐性について選択された殺虫タンパク質に通常感受性のある有害生物種の群を使用して行われる。例えば、「タンパク質Ａ」に対する耐性に関して選択された有害生物群が「タンパク質Ｂ」に感受性を有するならば、交差耐性がなく、また、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの組み合わせがタンパク質Ａのみに対する耐性を遅らせるのに有効であると本発明者らは結論付ける。
耐性のある昆虫群が存在しない状態において、作用機序および交差耐性の有望性に関連すると考えられる別の特性に基づいて評価することができる。交差耐性を示さない可能性がある殺虫タンパク質の同定において、受容体が介在する結合が有用であることが示唆されている（米国特許第６，８５５，８７３号）。この手法に欠かせない交差耐性欠如の主要要因は、殺虫タンパク質が感受性昆虫種の受容体を競合しないということにある。
２種のＢｔ Ｃｒｙ毒素が同一受容体を競合し、その後、毒素の１つがその受容体に結合しないように、受容体がその昆虫内で突然変異した結果、該昆虫に対して殺虫性ではない場合、昆虫は第２の毒素に対しても耐性である場合もある（同一受容体に競合的に結合されている）。しかし、２種の毒素が２種の異なる受容体に結合する場合、これは、昆虫がそれらの２種の毒素に同時に耐性を持たないということを示唆し得る。
Ｃｒｙ１Ｆａは、アワノメイガ（European corn borer）（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ））およびツマジロクサヨトウ（fall armyworm）（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））をはじめとする、多くの鱗翅目の有害生物種を防除するのに有用であり、サトウキビメイガ（sugarcane borer）（ＳＣＢ；ジアトレア・サッカラリス（Diatraea saccharalis））に対して活性がある。
事象ＴＣ１５０７を含有するトウモロコシ植物において産生される、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質は、ＦＡＷを防除するための業界最高レベルの昆虫耐性形質を担っている。さらに、Ｃｒｙ１Ｆａは、ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）、ＳＭＡＲＴＳＴＡＸ（商標）、およびＷＩＤＥＳＴＲＩＫＥ（商標）の製品で展開されている。
受容体結合アッセイ検出用のタンパク質標識化に利用可能な最も一般的な技術がＣｒｙ１Ｆａタンパク質の殺虫活性を不活性化することから、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質を使用して（競合的または相同的）受容体結合試験を導く能力は、制限される。
Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｆａは、様々な害虫から植物を保護するためにトランスジェニックトウモロコシにおいて現在（個別に）使用されている殺虫タンパク質である。これらのタンパク質が保護を提供するトウモロコシの主要有害生物は、アワノメイガ（European corn borer）（ＥＣＢ）である。米国特許出願第２００８／０３１１０９６号は、Ｃｒｙ１Ｆ耐性ＥＣＢ群を防除するためのＣｒｙ１Ａｂの使用に一部関係する。
本願は、植物形質転換率を高めるために改変したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株について記述する。これらの株の使用により、植物発現可能な外来遺伝子を植物細胞へ導入するための新規な植物形質転換系を提供する。さらに、これらの株は、形質転換効率を高めるさらなる改良を提供するとともに、外来遺伝子で植物を形質転換する場合の操作上の欠点を解消するのに顕著な利点を提供する。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体、Ｔｉプラスミド、および植物形質転換バイナリーベクターから独立して複製可能なプラスミド上の形質転換促進遺伝子を保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株、ならびにそれらを使用するための方法を本明細書に記載する。アグロバクテリウム（Agrobacterium）株は、植物形質転換バイナリーベクターの不安定性または再構成につながるＤＮＡ組換え機能を欠損しており、アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体、Ｔｉプラスミドおよび植物形質転換バイナリーベクターから独立して複製可能なプラスミド上の形質転換促進遺伝子を保持する。また、アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の通常の増殖および植物形質転換能力を妨げないか、または他の方法で損なわないアグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体の遺伝子座へ組み込まれている形質転換促進遺伝子を保持するさらなるアグロバクテリウム（Agrobacterium）株およびそれらの使用も記載する。
本明細書に記載の方法の一実施形態において、植物は、植物の細胞を、ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ断片を含む少なくとも１つのｐＴｉヘルパープラスミドと、少なくとも１つの無害化（disarmed）Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＴｉプラスミドとを有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株と接触させることにより形質転換され、Ｔ−ＤＮＡ領域は少なくともＴ−ＤＮＡ右側境界および該境界に隣接する外来性ＤＮＡを含み、該プラスミドは互いに対して異なる複製開始点を有する。
本明細書に記載の方法のさらなる実施形態において、植物は、植物の細胞を、ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片と少なくとも１つの無害化Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＴｉプラスミドとを有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌と接触させることにより形質転換され、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片は該細菌の染色体の中立組込み部位へ組み込まれている。
本明細書に記載の方法のさらなる実施形態において、アグロバクテリウム（Agrobacterium）株は、ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ断片を含む少なくとも１つのｐＴｉヘルパープラスミドと少なくとも１つの無害化Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＴｉプラスミドとを含み、該プラスミドは互いに対して異なる複製開始点を有する。
さらなる実施形態において、形質転換促進特性を有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株は、ｐＳＢ１から単離された１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片と、少なくとも１つの無害化Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＴｉプラスミドとを含む。
別の実施形態において、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のｎｉｌＡゲノム遺伝子座は、ｎｉｌＡゲノム遺伝子座へ組み込まれているポリヌクレオチド配列を含む。
さらなる実施形態において、ＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）株は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体上の中立組込み部位へ組み込まれている。
別の実施形態において、アグロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢ４４０４株は、ｐＴｉヘルパープラスミド上のｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片と、少なくとも１つの無害化Ｔ−ＤＮＡ領域を有し、少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接する外来性ＤＮＡを有するｐＴｉプラスミドとを含み、該プラスミドは互いに関連する異なる複製開始点を有する。
さらなる実施形態において、アグロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４株は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体上の中立組込み部位へ組み込まれているｐＳＢ１から単離された１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片由来の少なくとも１つのｖｉｒ遺伝子を含む。
さらなる実施形態において、本明細書に記載の形質転換方法によって作出される植物を提供する。
さらに別の実施形態において、稔性トランスジェニックトウモロコシ植物またはその後代は、殺虫量のＣｒｙ１Ｃａタンパク質、Ｃｒｙ１Ｆ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ１殺虫タンパク質、および除草剤耐性量のＡＡＤ−１タンパク質を発現し、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ１およびＡＡＤ１タンパク質は該植物のゲノム中に安定に組み込まれている組換えＤＮＡの単一遺伝子座からまとめて発現される。
プラスミドｐＤＡＢ９２９２の構築物に関するクローニングスキームを示す図である。 プラスミドｐＤＯＷ３７１９のマップを示す図である。 プラスミドｐＤＡＢ９６９８の構築物のクローニングスキームを示す図である。 バイナリーベクタープラスミドｐＤＡＢ１０１５１３およびｐＤＡＢ１０１５１４のマップを示す図である。 バイナリーベクタープラスミドｐＤＡＢ１０１５５６のマップを示す図である。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の株は、植物細胞を形質転換するそれらの能力において互いに異なる。野生型の腫瘍形成性アグロバクテリウム（Agrobacterium）株は、多くの宿主植物、特に双子葉植物種において根頭癌腫病（腫瘍性異常増殖）を誘発するその能力で知られている。通常の成長をしている植物細胞の自己制御されない腫瘍細胞へのこの形質転換は、植物ホルモンをコードしている植物発現可能な遺伝子をコードする特異的ＤＮＡ塩基配列（Ｔ−ＤＮＡ）を腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドから植物細胞へ移入する（この場合、これらの配列は植物染色体へ安定に組み込まれる）結果として起こる。Ｂｏ５４２株（すなわち、ｐＴｉＢｏ５４２）由来のＴｉプラスミドは、一部のアグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体バックグラウンドに入れた場合、それが一部の植物においてとりわけ激しく増殖する大きな腫瘍の誘導を促進するという点で注目される（Hoodら、（1986） J. Bacteriol. 168:1291-1301）。この「超病原性」表現型に関与する遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡ領域の外側のｐＴｉＢｏ５４２上に存在する。さらなる研究において、ｐＴｉＢｏ５４２由来の「１５．８」キロ塩基対（ｋｂｐ）ＫｐｎＩ断片を含有しており、完全なｖｉｒＧ、ｖｉｒＢおよびｖｉｒＣオペロンを含有したプラスミドが、そのプラスミドを欠損している株と比較された場合、Ａ２８１株により腫瘍形成増強を促進したことが明らかになった（Jinら、（1987） J. Bacteriol. 169:4417-4425）。ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＧ遺伝子は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）のＡ２８１株の超病原性表現型に関与していると考えられる。ｐＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒＧは、プロモーター領域内の２つの遺伝子、コード配列、および３’非翻訳領域の間の相違により、ｐＴｉＡ６由来のｖｉｒＧと比べると、ｖｉｒＢ発現において１．７倍の増加を引き起こす（Chenら、（1991） Molec. Gen. Genet. 230:302-309）。したがって、ｐＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒＧ遺伝子は、特に、ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢオペロンおよびｖｉｒＣオペロンも保持するｐＴｉＢｏ５４２プラスミドの大型ＫｐｎＩ断片上に存在する場合、Ｔ−ＤＮＡの高移入効率、したがって、植物の高形質転換率をより促進するために有利に使用することが可能である。
ｐＴｉＢｏ５４２の注釈付き全塩基配列は、２００５年５月１２日にアクセッション番号ＤＱ０５８７６４としてＧＥＮＢＡＮＫに提出した。ＫｐｎＩ制限断片マップおよび遺伝子注釈の試験によると、全ｖｉｒＢオペロン（遺伝子ｖｉｒＢ１、ｖｉｒＢ２、ｖｉｒＢ３、ｖｉｒＢ４、ｖｉｒＢ５、ｖｉｒＢ６、ｖｉｒＢ７、ｖｉｒＢ８、ｖｉｒＢ９、ｖｉｒＢ１０およびｖｉｒＢ１１を含む）、ｖｉｒＧ遺伝子、ｖｉｒＣオペロン（遺伝子ｖｉｒＣ１およびｖｉｒＣ２を含む）および遺伝子ｖｉｒＤ１を含んでいるｖｉｒＤオペロンの部分が、１４，８１５塩基対（ｂｐ）を含んでいるＫｐｎＩ断片上で単離することができることが明らかである。恐らく、Jinら（前掲）で言及されている「１５．８ｋｂｐ」ＫｐｎＩ断片のサイズは、断片のアガロースゲル移動度から推定されたものであり、言及されている断片の実際のサイズは、実は１４．８ｋｂｐである。分子生物学分野の当業者は、アガロースゲル電気泳動移動度によるこのような大きなＤＮＡ断片のサイズ評価は、１ｋｂｐ以上によるＤＮＡ塩基配列分析によって決定される真の断片サイズとは異なる可能性があることは理解するであろう。記載を容易にするため、ｐＴｉＢｏ５４２由来のこの断片は、本明細書では、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片と呼ぶ。
本明細書に記載の方法の実施形態は、少なくとも１つの無害化ｐＴｉヘルパープラスミドを保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株中のｐＳＢ１から単離された１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片上にコードされている形質転換促進特性の使用を含み、ここで、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片は、植物を形質転換するＩｎｃＰ以外の不和合性グループの複製起点を有するプラスミド上にある。さらなる実施形態は、本方法で使用するための記載したアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を含む。このアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して植物に導入するＴ−ＤＮＡ領域は、少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド上にあることが可能であって、該プラスミドは、ＩｎｃＰ不和合性グループ、または、ＩｎｃＰ以外の不和合性グループの複製起点を有するプラスミド上にある１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片の不和合性グループと適合する不和合性グループの複製起点を有している。このプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ右側境界および左側境界に隣接可能である。
プラスミドは、プラスミドに含有されている配列に基づき、不和合性グループ（遺伝子型表示：ｉｎｃ；グループ表示：Ｉｎｃ）に割り当てられる。ｉｎｃ決定基は、典型的には、同一宿主内の共存から同一または関連の不和合性グループの別のプラスミドを防ぐように機能し、細胞内のプラスミドの一定コピー数を維持するようにする。例えば、Fernandez-Lopezら、(2006) FEMS Microbiol. Rev. 30:942-66；ならびにAdamczykおよびJagura-Burdzy (2003) Acta Biochim. Pol. 50:425-53を参照されたい。２つのプラスミドは、一方が、単独であった場合よりも他方の存在下において不安定であれば、不和合性である。同一不和合性グループの２つのプラスミドが同一細胞で確認される場合、細胞源に対する競合が生じる可能性がある。プラスミドがより速く自己複製され得るか、プラスミドが別のいくつかの利点を提供するかのどちらであっても、不和合系が許すコピーに不均衡な度合いが現れる。驚いたことに、プラスミドは、これらが両方とも娘細胞へそれら自体を分配するために同一機能を保持する場合にも、不和合性であってもよい。
プラスミドは、典型的には、既存の数多くの不和合性グループのうちのほんの１つに該当するにすぎない。知られている不和合性グループは３０以上存在する。不和合性グループＩｎｃＰに属するプラスミドが詳細に検討され、このＩｎｃＰグループに由来する数多くのプラスミドが構築された（Schmidhauserら、(1988) Biotechnology 10:287-332）。ＩｎｃＰ不和合性グループを持つプラスミドの例示としては次のものが挙げられる：ｐＭＰ９０ＲＫ、ｐＲＫ２０１３、ｐＲＫ２９０、ｐＲＫ４０４およびｐＲＫ４１５。これらのプラスミドは、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）をはじめとする多数の細菌種において維持され得る。別の不和合性グループの例としては、限定するものではないが、例えば、実質的な配列または機能的関係を示す、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＢ／Ｏ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＩＩ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＣｏｍ９、ＩｎｃＦＩ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦＩＩＩ、ＩｎｃＨＩｌ、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＸ、ＩｎｃＡ／Ｃ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＦＩＶ、ＩｎｃＦＶ／ＦＯ、ＩｎｃＦＶＩ、ＩｎｃＨｌ ３、ＩｎｃＨＩＩ、Ｉｎｃ１２、ＩｎｃＩ、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＱ（これらの変異体を含む）などが挙げられる。表１に一般に知られている様々な不和合性グループを挙げ、これらの不和合性グループを示すプラスミドの例を提供する（この不和合性グループおよびプラスミドの一覧は例示としてのみ提供するものであり、本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株および方法で有用な不和合性グループおよびプラスミドを限定するものではない）。
本明細書に記載の方法の別の実施形態は、ＲｅｃＡ機能の欠損を有し、少なくとも１つの無害化ｐＴｉヘルパープラスミドを保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株のｐＳＢ１から単離された１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片にコードされている形質転換促進特性の使用であって、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片がＩｎｃＰ以外の不和合性グループの複製起点を有するプラスミドにある、前記使用を含む。さらなる実施形態は、この方法で使用するための記載したアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を含む。このアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して植物に導入されるＴ−ＤＮＡ領域は、少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド上にあることが可能であって、該プラスミドは、ＩｎｃＰ不和合性グループ、または、ＩｎｃＰ以外の不和合性グループの複製起点を有するプラスミド上にある１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片の不和合性グループと適合する不和合性グループの複製起点を有している。
本明細書に記載の方法のさらに別の実施形態は、ｐＳＢ１から単離され、少なくとも１つの無害化ｐＴｉヘルパープラスミドを保持する、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片にコードされている形質転換促進特性の使用であって、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片がＣ５８株とは異なるアグロバクテリウム（Agrobacterium）株の染色体に配置されている中立組込み部位へ込み込まれる、前記使用を含む。さらなる実施形態は、この方法で使用するための記載したアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を含む。このアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して植物に導入されるＴ−ＤＮＡ領域は、少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミドをさらに含む。
スーパーバイナリー系は知られており、例えば、国際公開第９４／００９７７Ａ１、国際公開第９５／０６７２２Ａ１、および国際公開第９５／１６０３１Ａ１を参照されたい。またKomariら（前掲）およびKomoriら（前掲）により開示されているが、これらの系には多数の欠点がある。スーパーバイナリー系の操作上の欠点（これは、本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株および方法によって解消される）は、ｐＳＢ１１誘導体にある改変Ｔ−ＤＮＡがアグロバクテリウム（Agrobacterium）中で安定に維持される手段として、ｐＳＢ１とｐＳＢ１１（およびその誘導体）の間の同時組込み体プラスミドの形成が要求されることである。この同時組込み事象は、ｐＳＢ１とｐＳＢ１１の相同領域間の組換えにより、１対の大型（約２．３ｋｂｐ）の直接反復配列を生成する。分子生物学の分野の当業者にはよく知られているように、特に反復がプラスミド構造の部位である場合、これらのような大型の反復配列は、ＤＮＡ欠失および別の再構成を最終的にはもたらす分子内組換えの好ましい標的である。アグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリー系において、そのような再構成は、ｐＳＢ１１誘導体により導入されたＴ−ＤＮＡ領域の部分的な再構成または完全欠損をもたらす可能性があり、最終的に、完全な所望の外来遺伝子の宿主植物細胞への移入がほとんど行われないか、全く無くなる。
上記のスーパーバイナリー系に対するさらなる欠点は（またこれも、本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株および方法によって解消されるが）、ｐＳＢ１誘導体とｐＳＢ１１誘導体の間の同時組込み体プラスミドの形成が、２つの異なるＣｏｌＥ１タイプ（不和合性グループｐＭＢ１／ＣｏｌＥ１）複製開始点（ｏｒｉ）、ならびにＲＫ２プラスミド（不和合性グループＩｎｃＰ）由来の第３ｏｒｉを有する、大型のプラスミド（最小４３ｋｂｐより大きい）を生成することである。通常の環境では、ＣｏｌＥ１ ｏｒｉはアグロバクテリウム（Agrobacterium）において機能しないが、アグロバクテリウム（Agrobacterium）中にＣｏｌＥ１ ｏｒｉを有するプラスミドを安定に維持させるゲノムの変異が知られている（Ruslyakovaら、(1999) Russian J. Genet. 35:327-331）。そのような変異を有する細胞において、３つの機能複製開始点を有するｐＳＢ１：：ｐＳＢ１１誘導体同時組込み体のようなプラスミドは、高度に不安定であることが予想される。したがって、スーパーバイナリー系は不完全であるが、これは、本明細書に記載の植物を形質転換するためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）株および方法のエレメントによって有利に対処される。
外来遺伝子またはアグロバクテリウム（Agrobacterium）介在の形質転換によるトランスジェニック植物細胞における導入および発現の対象とされている遺伝子のＤＮＡ構造は、大腸菌（Escherichia coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）の細胞でそれらの遺伝子を保持するバイナリーベクタープラスミドまたはシャトルベクタープラスミドの安定性に重大な影響を及ぼし得る。遺伝子構築物内に複数回用いられる遺伝子成分を外来遺伝子が含む場合、不安定性は特に顕著である。例えば、トランスジェニック植物中の異なるタンパク質コード領域の発現を作動させるために、特定の植物発現可能なプロモーターを用いることができることは珍しいことではない。別の遺伝子成分例えば３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（すなわち、転写終止および配列決定に加えてポリアデニル化）ならびに非常に高度に類似するタンパク質コード領域は、単一のＴ−ＤＮＡ領域内のマルティプルコピーで複製されるか存在し得る。上述のように、逆方向反復配向または直接反復配向のいずれか存在し得る、これらの反復配列エレメントは、特に反復がプラスミド構造の部位である場合、ＤＮＡ欠失および別の再構成をもたらし得る、分子内組換えの標的である。
大腸菌（E. coli）の多数の特定菌株が、そのような不安定性の問題の解消を手助けする分子クローニング宿主として機能するように開発されている（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡにより提供されているＳＴＢＬ２（商標）株、ＳＴＢＬ３（商標）株、およびＳＴＢＬ４（商標）株）。大腸菌（E. coli）クローニング株のようなすべてに共通な特徴は、ｒｅｃＡ遺伝子中のゲノム変異の存在である。ＲｅｃＡタンパク質は、相同組換え、ＤＮＡ修復および細菌性ＳＯＳ反応の誘導で役割を果たす多機能酵素である。相同組換え方法において、このタンパク質は、ＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ、シナプシス促進、ヘテロデュプレックス形成および相同ＤＮＡ間の鎖交換として機能する。したがって、ＲｅｃＡ機能の欠損のある細胞は、再構成または欠失なく、相同ＤＮＡ配列に対する耐性をより強く持つ傾向がある。
反復配列を含有する大型ＤＮＡ断片をクローニングする際に認められる不安定性の問題に対処するため、アグロバクテリウム（Agrobacterium）のＲｅｃＡ欠損株が開発されている（Klapwicjら、（1979） Molec. Gen. Genet. 173:171-175；Farrandら、（1989） J. Bacteriol. 171:5314-5321；Lazoら、（1991） Bio/Technology 9:963-967）。これらの株は、場合によっては高分子量の形質転換構築物の安定化を促進するのに有用であることが分かった（FraryおよびHamilton, （2001） Transgenic Res. 10:121-132）が、すべての場合ではない（Songら、（2003） Theor. Appl. Genet.107:958-964）。したがって、プラスミド維持および植物形質転換能力において非常に効率的である、開発株でｒｅｃＡを欠損するアグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体のバックグラウンドを有利に使用することができる。本明細書に記載の方法で使用するための開発株でｒｅｃＡを欠損するアグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体のバックグラウンドを使用する他に、ｒｅｃＡ機能は、本明細書に記載の方法でその株を有用にするために、既存株または生産株で非活性化することができる。例えば、Farrandら（前掲）を参照。例えば、ＲｅｃＡ機能および所望する任意の染色体追加（例えば、ｖｉｒ遺伝子の追加）を持つ株を開発することが可能であり、その後、ＲｅｃＡ機能を機能しないようにすることができる。
植物および非植物の宿主細胞への大型ＤＮＡ断片の効率的な形質転換を可能にすることを意図したＢＩＢＡＣベクターを利用することができる。例えば、米国特許第５，７３３，７４４号、米国特許第５，９７７，４３９号、および米国特許出願第２００２／０１２３１００Ａ１号を参照されたい。ＢＩＢＡＣベクターを用いて利用することが可能なアグロバクテリウム（Agrobacterium）株の１つは、Farrandら（前掲）によって開発されたＲｅｃＡ欠損株ＵＩＡ１４３である。ＢＩＢＡＣ系の改良には、別のｖｉｒ遺伝子と組み合わせて１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片上に保有する遺伝子のサブセットを使用し、操作されるアグロバクテリウム（Agrobacterium）株の植物形質転換能力を増強した。特に、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片由来のｖｉｒＧ遺伝子は、単独で用いるか、ＵＩＡ１４３のＲｅｃＡ欠損株のｐＴｉＡ６に由来するｖｉｒＥ１遺伝子およびｖｉｒＥ２遺伝子と組み合わせて用いられた。例えば、Hamiltonら、（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. 93:9975-9979; Hamilton, （1997） Gene 200:107-116; FraryおよびHamilton（前掲）を参照されたい。
さらに、本明細書に記載の方法を用いて植物細胞を形質転換するために用いられる適切なベクターは、形質転換された植物細胞に抗生物質または除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。したがって、個別に用いられる選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換細胞の選択を可能にし、一方、挿入ＤＮＡを含有していない細胞の増殖は選択的化合物により抑制することができる。使用される特定の選択可能なマーカー遺伝子は実験計画法または優先度に依存し得るが、以下のいずれかの選択可能なマーカー、ならびに、選択可能なマーカーとして機能し得る本明細書に記載されていない別の遺伝子を用いることができる。選択可能なマーカーの例としては、限定するものではないが、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシンおよびメトトレキサートなど）に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子、あるいは除草剤（例えば、ホスフィノトリシン（ビアラホス）、グリホサート、イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン、クロルスルフロン、ブロモキシニルおよびＤＡＬＡＰＯＮなど）に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子が挙げられる。
選択可能なマーカーの他に、レポーター遺伝子も使用することができる。場合によっては、選択可能なマーカーなしでレポーター遺伝子を使用することができる。レポーター遺伝子は、一般に、移植体の生物または組織に対して増殖効果は提供しない遺伝子である。レポーター遺伝子は、典型的には、表現型変更または酵素特性を提供するタンパク質をコードしている。適切なレポーター遺伝子としては、限定するものではないが、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ホタルルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質）をコードするものが挙げられる。
植物を形質転換するための数多くの技術の他に、外来遺伝子と接触させる組織のタイプをさらに変更することができる。そのような組織としては、限定するものではないが、胚形成組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、胚軸および分裂組織を挙げることができる。植物組織はほとんどすべて、脱分化中に、当業者において適切とされる技術を使用して形質転換することができる。植物形質転換の分野の当業者には、多様な方法が形質転換植物の生産に利用可能であること、また、これらを改変し、特定化して各種の宿主植物種間の生物学的な相違を調整することが可能であることは理解されよう。
用いられる特定の形質転換技術にかかわらず、外来遺伝子は、ベクターに植物プロモーターを含むことにより植物細胞中の外来遺伝子を発現するように適合された遺伝子導入ベクターへ組み込むことができる。植物プロモーターの他に、様々な起源由来のプロモーターを植物細胞中で有効に用いて、外来遺伝子を発現させることができる。例えば、細菌起源のプロモーター、例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター；ウイルス起源のプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓのプロモーター、サトウキビ桿状ウイルス由来のプロモーターなどを使用することができる。植物由来のプロモーターとしては、限定するものではないが、リブロース−１，６−二リン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼスモールサブユニット（ｓｓｕ）プロモーター、ベータコングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ヒートショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン脱重合因子）プロモーター、および組織特異的プロモーターなどが挙げられる。またプロモーターは、転写効率を改善することができる特定のエンハンサー配列エレメントを含有していてもよい。典型的なエンハンサーとしては、限定するものではないが、アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）イントロン１およびＡＤＨ１−イントロン６が挙げられる。構成的プロモーターを使用してもよい。構成的プロモーターは、ほぼすべての細胞のタイプにおいて、またほぼすべての回で連続的遺伝子発現を導く（例えば、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）。組織特異的プロモーターは、特定の細胞または組織のタイプ（例えば、葉または種子）における遺伝子発現に関与する。使用可能な別のプロモーターの例としては、植物の発育の特定段階中に活性であるもの、ならびに、特定の植物組織および器官において活性であるものが挙げられる。このようなプロモーターの例としては、限定するものではないが、根特異的、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシ毛特異的、ワタ繊維特異的、種子内乳特異的、および師部特異的なプロモーターが挙げられる。
特定の環境の下では、誘導性プロモーターの使用が望ましい可能性がある。誘導性プロモーターは、特異的シグナル、例えば物理的刺激（例えばヒートショック遺伝子プロモーター）；光線（例えば、リブロース−ビス−ホスフェート１，５カルボキシラーゼプロモーター）；ホルモン（例えば、グルココルチコイド）；抗生物質（例えば、テトラサイクリン）；代謝物質；およびストレス（例えば干ばつ）に応じて遺伝子の発現に関与する。植物で機能する別の望ましい転写エレメントおよび翻訳エレメントも使用することが可能であり、例えば、５’非翻訳リーダー配列、ＲＮＡ転写終止配列およびポリアデニレート添加シグナル配列などがある。当技術分野で知られている任意の適切な植物特異的遺伝子導入ベクターも使用することができる。
耐虫性（ＩＲ）形質を含有するトランスジェニック作物は、北アメリカの至る所におけるトウモロコシおよびワタ植物において普及しており、これらの形質の使用は世界的に広がっている。ＩＲおよび除草剤耐性（ＨＴ）形質を組み合わせている市販のトランスジェニック作物は、多くの種子会社によって開発されている。このような例としては、Ｂｔ（バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis））の殺虫タンパク質により付与されているＩＲ形質と、ＨＴ形質、例えば、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤、例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリドなどに対する耐性、グルタミン合成酵素（ＧＳ）阻害剤、例えば、ビアラホス、グルホシネートなどに対する耐性、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、例えば、メソトリオン、イソキサフルトールなどに対する耐性、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）阻害剤、例えば、グリホサートなどに対する耐性、およびアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤、例えば、ハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどに対する耐性との組み合わせが挙げられる。遺伝子導入により提供されるタンパク質が、フェノキシ酸除草剤、およびピリジルオキシアセテートオーキシン除草剤（国際公開第２００７／０５３４８２Ａ２を参照）、またはフェノキシ酸除草剤およびアリールオキシフェノキシプロピオネート除草剤（国際公開第２００５１０７４３７Ａ２、Ａ３を参照）などの除草剤化学分類に対する植物耐性を提供する別の例が知られている。ＩＲ形質により多数の有害生物問題を防除する能力は価値のある商品コンセプトであり、昆虫防除形質および雑草防除形質が同一植物中で組み合わされる場合、この製品コンセプトの便利さはさらに良くなる。さらに、上記のような１種または複数のさらなるＨＴ形質、プラス１種または複数のさらなるインプット形質（例えば、Ｂｔ由来または別の殺虫タンパク質によって付与される別の耐虫性、ＲＮＡｉなどの機序により付与される耐虫性、耐病性、耐ストレス性、窒素利用の改善など）またはアウトプット形質（例えば、油成分高含有量、健康的な油組成物、栄養上の改善など）を含むＢｔ殺虫タンパク質により付与されるＩＲ形質の単一植物の組み合わせによって、価値が改善される。こうした組み合わせは、従来の品種改良（例えば、品種改良スタック）によって得ることができるか、複数遺伝子の同時導入に関する新規な形質転換の事象として（例えば、分子スタック）一緒に得ることができる。利点としては、作物中の害虫を管理する能力および雑草防除の改善が挙げられ、これは生産者および（または）消費者に第２の利点を提供する。したがって、本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株および方法を用いて、様々な農業問題を柔軟かつコスト効率よくコントロールする能力を持つ改善された作物品質の完全なる農業用パッケージを含む、形質が組み合わされた形質転換植物を提供することができる。
各種のｐＴｉプラスミドのｖｉｒＧ遺伝子に関し、植物形質転換率を増強するその能力を解明するために研究されてきた。Liuら（1992, Plant Molec. Biol. 20:1071-1087）は、多数の起源（すなわち、異なるｐＴｉプラスミド由来であるが、ｐＴｉＢｏ５４２を含むもの）由来のｖｉｒＧ遺伝子の余分なコピーが一部の植物の一過性形質転換を増強し、その効果の規模は、特定のｖｉｒＧ遺伝子がペアになっていたヘルパーｐＴｉプラスミドの同一性に依存したことを発見した。ｖｉｒＧＮ５４Ｄ（この変異はアミノ酸Ａｓｎ５４がＡｓｐで置き換えられている）と命名されたｖｉｒＧ遺伝子の突然変異体（ｐＴｉＡ６由来と推定）は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）中で構成的に発現される（野生型ｖｉｒＧ遺伝子の誘導には、酸性ｐＨ、高モノサッカリド濃度、およびアセトシリンゴンなどのフェノール酸インデューサーの存在が必要である）。Pazourら、(1992) J. Bacteriol. 174:4169-4174を参照されたい。ｐＴｉＡ６のＶｉｒＧＮ５４Ｄはトウモロコシ形質転換の増強に有効であったが、親野生型ｖｉｒＧのマルティプルコピーは効果がなかった。Hansenら、(1994) J. Bacteriol. 174:4169-4174を参照されたい。ｐＴｉ１５９５５由来の構成的突然変異体ｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子のコピーが、無害化ｐＴｉヘルパープラスミドｐＡＬ４４０４および植物形質転換用の遺伝子を保持するバイナリーベクターを含んだアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株中のｐＢＢＲ１−誘導プラスミド上に同時存在した、「三成分」（すなわち３−プラスミド）系が記載されている。van der Fitsら、(2000) Plant Molec. Biol. 43:495-502を参照されたい。この構成的に発現されるｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子は、いくつかの植物種の一過性の形質転換効率と安定な形質転換効率の両方を大幅に高めること分かった。ｐＢＲＲ１複製制御域を含有するプラスミドは、任意の知られている不和合性グループに属するので分類することができない。したがって、それらのプラスミドは、単一宿主で広範囲の別のプラスミドと共存し得る。さらに、タバコ、ワタおよびイネにおいて植物形質転換効率に影響する、次のｖｉｒ遺伝子の各種組み合わせの能力が詳しく試験された：ｐＴｉＡ６由来の突然変異体ｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子、ｐＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒＧ遺伝子、ｐＴｉＡ６由来のＶｉｒＥ１／Ｅ２遺伝子、および後者２種の遺伝子セットの組み合わせ。Parkら、(2000) Theor. Appl. Genet. 101:1015-1020を参照されたい。形質転換効率の増加が一部の植物種およびｖｉｒ遺伝子の追加コピーで認められた。
欧州特許出願第２０４２６０２Ａ１および米国特許出願第２０１０／０１３２０６８Ａ１号には、ｐＴｉヘルパープラスミドを保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞中に存在する場合、ターナリープラスミド系のさらなる例示を構成する、コスミドバイナリーベクターおよび「ブースター」プラスミドが記載されている。それらの中に記載されているブースタープラスミドは、ＩｎｃＷ不和合性グループの複製起点を有し、またｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子を有するプラスミドｐＶＧＷおよびプラスミドｐＶＧＷ２（これはクローニングおよび選択を促進するように改変されているｐＶＧＷの誘導体である）を含む。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）中の染色体遺伝子によってコードされている機能は、２種類の遺伝学的手法によって典型的に測定された。第１の方法、またはフォワード遺伝学的方法は、研究対象の遺伝子の分子クローンを取得し、次いで、遺伝環境中にそのクローン遺伝子を配置することが必要とされ、そこで、「機能の獲得」表現型を評価することができる。第２の方法、または「リバース遺伝学的方法」では、染色体の遺伝子の中または周囲の配列の挿入または欠失により遺伝子の構造を破壊し、次いで、タンパク質または表現型が遺伝子機能の消失により除かれたことを測定することが必要である。これは、前述のＣ５８株のＲｅｃＡ欠損変異株を構築するために用いられる手法である。Farrandら（前掲）を参照されたい。アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の遺伝子操作分野の当業者には、様々なベクターや多数の方法がそのような遺伝子破壊実験を可能にすることが記載されていることは理解されよう。この方法は、変異株の活力度、増殖および植物形質転換能力に関与しない遺伝子の同定に使用する場合に特に有用であることが分かった。アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｃ５８株のそのような遺伝子座の１つは、ｐｇｌ／ｐｉｃＡ遺伝子座である。Leeら、(2001) Plant Microbe Interact. 14:577-579; およびLee (2006) In: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ. pp.55-66を参照されたい。ｖｉｒＤ２遺伝子が相同組換えによってこの染色体座へ組み込まれた細胞は、自己複製するプラスミドに配置されたｖｉｒＤ２遺伝子を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株から得た結果と同一の植物形質転換表現型を有することが分かった。Leeら（前掲）を参照されたい。さらに、Ｃ５８のｐｇｌ／ｐｉｃＡ遺伝子座に組み込まれたＴ−ＤＮＡ領域は、植物細胞に機能的に送達され得る（Oltmannsら、2010. Plant Physiol. 152:1158-1166）。したがって、Ｃ５８株において、ｐｇｌ／ｐｉｃＡ遺伝子座は、Ｃ５８染色体へ遺伝子を導入するための「中立組込み部位」として役立ち得る。本明細書では、「中立組込み部位」とは、植物形質転換に必要なすべての機能を果たすために細胞の成長または細胞の能力にとって正常機能が必要でない、アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の染色体にもともと存在する遺伝子または染色体座を意味する。その遺伝子内に通常存在しないＤＮＡ塩基配列の組込みによって破壊される場合、破壊した中立組込み部位遺伝子を保持する細胞は、植物形質転換を生産的に達成することができる。例として、Hoekemaら（1984, EMBO J. 3:2485-2490）は、Ｔｎ３転位によりＣ５８染色体中の特性化されていない遺伝子座へ組み込まれた機能Ｔ領域が生産的に植物細胞に移入されたことを証明した。
本明細書で論じたアグロバクテリウム（Agrobacterium）株は、１種または複数の遺伝子を植物に導入するために、例えば、個別のまたは多数の殺虫特性または除草特性を植物に提供するために有利に使用することができる。例えば、本アグロバクテリウム（Agrobacterium）株は、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上の遺伝子を植物に導入するために使用することができる。本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用する際、選択可能な遺伝子配列を含有するポリヌクレオチドは、植物細胞が形質転換されるときに植物細胞中の単一の位置に挿入される。遺伝子の挿入に用いられるＴ−ＤＮＡ領域のサイズに関して、Ｔ−ＤＮＡ領域は、１５，０００ヌクレオチド塩基対以上、２０，０００ヌクレオチド塩基対以上、２５，０００ヌクレオチド塩基対以上、２６，０００ヌクレオチド塩基対以上、２７，０００ヌクレオチド塩基対以上、２８，０００ヌクレオチド塩基対以上、２９，０００ヌクレオチド塩基対以上、または３０，０００ヌクレオチド塩基対以上であってよい。本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用する場合、選択可能な遺伝子配列は、６０％以上、６５％以上、６７％以上、６９．５％以上、７０％以上、７５％以上、または８０％以上の配列相同性を有していてよく、また、それらの転写可能な配列同一性を保持していてもよい。導入可能な遺伝子のタイプは、殺虫タンパク質、除草タンパク質、または殺虫タンパク質および除草タンパク質の混合物をコードし得る。導入可能な遺伝子の具体例としては、Ｃｒｙ１Ｃａ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ｆ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ１殺虫タンパク質、およびＡＡＤ１除草タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、これらは様々な組み合わせで、または４種すべてを含む一セットとして導入することができる。単子葉の種（単子葉植物）および双子葉の種（双子葉植物）は、これらのアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して形質転換することができる。
また、ポリヌクレオチド配列が組み込まれ得る、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のｎｉｌＡゲノム遺伝子座も本明細書で開示する。このような組込みポリヌクレオチド配列は、任意のｖｉｒ遺伝子またはｖｉｒオペロンまたは別の有用遺伝子を含み得る。実施例１７〜２０には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のｎｉｌＡゲノム遺伝子座の同定、特性決定および使用、ならびに、染色体に配置されている多数のｖｉｒ遺伝子を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株の生産を示す。ｎｉｌＡゲノム遺伝子座、または８５〜１００％のヌクレオチド配列同一性を共有する任意の遺伝子座は、本明細書に記載の同定技術および特性決定技術を使用して、別のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株で同定することができる。また、ｖｉｒ遺伝子または別の適切な遺伝子（例えば、植物形質転換効率を高めることができる遺伝子）を組み込むために、任意のそのような同定ｎｉｌＡ座を本明細書で記載した方法と同様の方法で使用することができる。本明細書に記載のそのようなゲノム遺伝子座の同定および特性決定の技術は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）株が植物を形質転換する可能性を維持するように、ｖｉｒまたは別の遺伝子を含有するポリヌクレオチド配列が組み込まれ得る、アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体上の別の中立組込み部位を同定するために使用することもできる。中立組込み部位として使用可能な一部の染色体部位は既に知られており、例えば、ＲｅｃＡ欠損株のＲｅｃＡ部位、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８株のｐｇｌ／ｐｉｃＡ遺伝子座である。しかし、ｐｇｌ／ｐｉｃＡ遺伝子座は別の一部の株（例えば、ＬＢＡ４４０４株）で検出されないので、Ｃ５８に加えて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株中の新しい中立部位を同定する必要がある（Oltmannsら、前掲）。中立組込み部位として使用可能なさらなる染色体部位は、米国特許第６，３２３，３９６号に記載されている。したがって、アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体上の中立組込み部位へ組み込まれたｖｉｒ遺伝子を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）株も開示する。そのようなアグロバクテリウム（Agrobacterium）株は、ｎｉｌＡゲノム遺伝子座または別の中立組込み部位をｖｉｒ遺伝子の組込みに使用することができる。
Ｔ−ヘルパープラスミドの使用が不要とされるこの方法では、多数のタイプの有用遺伝子を染色体に加えることができる。例えば、異なる菌株由来のさらなるｖｉｒ遺伝子および有用なｖｉｒ遺伝子のマルティプルコピーを使用することができる。
また、本明細書では、ＩｎｃＰ以外の不和合性グループの複製起点を有するヘルパープラスミドおよび少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド（前記プラスミドはＩｎｃＰ不和合性グループの複製起点を有する）上のｖｉｒ遺伝子を含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株も開示する。
さらに、本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して、本明細書に記載の方法によって作出される植物も開示する。そのような植物は、本明細書に記載の方法を使用して導入される任意のＴ−ＤＮＡ領域を安定に組み込む。さらに、そのような植物は、任意の遺伝子を発現させ、それらのＴ−ＤＮＡ領域により付与された任意の遺伝形質を示す。さらに、本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して、本明細書に記載の方法によって作出される植物の任意の後代は、任意の遺伝子を安定に生じ、親で確認されるそれらのＴ−ＤＮＡ領域によって付与された任意の遺伝形質を示す。
特定の実施形態において、Ｃｒｙ１Ｃａ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ｆ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ１殺虫タンパク質およびＡＡＤ１除草タンパク質を安定に発現する植物を記載する。この植物は、例えば、トウモロコシであってよい。
本明細書では特定例のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株が記載されているが、同一の基準を用いて、論じた機能を別のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株、例えば、ＲｅｃＡに欠損のある別の菌株またはＲｅｃＡに欠損を作製することが可能な別の菌株に展開することができる。本明細書に記載の菌株および方法を用いて使用することが可能な別の菌株の例としては、限定するものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８株、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃｈｒｙ５株、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）株、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＥＨＡ１０１株、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＥＨＡ１０５株、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＭＯＧ１０１株、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｔ３７株が挙げられる。
本明細書で言及した、または本明細書で引用したすべての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらが本明細書の明白な教示と矛盾しない程度まで参照によりそれら全体を組み込むものとする。
下記は、本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を利用し、本明細書に記載の方法を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は、限定するものとして解釈されるべきでない。特に断りのない限り、パーセンテージはすべて重量パーセントであり、溶媒混合比率はすべて容量比である。温度はすべて摂氏度である。
特に指示または示唆のない限り、本明細書では、「１つの（１種の）（ａ）」、「１つの（１種の）（ａｎ）」および「その（本、または該）（ｔｈｅ）」という用語は、「少なくとも１つ」を示す。
［実施例］
プラスミドｐＵＣＤ２の欠失変異体の構築
プラスミドｐＵＣＤ２の構築はCloseら、（1984, Plasmid 12:111-118）によって記載されており、１３，２３９ｂｐの完全ＤＮＡ配列は、初めて本明細書に配列番号１として開示している。ｐＵＣＤ２は、抗生物質に対する細菌耐性、詳しくは、スペクチノマイシン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびアンピシリンに対する耐性（図１）を付与する４つの遺伝子を保持する。例えば、Sambrookら、（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition. , COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, Plainview, N.Y.) およびAusubelら、（1995, Current Protocols in Molecular Biology,（GREENE PUBLISHING AND WILEY-INTERSCIENCE, New York）およびそれらの最新版に教示されている標準の分子生物学方法を、本開示のこの実施例および別の実施例に記載されているこのステップおよび別のステップで用いた。ｐＵＣＤ２への第１の改変は、制限酵素Ｓａｃ ＩおよびＳａｃ ＩＩでｐＵＣＤ２ ＤＮＡを切断し、 Ｓａｃ ＩまたはＳａｃ ＩＩ生成オーバーハングと適合する適切なオーバーハングの「付着末端」を有する通常二本鎖のオリゴヌクレオチド断片にライゲーションすることにより作製される。この二本鎖オリゴヌクレオチド（図１）は、配列番号２および配列番号３として開示されている、２つの相補的オリゴヌクレオチド配列をアニールすることにより生成された。配列番号２および配列番号３のオリゴヌクレオチドの配列は、Ｓａｃ Ｉ およびＳａｃ ＩＩで切断されたｐＵＣＤ２ ＤＮＡとのライゲーションの際に機能カナマイシン耐性遺伝子を回復するように設計されている。この操作によりプラスミドｐＤＡＢ９２９０が作製されたが（図１）、これは、スペクチノマイシン耐性に関するコード領域の欠失、カナマイシン耐性に関するコード領域内部から得られるＫｐｎ Ｉ制限酵素認識部位の除去、およびカナマイシン耐性コード領域の下流の新規Ｋｐｎ Ｉ部位の作製によりｐＵＣＤ２とは異なる。
プラスミドｐＤＡＢ９２９０のＤＮＡは、テトラサイクリン耐性およびアンピシリン耐性をコードしている遺伝子を無効にするために、第１に制限酵素Ｐｓｔ ＩおよびＳａｌ Ｉで切断し、これらの酵素によって得られたオーバーハンギング末端をＱＵＩＣＫ ＢＬＵＮＴＩＮＧ（商標） ｋｉｔ （ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で処理して平滑末端を作製し、これによって得られた断片を円形状にするために自己ライゲーションを行うことによって、さらに操作した。得られたプラスミド（ｐＤＡＢ９２９１）はカナマイシン細菌性抗生物質耐性遺伝子のみを保持し、カナマイシン耐性遺伝子の下流でＫｐｎ Ｉにより切断するための特有の部位を有する。ｐＤＡＢ９２９１の配列は、配列番号４として開示している。プラスミドｐＤＡＢ９２９１には２つの複製開始点があり、１つはプラスミドｐＢＲ３２２由来のもの（ｃｏｌＥ１不和合性グループ）で、２つにはプラスミドｐＳａ由来のもの（不和合性グループＷ）である。したがって、プラスミドｐＤＡＢ９２９１は、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）において平均コピー数を維持することができる。
１４．８Ｋｐｎ Ｉ ｖｉｒＢＣＤＧ断片のｐＤＡＢ９２９１へのクローニング
「超病原性」ｐＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒＧ、ｖｉｒＢおよびｖｉｒＣオペロンならびにｖｉｒＤ１を含有する１４．８ｋｂｐ Ｋｐｎ Ｉ断片（図１）は、プラスミドｐＳＢ１（Komariら、前掲；およびKomoriら、前掲）から単離され、ｐＤＡＢ９２９１の特有のＫｐｎ Ｉ部位へクローニングした。挿入断片の２つの可能な配向をそれぞれ含有するプラスミドが得られ、ｐＤＡＢ９２９２およびｐＤＡＢ９２９３と命名された。１つのプラスミド、ｐＤＡＢ９２９２（図１）を以降の試験に選択した。ｐＤＡＢ９２９２のＤＮＡ配列を配列番号５として開示している。
ヘルパープラスミドｐＴｉＥＨＡ１０５を保持するＲｅｃＡ−欠損アグロバクテリウム（Agrobacterium）株の構築
アグロバクテリウム（Agrobacterium）ＵＩＡ１４３株はＣ５８遺伝的バックグラウンドを有するＲｅｃＡ−欠損株であり、Farrandら（前掲）により構築され、記載された。染色体のｒｅｃＡ遺伝子が欠失され、１５０μｇ／ｍＬでエリスロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子カセットと置き換えられた。このＵＩＡ１４３株は、ＴｉプラスミドやＴｉプラスミド誘導体を含有していない。
Hoodら（1993, Transgenic Research 2:208-221）によって構築され、記載されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）ＥＨＡ１０５株は、「超病原性」ｐＴｉＢｏ５４２プラスミド由来のヘルパープラスミド（本明細書ではｐＴｉＥＨＡ１０５と呼ぶ）を保持する。プラスミドｐＴｉＥＨＡ１０５ ＤＮＡはＥＨＡ１０５株から調製され、標準方法（WeigelおよびGlazebrook, (2002) Arabidopsis: A Laboratory Manual. COLD SPRING HARBOR PRESS, Cold Spring Harbor, NY, 354 pages; Mersereauら、(1990) Gene 90:149-151; Mattanovichら、(1989) Nucl. Acids Res. 17:6747)）によりエレクトロコンピテント作製したＵＩＡ１４３株の細胞へエレクトロポレーションによって導入された。ｐＴｉＥＨＡ１０５で形質転換されたＵＩＡ１４３株の細胞は、精製寒天と増殖用の唯一の炭素源および窒素源としてマンノピン（２ｍｇ／ｍＬ）を使用するＡＢ最少培地（Watson,ら、(1975) J. Bacteriol. 123:255-264）で増殖するその能力により選択された（Guyonら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2693-2697; Dessauxら、(1987) Molec. Gen. Genet. 208:301-308）。
ｐＴｉＥＨＡ１０５の存在は、ｐＴｉＢｏ５４２ ｖｉｒＤ２遺伝子およびｖｉｒＧ遺伝子の断片が増幅するように設計されたプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により確認され、さらに、塩化セシウム勾配遠心分離により精製したｐＴｉＥＨＡ１０１の３２Ｐ標識化ＤＮＡでプローブした候補コロニーから調製した全ＤＮＡについてサザンブロット分析を行い特徴決定した。このアグロバクテリウム（Agrobacterium）株（すなわち、ｐＴｉＥＨＡ１０５含有ＵＩＡ１４３）はＤＡ２５５２と称する。
ヘルパープラスミドｐＴｉＣ５８Δを保持するＲｅｃＡ−欠損アグロバクテリウム（Agrobacterium）株の構築
Ｚ７０７株は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８株のｐＴｉＣ５８プラスミドの全Ｔ−ＤＮＡ領域を、カナマイシンに対する耐性を付与するＴｎ９０３のｎｐｔ Ｉ遺伝子で置き換えることにより得た。得られたプラスミド（本明細書ではｐＴｉＣ５８Δという）の全ｖｉｒ領域は、完全なままであった（Hepburnら、(1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969）。Ｚ７０７株から得たヘルパープラスミドｐＴｉＣ５８Δは塩化セシウム勾配遠心分離により精製し、エレクトロコンピテントＵＩＡ１４３細胞へエレクトロポレートされた。ｐＴｉＣ５８Δプラスミド由来のカナマイシン耐性遺伝子および染色体由来のエリスロマイシン耐性遺伝子に基づいて形質転換体が選択され、その株をＤＡ２５６９と命名した。ＤＡ２５６９中のｐＴｉＣ５８Δの存在は、選択したｖｉｒ遺伝子領域を検出するためのプライマーを使用してＰＣＲ増幅により、また、Ｚ７０７株の細胞から塩化セシウム勾配遠心分離によって精製したｐＴｉＣ５８Δの３２Ｐ標識化ＤＮＡでプローブしたＤＡ２５６９候補コロニーから調製した全ＤＮＡをサザンブロット分析することにより確認した。
ヘルパープラスミドｐＭＰ９０を保持するＲｅｃＡ−欠損アグロバクテリウム（Agrobacterium）株の構築
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）株は、全Ｔ−ＤＮＡ領域が欠失され、ゲンタミシンに対する耐性を付与する遺伝子と置き換えられたｐＭＰ９０と呼ばれるｐＴｉＣ５８の欠失型を保持する（KonczおよびSchell, (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396）。プラスミドｐＭＰ９０のＤＮＡは、塩化セシウム勾配遠心分離またはＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ ＸＴＲＡ ＭＡＸＩ ＫＩＴ 「ＬＯＷ ＣＯＰＹ」（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ Ｉｎｃ．；Ｂｅｔｈｅｌｅｍ、ＰＡ）などの方法により調製され、ＵＩＡ１４３細胞へエレクトロポレートされる。形質転換体は、ｐＭＰ９０プラスミド由来のゲンタミシン耐性遺伝子（１００μｇ／ｍＬ）に基づいて選択され、その株はＤＡｔ２０５３８と命名される。ＤＡｔ２０５３８中のｐＭＰ９０の存在は、選択されたｖｉｒ遺伝子領域を検出するためにプライマーを使用するＰＣＲ増幅により、また、ＤＡｔ２０５３８から調製した全ＤＮＡをサザンブロット分析することにより確認される。
ヘルパープラスミドｐＭＰ９０ＲＫを保持するＲｅｃＡ−欠損アグロバクテリウム（Agrobacterium）株の構築
実施例５に記載のヘルパープラスミドｐＭＰ９０は、プラスミドｐＲＫ２０１３由来の４２ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ断片を（ダブルクロスオーバー相同組換えにより）導入することによってさらに改変した（FigurskiおよびHelinski, (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1648-1652）。４２ｋｂｐ断片は、プラスミド複製および移動に関するプラスミドＲＫ２由来の遺伝子（例えば、ｔｒｆＡ、ｔｒａ１、ｔｒａ２、ｔｒａ３およびｏｒｉＴ）およびカナマイシン耐性を付与する遺伝子を含有する。この操作をプラスミドｐＭＰ９０のゲンタミシン耐性遺伝子に置き換え、得られたプラスミドがｐＭＰ９０ＲＫと命名された（KonczおよびSchell、前掲）。プラスミドｐＭＰ９０ＲＫのＤＮＡは、塩化セシウム勾配遠心分離またはＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ ＸＴＲＡ ＭＡＸＩ ＫＩＴ「ＬＯＷ ＣＯＰＹ」などの方法によって調製され、エレクトロコンピテントＵＩＡ１４３細胞へエレクトロポレートされる。形質転換体はｐＭＰ９０ＲＫのプラスミド由来のカナマイシン耐性遺伝子に基づいて選択され、その株はＤＡｔ２０５３９と命名される。ＤＡｔ２０５３９中のｐＭＰ９０ＲＫの存在は、選択したｖｉｒ遺伝子領域を検出するプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、また、ＤＡｔ２０５３９から調製した全ＤＮＡのサザンブロット分析によって確認される。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＤＡ２５５２内へのｐＤＡＢ９２９２ＤＮＡのエレクトロポレーション
エレクトロコンピテントＤＡ２５５２細胞は、標準プロトコルを使用して調製した（実施例３を参照）。コンピテントＤＡ２５５２細胞５０μＬを氷上で溶解させ、３００〜４００ｎｇのプラスミドｐＤＡＢ９２９２ ＤＮＡを使用して形質転換した。ＤＮＡおよび細胞ミックスは、予備冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍ）およびＢＩＯ−ＲＡＤ ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲエレクトロポレーター（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｉｎｃ．；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ．）を使用してエレクトロポレートした。条件は以下のとおりである：電圧：２．５ｋＶ、パルス長：５ ｍｓｅｃ、キャパシタンスアウトプット：２５μＦａｒａｄ、抵抗：２００オーム。エレクトロポレーション後、１ｍＬのＹＥＰ（ｇｍ／Ｌ：酵母抽出物 １０、ペプトン １０、ＮａＣｌ ５）ブロスをキュベットに加え、細胞−ＹＥＰ懸濁液を１５ｍＬの培養試験管に移した。細胞を４時間温和な撹拌を行いながら２８℃でインキュベートし、その後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１５０μｇ／ｍＬのエリスロマイシンを含有するＹＥＰ＋寒天上でこの培養物を平板培養した。プレートを２８℃で２〜４日間インキュベートし、コロニーを選択し、上記のような抗生物質を含む新鮮なＹＥＰ＋寒天平板上に平板画線し、１〜３日間２８℃でインキュベートした。これらのコロニーは、ケトラクトース試験（Bouzarら、(1995) In: Methods in Molecular Biology (K. GartlandおよびM. Davey, eds.)Agrobacterium Protocols. (Vol. 44) HUMANA PRESS, Totowa, NJ. pp. 9-13を使用し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）として確認された。３ｍＬのＹＥＰ（抗生物質を含有）種培養を開始するため、いくつかのケトラクトース陽性コロニーを選択し、振盪しながら２８℃で終夜増殖させた。３００μＬの各種培養を用いて２００ｍＬのＹＥＰ（抗生物質を含有）に接種し、終夜培養物を２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で増殖させた。プラスミドＤＮＡは、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ（登録商標） ＸＴＲＡ ＭＡＸＩ ＰＬＡＳＭＩＤ ＤＮＡ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮキットを使用して、それぞれ終夜培養物２００ｍＬの１６５ｍＬから調製した。緩衝液ＲＥＳ、ＬＹＳおよびＮＥＵをそれぞれ３０ｍＬ使用すること以外は、製造者のプロトコルに従った。溶出されたＤＮＡは、４℃で保存した。
ＢａｍＨ ＩによるプラスミドＤＮＡの制限酵素消化を用いてこれらの単離物中のｐＤＡＢ９２９２の存在を確認し、次いで、単一コロニー単離の２継代を使用して、正確なパターンを有するコロニーをさらに精製した。プラスミドＤＮＡは上記のように終夜培養物から調製し、制限消化分析を用いて完全なｐＤＡＢ９２９２の存在を確認した。ＤＡ２５５２形質転換でオリジナルとして使用したｐＤＡＢ９２９２ベクターのプラスミドＤＮＡが消化基準として含まれていた。４つの個別の消化反応（Ｐｓｔ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｍｆｅ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ）が７５０ｎｇ〜１μｇのＤＮＡを使用して行われた。この反応は１〜２時間実施され、アガロースゲル電気泳動（０．８％ｗ／ｖ）によって分析され、ＤＮＡ断片は臭化エチジウム染色によって視覚化した。このアグロバクテリウム（Agrobacterium）株（すなわち、ｐＤＡＢ９２９２を保持するＤＡ２５５２）は、ＤＡｔ１３１９２と命名される。この株は、組換え欠損「ターナリー」植物形質転換系に対するベースを提供する。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）へのｐＤＡＢ９２９２ ＤＮＡのエレクトロポレーション
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）の細胞（KonczおよびSchell、前掲）は、標準プロトコルによりエレクトロコンピテントが作製された（実施例３を参照）。５０μＬのコンピテントＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）細胞を氷上で溶解させ、３００〜４００ｎｇのプラスミドｐＤＡＢ９２９２ ＤＮＡを使用して形質転換した。ＤＮＡおよび細胞ミックスは、予備冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍ）およびＢＩＯ−ＲＡＤ ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレートした。条件は以下のとおりである：電圧：２．５ｋＶ、パルス長：５ ｍｓｅｃ、キャパシタンスアウトプット：２５μＦａｒａｄ、抵抗：２００オーム。エレクトロポレーション後、１ｍＬのＹＥＰブロスをキュベットに加え、細胞−ＹＥＰ懸濁液を１５ｍＬの培養試験管に移した。細胞を４時間温和な撹拌を行いながら２８℃でインキュベートし、その後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＹＥＰ＋寒天上でこの培養物を平板培養した。プレートを２８℃で２〜４日間インキュベートし、コロニーを選択し、上記のような抗生物質を含む新鮮なＹＥＰ＋寒天平板上に平板画線し、１〜３日間２８℃でインキュベートした。これらのコロニーは、ケトラクトース試験を使用し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）として確認された。３ｍＬのＹＥＰ（抗生物質を含有）種培養を開始するため、いくつかのケトラクトース陽性コロニーを選択し、振盪しながら２８℃で終夜増殖させた。３００μＬの各種培養を用いて２００ｍＬのＹＥＰ（抗生物質を含有）に接種し、終夜培養物を２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で増殖させた。プラスミドＤＮＡは、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ（登録商標） ＸＴＲＡ ＭＡＸＩ ＰＬＡＳＭＩＤ ＤＮＡ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮキットを使用して、それぞれ終夜培養物２００ｍＬの１６５ｍＬから調製した。緩衝液ＲＥＳ、ＬＹＳおよびＮＥＵをそれぞれ３０ｍＬ使用すること以外は、製造者のプロトコルに従った。溶出されたＤＮＡは、４℃で保存した。
ＢａｍＨ ＩによるプラスミドＤＮＡの制限酵素消化を用いてこれらの単離物中のｐＤＡＢ９２９２の存在を確認し、次いで、単一コロニー単離の２継代を使用して、正確なパターンを有するコロニーをさらに精製した。プラスミドＤＮＡは上記のように終夜培養物から調製し、制限消化分析を用いて完全なｐＤＡＢ９２９２の存在を確認した。ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）形質転換でオリジナルとして使用したｐＤＡＢ９２９２ベクターのプラスミドＤＮＡが消化基準として含まれていた。４つの個別の消化反応（Ｐｓｔ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｍｆｅ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ）が７５０ｎｇ〜１μｇのＤＮＡを使用して行われた。この反応は１〜２時間実施され、アガロースゲル電気泳動（０．８％ｗ／ｖ）によって分析され、ＤＮＡ断片は臭化エチジウム染色によって視覚化した。ｐＭＰ９０ ＴｉヘルパープラスミドおよびｐＤＡＢ９２９２を保持するこのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＧＶ３１０１単離物は、ＤＡｔ２０７１２と呼ばれる。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＬＢＡ４４０４へのｐＤＡＢ９２９２ ＤＮＡのエレクトロポレーション
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株の細胞（Oomsら、(1982) Plasmid 7:15-29）は、標準プロトコルによりエレクトロコンピテントが作製された（実施例３を参照）。５０μＬのコンピテントＬＢＡ４４０４細胞を氷上で溶解させ、３００〜４００ｎｇのプラスミドｐＤＡＢ９２９２ ＤＮＡを使用して形質転換した。ＤＮＡおよび細胞ミックスは、予備冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍ）およびＢＩＯ−ＲＡＤ ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレートした。条件は以下のとおりである：電圧：２．５ｋＶ、パルス長：５ ｍｓｅｃ、キャパシタンスアウトプット：２５μＦａｒａｄ、抵抗：２００オーム。エレクトロポレーション後、１ｍＬのＹＥＰブロスをキュベットに加え、細胞−ＹＥＰ懸濁液を１５ｍＬの培養試験管に移した。細胞を４時間温和な撹拌を行いながら２８℃でインキュベートし、その後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＹＥＰ＋寒天上でこの培養物を平板培養した。プレートを２８℃で２〜４日間インキュベートし、コロニーを選択し、上記のような抗生物質を含む新鮮なＹＥＰ＋寒天平板上に平板画線し、１〜３日間２８℃でインキュベートした。これらのコロニーは、ケトラクトース試験を使用し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）として確認され、単一コロニー単離の２継代を使用して、さらに精製した。
３ｍＬのＹＥＰ（抗生物質を含有）種培養を開始するため、いくつかのケトラクトース陽性コロニーを選択し、振盪しながら２８℃で終夜増殖させた。３００μＬの各種培養を用いて２００ｍＬのＹＥＰ（抗生物質を含有）に接種し、終夜培養物を２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で増殖させた。プラスミドＤＮＡは、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ（登録商標） ＸＴＲＡ ＭＡＸＩ ＰＬＡＳＭＩＤ ＤＮＡ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮキットを使用して、それぞれ終夜培養物２００ｍＬの１６５ｍＬから調製した。緩衝液ＲＥＳ、ＬＹＳおよびＮＥＵをそれぞれ３０ｍＬ使用すること以外は、製造者のプロトコルに従った。溶出されたＤＮＡは、４℃で保存した。
制限消化分析を用いて完全なｐＤＡＢ９２９２プラスミドの存在を確認した。ＬＢＡ４４０４形質転換でオリジナルとして使用したｐＤＡＢ９２９２ベクターのプラスミドＤＮＡが消化基準として含まれていた。３つの個別の消化反応（Ｐｓｔ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、およびＨｉｎｄ ＩＩＩ）が７５０ｎｇ〜１μｇのＤＮＡを使用して行われた。この反応は１〜２時間実施され、アガロースゲル電気泳動（０．８％ｗ／ｖ）によって分析され、ＤＮＡ断片は臭化エチジウム染色によって視覚化した。ｐＤＡＢ９２９２を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４単離物はＤＡｔ２０７１１と呼ばれる。この株は、組換え能の高い「ターナリー」系に対してベースを提供する。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）ＤＡｔ２０５３８株へのｐＤＡＢ９２９２ ＤＮＡのエレクトロポレーション
エレクトロコンピテントＤＡｔ２０５３８細胞は、標準プロトコルを使用して調製した（実施例３を参照）。５０μＬのコンピテントＤＡｔ２０５３８細胞を氷上で溶解させ、３００〜４００ｎｇのプラスミドｐＤＡＢ９２９２ ＤＮＡを使用して形質転換した。ＤＮＡおよび細胞ミックスは、予備冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍ）およびＢＩＯ−ＲＡＤ ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレートした。条件は以下のとおりである：電圧：２．５ｋＶ、パルス長：５ ｍｓｅｃ、キャパシタンスアウトプット：２５μＦａｒａｄ、抵抗：２００オーム。エレクトロポレーション後、１ｍＬのＹＥＰブロスをキュベットに加え、細胞−ＹＥＰ懸濁液を１５ｍＬの培養試験管に移した。細胞を４時間温和な撹拌を行いながら２８℃でインキュベートし、その後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＹＥＰ＋寒天上でこの培養物を平板培養した。プレートを２８℃で２〜４日間インキュベートし、コロニーを選択し、上記のような抗生物質を含む新鮮なＹＥＰ＋寒天平板上に平板画線し、１〜３日間２８℃でインキュベートした。これらのコロニーは、ケトラクトース試験を使用し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）として確認され、ケトラクトース陽性コロニーを、単一コロニー単離の２継代を用いてさらに単離した。
３ｍＬのＹＥＰ（抗生物質を含有）種培養を開始するため、コロニーを選択し、振盪しながら２８℃で終夜増殖させた。３００μＬの各種培養を用いて２００ｍＬのＹＥＰ（抗生物質を含有）に接種し、終夜培養物を２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で増殖させた。プラスミドＤＮＡは、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ（登録商標） ＸＴＲＡ ＭＡＸＩ ＰＬＡＳＭＩＤ ＤＮＡ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮキットを使用して、それぞれ終夜培養物２００ｍＬの１６５ｍＬから調製した。緩衝液ＲＥＳ、ＬＹＳおよびＮＥＵをそれぞれ３０ｍＬ使用すること以外は、製造者のプロトコルに従った。溶出されたＤＮＡは、４℃で保存した。
制限消化分析を用いて完全なｐＤＡＢ９２９２プラスミドの存在を確認した。ＤＡｔ２０５３８形質転換でオリジナルとして使用したｐＤＡＢ９２９２ベクターのプラスミドＤＮＡが消化基準として含まれていた。４つの個別の消化反応（Ｐｓｔ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、およびＨｉｎｄ ＩＩＩ）が７５０ｎｇ〜１μｇのＤＮＡを使用して行われた。この反応は１〜２時間実施され、アガロースゲル電気泳動（０．８％ｗ／ｖ）によって分析され、ＤＮＡ断片は臭化エチジウム染色によって視覚化した。ｐＤＡＢ９２９２を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＤＡｔ２０５３８単離物はＤＡｔ２０５３８（ｐＤＡＢ９２９２）と呼ばれる。
複数の反復配列エレメントを有する植物形質転換ベクターの構築およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）株への導入
１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片により提供されるｖｉｒ補助遺伝子と組み合わせたＲｅｃＡ機能の欠損を有する操作されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株の有用性を本明細書で説明する。バイナリー植物形質転換ベクター、ｐＤＡＢ１０１５１３（図４Ａ）は、標準クローニング方法の組み合わせによって（例えば、Sambrookら（1989、前掲）およびAusubelら（1995、前掲））ならびにＧＡＴＥＷＡＹ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に記載されているようにして）大腸菌（E. coli）クローニング株ＳＴＢＬ２（商標）で構築した。バイナリーベクターｐＤＡＢ１０１５１３はプラスミドＲＫ２のＩｎｃＰ−タイプ複製起点をベースとし、ベクター骨格は、１００μｇ／ｍＬでスペクチノマイシン（図４中のＳｐｃＲ）に対する耐性を付与する細菌遺伝子を保持する。Ｔ−ＤＮＡ境界反復は、ｐＴｉ１５９５５のＴＬ領域から誘導される。プラスミドｐＤＡＢ１０１５１３のＴ−ＤＮＡ領域の右側境界（図４のＴ−ＤＮＡ境界Ｂ）およびトリプル左側境界（図４のＴ−ＤＮＡ境界Ａ）内では、４つの植物発現可能な、植物−コドン−最適化タンパク質コード配列（ＣＤＳ）が配置されており、各々の転写は、関連するイントロン１で１，９９１ｂｐのトウモロコシユビキチン１プロモーターにより作動される（米国特許第５，５１０，４７４号）。これらのコード領域の３つは、それぞれ約３，５００ｂｐを含む個別のＢｔ Ｃｒｙ１タンパク質（Ｃｒｙ１Ｃａ、配列番号７；Ｃｒｙ１Ｆａ、配列番号９；およびＣｒｙ１Ａｂ、配列番号１１）をコードしている。これらのコード領域は、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託から得られた７０６のトウモロコシタンパク質コード領域の分析から計算されたトウモロコシ（Zea mays）コドンバイアス表を使用する、トウモロコシ植物での発現において最適化されたコドンであった。合成遺伝子の設計および生産に関するさらなるガイダンスは、例えば、国際公開第９７／１３４０２Ａ１、米国特許第６，１６６，３０２号および米国特許第５，３８０，８３１号で確認することができる。３つのＢ．ｔタンパク質コード領域は、以下の様式で相互に関連する：ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号６）に関するコード領域とｃｒｙ１Ｆａ（配列番号８）に関するコード領域は、６７％の配列相同性を共有し；ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号６）に関するコード領域とｃｒｙ１Ａｂ（配列番号１０）に関するコード領域は６９．５％の配列相同性を共有し、ｃｒｙ１Ｆａ（配列番号８）に関するコード領域とｃｒｙ１Ａｂ（配列番号１０）に関するコード領域は、６７％の配列相同性を共有する。さらに、ｃｒｙ１Ｃａ、ｃｒｙ１Ｆａおよびｃｒｙ１Ａｂに関するＣＤＳのＣ末端１，６００ｂｐは、７３％の配列相同性を共有する。これらの３つのそれぞれのコード領域は、３６５ｂｐのトウモロコシＰｅｒ５ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）により終止する（米国特許第６，３８４，２０７号）。第４の遺伝子は、ＡＡＤ１選択可能なマーカータンパク質（配列番号１３）をコードする植物−コドン−最適化ａａｄ１コード領域（配列番号１２）を含む（米国特許第７，８３８，７３３号）。このａａｄ１コード領域は、ｃｒｙ１Ｃａ、ｃｒｙ１Ｆａまたはｃｒｙ１Ａｂに関し、ＣＤＳと関連していない。ａａｄ１に関するコード領域は、植物−コドンバイアス表を用いて設計した。トウモロコシコドンバイアス表は、ＧＥＮＢＡＮＫに寄託されている配列から得られた、７０６のトウモロコシタンパク質コード配列から計算された。タバコ（Nicotiana tabacum、１２６８ ＣＤＳ）キャノーラ（Brassica napus、５３０ ＣＤＳ）、ワタ（Gossypium hirsutum、１９７ ＣＤＳ）、およびダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；約１０００ ＣＤＳ）に関するコドン利用表は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／のデータからダウンロードした。適切な設計し直された平均相対量で、トウモロコシおよび双子葉植物の両方のデータセットに共通してたびたび用いられるコドンを含む偏位コドンセットは、いずれかの植物タイプのアミノ酸に対する全コドンの使用の約１０％未満で使用されるすべての余分のコドンを省いた後に計算した。ａａｄ１遺伝子はトウモロコシリパーゼ３’ＵＴＲにより終端している（米国特許第７，１７９，９０２号）。したがって、ｐＤＡＢ１０１５１３の２２，７２９ｂｐ Ｔ−ＤＮＡ領域の内に、トウモロコシｕｂｉ１プロモーターの４つのコピーは、約２ｋｂｐ（キロ塩基対）の４つの直接反復中にそれぞれ配置されている、合計７，９６４塩基を含み、それぞれの反復は互いに１００％関連している。Ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲの３つのコピーは、３つの直接反復単位で配置されている、合計１，０９５塩基を含み、それぞれの反復は互いに１００％関連しており、３つのコード領域ｃｒｙ１Ｃａ、ｃｒｙ１Ｆａおよびｃｒｙ１Ａｂは、相互に６７％〜７３％の間の相同性を有する直接反復として配置されている。合計で、ｐＤＡＢ１０１５１３のＴ領域は約８６％の高度に反復された配列を含み、下記のように簡便に説明することができる：
ＲＢ＞Ｕｂｉ１プロモーター：ｃｒｙ１Ｃａ ＣＤＳ：Ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ＞Ｕｂｉ１ プロモーター：ｃｒｙ１Ｆａ ＣＤＳ：Ｐｅｒ５
３’ＵＴＲ＞Ｕｂｉ１ プロモーター：ｃｒｙ１Ａｂ ＣＤＳ：Ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ＞Ｕｂｉ１ プロモーター：ａａｄ１ ＣＤＳ：Ｌｉｐ
３’ＵＴＲ＞ＬＢ。
この構築物の高度に反復された性質は、クローニングステップが大腸菌（E. coli）クローニング株ＳＴＢＬ２（商標）で終わることが求められ、それはそのような高度に反復されたＤＮＡ配列を含有するクローンの完全性を維持するように特別に操作される。
プラスミドｐＤＡＢ１０１５１３は、エレクトロポレーションによって（自発的な染色体突然変異によってストレプトマイシン耐性が付与された）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＥＨＡ１０５株のエレクトロコンピテント細胞へ導入され、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性単離物は、完全なプラスミドｐＤＡＢ１０１５１３を含有していることが制限消化分析により確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。この株は、ＥＨＡ１０５（ｐＤＡＢ１０１５１３）と命名する。ＥＨＡ１０５（ｐＤＡＢ１０１５１３）の凍結グリセロールストックから得られた細胞から確立された多数の個々の培養物は、ｐＤＡＢ１０１５１３プラスミドの再構成バージョンまたは欠失バージョンを含有していることが確認された。トウモロコシ形質転換に関して、ＥＨＡ１０５株（ｐＤＡＢ１０１５１３）のバルク細胞を冷凍グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例１３に記載されているように直接使用した。
プラスミドｐＤＡＢ１０１５１３は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＤＡ２５５２株（本質的にＥＨＡ１０５株のＲｅｃＡ−欠損バージョン）のエレクトロコンピテント細胞へ順調に導入され、ＤＡ２５５２株（ｐＤＡＢ１０１５１３）が生産された。エリスロマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性により選択された形質転換体は、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。凍結グリセロールストックから得られた細胞から確立された多数の個々の培養物は、完全なｐＤＡＢ１０１５１３プラスミドを含有していることが確認された。ＤＡ２５５２株（ｐＤＡＢ１０１５１３）のバルク細胞を冷凍グリセロールストックから接種された寒天平板から回収し、トウモロコシ形質転換に使用した（実施例１３）。
プラスミドｐＤＡＢ１０１５１３はエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＤＡｔ１３１９２株（プラスミドｐＤＡＢ９２９２を保持するＤＡ２５５２株）のエレクトロコンピテント細胞に順調に導入され、ＤＡｔ１３１９２株（ｐＤＡＢ１０１５１３）が得られた。エリスロマイシン、カナマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択された形質転換体は、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって確認された後、凍結グリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。凍結グリセロールストックから得られた細胞から確立された多数の個々の培養物は、完全なｐＤＡＢ１０１５１３プラスミドを含有していることが確認された。ＤＡｔ１３１９２株（ｐＤＡＢ１０１５１３）のバルク細胞を凍結グリセロールストックから接種された寒天平板から回収し、トウモロコシ形質転換に使用した（実施例１３）。
同様の方法で、ｐＤＡＢ１０１５１３のものと類似のＴ−ＤＮＡ領域を有する、ｐＳＢ１１の誘導体（スーパーバイナリー系のシャトルベクター）を構成した。ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）において標準方法によりスーパーバイナリープラスミドを構築する複数の試みは失敗であった。すべての試みでは、高度に再構成され欠失したｐＳＢ１ベースの同時組込み体プラスミドが単離された。
複数の反復配列エレメントを有する植物形質転換ベクターｐＤＡＢ１０１５１４の構築とアグロバクテリウム（Agrobacterium）株への導入
１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片により提供されるｖｉｒ補助遺伝子と組み合わせたＲｅｃＡ機能の欠損を有する、操作されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株の有用性を本明細書でさらに説明する。バイナリー植物形質転換ベクター、ｐＤＡＢ１０１５１４（図４Ｂ）は、標準クローニング方法およびＧＡＴＥＷＡＹ（商標）技術の組み合わせによって大腸菌（E. coli）クローニング株ＳＴＢＬ２（商標）で構築した。バイナリーベクターｐＤＡＢ１０１５１４の構造は、ｃｒｙ１Ｃａ遺伝子の発現を作動するのに用いられる発現要素を除いて、ｐＤＡＢ１０１５１３（前の実施例）の構造とほとんど同じである。ｐＤＡＢ１０１５１４中のｃｒｙ１Ｃａ ＣＤＳの転写は、１４２９ｂｐのサトウキビ桿状ウイルスプロモーターにより作動される（SCBV; Tzafrirら、(1998) Plant Molec. Biol. 38:347-356）。５’ＵＴＲは、本質的に、２０塩基のエキソン６と１１塩基のエキソン７に隣接している、トウモロコシアルコール脱水素酵素遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＸ０４０４９）のイントロン６で構成されている。この遺伝子の転写は、ジャガイモｐｉｎＩＩ ３’ＵＴＲにより終止される（Anら、(1989) Plant Cell. 1:115-122）。ｃｒｙ１Ｆａ、ｃｒｙ１Ａｂおよびａａｄ１遺伝子の発現を調節するために使用される発現エレメントは、ｐＤＡＢ１０１５１３中で用いられたものと同じ物である。したがって、ｐＤＡＢ１０１５１４の２２，５８６ｂｐ Ｔ−ＤＮＡ領域の内部では、トウモロコシｕｂｉ１プロモーターの３つのコピーは、約２ｋｂｐの３つの直接反復中にそれぞれ配置され、各反復が互いに１００％関連している、合計５，９７３塩基を含む。Ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲの２つのコピーは、２つの直接反復単位に配置され、各反復単位が互いに１００％関連している、合計７３０塩基を含み、３つのコード領域ｃｒｙ１Ｃａ、ｃｒｙ１Ｆａまたはｃｒｙ１Ａｂは、直接反復が、互いに６７％〜７３％の間のＤＮＡ配列相同性を有するように配置される。合計で、ｐＤＡＢ１０１５１４のＴ領域は約７６％の高度に反復されたＤＮＡ配列を含み、物理的な配置は、以下のように簡単に説明することができる：
ＲＢ＞ＳＣＢＶ プロモーター：ｃｒｙ１Ｃａ ＣＤＳ：ｐｉｎＩＩ ３’ＵＴＲ＞Ｕｂｉ１ プロモーター：ｃｒｙ１Ｆａ ＣＤＳ：Ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ＞Ｕｂｉ１ プロモーター：ｃｒｙ１Ａｂ ＣＤＳ：Ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ＞Ｕｂｉ１ プロモーター：ａａｄ１ ＣＤＳ：Ｌｉｐ ３’ＵＴＲ＞ＬＢ。
この構築物の高度に反復された性質は、このような高度に反復されたＤＮＡ配列を含有するクローンの完全性を維持するために特に操作される、クローニングステップが大腸菌（E. coli）クローニング株ＳＴＢＬ２（商標）で終わることが必須である。
プラスミドｐＤＡＢ１０１５１４は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＥＨＡ１０５株のエレクトロコンピテント細胞（自発的な染色体突然変異によってストレプトマイシン耐性が付与されたもの）へ導入され、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性の単離物は、制限消化分析によって完全なプラスミドｐＤＡＢ１０１５１４を含有していることが確認された後、凍結グリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。この株はＥＨＡ１０５（ｐＤＡＢ１０１５１４）と命名された。凍結グリセロールストックから得られたＥＨＡ１０５（ｐＤＡＢ１０１５１４）細胞から確立された多数の個々の培養物は、ｐＤＡＢ１０１５１４プラスミドの再構成バージョンまたは欠失バージョンを含有していることが確認された。トウモロコシ形質転換に関し、ＥＨＡ１０５株（ｐＤＡＢ１０１５１４）のバルク細胞を凍結グリセロールストックから接種された寒天平板から回収し、実施例１３で開示した方法により使用した。
プラスミドｐＤＡＢ１０１５１４は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＤＡ２５５２株のエレクトロコンピテント細胞（本質的にＥＨＡ１０５株のＲｅｃＡ−欠損バージョン）へ順調に導入され、ＤＡ２５５２株（ｐＤＡＢ１０１５１４）を得た。エリスロマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択された形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限酵素消化により確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。凍結グリセロールストックから得られた細胞から確立された多数の個々の培養物は、完全なｐＤＡＢ１０１５１４プラスミドを含有していることが確認された。ＤＡ２５５２株（ｐＤＡＢ１０１５１４）のバルク細胞を凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例１３で記載した方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。
プラスミドｐＤＡＢ１０１５１４は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＤＡｔ１３１９２株（プラスミドｐＤＡＢ９２９２を保持するＤＡ２５５２株）の細胞へ順調に導入され、ＤＡｔ１３１９２（ｐＤＡＢ１０１５１４）株を得た。エリスロマイシン、カナマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択された形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。凍結ストックから得られたＤＡｔ１３１９２（ｐＤＡＢ１０１５１４）細胞から確立された多数の個々の培養物は、完全なｐＤＡＢ１０１５１４プラスミドを含有していることが分かった。ＤＡｔ１３１９２（ｐＤＡＢ１０１５１４）株のバルク細胞は凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例１３で開示した方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。
同様の方法で、ｐＳＢ１１の誘導体（スーパーバイナリー系のシャトルベクター）は、ｐＤＡＢ１０１５１４のものと類似のＴ−ＤＮＡ領域を有して構築された。ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）での標準方法によるスーパーバイナリープラスミドを構築する複数の試みは失敗であった。すべての試みでは、高度に再構成され、欠失したｐＳＢ１ベースの同時組込み体プラスミドが単離された。
バイナリーベクターｐＤＡＢ１０１５１３およびｐＤＡＢ１０１５１４を保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株によるトウモロコシの形質転換
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）による形質転換。ＩＩ Ｆ１ ｃｒｏｓｓ（Armstrongら、(1991年) Maize Genet. Coop. Newslett. 65:92-93）に由来する種子が、９５％のＭＥＴＲＯ−ＭＩＸ ３６０ソイルレス系成長培地（ＳＵＮ ＧＲＯ ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）および５％のｃｌａｙ／ｌｏａｍ土壌からなる混合物を含む５ガロンのポット内に植栽された。植物を、高圧ナトリウムランプおよびメタルハライドランプを併用する温室内で、１６：８時間の明光：暗光周期にて成長させた。形質転換用の未成熟のＦ２胚を得るために、制御された同胞受粉（sib-pollination）が実施された。未成熟の胚が約１．０〜２．０ｍｍのサイズになる受粉後およそ８〜１０日目に、トウモロコシ雌穂（Maize ears）が回収された。
感染および共培養。トウモロコシ雌穂（Maize ears）は、液体石鹸で洗浄し、次に２０％の市販漂白剤（５％の次亜塩素酸ナトリウムを含む）中に約２０分間浸漬することにより外皮除去および表面滅菌処理され、次いで滅菌水で３回すすいだ。ｐＤＡＢ１０１５１３またはｐＤＡＢ１０１５１４、Ｂｔ Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ａｂタンパク質をコードしている３つの遺伝子を有し、ａａｄ−１植物選択可能なマーカー遺伝子を含有する、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）細胞の懸濁液は、１または２白菌耳の細菌（適切な抗生物質を含有するＹＥＰ寒天培地で２〜３日間２８℃で成長させたもの）を、２００μＭのアセトシリンゴンを含有する５ｍＬの液体感染培地（ＬＳ基本培地、（LinsmaierおよびSkoog, （1965） Physiologia Plantarum 18:100-127）Ｎ６ビタミン（Chuら、(1975) Scientia Sinica 18:659-668）、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇｍ／Ｌのスクロース、３６．０ｇｍ／Ｌのグルコース、６ｍＭのＬ−プロリン、ｐＨ５．２）に移植することにより調製された。均一な懸濁液が得られるまでこの溶液をボルテックス処理し、濃度は５５０ｎｍで最終吸光度を約０．４に調節した。
未成熟の胚は、２ｍＬの感染培地を含むマイクロ遠心管に直接単離された。培地は除去され、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液１ｍＬと置き換えられ、アグロバクテリウム（Agrobacterium）／胚溶液は室温で５〜１０分間インキュベートされた。次いで、２００μＭのアセトシリンゴンを含有する胚は共培養培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、０．８５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２．８ｇｍ／ＬのＧＥＬＬＡＮ ＧＵＭ（商標）（ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ．、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、ｐＨ５．８）へ移され、暗光下で３〜４日間、２０℃で共培養された。
共培養後、胚はＭＳ塩およびビタミン（Frameら、2011, Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. In: Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. ThorpeおよびE. C. Yeung, (Eds), SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA, LLC. pp 327-341）、６ｍＭのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＬＡＢＲ．）、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、０．８５のＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセホタキシム、２．８ｇｍ／ＬのＧＥＬＬＡＮ ＧＵＭ（商標）、ｐＨ５．８）を含有する休止培地に移された。約７日後に、胚は１００ｎＭのハロキシホップで補充した同一培地に移された。約８週後に形質転換された単離物が同定され、再生および分析を行うために２週間の間隔で新鮮な選択培地に移すことにより蓄積させた。
再生および種子生産。再生する場合、培養物は、１００ｎＭのハロキシホップを補充した「２８」導入培地（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、５ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２５０ｍｇ／Ｌのセホタキシム、２．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＬＡＮ ＧＵＭ（商標）、ｐＨ５．７）に弱光条件下（１４μＥｍ−２ｓ−１）に移した。インキュベーションは、微弱光条件下（１４μＥｍ−２ｓ−１）で１週間、次に強光条件下（約８９μＥｍ−２ｓ−１）で１週間行った。その後、組織は「３６」再生培地（植物成長調節剤を含まない点を除き、導入培地に同じ）に移植された。苗が長さ３〜５ｃｍに成長したときに、それらはＳＨＧＡ培地［（Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ ｓａｌｔｓ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎｓ，ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＬＡＢＲ.）、１．０ｇｍ／Ｌのミオイノシトール、１０ｇｍ／Ｌのスクロース、および２．０ｇｍ／ＬのＧＥＬＬＡＮ ＧＵＭ（商標）、ｐＨ５．８］を含むガラス製培養チューブに移植されて、さらに成長しおよびシュートと根が発生するようにさせた。植物は本明細書にこれまでに記載したものと同一の土壌混合物に移植され、および温室内で開花するまで育成された。植物組織の試料が回収され、実施例１４に開示の方法による昆虫バイオアッセイ、および分子生化学的分析において用いた。種子生産のために調節受粉を行う。
トウモロコシ形質転換の当業者には、その他の植物で発現可能な選択可能なマーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）が用いられる場合には、トウモロコシ形質転換および形質転換植物の選択にその他の方法が利用可能であることは理解されよう。
トウモロコシ害虫に対する葉試料のインビトロバイオアッセイ
アッセイする鱗翅目の種は、オオタバコガ（ＣＥＷ；Helicoverpa zea（Ｂｏｄｄｉｅ））、アワノメイガ（ＥＣＢ；Ostrinia nubilalis（Ｈｕｂｎｅｒ））、およびツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ；Spodoptera frugiperda（Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ））であった。これらの昆虫に関する卵は、ＢＥＮＺＯＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ （Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ＰＡ）から入手した。
第１のティアバイオアッセイ（Tier Bioassay）：ハイスループット９６ウェルバイオアッセイ。９６ウェルトレー（ＴＰＰ−ＵＳ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に２％寒天溶液（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）で部分充填し、寒天を固化させた。標準の携帯型ペーパーパンチを使用し、このフォーマットで試験される２種のそれぞれの昆虫種（ＣＥＷおよびＦＡＷ）用に、３つの直径１／８インチの葉片をサンプリングした。１つの葉片を、９６ウェルプレートの単一ウェルに置いた。試験するそれぞれの昆虫に対してプレートは３枚であった（それぞれの複製／葉片について１プレート）。卵播種装置を使用して、９６ウェルプレートの各ウェルへ昆虫の卵を投入した。次いで、プレートは穴を空けた粘着性の蓋で密閉され、さらに、プレートに付属するプラスチック蓋で封入した。プレートは、３０℃、４０％の相対湿度（ＲＨ）、１６時間の明光下：８時間の暗光下で３日間保持した。等級は０−１−２尺度を使用して実施したが、この場合、各ウェル内で、０は葉片被害が＜２５％であることを示し、１は葉片被害が２５〜５０％であることを示し、２は葉片被害が＞５０％であることを示す。各試験の被害スコアを平均し、相関分析を行うためにタンパク質発現分析を同時に使用した。その平均昆虫被害スコアが０．６７以下であった植物は、試験有害生物に対して活性があると考えられた。
第２のティアバイオアッセイ：３２ウェルのバイオアッセイ。３２ウェルトレー（Ｃ−Ｄ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ；Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）に２％寒天溶液を部分充填し、寒天を固化させた。各植物から約１インチ正方形の葉切片を取得し、３２ウェルトレーのウェルに１つずつ入れた。１つの葉片をそれぞれのウェルに入れ、２つの葉片が植物に対して、また昆虫に対して試験された。昆虫（ＥＣＢおよびＦＡＷ）は、絵筆を使用し、各ウェルに１０〜２０匹の誕生後の幼虫を入れることにより多量感染させた。トレーは、試験期間に通気できるように穴を空けた粘着性の蓋で密閉した。トレーは、２８℃、４０％の相対湿度（ＲＨ）、１６時間の明光下：８時間の暗光下で３日間保持した。試験期間の後に、簡易パーセント被害スコアをそれぞれの葉片に対して得た。各試験の被害スコアを平均し、相関分析を行うためにタンパク質発現分析を同時に使用した。その平均昆虫被害評価が２５％以下であった植物は、試験有害生物に対して活性があると考えられた。
統計的分析。分析はすべてＪＭＰ ８．０．２ （ＳＡＳ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）で行われた。一元配置分散分析を用いて、昆虫被害データに関するそれらの処理と陰性対照植物の間の有意差を決定した。さらに平均のＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ＨＳＤ比較を使用して、処理中の有意差を評価した。加えて、線形回帰（最小二乗適合）分析を用いて、定量的タンパク質発現と昆虫活性測定と相関させた。
バイオアッセイの結果を表２にまとめる。
ｐＤＡＢ１０１５１３で形質転換されたトウモロコシ組織の生化学的・分子的な特性決定
多重形質転換実験は、操作したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＥＨＡ１０５（ｐＤＡＢ１０１５１３）株、ＤＡ２５５２（ｐＤＡＢ１０１５１３）株およびＤＡｔ１３１９２（ｐＤＡＢ１０１５１３）株を用いて実施した。トランスジェニックＴ０植物における４つの導入遺伝子のコピー数は遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用し、加水分解プローブアッセイ（BubnerおよびBaldwin, (2004) Plant Cell Rep. 23:263-271）により推定した。遺伝子の１〜３コピー（「低コピー」）を含む植物から得たタンパク質抽出物は、Ｂｔ Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ａｂタンパク質の産生について、またＡＡＤ１タンパク質について、工業生産された抗体キット（ＥＮＶＩＲＯＬＯＧＩＸ（商標）、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＡ）を使用するＥＬＩＳＡ法によってさらに試験した。４つのタンパク質をすべて産生するいくつかの植物が見つかった（表３）。さらに、植物の葉片を、摂食アッセイにおいて３種のトウモロコシ害虫：オオタバコガ（ＣＥＷ；Helicoverpa zea）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ；Spodoptera frugiperda）、およびアワノメイガ（ＥＣＢ；Ostrinia nubilalis）に対する活性をバイオアッセイした（実施例１４）。低コピー数に４つの導入遺伝子をすべて有し、４つのタンパク質をすべて産生し、３種の有害生物すべてに対する昆虫活性を有する、いくつかの植物が見つかった（表４）。これらの基準を満たす形質転換された植物は、ＥＨＡ１０５（ｐＤＡＢ１０１５１３）株またはＤＡ２５５２（ｐＤＡＢ１０１５１３）株を使用する実験からは得られなかった（表４）。したがって、染色体ｒｅｃＡ遺伝子の欠失を含み、ｐＴｉＥＨＡ１０５上に保持されているｐＴｉＢｏ５４２誘導ｖｉｒ遺伝子のフルセットをさらに含み、ｐＤＡＢ９２９２の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片上に保持されているｐＴｉＢｏ５４２誘導ｖｉｒ遺伝子の部分的セットをさらに含む、ＤＡｔ１３１９２株の特徴は、高度に反復された配列エレメントで構成されている大型Ｔ−ＤＮＡ領域で形質転換されたトウモロコシ植物を効率的に生産することができるということである。
ｐＤＡＢ１０１５１４で形質転換されたトウモロコシ組織の生化学的・分子的な特性決定
多重形質転換実験は、操作したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＥＨＡ１０５（ｐＤＡＢ１０１５１４）株、ＤＡ２５５２（ｐＤＡＢ１０１５１４）株およびＤＡｔ１３１９２（ｐＤＡＢ１０１５１４）株を用いて実施した。トランスジェニックＴ０植物における４つの導入遺伝子のコピー数は遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用し、加水分解プローブアッセイ（BubnerおよびBaldwin, (前掲)）により推定した。遺伝子の１〜３コピー（「低コピー」）を含む植物から得たタンパク質抽出物は、Ｂｔ Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ａｂタンパク質の産生について、またＡＡＤ１タンパク質について、工業生産された抗体キット（ＥＮＶＩＲＯＬＯＧＩＸ（商標）、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＡ）を使用するＥＬＩＳＡ法によってさらに試験した。さらに、植物から得た葉片を、摂食アッセイにおける３種のトウモロコシ害虫に対する活性についてバイオアッセイした（実施例１４）。低コピー数に４つの導入遺伝子すべて有し、４つのタンパク質をすべて産生し、３種の有害生物すべてに対する昆虫活性を有する、いくつかの植物が見つかった（表５）。これらの基準を満たす形質転換された植物は、ＥＨＡ１０５（ｐＤＡＢ１０１５１４）株またはＤＡ２５５２（ｐＤＡＢ１０１５１４）株を使用する実験からは得られなかった。したがって、染色体ｒｅｃＡ遺伝子の欠失を含み、ｐＴｉＥＨＡ１０５上に保持されているｐＴｉＢｏ５４２誘導ｖｉｒ遺伝子のフルセットをさらに含み、ｐＤＡＢ９２９２の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片上に保持されているｐＴｉＢｏ５４２誘導ｖｉｒ遺伝子の部分的セットをさらに含む、ＤＡｔ１３１９２株の特徴は、高度に反復された配列エレメントで構成されている大型Ｔ−ＤＮＡ領域で形質転換されたトウモロコシ植物を効率的に生産することができるということである。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４染色体中の中立組込み部位の同定および特性決定
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）Ｃ５８株染色体の植物誘導性ｐｉｃＡ／ｐｇｌ遺伝子座（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＡＥ０００９２４３）は、ＤＮＡ断片が組み込まれ得る非必須遺伝子であることが確認された（Rongら、(1990) J. Bacteriol. 172:5828-5836; Rongら、(1991) J. Bacteriol. 173:5110-5120）。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株のゲノム中の同様の中立組込み部位は未だ報告されていない。本発明者らは、Ｃ５８ ｐｉｃＡ／ｐｇｌ遺伝子座に部分的に相同な配列を含むＬＢＡ４４０４のゲノム領域の同定および配列決定について本明細書に記載する。ＬＢＡ４４０４（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）の細胞を、３０℃で終夜、ＹＭ培地（ｇｍ／Ｌ：酵母抽出物、０．４；マンニトール、１０；ＮａＣｌ、０．１；ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、０．２；Ｋ２ＨＰＯ４ ３Ｈ２Ｏ、０．５）で増殖させた。ゲノムＤＮＡを、製造者のプロトコルに従って、ＥＡＳＹ ＤＮＡ ｋｉｔ （ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用して１ｍＬ培養物から調製した。縮重プライマーは、Ｃ５８ ＰｉｃＡタンパク質配列とシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、カルジセルロシルプトル・サッカロリチクス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）、アルカリフィルス・メタリレジゲネス（Alkaliphilus metalliredigenes）およびクロストリジウム・アセトブチルイクム（Clostridium acetobutylicum）から同定された相同体との間の２つの相同領域に基づいて設計した。ＬＢＡ４４０４ゲノムＤＮＡは、ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標） ＭＡＳＴＥＲ ＭＩＸ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、および縮重プライマーＡｔｎｉｌＡ１Ｆａ（５’−ＧＡＣＡＧＴＣＣＮＡＡＴＡＣＳＧＡＹＧＧ−３’；配列番号１４；Ｃ５８ ＰｉｃＡタンパク質のアミノ酸２７３〜２７９に対応）およびＡｔｎｉｌＡ３Ｒ（５’−ＧＴＹＴＴＳＡＧＮＣＧＳＡＧＳＣＣＳＣＧＲＴＣＳＧＴ−３’；配列番号１５、Ｃ５８ ＰｉｃＡタンパク質のアミノ酸３６４〜３６９をコードしている相補鎖に対応）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に鋳型として使用した。使用する熱サイクル条件は以下のとおりであった：９４℃の１サイクル、２分；［９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、６０秒］の２５サイクル；７２℃の１サイクル、７分。プライマー配列中の縮重ヌクレオチドの呼称は、以下のようなＤＮＡヌクレオチドに対応する：Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｙ＝ＴまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；およびＳ＝ＣまたはＧ。２８５塩基対（ｂｐ）生成物が単離され、大腸菌（Escherichia coli）ＴＯＰ１０細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中のベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）へクローニングされ、ＤＮＡ配列が決定された。この配列は、Ｃ５８ ｐｉｃＡ遺伝子の領域と相同である（しかし同一ではない）ことが分かった（８５％の配列同一性）。また、それが示すＬＢＡ４４０４ゲノム領域を本明細書ではｎｉｌＡ断片と呼ぶ。
２８５ｂｐのＬＢＡ４４０４ ｎｉｌＡ断片に相補的な追加プライマーを、２８５ｂｐ配列の両端に隣接するゲノム断片のＰＣＲ増幅にアンカーとして使用されるように設計した。これらは、Ｃ５８ ｐｉｃＡ遺伝子の隣接領域の配列から設計されたプライマーとＰＣＲ反応で対になった。２８５ｂｐ配列内部から生じ、ｎｉｌＡ断片の両隣接領域へ広がる増幅された断片の配列が決定され、それを用いて後続のＰＣＲ反応の別プライマーを設計した。ＬＢＡ４４０４ゲノムＤＮＡ鋳型をプライマーｎｉｌＡ２Ｆ（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＣＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴ−３’；配列番号１６）およびｎｉｌＡ２Ｒ（５’−ＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡＣＧＡＣＣＡ−３’；配列番号１７）と一緒に使用し、約２キロ塩基（ｋｂｐ）のＰＣＲ断片を生成させ、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いてｐＣＲ（登録商標）−ＢＬＵＮＴ ＩＩ／ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）へクローニングし、プラスミドｐＤＯＷ３７１９を生成した（図２）。ｐＤＯＷ３７１９の挿入物断片の配列分析により１，７９６ｂｐ配列（配列番号１８）が得られたが、これは５３１個のアミノ酸の推定上のタンパク質をコードする最長のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいる。同一リーディングフレーム中のより短いＯＲＦは、５２３個のアミノ酸の推定上のタンパク質をコードする。ＬＢＡ４４０４の５２３個アミノ酸の推定上のタンパク質は、Ｃ５８ ＰｉｃＡタンパク質と８８％の類似性、８５％の同一性を示す。ＬＢＡ４４０４の５２３個アミノ酸の推定上のタンパク質に関するコード配列とＣ５８ ＰｉｃＡタンパク質に関するコード配列は８１％の同一性を有する。したがって、実質的にＣ５８ ｐｉｃＡ遺伝子から分化した推定上の遺伝子を含む、ＬＢＡ４４０４のｎｉｌＡ断片はゲノムセグメントを表す。本開示において、配列番号１８により表される１．８ｋｂｐのゲノム配列をｎｉｌＡ遺伝子座と称する。
複製のｃｏｌＥ１起源を有するプラスミドｐＤＯＷ３７１９は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）の細胞で自発的に自己複製することは予測されない。プラスミドｐＤＯＷ３７１９のＤＮＡを使用し、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＬＢＡ４４０４株の細胞を形質転換した。カナマイシン耐性（ｐＤＯＷ３７１９上に保持）に関する選択を行い、ＬＢＡ４４０４染色体中に、またｐＤＯＷ３７１９上に存在する１．８ｋｂｐ相同性領域により介在されている組換えによるＬＢＡ４４０４染色体へｐＤＯＷ３７１９を組み込まれた形質転換体を同定した。このような組込み事象により、ここで複製された１．８ｋｂｐ相同性領域によりそれぞれの側に隣接されているｐＤＯＷ３７１９ベクタープラスミド配列の線状コピーが作製される。カナマイシン耐性ＬＢＡ４４０４形質転換体が単離され、ＰＣＲ分析によりｐＤＯＷ３７１９の挿入に関してスクリーニングした。形質転換体のゲノムＤＮＡ調製物を、以下の５つのプライマーセットを用いるＰＣＲ反応における鋳型として使用した：ｉ）ｐＤＯＷ３７１９中の挿入物に隣接する、Ｍ１３Ｒプライマーと対になるＭ１３Ｆプライマー、ｉｉ）プライマーＡＳ４Ｒと対になるＭ１３Ｆプライマー（配列番号１８の残基１０４１〜１０６０に相補的な塩基を含む）、ｉｉｉ）プライマーＡＳ１０Ｒと対になるＭ１３Ｆプライマー（配列番号１８の残基１，３２０〜１，３３７に相補的な塩基を含む）、ｉｖ）プライマーＡＳ１１Ｒと対になるＭ１３Ｆプライマー（配列番号１８の残基１，３９１〜１，４０６に相補的な塩基を含む）、およびｖ）プライマーＡＳ９Ｆと対になるＭ１３Ｒプライマー（配列番号１８の６３４〜６４９の塩基を含む）。コントロール反応において、ｐＤＯＷ３７１９プラスミドＤＮＡが鋳型として使用された場合、これらのプライマーセットはすべて予想されるサイズの断片を増幅した。しかし、カナマイシン耐性ＬＢＡ４４０４形質転換体から得たゲノムＤＮＡが鋳型として使用された場合、Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒプライマー対を使用するＰＣＲは増幅産物を産出しなかった。このことは、完全ではない（組み込まれなかった）ｐＤＯＷ３７１９プラスミドＤＮＡがゲノムＤＮＡにより同時精製されなかったことを示唆する。別の４つのプライマー対を用いるゲノムＤＮＡ試料のＰＣＲ分析によって、予想されるサイズのＤＮＡ断片の産生が示された。これらの結果は、ＬＢＡ４４０４形質転換体のカナマイシン耐性がゲノムへ組み込まれたｐＤＯＷ３７１９ ＤＮＡにより付与されることを示唆している。
このような形質転換体［ＬＢＡ４４０４ｎｉｌＡ−ｉｎｔ１］の１つを使用して、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を形質転換するその株の能力に対するｎｉｌＡ遺伝子座へのゲノムの挿入が有する効果を試験した。ＰＡＴタンパク質（除草剤ＢＡＳＴＡ（商標）に対して耐性を付与する）をコードしている植物発現可能な遺伝子を含有する、バイナリーベクターｐＤＡＢ３７７９は、スペクチノマイシン耐性に関する選択性を持つ株ＬＢＡ４４０４ｎｉｌＡ−ｉｎｔ１株およびＬＢＡ４４０４株の細胞に形質転換した。次いで、これらの株は、WeigelおよびGlazebrook（前掲）の方法を使用して、アラビドプシス形質転換試験を実施するために使用した。２つの株で得られた形質転換率に相違は見出されなかった。したがって、本明細書に記載の実施形態および方法の特徴は、配列番号１８を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株の染色体ｎｉｌＡ遺伝子座への外来性ＤＮＡ断片の挿入は、こうした操作を行った株の増殖または植物形質転換能力に対して影響がないということである。
ＬＢＡ４４０４ ｎｉｌＡ遺伝子座へ組込みを行うためのｐＤＯＷ３７１９の自殺誘導体の構築
ｐＤＯＷ３７１９でクローニングされたｎｉｌＡ遺伝子座中の多重クローニング部位の挿入は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Hortonら、(1990) BioTechniques 8:528-535）により達成した。ＳＯＥ ＰＣＲ反応は、製造者のプロトコルに従って、ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標）マスターミックスを使用して行った。ｎｉｌＡ遺伝子座の一部分は、ｐＤＯＷ３７１９ ＤＮＡを鋳型として、プライマーｎｉｌＡ＿ＭＣＳ＿ＳＯＥＲ（５’−ＧＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡ ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＡＧＣＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣ−３’；配列番号２０）と対になるプライマーｎｉｌＡ５’（５’−ＣＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣ−３’；配列番号１９）と一緒に使用して増幅し、約８００ｂｐの断片を得た。ｎｉｌＡ遺伝子座の第２の部分は、鋳型としてｐＤＯＷ３７１９ ＤＮＡ、およびプライマーｎｉｌＡ３’（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＧＧＧＴＴＴＴＣＴＣＧ−３’；配列番号２２）と対になるプライマーｎｉｌＡ＿ＭＣＳ＿ＳＯＥＦ（５’−ＧＣＡＡＴＧＴＣＧＧＧＣＴＴＴＴＣＧＧ ＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＣ−３’；配列番号２１）を使用して増幅し、約９００ｂｐの断片を得た。次いで、得られた断片をゲル精製し（ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（商標）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プライマーｎｉｌＡ５’およびｎｉｌＡ３’と一緒に鋳型として増幅に使用し、１．６ｋｂｐの断片を得た。この配列は配列番号２３として開示する（ｎｉｌＡ ＭＣＳ）。得られた断片はＰｖｕ ＩおよびＳａｐ Ｉ（ＮＥＢ）で消化し、同一制限酵素で消化したｐＢＣＳＫ＋ｓａｃＢＩ ＤＮＡ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用してライゲートした。大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０細胞をこのライゲーション混合物で形質転換し、形質転換体を、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール補充のＬＢ大豆寒天培養基（ＴＥＫＮＯＶＡ；Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）上で選択した。クローンは、Ｐｖｕ ＩおよびＫｐｎ Ｉ（ＮＥＢ）を使用する制限消化によってスクリーニングした。陽性クローンのｎｉｌＡ遺伝子座領域は確認された配列であり、得られたプラスミドはｐＤＯＷ３７２１と命名した。ｐＤＯＷ３７２１の特徴は、制限酵素Ｓｐｈ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｐａｃ Ｉ、Ａｓｅ ＩおよびＸｂａ Ｉに対する認識配列を含有する多重クローニング部位（ＭＣＳ）が、８５２ｂｐのＬＢＡ４４０４誘導塩基により１つの側に隣接されており、７４５ｂｐのＬＢＡ４４０４誘導塩基によりもう１つの側に隣接されていることである。
したがって、外来性ＤＮＡ断片はｐＤＯＷ３７２１のＭＣＳへクローニングし、それから、ＬＢＡ４４０４誘導隣接配列により介在される相同組換えによってＬＢＡ４４０４の染色体ｎｉｌＡ遺伝子座へ組み込むことができる。このｐＤＯＷ３７２１プラスミド配列全体をＬＢＡ４４０４染色体へ組み込む手段による、単一クロスオーバー事象は、スクロース含有培養基上の対抗選択によって二重クロスオーバー事象へ分けることができる。このような培養基では、スクロースは、ｓａｃＢ遺伝子によってコードされているＳａｃＢタンパク質によって酵素性分解の際に毒性生成物に変換される（ReidおよびCollmer, (1987) Gene 57:239-246; Quandtら、(1993) Gene 127:15-21）。したがって、スクロース含有増殖培地上で生存し得る形質転換体は、組み込まれた外来性ＤＮＡ断片を含有する破壊ｎｉｌＡ遺伝子座を残して、染色体からｐＤＯＷ３７２１プラスミドベクター骨格を除く、第２のクロスオーバー事象を経ている。ベクター骨格配列の導入がかなり一般的であるという多くの報告が過去１０年間に開示されている。形質転換体で骨格配列が得られる植物の割合は典型的には２０％〜５０％の間の範囲にあり、時に、７５％以上の高い割合があった。
ｐＤＯＷ３７２１の有用性の１つの例証として、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片をプラスミドｐＳＢ１から調製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、Ｋｐｎ Ｉで消化したｐＤＯＷ３７２１ ＤＮＡへライゲートした。大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０細胞がこのライゲーション混合物で形質転換され、形質転換体が３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール補充のＬＢ大豆寒天培養基上で選択された。クローンは、ＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを用いる制限消化によってスクリーニングした。得られたプラスミドはｐＤＯＷ３７２２と命名した。
ｎｉｌＡの上流および下流のヌクレオチド配列の同定
プラスミドｐＤＯＷ３７１９のゲノム組込みを含有している（図２および実施例１８）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＬＢＡ４４０４ｎｉｌＡ−ｉｎｔ１株を使用して、ｎｉｌＡゲノム領域の上流および下流に位置している付加配列を同定した。ｐＤＯＷ３７１９は、ＰＣＲ−ＢＬＵＮＴ ＩＩ／ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）へクローニングされたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株ｎｉｌＡ遺伝子座の１，７９６ｂｐのＰＣＲ増幅産物を含有する。このプラスミドは、相同組換えによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株のゲノムへ組み込まれた。この組込みプラスミドを含有したコロニーは、カナマイシンに対する耐性により同定した（実施例１７）。この組込みプラスミド、またその内部に含有されたエレメントは、「プラスミドレスキュー」技術による付加ヌクレオチド配列の単離および特性決定にツールとして使用することができる。
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、細菌性ゲノムＤＮＡ単離のプロトコル（Sambrookら、前掲）によってＬＢＡ４４０４ｎｉｌＡ−ｉｎｔ１株の細胞から調製した。１マイクログラムのｇＤＮＡを以下の酵素（すべてＮＥＢから得られたもの）で個別に消化した：Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ａｓｃ ＩおよびＳａｃ ＩＩ。これらの制限酵素は、ｎｉｌＡ遺伝子座の上流および下流にマップするｇＤＮＡ断片を特異的に得るために選択された。認識部位がｐＤＯＷ３７１９配列内に特有であることから、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＢａｍＨ ＩおよびＰｓｔ Ｉの制限酵素が選択された。さらに、これらの酵素認識部位は、ｎｉｌＡ遺伝子座増幅産物断片とＰＣＲ−ＢＬＵＮＴ ＩＩ／ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターの間の結合点に配置されている（図２）。したがって、これらの酵素によるｇＤＮＡの切断と得られた断片の自己ライゲーションにより、ｐＤＯＷ３９１７プラスミドのＭ１３フォワードユニバーサルプライマーまたはＭ１３リバースユニバーサルプライマー結合部位に隣接してライゲートされている、特性決定されていないゲノム配列を含有するプラスミドレスキュー断片が生じる。このようなクローンは、ｐＤＯＷ３９１７により保持されているカナマイシン耐性遺伝子に対する選択で、ライゲーション混合物を大腸菌（E. coli）細胞に形質転換することにより単離される。
さらに、ｐＤＯＷ３７１９プラスミドは、Ａｓｃ ＩおよびＳａｃ ＩＩ制限酵素に対する認識部位を含有していない。したがって、これらの制限酵素により生成されるｇＤＮＡ断片は、組込みｐＤＯＷ３７１９プラスミド配列の全長に及び、組込みｐＤＯＷ３７１９プラスミドの両側に隣接するｇＤＮＡ領域を含む、キメラＤＮＡ断片を生成する。
上記のような制限酵素消化から得られたｇＤＮＡ断片は、Ｔ４リガーゼ（ＲＯＣＨＥ ＡＰＰＬＩＥＤ ＳＣＩＥＮＣＥＳ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、自己ライゲートされた。ライゲーション生成物は、大腸菌（E. coli）ＯＮＥＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０ ＣＥＬＬＳ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に形質転換され、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地上で平板培養した。個別のコロニーが選択され、プラスミドＤＮＡが単離され、プラスミド制限酵素消化パターンにより特性決定された。相互に比較した場合に一貫した制限酵素消化バンドパターンを示すプラスミドを含有するクローンを、シークエンシング反応で使用するために用いた。
ｎｉｌＡ遺伝子座から得たｇＤＮＡの上流および下流のヌクレオチド配列は、「ゲノムウォーキング」技術を使用して決定した。知られているｇＤＮＡ配列に対応するシークエンシングプライマー（ｐＤＯＷ３７１９中に存在する場合）が設計され、製造者（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）の情報に従い、ＣＥＱ（商標） ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ ＣＹＣＬＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＫＩＴを使用した。決定した配列から、以前は未知であったゲノム配列に配置されている、第２のプライマーのセットを設計し、追加のシークエンシングデータを得るために使用した。利用可能なｇＤＮＡヌクレオチド配列がすべて決定されるまで、この方法を繰り返した。この技術により、ｎｉｌＡ遺伝子座から上流の２，９３６ｂｐの配列と、ｎｉｌＡ遺伝子座から下流の４，３６１ｂｐの配列を得た。以前に同定されたｎｉｌＡ遺伝子座の１，７９６ｂｐと組み合わせて、新しく同定された上流および下流の隣接配列領域は、ｎｉｌＡゲノム領域を含む９，０９３ｂｐの配列（配列番号２４）をカバーし、これは、もともと同定されているｎｉｌＡ遺伝子座から両方向に伸展している。
ＬＢＡ４４０４ ｎｉｌＡゲノム領域へ組込みを行うためのベクターの構築
外来性ＤＮＡ配列のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＬＢＡ４４０４ ｎｉｌＡのゲノム領域への相同性による組込みを行うための組込みベクターを設計し、構築した。ｎｉｌＡ遺伝子座にまたがるｎｉｌＡゲノム領域の６．３ｋｂｐの断片は、ＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標） ＰＣＲ ＫＩＴ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用し、ＰＣＲ増幅した。増幅した断片は、ＰＣＲ（登録商標）８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）へライゲートされ、陽性クローンが制限酵素消化およびＤＮＡ塩基配列検証により確認された。得られたベクター、ｐＤＡＢ９６１５は、特有の重複制限酵素認識部位を含有するオリゴヌクレオチド断片の付加によりさらに改変させた。ｎｉｌＡゲノム領域の３，２４４ｂｐ領域および３，１２８ｂｐ領域により隣接されている、これらの制限部位は、外来性ヌクレオチド配列を導入するためのクローニング部位として有用である。得られたベクターはｐＤＡＢ９６１８と命名した（図３）。
ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片および細菌性カナマイシン耐性遺伝子を含有する１５，５４９ｂｐ断片を、Ｋｐｎ ＩプラスＢｓｔ１１０７ ＩでｐＤＡＢ９２９２ ＤＮＡを消化することにより調製した。次いで、この断片を、Ｋｐｎ ＩプラスＳｗａ Ｉで消化したｐＤＡＢ９６１８のＤＮＡにライゲートし、ベクターｐＤＡＢ９６２１を得た（図３）。次いで、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）反応を使用して、３ｋｂｐのＬＢＡ４４０４ ｎｉｌＡゲノム領域配列によりそれぞれの側に隣接されている、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片および細菌性カナマイシン耐性遺伝子を含有するｐＤＡＢ９６２１の部分を、ＡＮ Ｌ−Ｒ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）によりＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標） ＰＤＥＳＴ（商標）１４ベクターへ移入した。得られたプラスミド、ｐＤＡＢ９６９８（図３、配列番号２５）が制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシング反応により確認された。ｐＤＡＢ９６９８は、（１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片上に保持されている）ｐＳＢ１由来のｐＴｉＢｏ５４２誘導ｖｉｒ遺伝子をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株のｎｉｌＡ染色体領域へ組み込むために組込みベクターとして利用した。
相同組換えによる１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片の染色体組込み
プラスミドｐＤＡＢ９６９８のＤＮＡは、ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ（登録商標）ＡＸ ＡＮＩＯＮ ＥＸＣＨＡＮＧＥ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＰＬＡＳＭＩＤ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を使用して得た。この精製プラスミドＤＮＡを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＬＢＡ４４０４ ＣＥＬＬＳ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）へエレクトロポレートした。簡潔に説明すると、５００ｎｇのプラスミドＤＮＡをこれらの細胞と４℃で１０分間インキュベートした。この混合物を、氷冷した０．２ｃｍのＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）ＣＵＶＥＴＴＥ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）へピペットで移し、以下の設定でＢＩＯ−ＲＡＤ ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲを使用してエレクトロポレートした：キャパシタンスアウトプット２５μＦａｒａｄ、キャパシタンスエクステンダー９６０μＦａｒａｄ、抵抗２００オーム、および電圧２．５ｋＶ。エレクトロポレーション直後に、９５０μＬのＳＯＣ培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を加え、その混合物をＦａｌｃｏｎ２０５９チューブ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯ．；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に移した。次いで、形質転換細胞を２８℃で５〜６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含有の個別のＹＥＰ中板上で平板培養した。プレートを逆さにして２８℃で３６〜４８時間増殖させた。単一コロニーを選抜し、２８℃で約３６時間、５ｍＬのカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含有液体ＹＥＰ中で増殖させた。これらの培養物を使用して、等量の１００％滅菌済みグリセロールとの激しい混合によってグリセロールストック培養物を調製した後、−８０℃で凍結保存した。
１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片の染色体組込みの表現型および分子の確認
複製のｃｏｌＥ１起源を有するｐＤＡＢ９６９８は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）細胞で自発的に自己複製するとは予想されない。したがって、ｐＤＡＢ９６９８ ＤＮＡのＬＢＡ４４０４細胞への形質転換に際して、安定性のあるカナマイシン耐性は、ｐＤＡＢ９６９８のＤＮＡの自発的に自己複製するアグロバクテリウム（Agrobacterium）遺伝因子への組込みから得られる。これらのプラスミド組込み体は、本明細書に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株およびそれらを使用するための方法に関する各種実施形態に従って使用することができる、４つのクラスに分類される。第１のクラスは、ｐＤＡＢ９６９８ ＤＮＡが非相同性組換えによりｎｉｌＡゲノム領域から遠位へ組み込まれた細胞を含む。これらの細胞は、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片に隣接するカナマイシン耐性遺伝子によりカナマイシン耐性であるはずであり、さらに、ｐＤＡＢ９６９８骨格ベクター（ｐＤＥＳＴ（商標）１４）に保持されているアンピシリン耐性遺伝子によりアンピシリンに耐性があるはずである。第２のクラスは、ｐＤＡＢ９６９８に存在するｐＴｉＢｏ５４２誘導ＶｉｒＢＣＤＧ遺伝子およびｐＡＬ４４０４に存在するｐＴｉＡＣＨ５誘導ＶｉｒＢＣＤＧ遺伝子により介在される相同組換えによって、ｐＤＡＢ９６９８ ＤＮＡが自発的に自己複製するｐＡＬ４４０４ Ｔｉヘルパープラスミド（本来ＬＢＡ４４０４内に存在する）へ組み込まれた細胞を含む。これらの細胞もまた、カナマイシンおよびアンピシリンの両方に耐性があるはずである。第３のクラスは、ｐＤＡＢ９６９８に保持されている約３ｋｂｐのｎｉｌＡゲノム領域配列、ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片およびカナマイシン耐性遺伝子を含有する１５，５４９ｂｐ断片に隣接するもののいずれかにより介在される単一相同組換え（クロスオーバー）事象によって、ｐＤＡＢ９６９８ ＤＮＡがＬＢＡ４４０４ ｎｉｌＡゲノム領域へ組み込まれた細胞を含む。これらの細胞もまた、カナマイシンおよびアンピシリンの両方に耐性があるはずである。第４のクラスは、上記の第３のクラスの細胞の単一クロスオーバー事象が、単一クロスオーバー事象の結果として生じるここで複製された３ｋｂｐのｎｉｌＡゲノム領域配列により介在される第２のクロスオーバー事象を経る細胞を含む。単一クロスオーバー事象を生じる隣接する３ｋｂｐのｎｉｌＡゲノム領域配列のいずれかに依存して、また第２のクロスオーバー事象を生じるこれらの隣接する配列のいずれかに依存して、得られた細胞は、カナマイシン感受性であるかアンピシリン耐性のいずれかであり、またはカナマイシン耐性およびアンピシリン感受性であるはずである。本明細書に記載の好ましい細胞は後者のクラス、すなわち、カナマイシン耐性およびアンピシリン感受性である細胞を含む。ｐＤＥＳＴ（商標）１４プラスミド骨格を含有しない、これらの二重クロスオーバーの事象は、これらが余分の遺伝因子、例えばｃｏｌＥ１複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有していないので望ましい。
実施例２１で単離された推定上の形質転換体は、望ましい二重相同組換えによる組込み事象のためにスクリーニングした。ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片およびカナマイシン耐性遺伝子を含有しており（またｐＤＥＳＴ（商標）１４ベクター骨格を欠損している）１５，５４９ｂｐ断片を有するカナマイシン耐性単離物は、アンピシリンに対する感受性により同定した。推定上の形質転換体は、２８℃で約３６時間、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＹＥＰ３ｍＬで増殖させた。次いで、これらの培養物は、以下（μｇ／ｍＬの濃度）のような各種の単一抗生物質を含有する固体ＹＥＰ培地上に平板画線した：リファンプシン（Rifampcin）、１００；カナマイシン、５０；ストレプトマイシン、１２５；クロラムフェニコール、５０；エリスロマイシン、２００；テトラサイクリン、１２．５；およびアンピシリン、１００。プレートを２８℃で４８時間インキュベートし、コロニー増殖を記録した。カナマイシン、リファンピシン（染色体マーカー）およびストレプトマイシンに耐性があった株が同定された（ｐＡＬ４４０４マーカー；Oomsら、前掲）。さらに、この株はクロラムフェニコール、エリスロマイシンおよびテトラサイクリンに感受性であった。最も重要なのは、この株はアンピシリン感受性であった。この薬剤スクリーニング表現型は望ましい二重クロスオーバー相同組換え事象を示すが、この場合、ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片およびカナマイシン耐性遺伝子を含有する１５，５４９ｂｐ断片は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＬＢＡ４４０４染色体へ組み込まれる。この株はＤＡｔ１６１７４と称する。
ＤＡｔ１６１７４株のｐＴｉＢｏ５４２誘導ＶｉｒＢＣＤＧ遺伝子の存在は、分子の特性決定によりさらに確認した。ＤＡｔ１６１７４株のゲノムＤＮＡは、細菌性ゲノムＤＮＡ単離プロトコルを使用して単離した（Sambrookら、前掲およびそれらの最新情報）。ＰＣＲプライマーは、染色体に組み込まれたＶｉｒＢＣＤＧ遺伝子のオーバーラッッピング断片を増幅するように設計した。表６に記載のプライマーを使用するＰＣＲ反応は、製造者の指示によりＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標） ＰＣＲ ＫＩＴ （ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標））を使用して完了した。組込みＶｉｒＢＣＤＧ遺伝子の総分子サイズが大きいため、５つのオーバーラップ断片が得られるように増幅を行った。予想されるサイズの増幅産物を、製造者のプロトコルに従い、ＱＩＡＥＸ ＩＩ ＧＥＬ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＫＩＴ （ＱＩＡＧＥＮ；Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、アガロースゲルから精製した。これらの断片は、ＰＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ ＣＬＯＮＩＮＧ（登録商標） ＫＩＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用して、ＰＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡベクターへクローニングした。ＰＣＲ増幅産物のクローンを含有すると思われる細菌コロニーは、制限酵素消化により確認した。増幅産物断片のＤＮＡ配列は、ＣＥＱ（商標）ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ ＣＹＣＬＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＫＩＴを使用し、製造者の使用説明書に従って決定し、シークエンシングデータは、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）バージョン４．１．４ソフトウェア（ＧＥＮＥ ＣＯＤＥＳ ＣＯＲＰ．；Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して分析した。得られた配列は、ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片およびカナマイシン耐性遺伝子、プラス、ｎｉｌＡのゲノム領域に隣接する約３ｋｂｐの両配列を含有する全１５，５４９ｂｐ断片にまたがり、ｎｉｌＡゲノム領域の上流および下流へさらに伸展している、２２ｋｂｐの連続配列を生じた（これにより、ｐＤＡＢ９６９８に本来含有されていなかったＬＢＡ４４０４染色体配列を含む）。
ＤＡｔ１６１７４株のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）同定は、ケトラクトース試験により確認した。推定上の形質転換コロニーはラクトース寒天上で平板画線を行い、２８℃で４８時間インキュベートした。次いで、プレートをベネディクト溶液で浸し、室温でモニターした。ベネディクト溶液と下層の寒天が青色から黄色に変化した単離物は、これによりアグロバクテリウム（Agrobacterium）であると確認した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＤＡｔ１６１７４株の特徴は、例えば、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＷまたはＶＳ１のクラスの複製起点を有するバイナリーベクターからＴ−ＤＮＡ遺伝子を移入するための植物形質転換剤として有利に使用することができることである。広義には、導入バイナリーベクターは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）中の任意の複製可能なクラスの複製起点を有していてもよく、一方、ＤＡｔ１６１７４にあるｐＡＬ４４０４プラスミドの複製（および関連する機能）のｐＴｉ起点と適合し得る。したがって、プラスミドが適合可能な複製起点を有する場合（すなわち、異なる不和合性グループである場合）、複数のバイナリーベクタープラスミドはＤＡｔ１６１７４株中に同時存在していてもよいことは、ＤＡｔ１６１７４株の使用可能な範囲内である。このような導入バイナリーベクターの選択は、カナマイシン、リファンピシンまたはストレプトマイシン耐性のいずれかを付与する細菌性選択可能なマーカー遺伝子に依存するべきではない。なぜならＤＡｔ１６１７４株がこれらの３つの抗生物質に耐性であるからである。
バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の両方で自発的に自己複製することができる。これらは、形質転換植物細胞、クローニングリンカー、クローニングポリリンカー、または植物細胞形質転換の対象とされている遺伝子に対する導入部位として機能し得る別の配列の選択に機能する選択可能なマーカー遺伝子を含み得る、Ｔ−ＤＮＡ右側境界反復および左側反復領域により囲まれている配列を含む。これらは、エレクトロポレーションによって、細菌接合で導入される、化学的介在性直接ＤＮＡ形質転換によって、または別の方法によって、アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞に直接形質転換することができる。宿主細胞として使用されるアグロバクテリウム（Agrobacterium）は、ｖｉｒ領域を有する少なくとも１個のプラスミドを保持する。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への移入に関与するすべての必要条件機能を果たすＶｉｒタンパク質を提供するのに必要である。一般に、ｖｉｒ領域を有するプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ領域（Ｔ−ＤＮＡ右側および左側境界反復を含む）が欠失した、変異型ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド（ヘルパープラスミド）である。ヘルパープラスミドを含有しており、植物形質転換に有用なアグロバクテリウム（Agrobacterium）株の例としては、例えば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）、ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０ＲＫ）、ＧＶ２２６０、ＧＶ３８５０、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５およびＡＧＬ１が挙げられる。バイナリーベクター系の多くの例がHellensら（2000, Trends Plant Sci. 5:446-451）により論じられている。
さらに、ｐＳＢ１プラスミド上に保持されている、ｐＴｉＢｏ５４２誘導ｖｉｒＢオペロン（遺伝子ｖｉｒＢ１、ｖｉｒＢ２、ｖｉｒＢ３、ｖｉｒＢ４、ｖｉｒＢ５、ｖｉｒＢ６、ｖｉｒＢ７、ｖｉｒＢ８、ｖｉｒＢ９、ｖｉｒＢ１０およびｖｉｒＢ１１を含む）、ｖｉｒＧ遺伝子、ｖｉｒＣオペロン（遺伝子ｖｉｒＣ１およびｖｉｒＣ２を含む）、および遺伝子ｖｉｒＤ１を含むｖｉｒＤオペロンの一部により［スーパーバイナリー系で使用される］ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）株に付与された植物形質転換の利点は、ＤＡｔ１６１７４株に保持される。上記で列挙したスーパーバイナリーｖｉｒ遺伝子はＬＢＡ４４０４染色体へ組み込まれるので、ＤＡｔ１６１７４株はＳＵＰＥＲＣＨＲＯＭＥ株と呼ばれる。スーパーバイナリー系とは反対に、ＤＡｔ１６１７４株を使用する場合、ｐＳＢ１とｐＳＢ１１などのシャトルベクターの間の相同組換えによる不安定なスーパーバイナリープラスミドの形成は必要とされない。ＳＵＰＥＲＣＨＲＯＭＥ株のさらなる利点は、植物形質転換において標準バイナリーベクターがこの株へ導入され得るということである。
ｐＤＡＢ１０１５５６を保持する各種アグロバクテリウム（Agrobacterium）株で形質転換されたトウモロコシ組織の生化学的および分子的特性決定
バイナリー植物形質転換ベクター、ｐＤＡＢ１０１５５６（図５）は、標準クローニング方法およびＧＡＴＥＷＡＹ（商標）技術の組み合わせにより構築した。バイナリーベクターｐＤＡＢ１０１５５６はプラスミドＲＫ２のＩｎｃＰタイプ複製起点に基づき、そのベクター骨格は、１００μｇ／ｍＬでスペクチノマイシンに対する耐性を付与する細菌遺伝子を保持する。Ｔ−ＤＮＡ境界反復は、ｐＴｉ１５９５５のＴＬ領域由来である。プラスミドｐＤＡＢ１０１５５６のＴ−ＤＮＡ領域の右側境界（ＲＢ）および複数の左側境界（ＬＢ）内には、位置している２つの植物発現可能なタンパク質コード配列（ＣＤＳ）がある。第１の遺伝子（選択可能なマーカー）は、ＡＡＤ１選択可能なマーカータンパク質に対するコード領域（配列番号１３）（米国特許第７，８３８，７３３号）を含むが、これは関連するイントロン１を含む１，９９１ｂｐのトウモロコシユビキチン１プロモーターの転写調節の下にある（米国特許第５，５１０，４７４号）。この遺伝子はトウモロコシリパーゼ３’ＵＴＲにより終止する（米国特許第７，１７９，９０２号）。第２の遺伝子（選択可能なマーカー）は、黄色蛍光タンパク質（実質的に米国特許第７，９５１，９２３号に開示されているようなＹＦＰ）に対するＣＤＳを含み、この転写は、関連するイントロン１とともにトウモロコシユビキチン１プロモーターにより調節される。この遺伝子はトウモロコシＰｅｒ５ ３’ＵＴＲによって終止する（米国特許第６，３８４，２０７号）。
プラスミドｐＤＡＢ１０１５５６は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＬＢＡ４４０４株の細胞へ順調に導入され、ＬＢＡ４４０４（ｐＤＡＢ１０１５５６）株を得た。したがって、この株／プラスミドの組み合わせは、標準バイナリー植物形質転換系を含む。ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性により選択された形質転換体は、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。ＬＢＡ４４０４（ｐＤＡＢ１０１５５６）株のバルク細胞は、凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例２４で開示の方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。
プラスミドｐＤＡＢ１０１５５６は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＤＡｔ１３１９２株の細胞へ順調に導入され（実施例７を参照）、ＤＡｔ１３１９２（ｐＤＡＢ１０１５５６）株を得た。したがって、この株／プラスミドの組み合わせは、組換え欠損のあるターナリー植物形質転換系を含む。エリスロマイシン、カナマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択される形質転換体はプラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。ＤＡｔ１３１９２（ｐＤＡＢ１０１５５６）株のバルク細胞は、凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例２４で開示の方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。
ＤＡｔ２０７１１株へプラスミドｐＤＡＢ１０１５５６のＤＮＡを導入するいくつかの試みがなされた（実施例９を参照）（組換え能の高いターナリー系）。すべての事例において、プラスミドｐＤＡＢ１０１５５６がこの株では不安定であることが判明し、Ｄａｔ２０７１１（ｐＤＡＢ１０１５５６）株は構築されなかった。
プラスミドｐＤＡＢ１０１５５６は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＤＡｔ１６１７４株（実施例２２）の細胞へ順調に導入され、ＤＡｔ１６１７４（ｐＤＡＢ１０１５５６）株が得られた。したがって、この株／プラスミドの組み合わせは、ＳＵＰＥＲＣＨＲＯＭＥ／バイナリー植物形質転換系を含む。ストレプトマイシン、カナマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択された形質転換体はプラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。ＤＡｔ１６１７４（ｐＤＡＢ１０１５５６）株のバルク細胞は、凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例２４で開示の方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。
バイナリーベクターｐＤＡＢ１０１５５６を保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株によるトウモロコシの形質転換
未熟胚生産。同系交配されたＢ１０４から得た種子を、ＭＥＴＲＯ ＭＩＸ ３６０（ＳＵＮ ＧＲＯ ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ Ｉｎｃ．；Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）を入れた３．５インチＳＶＤ鉢に植えた。植物がＶ４〜Ｖ５の成長段階に達したとき、添加剤として２０グラムのＯＳＭＯＣＯＴＥ １９−６−１２と２０グラムのＩＲＯＮＩＴＥ（商標）を含む、ＭＥＴＲＯ ＭＩＸ ３６０とＰＲＯＦＩＬＥ ＧＲＥＥＮＳ ＧＲＡＤＥ焼成粘土（ＰＲＯＦＩＬＥ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＬＬＣ；Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を１：１の混合で入れた４ガロン鉢へ移植した。外部光線が４５０Ｗ／ｍ２を超えないならば、１６：８の明光／暗光光周期になるまで１０００ＷのＨＰＳ（高圧ナトリウム）および１０００ＷのＭＨ（金属ハロゲン化物）ランプセットの組み合わせを使用し、植物を温室で成長させた。形質転換用の未熟胚を得るために、同胞コントロールまたは自己受粉を行った。
胚が約１．６〜２．０ｍｍのサイズであった場合、未熟胚は受粉後１０〜１３日で単離した。
感染および共培養。トウモロコシ穂は、２０分間、ＬＩＱＵＩＮＯＸ（商標）洗剤（５００ｍＬ当たり１または２滴）を入れた市販の２０％漂白液に浸漬することによって表面殺菌し、滅菌水で３回すすいだ。バイナリーベクターｐＤＡＢ１０１５５６を含有しているアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の懸濁液は、２０℃で２〜３日間、ＡＢ固形培地上で増殖した後、２８℃で１〜２日間、ＹＥＰ固形培地上で増殖した細菌から調製した。ＡＢおよびＹＥＰの両培地は、バイナリーベクターｐＤＡＢ１０１５５６で試験した各アグロバクテリウム（Agrobacterium）株について実施例２３で記載したような適切な補充抗生物質を含有していた。ＹＥＰプレートから掻き取った白金耳量の細胞を、ＭＳ塩（Frameら、前掲）、ＩＳＵ改変ＭＳビタミン（Frameら、前掲）、３．３ｍｇ／Ｌのジカンバエタノール、６８．４ｇｍ／Ｌのスクロース、３６ｇｍ／Ｌのグルコース、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリンを含み（ｐＨ５．２）、１００〜２００μＭのアセトシリンゴンを含有する、１０〜１５ｍＬの液体感染培地へ移植した。この溶液は、均一な懸濁液になるまで、滅菌済み５ｍＬピペットまたはボルテックスミキサーを使用して上下に穏やかにピペットで移し、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｐ８４５２ａ分光光度計を使用して、６００ｎｍで約１．０の吸光度（ＯＤ６００）まで濃度を調節した。
共培養。未熟胚は、２ｍＬの感染培地を含有しているミクロ遠心分離管へ直接単離した。培地が除去され、１〜２ｍＬの新鮮な感染培地と置き換えられた後、１．５ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液と置き換えられた。アグロバクテリウム（Agrobacterium）および胚の溶液を室温で５分間インキュベートし、次いで、共培養培地（ＭＳ塩、ＩＳＵ改変ＭＳビタミン、３．３ｍｇ／Ｌのジカンバエタノール、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン酵素加水分解物、１５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、１００〜２００μＭのアセトシリンゴン、および２．３ｇｍ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥ（商標）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ；Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有、ｐＨ５．８）に移した。共培養インキュベーションは、３日間、２０℃の暗所にて行った。
休止および選択。共培養後、胚は、非選択ＭＳベース休止培地（ＭＳ塩、ＩＳＵ改変ＭＳビタミン、３．３ｍｇ／Ｌのジカンバエタノール、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン酵素加水分解物、１５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ、２５０ｍｇ／Ｌのセホタキシム、および２．３ｇｍ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥ（商標）を含有、ｐＨ５．８）に移した。インキュベーションは、７日間、２８℃で暗所にて継続した。７日の休止期の後、胚を選択培地に移した。植物で発現し得るａａｄ−１選択可能なマーカー遺伝子を含有するスーパーバイナリーまたはバイナリープラスミドで形質転換されたトウモロコシ組織を選択するため、ＭＳベースの休止培地（上述）をハロキシホップを補充して使用した。まず、１００ｎＭのハロキシホップを含有する選択培地Ｉに胚を移し、２週間インキュベートし、次いで、５００ｎＭのハロキシホップを含む選択培地ＩＩに移し、さらに２週間インキュベートした。形質転換された単離物は、２８℃の暗所で約５週間かけて得た。必要ならば、回収された単離物は、さらに２週間、新しい選択培地ＩＩに移すことによりバルクアップし、その後、再生培地に移した。
トウモロコシ形質転換分野の当業者には、別の植物で発現し得る選択可能なマーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）が用いられる場合、形質転換植物の別の選択方法が利用可能であることが理解されよう。
再生Ｉ。選択ステップの後、培養物を、ＭＳ塩、ＩＳＵ改変ＭＳビタミン、６０ｇｍ／Ｌのスクロース、３５０ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、５０ｍｇ／Ｌのカゼイン酵素加水分解物、１ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセホタキシム、２．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥ（商標）および５００ｎＭのハロキシホップを含有するＭＳベースの再生培地Ｉ（ｐＨ５．８）に移した。インキュベーションは、２８℃の暗所で２週間継続した。
再生ＩＩ。培養を、ｐＨ５．８で、ＭＳ塩、ＩＳＵ改変ＭＳビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、２５０ｍｇ／Ｌのセホタキシム、２．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥ（商標）、および５００ｎＭのハロキシホップを含有するＭＳベースの再生培地ＩＩに移した。２８℃で３週間、白色蛍光条件（約８０μＥｍ−２ｓ−１）で、１６／８時間の光周期下に置いた後、苗を切除し、ＭＳ塩（または１／２ＭＳ塩）、ＩＳＵ改変ＭＳビタミン、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、２．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥ（商標）からなるＭＳベースのまたは（１／２ＭＳベースの）シュート／根伸長培地（ｐＨ５．８）に移した。苗が長さ４〜６ｃｍに達したとき、これらをグロースチャンバーに、最終的には温室に移した。
種子生産。再生された植物は、ＭＥＴＲＯ ＭＩＸ ３６０を入れた３．５インチのＳＶＤ鉢へ移植し、グロースチャンバーに置いて慣れさせた。植物がＶ３成長段階に達したときに、これらを温室に移し、Ｖ４／Ｖ５の成長段階で、添加剤として２０グラムのＯＳＭＯＣＯＴＥ １９−６−１２と２０グラムのＩＲＯＮＩＴＥ（商標）を含む、ＭＥＴＲＯ ＭＩＸ ３６０およびＰＲＯＦＩＬＥ ＧＲＥＥＮＳ ＧＲＡＤＥ焼成粘土を１：１の混合で含有する、５ガロンの鉢へこれらを移した。植物は、１６：８の明光／暗光光周期下の温室で成長させた。Ｔ１種子が調節受粉を行うことにより生成された（Ｂ１０４への戻し交雑）。種子は、受粉の６週間後に回収した。
操作したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＬＢＡ４４０４（ｐＤＡＢ１０１５５６）株、ＤＡｔ１３１９２（ｐＤＡＢ１０１５５６）株およびＤＡｔ１６１７４（ｐＤＡＢ１０１５５６）株を用いて、多重トウモロコシ形質転換実験を実施し、ハロキシホップの阻害濃度で選択したトランスジェニックカルスをこれ以降の苗再生とさらなる試験のために得た。合計で、１６の事象がＬＢＡ４４０４（ｐＤＡＢ１０１５５６）形質転換で保持され、４９の事象がＤＡｔ１３１９２（ｐＤＡＢ１０１５５６）形質転換で保持され、６０の事象がＤＡｔ１６１７４（ｐＤＡＢ１０１５５６）形質転換で保持された（表７）。
トランスジェニックＴ０植物のａａｄ−１導入遺伝子のコピー数は、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用し、加水分解プローブアッセイ（BubnerおよびBaldwin、前掲）により推定した。３２Ｐ−標識化プローブとしてａａｄ−１遺伝子のＰＣＲ増幅断片を使用して、セチルトリメチルアンモニウムブロミド抽出法により選択された事象から調製したＮｃｏＩ切断ＤＮＡのサザンブロット解析を行った。さらに、ｐＤＡＢ１０１５５６起源の挿入骨格ベクター配列の存在を加水分解プローブ分析により検出した。
したがって、ＤＡｔ１６１７４株、ｐＡＬ４４０４上に保持されているｐＴｉＡＣＨ５−誘導ｖｉｒ遺伝子のフルセットを含み、ＬＢＡ４４０４染色体のｎｉｌＡ遺伝子座へ組み込まれたｐＴｉＢｏ５４２−誘導ｖｉｒ遺伝子の部分的セットをさらに含むＳＵＰＥＲＣＨＲＯＭＥ株は、形質転換トウモロコシ植物を効率的に生産することができる。さらに、ターナリー株を用いて得られた場合よりも全体的な形質転換効率は多少低いが、ＳＵＰＥＲＣＨＲＯＭＥで得られる事象の質は優れており、得られた事象の９０％は検出可能な骨格コンタミネーションのない単一コピー挿入物を有している。
本発明を特定実施例の実施形態で記載したが、これは本発明のいくつかの態様を説明することを意図したものであり、本発明は、本開示の趣旨および範囲内でさらに改変させることができる。したがって、本願は、その一般的な原則を使用する、本発明のあらゆる変化形態、利用または改良を網羅するものである。さらに、本願は、本発明が関連し、添付の特許請求の範囲内にある、当技術分野で公知または慣用の実施に入る場合、本開示から得られるそのような展開を網羅するものである。
本明細書に引用されたすべての参考文献（刊行物、特許および特許出願を含む）は、あたかもそれぞれの参考文献が、個別にまたは詳細に参照により組み込まれることを示すのと同程度まで、また、その全体が本明細書で述べられているのと同程度まで、これによって参照により援用されるものとする。本明細書で論じられている参考文献は、本願の出願日前にそれらの開示が提供されているにすぎない。本発明者らが先発明によるそのような開示に先行する権利がないということを承認するものと解釈されるべきではない。
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Claims (48)

  1. 植物を形質転換する方法であって、前記植物の細胞を、ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ断片を含む少なくとも１つのｐＴｉヘルパープラスミドと、少なくとも１つの無害化Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＴｉプラスミドとを有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株と接触させるステップを含み、前記Ｔ−ＤＮＡ領域が少なくともＴ−ＤＮＡ右側境界および前記境界に隣接する外来性ＤＮＡを含み、前記プラスミドが互いに対して異なる複製開始点を有する、方法。
  2. アグロバクテリウム（Agrobacterium）株中のｐＳＢ１から単離された１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片がＲｅｃＡ機能の欠損を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 植物を形質転換する方法であって、前記植物の細胞を、ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片と少なくとも１つの無害化Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＴｉプラスミドとを有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌と接触させるステップを含み、１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片が前記細菌の染色体の中立組込み部位へ組み込まれている、方法。
  4. 前記細菌が少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミドをさらに含み、前記プラスミドがＩｎｃＰ不和合性グループの複製起点を有する、請求項１から２のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。
  5. 前記細菌が少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミドをさらに含む、請求項３に記載の植物を形質転換する方法。
  6. 前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）株がＲｅｃＡ機能を欠損している、請求項３に記載の植物を形質転換する方法。
  7. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域が３つ以上の遺伝子配列を含有する、請求項４から６のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。
  8. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域が２５，０００以上のヌクレオチド塩基対を含有する、請求項４から７のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。
  9. 前記植物が形質転換されるときに前記Ｔ−ＤＮＡ領域が植物細胞中の単一の位置に挿入される、請求項４から８のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。
  10. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域が複数の遺伝子配列を含み、前記遺伝子配列が６０％以上の配列相同性を有する、請求項４から９のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。
  11. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域が殺虫タンパク質、除草タンパク質、または殺虫タンパク質および除草剤耐性タンパク質の混合物の１つまたは複数をコードする、請求項４から１０のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。
  12. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域がＣｒｙ１Ｃａ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ｆ殺虫タンパク質およびＣｒｙ１Ａｂ１殺虫タンパク質をコードする、請求項４から１１のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。
  13. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域がＣｒｙ１Ｃａ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ｆ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ１殺虫タンパク質およびＡＡＤ−１除草剤耐性タンパク質をコードする、請求項４から１２のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。
  14. 前記植物が単子葉植物である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
  15. １４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片がｐＤＡＢ９２９１プラスミドのＫｐｎ Ｉ部位へクローニングされる、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記ｐＴｉヘルパープラスミドがプラスミドｐＭＰ９０である、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記ｐＴｉヘルパープラスミドがプラスミドｐＴｉＣ５８Δである、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
  18. プラスミドｐＤＡＢ９２９２ＤＮＡを使用して前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）株を形質転換するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  19. 形質転換細胞または形質転換組織を、前記培養組織を形質転換に供した後に、選択するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
  20. ｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ断片を含む少なくとも１つのｐＴｉヘルパープラスミドと、少なくとも１つの無害化Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＴｉプラスミドとを有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株であって、前記プラスミドが互いに対して異なる複製開始点を有する、アグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  21. ＲｅｃＡ機能の欠損を有する、請求項２０に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  22. ｐＳＢ１から単離された１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片と、少なくとも１つの無害化Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＴｉプラスミドとを含む、形質転換促進特性を有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  23. 少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミドをさらに含む、請求項２０から２１のいずれかに記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  24. 少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミドをさらに含む、請求項２２に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  25. ＲｅｃＡ機能を欠損している、請求項２４に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  26. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域が３つ以上の遺伝子配列を含有する、請求項２３から２５のいずれかに記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  27. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域が２５，０００以上のヌクレオチドを含有する、請求項２３から２６のいずれかに記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  28. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域が複数の遺伝子配列を含み、前記遺伝子配列が６０％を超える配列相同性を有する、請求項２３から２７のいずれかに記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  29. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域が殺虫タンパク質、除草タンパク質、または殺虫タンパク質および除草剤耐性タンパク質の混合物の１つまたは複数をコードする、請求項２３から２８のいずれかに記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  30. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域がＣｒｙ１Ｃａ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ｆ殺虫タンパク質およびＣｒｙ１Ａｂ１殺虫タンパク質をコードする、請求項２３から２９のいずれかに記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  31. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域がＣｒｙ１Ｃａ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ｆ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ１殺虫タンパク質およびＡＡＤ−１除草剤耐性タンパク質をコードする、請求項２３から３０のいずれかに記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  32. ポリヌクレオチド配列がｎｉｌＡゲノム遺伝子座へ組み込まれている、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のｎｉｌＡゲノム遺伝子座。
  33. 前記ポリヌクレオチド配列がｖｉｒ遺伝子を含む、請求項３２に記載のｎｉｌＡゲノム遺伝子座。
  34. アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体上の中立組込み部位へ組み込まれているＳＢ１の１４．８ ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  35. 前記中立組込み部位がｎｉｌＡゲノム遺伝子座である、請求項３４に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  36. ＲｅｃＡ機能を欠損している、請求項３４から３５のいずれかに記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  37. アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）である、請求項３４から３６のいずれかに記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株。
  38. ｐＴｉヘルパープラスミド上のｐＳＢ１の１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片と、少なくとも１つの無害化Ｔ−ＤＮＡ領域を有し、少なくとも１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接する外来性ＤＮＡを有するｐＴｉプラスミドとを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢ４４０４株であって、前記プラスミドが互いに対して異なる複製開始点を有する、アグロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢ４４０４株。
  39. 請求項１から１９のいずれかに記載の植物。
  40. 形質転換によって植物に導入された任意の遺伝形質が植物の後代で安定に生じる、請求項３９に記載の植物。
  41. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域が植物ＤＮＡへ安定に組み込まれている、請求項４から１３のいずれかに記載の植物。
  42. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域によってコードされている任意の遺伝子が前記植物で発現される、請求項４１に記載の植物。
  43. 前記Ｔ−ＤＮＡ領域によってコードされている任意の遺伝子が前記植物の後代で安定に生じる、請求項４１から４２のいずれかに記載の植物。
  44. Ｃｒｙ１Ｃａ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ｆ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ１殺虫タンパク質およびＡＡＤ１除草タンパク質を安定に発現する、請求項４１に記載の植物。
  45. トウモロコシである、請求項４４に記載の植物。
  46. アグロバクテリウム（Agrobacterium）染色体上の中立組込み部位へ組み込まれているｐＳＢ１から単離された１４．８ＫｐｎＩ ＶｉｒＢＣＤＧ断片由来の少なくとも１つのｖｉｒ遺伝子を含む、アグロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４株。
  47. 殺虫量のＣｒｙ１Ｃａタンパク質、Ｃｒｙ１Ｆ殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ１殺虫タンパク質、および除草剤耐性量のＡＡＤ−１タンパク質を発現する、稔性トランスジェニックトウモロコシ植物またはその後代であって、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ１およびＡＡＤ１タンパク質が、前記植物のゲノム中に安定に組み込まれている組換えＤＮＡの単一遺伝子座からまとめて発現される、稔性トランスジェニックトウモロコシ植物またはその後代。
  48. 組換えＤＮＡの前記単一遺伝子座がｐＴｉ ＤＮＡプラスミド由来のベクター骨格配列を実質的に含まない、請求項４７に記載の稔性トランスジェニックトウモロコシ植物。

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