CN1728938A - 生产改变含油量的植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由于改变顺乌头酸酶核酸表达显示改变含油量表现型的植物。本发明还涉及产生具有改变含油量表现型的植物的方法。

Description

生产改变含油量的植物

相关申请

本申请要求2002年12月18日提交的美国临时专利申请60/434,795的优先权，其内容全部引入作为参考。

发明背景

控制农作物种子的组合物，尤其是种子油类的含量和组合物的能力在涉及加工食品油类以及动物饲养油类的农业工业中具有重要的应用价值。农作物的种子含有多种有价值的组分包括油类，蛋白以及淀粉。工业生产过程可以分离若干或所有这些组分用于专门应用的单独销售。例如，几乎60％的美国大豆农作物通过大豆加工工业进行压榨。大豆加工产生高价销售的精炼油，而残余物主要作为低价值的饲料销售(US Soybean Board，2001 Soy Stats)。加拿大油菜(canola)种子被压榨产生油类以及副产品加拿大油菜粗粉(加拿大加拿大油菜协会)。几乎20％的1999/2000年的美国谷物农作物经过工业化精炼，主要用于产生淀粉，乙醇以及油类(谷物精炼业者协会)。因此，常常需要使种子的含油量最大化。例如，对于诸如大豆以及加拿大油菜的加工含油种子而言，提高种子的绝对含油量将提高这种谷物的价值。对于加工的谷物而言，可能需要根据其它主要组分的应用提高或者降低含油量。降低油类可以通过降低与油类氧化相关的不希望的味道改善分离淀粉的质量。或者，在味道不重要的乙醇产生中，提高含油量可以提高总的价值。在许多谷物饲料中，诸如谷物以及小麦，可能希望提高植物含油量，因为油类比诸如碳水化合物的其它种子组分具有较高的能含量。含油种子加工，就像大多数谷物加工业一样是资金密集产业；因此产品从低值组分到高价值油类组分的分布的较小改变可能对于谷物加工者而言就有显著的经济影响。

油类的生物技术处理可以提供组成的改变以及油产量的改进。组成的改变尤其包括高油酸的大豆以及玉米油(美国专利6,229,033以及6,248,939)，以及含有月桂酸酯的种子(美国专利5,639,790)等。组成改变的工作主要集中在加工的含油种子但是已经可以很容易地延伸至非-含油种子农作物包括谷物。虽然对提高含油量具有相当的兴趣，在这一领域目前唯一实践的生物技术是高油类谷物(HOC)技术(杜邦，美国专利5,704,160)。HOC利用通过标准的选择育种连同生产系统中称为顶交的优良品种(不孕雄性)杂交雌性得到的高油类授粉者。顶交高油类系统使玉米收获的谷物含油量从～3.5％提高到～7％，改善了谷物的能含量。

虽然HOC生产系统已经卓有成效，但是其仍然具有固有的局限性。首先，担负全部的土地的种子栽植的低授粉者百分比的系统含有固有风险，尤其是在旱年。第二，当前HOC领域含油量已经平稳在大约9％的油类。最后，高油类谷物主要不是生物化学变化，而是对于提高含油量产生间接结果的解剖学上的突变体(提高胚芽芽尺寸)。为此，可选择的高油类策略，尤其是来源于改变生化产量的高油类策略将是非常重要的。

操作油市场最明显的目标农作物是大豆以及油菜籽，并且大量商业工作(例如美国专利5,952,544；PCT申请WO9411516)证明拟南芥是这些农作物油类代谢的优良模型。植物油组合物的生物化学筛选已经鉴定了许多关键生物合成酶的拟南芥基因并且导致农业上重要基因的直向同源物的鉴定。例如，利用化学诱变处理群的筛选已经鉴定了其种子显示脂肪酸成份改变的脂类突变体(Lemieux B等1990，Theor ApplGenet 80，234-240；James DW以及Dooner HK(1990)Theor Appl Genet80，241-245)。检测脂肪酸成份改变的T-DNA诱变筛选(Feldmann等，Science 243：1351-1354，1989)鉴定了ω3脱氢酶(FAD3)以及δ-12脱氢酶(FAD2)基因(美国专利5952544；Yadav NS等(1993)Plant Physiol103，467 476；Okuley等，Plant Cell.1994 Jan；6(1)：147-58)。集中在含油量而非油类质量的筛选分析化学上诱导的皱缩种子或籽粒容量改变的突变体，据此推断出改变的植物含油量(Focks N以及Benning C，Plant Physiol 118：91-101，1998)。用来鉴定参与非常长链脂肪酸产生的酶的另一种筛选鉴定了编码负责降低种子中三酰甘油聚集的甘油二酯酰基转移酶(DGAT)的基因的突变(Katavic V等，Plant Physiol.1995May；108(1)：399-409)。此外，还显示DGAT cDNA的种子特异性过量表达与提高的植物含油量有关(Jako等，Plant Physiol.2001 Jun；126(2)：861-74)。

发明概述

本发明提供了具有高油类含量表现型的转基因植物。转基因植物包括含有编码或互补于编码顺乌头酸酶多肽的序列的核苷酸序列的转化载体。在优选的实施方案中，转基因植物选自油菜，大豆，谷物，向日葵，棉花，可可粉，红花，油棕，椰子，亚麻蓖麻以及花生。本发明还提供了产生油类的方法，包括培育转基因植物以及从所述植物回收油类。

本发明的转基因植物通过包括向植物的祖细胞引入含有编码或互补于编码顺乌头酸酶多肽的序列的核苷酸序列的植物转化载体，以及培育转化的祖细胞产生转基因植物的方法产生，其中顺乌头酸酶多核苷酸序列的表达产生高油类含量表现型。

发明详述

定义

除非另有陈述，这里使用的全部技术以及科学名词具有与本领域技术人员知晓的相同的含义。专业人员尤其是参考Sambrook等的分子克隆实验指南(第二版)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989，以及Ausubel FM等的Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1993的定义以及术语。应该理解本发明不限于所描述的特定方法，流程以及试剂，因为这些可以改变。

此处所述的术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指可以在异源细胞中整合并表达异源DNA片段的载体。许多原核以及真核生物表达载体是可以市售获得的。选择合适的表达载体是本领域述人员所熟知的。

“异源的”核酸构建体或序列具有一部分序列不是植物细胞的野生型序列但是在其中表达。异源的控制序列是指不天然调节目前正在调节的相同基因表达的控制序列(即启动子或增强子)。通常，异源核酸序列不是它们所存在于的细胞或者基因组的一部分所内源产生的，并且已经通过传染，转染，显微注射，电穿孔法等加入至细胞中。“异源的”核酸构建体可以含有控制序列/DNA编码序列组合，其与野生型植物中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或者不同。

此处所述的术语“基因”是指参与多肽链产生的DNA片段，其可能包括或者不包括编码区之前以及之后的区域，例如5′非翻译区(5′UTR)或者“前导”序列以及3′UTR或者“尾部”序列以及单独的编码片段(外显子)以及非-转录调节序列之间的内含子序列(内含子)。

这里使用的“重组体”包括已经通过引入异源的核酸序列进行修饰的细胞或者载体，或者所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非-重组体)形式的细胞内没有发现相同形式的基因或者表达在人为干预下完全表达或者完全不表达的异常表达的天然基因。

此处所述的术语“基因表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的方法。所述方法包括转录以及翻译；因此“表达”可以是针对多核苷酸或者多肽序列或者两者。有时，多核苷酸序列的表达不会引起蛋白翻译。“过量表达”是指相对于其在野生型(或者其它的参考[例如，非-转基因])植物中的表达，多核苷酸和/或多肽序列表达增加并且可能涉及自然存在或者非-自然存在的序列。“异位表达”是指在非-改变或者野生型植物中不自然发生的，在某时，某地和/或提高水平的表达。“下调表达”是指多核苷酸和/或多肽序列，通常是内源性基因相对于其在野生型植物中表达的降低表达。术语“错误表达”以及“改变表达”包括过量表达，下调表达以及异位表达。

在将核酸序列插入细胞的概念中，术语“引入的”是指“转染”，或者“转化”或者“转导”，并且包括针对核酸序列整合到真核或者原核细胞，其中核酸序列可以整合入细胞的基因组(例如染色体，质粒，质体或者线粒体DNA)，转化为自主复制子，或者瞬间表达(例如，转染的mRNA)。

本文使用的“植物细胞”是指来源于植物的任意细胞，包括来自未分化的组织(例如愈伤组织)以及植物种子，花粉，繁殖体(progagules)并且胚芽的细胞。

此处所述的术语“天然的”以及“野生型”相对于给定植物特性或者表现型是指具有在相同种类的植物本身发现的特征或者表现型的形式。

此处所述的术语关于植物特性的“修饰的”是指转基因植物相对于类似的非-转基因植物的表现型的改变。“改变含油量的表现型”是指基因修饰植物的可测量的表现型，其中植物与类似的但是非-修饰的植物相比显示总含油量的统计上显著的增减(即，油类相对种子质量的百分比)。高油类表现型是指总含油量的增加。

本文使用的“突变体”多核苷酸序列或者基因与相应的野生型多核苷酸序列或者基因是在序列或者表达上不同，其中的差异导致修饰的植物的表现型或者特性。相对于植物或植物株系，术语“突变体”是指植物或者株系具有修饰的植物表现型或特性，其中修饰的表现型或特性与野生型多核苷酸序列或基因的修饰表达有关。

此处所述的术语“T1”是指来自T0植物的种子的植物子代。T1子代是可通过应用选择性试剂筛选的第一系列转化的植物，所述的选择性试剂为例如抗生素或除草剂，由此转基因植物含有相应的抗性基因。术语“T2”是指通过T1植物的花进行自体受精产生的植物子代，所述T1植物之前被筛选作为转基因植物。T3植物是由T2植物等产生的。这里所述的特定植物的“直系子代”来源于所述植物的种子(或者，有时来自其它的组织)且是直接紧接的子代；例如，对于特定的家系而言，T2植物是T1植物的直系子代。特定植物的“间接子代”来源于所述植物直系子代的种子(或其它组织)，或来自该家系随后子代的种子(或其它组织)；例如，T3植物是T1植物的间接子代。

此处所述的术语“植物的部分”包括任意的植物器官或组织，包括，但不限于种子，胚芽，分生组织区域，愈伤组织，叶，根，芽，配子体，孢子体，花粉，和小孢子。植物细胞可获自任意的植物器官或组织以及由其制备的培养物。可用于本发明方法的植物种类通常是广泛的，其可以是可用于转化技术的高等植物，包括单子叶的和双子叶的植物。

在这里所述的“转基因植物”包括在其基因组内含有异源多核苷酸的植物。异源的多核苷酸可以稳定地整合到基因组中，或可以被插入到染色体外。优选地，本发明的多核苷酸被稳定地整合到基因组中从而使多核苷酸被连续传代。植物细胞，组织，器官，或已被导入异源多核苷酸的植物被认为是“转化的”，“转染的”或“转基因的”植物。也含有该异源多核苷酸的转化植物或植物细胞的直系和间接子代也被视为是转基因的。

具有改变的含油量表现型的植物的鉴定

产生转基因植物过量表达编码乙醛酸途径酶的不同基因并且检验来自T1转基因植物的种子的高油表现型。人们发现乌头酸酶(At4g35830；GI#13124706)的过量表达赋予改变含油量的表现型(具体地，高植物油表现型)。因此，顺乌头酸酶基因和/或多肽可用于开发具有修饰的含油量表现型(“顺乌头酸酶表现型”)的遗传修饰的植物。顺乌头酸酶基因可用于产生由含油种子加工提供增加的油产量的含油种子农作物以及可用于产生提供动物饲养增加能的谷物饲料作物。顺乌头酸酶基因可进一步地被用于增加特定油料作物的含油量，以增加目的稀有脂肪酸的产量。已被遗传修饰表达顺乌头酸酶的转基因植物可用于产生油类，其中转基因植物被培育，并且通过常规方法由植物部分(例如种子)获取油类。

顺乌头酸酶核酸和多肽

拟南芥顺乌头酸酶核酸(基因组DNA)序列提供于SEQ ID NO：1以及Genbank中，登录号为GI#30690504。相应的蛋白序列提供于SEQID NO：2中，登录号为GI#131124706。作为拟南芥顺乌头酸酶的直向同源物或横向同源物的核酸和/或蛋白质，描述在下面实施例2中。

此处所述的术语“顺乌头酸酶多肽”是指全长的顺乌头酸酶蛋白或其片段，衍生物(变体)，或其“功能活性的”的直向同源物，是指该蛋白片段，衍生物，或直向同源物显示出一或多种或与SEQ ID NO：2多肽有关的功能性活性。在一个优选的实施方案中，当功能活性的顺乌头酸酶多肽在植物中错误表达时产生改变含油量的表现型。在另一个优选的实施方案中，顺乌头酸酶多肽的错误表达产生高含油量表现型的植物。在另一个实施方案中，当功能性活性的顺乌头酸酶多肽在植物或植物细胞中表达时能够拯救缺陷的(包括不足的)内源性顺乌头酸酶活性；拯救多肽可以是来自与缺陷活性种类相同或来自不同的种类。在另一个实施方案中，全长顺乌头酸酶多肽的功能活性片段(即，具有SEQ ID NO：2序列或其天然存在的直向同源物的天然多肽)保持一或多个与全长顺乌头酸酶多肽相关的生物学特性，诸如信号活性，结合活性，催化活性，或胞内或胞外定位活性。顺乌头酸酶片段优选含有顺乌头酸酶结构域，诸如C-或N-末端或催化结构域，尤其优选地含有至少10个，优选地至少20个，更优选地至少25个，且最优选地至少50个连续的顺乌头酸酶蛋白的氨基酸。功能域可利用PFAM程序来鉴定(Bateman A等，1999 Nucleic Acids Res 27：260-262；网址为pfam.wustl.edu)。全长顺乌头酸酶多肽或其片段的功能性活性变体包括具有氨基酸插入、缺失或取代的并保持一或多种与全长顺乌头酸酶多肽有关的生物学特性的多肽。有时，产生改变顺乌头酸酶多肽翻译后加工的变体。例如，变体与天然的多肽相比可能具有改变的蛋白质转运或蛋白质定位特性或改变的蛋白半衰期。

此处所述的术语“顺乌头酸酶核酸”包括具有SEQ ID NO：1序列或与其互补的序列的核酸，及其功能活性片段，衍生物或直向同源物。本发明的顺乌头酸酶核酸可以是DNA，来源于基因组DNA或cDNA，或RNA。

在一个实施方案中，功能活性的顺乌头酸酶核酸编码功能活性顺乌头酸酶多肽或与编码功能活性顺乌头酸酶多肽的核酸互补。此定义所包括的为充当初级RNA转录模板的基因组DNA(即，mRNA前体)，其中所述的初级RNA转录需要编码功能活性顺乌头酸酶多肽之前的加工，诸如剪接。顺乌头酸酶核酸可包括其它的非编码序列，其可被或可不被转录；此种序列包括5′和3′UTRs，尤其是本领域已知的调控基因表达的多聚腺苷酸化信号和调节序列。某些多肽需要加工事件，诸如蛋白水解，共价修饰等，以使其具有完全的活性。因此，功能活性核酸可编码成熟或预加工的顺乌头酸酶多肽，或中间体形式。顺乌头酸酶多核苷酸也可包括异源的编码序列，例如，编码包括的促进融合多肽纯化的标记或转化标记的序列。

在另一个实施方案中，功能活性的顺乌头酸酶核酸可用于产生顺乌头酸酶功能缺失的表现型，例如，通过反义抑制，共-抑制等等。

在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的顺乌头酸酶核酸含有编码顺乌头酸酶多肽或互补于编码顺乌头酸酶多肽的序列的核酸序列，所述编码顺乌头酸酶多肽的序列与SEQ ID NO：2的多肽序列具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多的序列同一性。

在另一个实施方案中，本发明的顺乌头酸酶多肽含有与SEQ IDNO：2的多肽序列具有至少50％或60％序列同一性的多肽序列，且可与SEQ ID NO：2的顺乌头酸酶多肽序列具有至少70％，80％，85％，90％或95％或更高的序列同一性。在另一个实施方案中，顺乌头酸酶多肽含有与SEQ ID NO：2所示多肽的功能活性片段具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或95％或更高序列同一性的多肽序列。在另一个实施方案中，顺乌头酸酶多肽含有与SEQ ID NO：2所示多肽的全长具有至少50％，60％，70％，80％或90％序列同一性的多肽序列。

在另一方面，顺乌头酸酶多核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示顺乌头酸酶核酸序列的全长，或与此顺乌头酸酶序列互补的核酸序列具有至少50％到60％的同一性，且可包括与SEQ ID NO：1所示顺乌头酸酶序列或其功能性活性片段，或互补序列具有至少70％，80％，85％，90％或95％或更高的序列同一性。

这里所述的，相对于特定的受试序列或其特定部分的“百分(％)序列同一性”，被定义为侯选衍生物的核苷酸或氨基酸序列与受试序列中核苷酸或氨基酸序列(或其特定部分)的同一性的百分比，在比对序列和引入缺口之后，如有必要来获得最大的百分序列同一性，如通过程序WU-BLAST-2.0a19(Altschul等，产生的J.Mol.Biol.(1997)215：403-410；比较网址：wustl.edu/blast/README.html)，检索参数设置为默认值。HSP S和HSP S2参数是动态值且通过程序本身根据特定序列的组成以及用于目标序列正在其中进行检索的特定数据库的组成来建立。通过匹配的相同核苷酸或氨基酸的数目除以所报道的百分比同一性的序列长度测定“％同一性值”。“百分(％)氨基酸序列相似性”通过进行测定％氨基酸序列同一性的相同计算来测定，但是包括除了计算中的相同氨基酸之外的保守氨基酸的取代。保守的氨基酸取代是其中的一个氨基酸被另一个具有类似特性的氨基酸取代而对蛋白的折叠或活性没有显著地影响。可彼此取代的芳族氨基酸为苯丙氨酸，色氨酸，和酪氨酸；可互换的疏水氨基酸为亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，和缬氨酸；可互换的极性氨基酸为谷氨酰胺和天冬酰胺；可互换的碱性氨基酸为精氨酸，赖氨酸和组氨酸；可互换的酸性氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸；且可互换的小氨基酸为丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸和甘氨酸。

受试核酸分子的衍生核酸分子包括与SEQ ID NO：1核酸序列选择性杂交的序列。可通过温度，离子强度，pH和杂交和冲洗过程中变性剂诸如甲酰胺的存在来控制杂交的严格性。通常使用的条件是公知的(参见，例如，Current Protocol in Molecular Biology，Vol.1，Chap.2.10，John Wiley & Sons，Publishers(1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor(1989))。在一些实施方案中，本发明的核酸分子能够在严格条件下杂交于含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子：含有核酸的滤膜预杂交8小时在65℃含有6X单一浓度柠檬酸盐(SSC)(1XSSC为0.15 NaCl，0.015M柠檬酸钠；pH7.0)，5X Denhardt溶液，0.05％焦磷酸钠和100μg/ml  鲱鱼精DNA的溶液中过夜；以及在65℃含有6XSSC，1X Denhardt溶液，100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸钠的溶液中杂交18-20小时；并在65℃在含有0.1XSSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中冲洗滤膜1小时。在其它的实施方案中，所使用的温和严格杂交条件为：含有核酸的滤膜在40℃在含有35％甲酰胺，5XSSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％PVP，聚蔗糖，1％BSA，和500μg/ml变性鲑精DNA的溶液中预处理6小时；在40℃在含有35％甲酰胺，5XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA，0.02％PVP，0.02％聚蔗糖，0.2％BSA，100μg/ml鲑精DNA和10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯的溶液中杂交18-20小时；然后在55℃在含有2XSSC和0.1％SDS的溶液中冲洗两次持续1小时。或者，可使用的低严格条件包括：在37℃在含有20％甲酰胺，5xSSC，50mM磷酸钠(pH7.6)，Denhardt′s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml变性剪切的鲑精DNA的溶液中温育8小时到过夜；在相同缓冲液中杂交18到20小时；并在1xSSC中大约37℃冲洗滤膜1小时。

由于遗传密码的简并性，可产生大量的编码顺乌头酸酶多肽的多核苷酸序列。例如，按照由特定的宿主生物体赋予的最佳密码子选择，可选择密码子来增加在特定宿主种类中出现多肽表达的比率(参见，例如，Nakamura等，1999，Nucleic Acids Res 27：292)。这样的序列变体可用于本发明的方法中。

本发明的方法可利用拟南芥顺乌头酸酶的直向同源物。在其它植物品种中鉴定直向同源物的方法是本领域公知的。通常，不同品种中的直向同源物保持相同的功能，取决于一或多个蛋白基序和/或3-三维结构的存在。在进化中，当物种形成后基因复制时，一个品种诸如拟南芥中的单一基因，可对应于另一种中的多个基因(横向同源物)。此处所述的术语“直向同源物”包括横向同源物。当序列数据可用于特定的植物品种时，直向同源物通常通过序列同源性分析，诸如BLAST分析，通常利用蛋白诱饵序列来进行鉴定。如果正向BLAST结果的最佳目标序列在反向BLAST中检索到最初查询序列，则序列被认为是可能的直向同源物(Huynen MA和Bork P，Proc Natl Acad Sci(1998)95：5849-5856；Huynen MA等，Genome Research(2000)10：1204-1210)。用于多重序列比对的程序，诸如CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 22：4673-4680)可用于高亮显示保守的区域和/或直向同源蛋白质的残基以及来产生系统发生树。在表示来自不同品种的多重同源序列的系统树中(例如，通过BLAST分析检索的)，来自两个品种的直向同源序列通常相对于来自此两个品种的所有其它序列最靠近地出现在树上。蛋白质折叠的结构线程(Structural threading)或其它分析(例如，利用ProCeryon，Biosciences，Salzburg，Austria的软件)也可鉴定可能的直向同源物。核酸杂交方法也可用于发现直向同源基因且当不能获得序列数据是优选的。变性PCR和cDNA或基因组DNA文库的筛选是发现相关基因序列的常规方法且是本领域公知的(参见，例如，Sambrook，见上文；Dieffenbach C和Dveksler G(Eds.)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，1989)。例如，由目的植物品种产生cDNA文库以及用部分同源的基因探针探测文库的方法描述下述文献中：Sambrook等，同上。拟南芥顺乌头酸酶编码序列的高度保守部分可用作探针。顺乌头酸酶直向同源物核酸可在高度，中度，或低严格条件下与SEQ ID NO：1的核酸杂交。假定的直向同源物片段的扩增或分离之后，那些片段可通过常规技术来克隆和测序并用作探针来分离全长cDNA或基因组克隆。或者，可启动EST项目来产生目的植物品种的序列信息的数据库。在另一种方法中，特异性结合已知的顺乌头酸酶多肽的抗体被用于直向同源物分离(参见，例如，Harlow E和Lane D，Using Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999，NewYork)。Western印迹分析可确定顺乌头酸酶直向同源物(即，直向同源的蛋白)存在于特定植物品种的粗提物中。当观察到反应时，编码侯选直向同源物的序列可通过筛选表示特定植物品种的表达文库来分离。表达文库可构建在各种市售的载体中，包括λgt11，如描述在Sambrook，等中，同上文。一旦通过任意的方式鉴定了候选的直向同源物，候选的直向同源序列被用作诱饵(“查询”)用于来自拟南芥或其中顺乌头酸酶核酸和/或多肽序列已被鉴定的其它品种的序列对比的反向BLAST。

可利用任意有效的方法来获得顺乌头酸酶核酸和多肽。例如，通过筛选DNA文库或通过利用聚合酶链式反应(PCR)分离目的cDNA或基因组DNA序列的技术，如先前描述的，是本领域公知的。或者，核酸序列可以是合成的。任意已知的方法，诸如位点定向诱变(KunkelTA等，Methods Enzymol.204：125-39，1991)可被用于将目的变化导入到克隆的核酸中。

通常，本发明的方法涉及将顺乌头酸酶核酸的目的形式整合入植物表达载体中用于转化植物细胞，且顺乌头酸酶多肽在宿主植物中表达。

分离的顺乌头酸酶核酸分子除了以其在自然中发现的形式或者组外的形式或者组且被鉴定和与最小的一种污染物核酸分子分离，所述的污染物核酸分子通常与顺乌头酸酶核酸的天然来源关联。然而，分离的顺乌头酸酶核酸分子包括通常表达顺乌头酸酶的细胞中包含的顺乌头酸酶核酸分子其中，例如核酸分子在不同于自然细胞中的染色体中。

具有改变的含油量表现型的基因改造植物的产生

顺乌头酸酶核酸和多肽可被用于产生具有修饰的含油量表现型的基因改造植物。在这里所述的“修饰的含油量表现型”可指植物任意部分中修饰的含油量；修饰的含油量通常在种子中被观察到。在优选的实施方案中，植物中顺乌头酸酶基因的改变表达被用于产生具有高含油量表现型的植物。

在这里描述的方法通常适用于所有的植物。在一个优选的实施方案中，本发明针对产油植物，其在特异性器官，主要在种子中产生和储藏三酰甘油。这样的品种包括大豆(毛豆)，油菜和加拿大油菜(包括芸苔，B.campestris)，向日葵(Helianthus annus)，棉花(Gossypiumhirsutum)，玉米(Zea mays)，可可(Theobroma cacao)，红花(Carthamustinctorius)，油棕(Elaeis guineensis)，椰子(Cocos nucifera)，亚麻(Linumusitatissimum)，蓖麻(Ricinus communis)和花生(Arachis hypogaea)。本发明的目的也在于提供水果-和蔬菜植物，产谷类-植物，产坚果-植物，短周期芸苔品种，苜蓿(紫苜蓿)，烟草(Nicotiana)，turfgrass(Poaceae家族)，其它的饲料作物，以及可作为独特的脂肪酸来源的野生品种。

技术人员可理解本领域已存在的各种转化技术以及新技术不断地适于应用。适于目标宿主植物的任意技术可在本发明的范围内实施。例如，构建体可以各种各样的形式包括但不限于如DNA的链被导入到质粒中，或人工染色体中。可通过各种各样的技术将构建体导入到目标植物细胞中，包括但不限于农杆菌-介导的转化，电穿孔法，显微注射，微粒轰击钙-磷酸盐-DNA共沉淀或脂质体-介导的异源核酸的转化。植物的转化优选地是稳定的，即，通过将导入的表达构建体整合到宿主植物基因组中，从而使得导入的构建体连续存在于植物子代中。取决于目的应用，含有顺乌头酸酶多核苷酸的异源核酸构建体可编码全蛋白或其生物学活性部分。

在一个实施方案中，二元的基于Ti的载体系统可被用于转移多核苷酸。标准农杆菌二元载体是本领域技术人员公知的，且许多是市售的(例如，pBI121 Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)。

用农杆菌载体转化植物的最佳方法将依据转化的植物的类型而变化。农杆菌介导的转化的示例性方法包括胚轴外植体，芽梢，来源于不育秧苗和/或幼苗干或叶组织的转化。这样的转化植物可以有性繁殖，或通过细胞或组织培养。先前描述的用于大量不同类型植物的农杆菌转化以及此种转化的方法可在科学文献中发现。特定相关的是转化商业上重要的作物的方法，诸如油菜籽(De Block等，Plant Physiol.(1989)91：694-701)，向日葵(Everett等，Bio/Technology(1987)5：1201)，以及大豆(Christou等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1989)86：7500-7504；Kline等，Nature(1987)327：70)。

顺乌头酸酶的表达(包括转录和翻译)可相对于表达的水平，进行表达的组织类型和/或表达的发育阶段被调节。大量的异源调节序列(例如，启动子和增强子)可有效调节顺乌头酸酶核酸的表达。这些调节序列包括组成性的，可诱导的和可调节的启动子，以及以组织-或时间特异性方式调节表达的启动子和增强子。示例性的组成性启动子包括树莓E4启动子(美国专利5,783,393和5,783,394)以及35S CaMV(JonesJD等，Transgenic Res 1：285-2971992)，CsVMV启动子(Verdaguer B等，Plant Mol Biol 37：1055-1067，1998)以及甜瓜肌动蛋白启动子(公开的PCT申请WO0056863)。示例性的组织特异性启动子包括番茄E4以及E8启动子(US专利No.5,859,330)以及番茄2AII基因启动子(Van Haaren MJJ等，Plant Mol Bio 21：625-640，1993)。

在一个优选的实施方案中，顺乌头酸酶表达在来自其表达与早期种子和/或胚发育有关的基因的调节序列的调节之下。其启动子与早期种子和胚发育有关的豆荚基因包括V.faba legumin(Baumlein等，1991，Mol Gen Genet 225：121-8；Baumlein等，1992，Plant J 2：233-9)，V.fabausp(Fiedler等，1993，Plant Mol Biol 22：669-79)，pea convicilin(Bown等，1988，Biochem J 251：717-26)，pea lectin(dePater等，1993，Plant Cell5：877-86)，P.vulgaris beta phaseolin(Bustos等，1991，EMBO J10：1469-79)，P.vulgaris DLEC2和PHS[beta](Bobb等，1997，NucleicAcids Res 25：641-7)和大豆β-Conglycinin，7S贮藏蛋白(Chamberland等，1992，Plant Mol Biol 19：937-49)。其启动子与早期的种子和胚发育有关的谷类基因包括稻米谷蛋白(″GluA-3，″Yoshihara和Takaiwa，1996，Plant Cell Physiol 37：107-11；″GluB-1，″Takaiwa等，1996，Plant Mol Biol 30：1207-21；Washida等，1999，Plant Mol Biol40：1-12；″Gt3，″Leisy等，1990，Plant Mol Biol 14：41-50)，大米醇溶蛋白(Zhou & Fan，1993，Transgenic Res 2：141-6)；小麦醇溶蛋白(Hammond-Kosack等，1993，EMBO J 12：545-54)，玉米玉米蛋白(Z4，Matzke等，1990，Plant Mol Biol 14：323-32)，和大麦B-hordeins(Entwistle等，1991，Plant Mol Biol 17：1217-31)。其启动子与早期的种子和胚发育有关的其它基因包括油椰GLO7A(7S globulin，Morcillo等，2001，Physiol Plant 112：233-243)，Brassica napus napin，2S贮藏蛋白和napA基因(Josefsson等，1987，J Biol Chem 262：12196-201；Stalberg等，1993，Plant Mol Biol 199323：671-83；Ellerstrom等，1996，Plant Mol Biol 32：1019-27)，芸苔油质蛋白(Keddie等，1994，PlantMol Biol 24：327-40)，拟南芥油质蛋白(Plant等，1994，Plant Mol Biol25：193-205)，拟南芥FAE1(Rossak等，2001，Plant Mol Biol 46：717-25)，Canavalia gladiata conA(Yamamoto等，1995，Plant Mol Biol27：729-41)，和长春花strictosidine合成酶(Str，Ouwerkerk和Memelink，1999，Mol Gen Genet 261：635-43)。在另一个优选的实施方案中，利用来自在油类生物合成过程中表达的基因的调节序列(参见，例如美国专利5,952,544)。可选择的启动子来自植物贮藏蛋白基因(Bevan等，1993，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 342：209 15)。

在又一个方面，有时可能需要抑制内源性顺乌头酸酶在宿主细胞中的表达。实施本发明此方面的示例性方法包括，但不限于反义抑制(Smith等，Nature 334：724-726，1988；van der Krol等，Biotechniques(1988)6：958-976)；共-抑制(Napoli，等，Plant Cell 2：279-289，1990)；核酶(PCT公开WO 97/10328)；以及反义和正义的组合(Waterhouse，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964，1998)。抑制宿主细胞内源性序列的方法典型地利用被抑制序列的至少一部分的转录或转录和翻译。这样的序列可能与内源性序列的编码和非编码区是同源的。反义抑制可利用全部的cDNA序列(Sheehy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：8805-8809)，部分cDNA序列包括5′编码序列的片段，(Cannon等，Plant Molec.Biol.(1990)15：39-47)，或3′非-编码序列(Ch′ng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86：10006-10010)。共抑制技术可利用全部的cDNA序列(Napoli等，同上；van der Krol等，ThePlant Cell(1990)2：291-299)或部分的cDNA序列(Smith等，Mol.Gen.Genetics(1990)224：477-481)。

可进行标准的分子和遗传测试来进一步分析基因和所观察的表现型之间的关联。示例性的技术描述如下。

1. DNA/RNA分析

突变体比较野生型品系的阶段-和组织特异性的基因表达模式可通过例如，原位杂交来测定。可以进行基因尤其是侧翼调节区域甲基化状态的分析。其它合适的技术包括过量表达，异常表达，在其它植物品种中的表达以及基因敲除法(反向遗传，目标敲除，病毒诱导的基因沉默[VIGS，参见Baulcombe D，Arch Virol Suppl 15：189-201，1999])。

在优选的应用表达分布图中，通常通过微阵列分析，用于同时测定差异或许多不同基因表达中诱导的变化。微阵列分析技术是本领域公知的(Schena M等，Science(1995)270：467-470；Baldwin D等，CurOpin Plant Biol.2(2)：96-103，1999；Dangond F，Physiol Genomics(2000)2：53-58；van Hal NL等，J Biotechnol(2000)78：271-280；Richmond T和Somerville S，Curr Opin Plant Biol(2000)3：108-116)。可分析单独标记的品系的表达分布。这样的分析可鉴定由于目的基因的过量表达协调调节的其它基因，其可促进将未知的基因放置在特定通道中。

2. 基因产物分析

基因产物的分析可包括重组蛋白质表达，抗血清产生，免疫定位，催化或其它活性的生物化学分析，磷酸化状态的分析，以及通过酵母二-杂交分析进行的与其它蛋白质相互作用的分析。

3. 途径分析

途径分析可包括根据基因或置于特定的生物化学，新陈代谢或信号传导途径中。或者，分析可包括与野生型品系及其它突变品系的遗传杂交(产生双重突变型)来对途径中的基因进行排序，或测定突变对途径中下游“报道”基因表达的作用。

具有改变的含油量表现型的突变植物的产生

本发明进一步提供了鉴定在内源性顺乌头酸酶中具有突变从而赋予了改变含油量的植物的方法，以及产生未遗传修饰的这些植物的改变含油量的子代的方法。在一个方法中，称为“TILLING”(用于靶向基因组中诱导的局部损害)，例如利用EMS处理在目的植物的种子中诱导突变。培育产生的植物并进行自体受精，且将子代用于制备DNA样品。利用顺乌头酸酶-特异性PCR鉴定突变的植物是否具有顺乌头酸酶突变。然后测定具有顺乌头酸酶突变的植物的改变的含油量，或者，测定植物的改变的含油量，然后进行顺乌头酸酶-特异性PCR测定具有改变含油量的植物是否具有突变的顺乌头酸酶基因。TILLING可鉴定改变特异性基因的表达或由这些基因编码的蛋白质活性的突变(参见Colbert等(2001)Plant Physiol 126：480-484；McCallum等(2000)Nature Biotechnology 18：455-457)。

在另一个方法中，候选基因/数量性状定位(QTLs)方法可被用于标记-辅助的育种计划来鉴定等位基因或可赋予改变的含油量的顺乌头酸酶基因或顺乌头酸酶直向同源物中的突变(参见Bert等，Theor ApplGenet.2003 Jun；107(1)：181-9；以及Lionneton等，Genome.2002Dec；45(6)：1203-15)。因此，在本发明另一个方面，顺乌头酸酶核酸被用于鉴定具有含油量改变的植物在内源性顺乌头酸酶中是否具有突变或具有引起含油量改变的特定的等位基因。

所有在这里引用的出版物被明确地引入作为参考来用于描述和公开可在本发明的相关方面使用的组合物和方法。所有引用的专利，专利申请，和参考网址和公众数据库中的序列信息也引入作为参考。

实施例

实施例1

产生过量表达乌头酸酶的转基因植物

编码乙醛酸途径酶的基因的亚型在野生型拟南芥中过量表达并且检验来自T1转基因植物的种子的高油表现型。为了过量表达基因，用每个基因的特异性引物PCR扩增基因组DNA。将PCR产物克隆在含有NPTII基因(作为选择性标记)T-DNA载体的CsVMV启动子后面并且转化入野生型拟南芥植物。通过在含有卡那霉素的琼脂培养基上萌发种子选择转基因植物。将卡那霉素抗性幼苗移植到土壤并且培育成熟。非-转化的野生型Col-0植物用作对照。种子在琼脂培养基(缺少卡那霉素)上萌芽并且将幼苗移植到土壤并且培育成熟。收获自转基因和对照植物的种子含油量利用近红外波谱(NIR)进行测定。利用Bruker 22N/F捕获NIR红外波谱。利用NIR分析的数据和参考厂商说明通过Bruker软件估计总植物油的含量。

结果表明Arabidopisis乌头酸酶基因(At4g35830)的过量表达赋予高种子油表现型。来自7个过量表达At4g35830(编码乌头酸酶)的转基因品系的种子比所有检验的对照植物具有更高的含油量。转基因植物的该值的范围为42.2％到41.8％，而对照种子的所述值范围介于41.7％和38.1％之间。对照种子中平均的含油量为40.3％。因此，乌头酸酶的过量表达可赋予植物油差不多5％的增加。

实施例2

拟南芥乌头酸酶的分析

利用BLAST(Altschul等，1997，J.Mol.Biol.215：403-410)，PFAM(Bateman等，1999，Nucleic Acids Res 27：260-262)，PSORT(Nakai K，和Horton P，1999，Trends Biochem Sci 24：34-6)，和/或CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 22：4673-4680)进行序列分析。鉴定具有高序列同一性的大量直向同源物，并且因此预计当在植物中过量表达时也赋予高油表现型。来自不同植物品种的直向同源的顺乌头酸酶包括：GI#599625，GI#25291984，GI#18416900，GI#15215804，以及GI#7437041(拟南芥)；GI#34851120(欧洲甜樱桃)；GI#11066033(烟草)；GI#1351856(Cucurbita cv)；GI#30407706(Lycopersicon pennellii)；GI#3309243(柠檬)；以及GI#2492636(甜瓜)。

                                   序列表

<110>农业经济有限责任公司(Agrinomics LLC)

<120>生产改变含油量的植物(GENERATION OF PLANTS WITHALTERED OILCONTENT)

<130>SCT052489-66

<150>60/434,601

<151>2002-12-18

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>3214

<212>DNA

<213>Arabidopsis thaliana

<400>1

gaatcggctc aggctcgtgt agcctcacca actccgctta taaactttct ctcttctgaa   60

aacagatctc tctactttgc ttcttcactc gacttgtatc tatcatccat ggcttccgag  120

aatcctttcc gaagcatatt gaaggcgtta gagaagcctg atggtggtga attcggtaac  180

tactacagct tacctgcttt gaacgatccc aggatcgata aactacctta ttccattagg  240

atacttcttg aatcggccat acgtaactgt gatgagttcc aagttaagag caaagatgtt  300

gagaagattc ttgattggga gaatacttct cccaagcagg ttgagattcc gttcaagcct  360

gctcgggttc ttcttcagga ctttactggt gttcctgctg ttgttgatct tgcttgcatg  420

agagatgcca tgaataatct cggtggtgat tctaataaaa ttaatccgct ggtccctgta  480

gatcttgtca ttgatcactc cgttcaggtg gatgtggcga gatcagagaa cgcagtgcag   540

gcaaacatgg agcttgagtt ccagcgtaac aaggaaagat ttgcttttct taagtgggga   600

tccaacgcct ttcacaacat gcttgtcgta cctcctggat ctggaatagt tcatcaagtc   660

aacctagaat accttgccag agttgttttc aacacaaatg gacttcttta cccagacagt   720

gttgttggca cagactctca caccactatg attgatggac tgggtgttgc tggatgggga   780

gttggcggta tagaagcgga agctaccatg cttggtcagc caatgagcat ggtcctaccc   840

ggtgttgtgg gtttcaagct aacgggaaag ttaagagatg gaatgacagc tactgatttg   900

gtcttaacag tgactcagat gttgaggaaa catggagtag ttggaaagtt tgttgaattc   960

cacggggaag ggatgagaga attgtcttta gctgaccgtg ctacaattgc caatatgtct  1020

cctgagtacg gtgcgaccat gggattcttc ccagtcgatc atgtcacttt gcagtatcta  1080

aggttgacag gcaggagcga tgacactgtc tccatgatag aggcgtattt acgagcaaac  1140

aagatgtttg tggattacag tgagccggag agtaagacag tttattcctc atgtctggaa  1200

ttgaatctcg aggatgtgga accttgtgtt tctggtccca agaggcctca tgatcgtgtt  1260

cctttgaagg aaatgaaagc ggactggcat tcttgcttgg acaatagagt aggattcaag  1320

ggtttcgctg tacctaaaga agcacagagt aaggctgtag agttcaattt taacgggacc  1380

acagcacagc ttagacatgg agatgttgtt atagcagcaa tcaccagttg cacaaatact  1440

tcaaacccta gtgtaatgct tggcgctgcc ttagttgcaa aaaaggcctg cgacctagga  1500

ctggaggtta agccatggat caaaactagt cttgctccag gctctggagt tgtaacaaag  1560

tacttggcaa agagtggctt gcagaagtac ttgaatcagc tcggcttcag tatcgttggt  1620

tatgggtgca ccacatgcat tggaaactcg ggggatatcc atgaagctgt ggcttcagca  1680

atagttgata atgacttggt ggcatccgct gtgttgtctg ggaacagaaa ttttgaggga  1740

cgtgttcacc cgttaacaag agctaactat ctagcttccc caccgcttgt tgtagcctat  1800

gctctggctg gaactgttga cattgatttt gagacacagc ccattggaac tgggaaagat  1860

ggaaaacaga tatttttcag ggacatttgg ccctctaaca aagaagttgc tgaggttgtt  1920

caatctagtg tccttcctga tatgttcaaa gctacatatg aagcaatcac caaaggaaat  1980

tccatgtgga atcagttatc tgtggcgtca ggtactctct atgagtggga cccgaaatca  2040

acttacattc acgagccgcc ttatttcaag ggcatgacca tgtctccacc cggtccacat  2100

ggtgtgaaag acgcatactg tttactcaat tttggagaca gtattaccac tgatcacatc  2160

tcaccagctg gtagcatcca caaggacagt cctgcggcta agtacttgat ggaacgaggt  2220

gtggatagaa gagacttcaa ctcatacggg agtcgccgtg gtaatgatga gattatggcg  2280

agaggcactt ttgcaaatat ccgtattgtc aacaaacact tgaaaggaga agttggtccc  2340

aaaacagttc acattcccac tggagagaag ctttctgttt tcgatgctgc catgaaatat  2400

aggaacgagg gacgcgacac aatcattttg gctggtgctg aatacggtag tggaagttct  2460

cgtgattggg ctgccaaggg tccaatgctt ctgggtgtga aagctgtgat ttcaaagagc  2520

ttcgagcgaa ttcaccgaag caatttggtg ggaatgggaa tcataccttt gtgcttcaag  2580

gcgggagaag atgctgagac ccttggccta acgggtcagg agctttacac cattgagctc  2640

ccaaacaatg ttagtgagat caaaccagga caagatgtaa cagtcgtcac aaacaatggc  2700

aaatctttca catgtacact ccgatttgac acagaggtgg agttggctta tttcgatcac  2760

ggagggattt tgcaatacgt tatcaggaac ttgatcaaac aataaatctg gtaacaccag  2820

agacttgagt tatatatccc aaggtttgtt gcaataaaaa tgtttgcagg gaggaggacg  2880

agaatgactt taatttaaac ttttgctttt gttcttcttc gtctcttgct tcgtgctagt  2940

caattggaaa cattatcact gtcgagtcat tttttttctt tcaaataaac atgcgagctc  3000

tttttttgtt gttgttgttc ataagcattg tcaatgctgc attgatagaa gtatactcta  3060

ccattagaaa ataaacacaa atacacaaag taatctaaag agctagagga tgaaaattat  3120

cttgtgaagg ttgtacaaaa acattaaaaa aaatctgaga tgatccaaag gattgattat  3180

cacattcgaa gtgatggtca gagattacct cttg                      3214

<210>2

<211>898

<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

<400>2

Met Ala Ser Glu Asn Pro Phe Arg Ser Ile Leu Lys Ala Leu Glu Lys

1         5           10          15

Pro Asp Gly Gly Glu Phe Gly Asn Tyr Tyr Ser Leu Pro Ala Leu Asn

      20             25          30

Asp Pro Arg Ile Asp Lys Leu Pro Tyr Ser Ile Arg Ile Leu Leu Glu

    35            40          45

Ser Ala Ile Arg Asn Cys Asp Glu Phe Gln Val Lys Ser Lys Asp Val

  50             55          60

Glu Lys Ile Leu Asp Trp Glu Asn Thr Ser Pro Lys Gln Val Glu Ile

65            70           75           80

Pro Phe Lys Pro Ala Arg Val Leu Leu Gln Asp Phe Thr Gly Val Pro

          85          90          95

Ala Val Val Asp Leu Ala Cys Met Arg Asp Ala Met Asn Asn Leu Gly

        100          105          110

Gly Asp Ser Asn Lys Ile Asn Pro Leu Val Pro Val Asp Leu Val Ile

     115          120           125

Asp His Ser Val Gln Val Asp Val Ala Arg Ser Glu Asn Ala Val Gln

  130           135           140

Ala Asn Met Glu Leu Glu Phe Gln Arg Asn Lys Glu Arg Phe Ala Phe

145          150          155           160

Leu Lys Trp Gly Ser Asn Ala Phe His Asn Met Leu Val Val Pro Pro

          165         170            175

Gly Ser Gly Ile Val His Gln Val Asn Leu Glu Tyr Leu Ala Arg Val

      180             185            190

Val Phe Asn Thr Asn Gly Leu Leu Tyr Pro Asp Ser Val Val Gly Thr

     195          200         205

Asp Ser His Thr Thr Met Ile Asp Gly Leu Gly Val Ala Gly Trp Gly

  210           215           220

Val Gly Gly Ile Glu Ala Glu Ala Thr Met Leu Gly Gln Pro Met Ser

225           230            235           240

Met Val Leu Pro Gly Val Val Gly Phe Lys Leu Thr Gly Lys Leu Arg

         245          250            255

Asp Gly Met Thr Ala Thr Asp Leu Val Leu Thr Val Thr Gln Met Leu

      260            265          270

Arg Lys His Gly Val Val Gly Lys Phe Val Glu Phe His Gly Glu Gly

     275          280            285

Met Arg Glu Leu Ser Leu Ala Asp Arg Ala Thr Ile Ala Asn Met Ser

  290           295          300

Pro Glu Tyr Gly Ala Thr Met Gly Phe Phe Pro Val Asp His Val Thr

305           310           315           320

Leu Gln Tyr Leu Arg Leu Thr Gly Arg Ser Asp Asp Thr Val Ser Met

          325         330            335

Ile Glu Ala Tyr Leu Arg Ala Asn Lys Met Phe Val Asp Tyr Ser Glu

        340           345           350

Pro Glu Ser Lys Thr Val Tyr Ser Ser Cys Leu Glu Leu Asn Leu Glu

    355           360           365

Asp Val Glu Pro Cys Val Ser Gly Pro Lys Arg Pro His Asp Arg Val

  370           375           380

Pro Leu Lys Glu Met Lys Ala Asp Trp His Ser Cys Leu Asp Asn Arg

385          390            395          400

Val Gly Phe Lys Gly Phe Ala Val Pro Lys Glu Ala Gln Ser Lys Ala

         405          410            415

Val Glu Phe Asn Phe Asn Gly Thr Thr Ala Gln Leu Arg His Gly Asp

      420            425         430

Val Val Ile Ala Ala Ile Thr Ser Cys Thr Asn Thr Ser Asn Pro Ser

     435             440          445

Val Met Leu Gly Ala Ala Leu Val Ala Lys Lys Ala Cys Asp Leu Gly

  450           455           460

Leu Glu Val Lys Pro Trp Ile Lys Thr Ser Leu Ala Pro Gly Ser Gly

465           470            475          480

Val Val Thr Lys Tyr Leu Ala Lys Ser Gly Leu Gln Lys Tyr Leu Asn

          485           490           495

Gln Leu Gly Phe Ser Ile Val Gly Tyr Gly Cys ThrThr Cys Ile Gly

      500            505            510

Asn Ser Gly Asp Ile His Glu Ala Val Ala Ser Ala Ile Val Asp Asn

    515            520            525

Asp Leu Val Ala Ser Ala Val Leu Ser Gly Asn Arg Asn Phe Glu Gly

  530           535           540

Arg Val His Pro Leu Thr Arg Ala Asn Tyr Leu Ala Ser Pro Pro Leu

545           550           555          560

Val Val Ala Tyr Ala Leu Ala Gly Thr Val Asp Ile Asp Phe Glu Thr

          565           570          575

Gln Pro Ile Gly Thr Gly Lys Asp Gly Lys Gln Ile Phe Phe Arg Asp

       580            585           590

Ile Trp Pro Ser Asn Lys Glu Val Ala Glu Val Val Gln Ser Ser Val

      595           600          605

Leu Pro Asp Met Phe Lys Ala Thr Tyr Glu Ala Ile Thr Lys Gly Asn

  610           615          620

Ser Met Trp Asn Gln Leu Ser Val Ala Ser Gly Thr Leu Tyr Glu Trp

625          630          635            640

Asp Pro Lys Ser Thr Tyr Ile His Glu Pro Pro Tyr Phe Lys Gly Met

         645           650            655

Thr Met Ser Pro Pro Gly Pro His Gly Val Lys Asp Ala Tyr Cys Leu

      660            665          670

Leu Asn Phe Gly Asp Ser Ile Thr Thr Asp His Ile Ser Pro Ala Gly

    675           680           685

Ser Ile His Lys Asp Ser Pro Ala Ala Lys Tyr Leu Met Glu Arg Gly

  690            695            700

Val Asp Arg Arg Asp Phe Asn Ser Tyr Gly Ser Arg Arg Gly Asn Asp

705           710         715            720

Glu Ile Met Ala Arg Gly Thr Phe Ala Asn Ile Arg Ile Val Asn Lys

          725           730           735

His Leu Lys Gly Glu Val Gly Pro Lys Thr Val His Ile Pro Thr Gly

      740            745           750

Glu Lys Leu Ser Val Phe Asp Ala Ala Met Lys Tyr Arg Asn Glu Gly

     755         760            765

Arg Asp Thr Ile Ile Leu Ala Gly Ala Glu Tyr Gly Ser Gly Ser Ser

  770             775           780

Arg Asp Trp Ala Ala Lys Gly Pro Met Leu Leu Gly Val Lys Ala Val

785           790           795          800

Ile Ser Lys Ser Phe Glu Arg Ile His Arg Ser Asn Leu Val Gly Met

          805           810           815

Gly Ile Ile Pro Leu Cys Phe Lys Ala Gly Glu Asp Ala Glu Thr Leu

        820           825           830

Gly Leu Thr Gly Gln Glu Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Pro Asn Asn Val

     835          840           845

Ser Glu Ile Lys Pro Gly Gln Asp Val Thr Val Val Thr Asn Asn Gly

  850            855          860

Lys Ser Phe Thr Cys Thr Leu Arg Phe Asp Thr Glu Val Glu Leu Ala

865          870          875           880

Tyr Phe Asp His Gly Gly Ile Leu Gln Tyr Val Ile Arg Asn Leu Ile

         885          890            895

Lys Gln

Claims (11)

1.转基因植物，包括含有编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的顺乌头酸酶多肽的核苷酸序列或其互补序列或其直向同源物的植物转化载体，由此，转基因植物相对于对照植物为高油表现型。

2.权利要求1的转基因植物，其选自油菜，大豆，谷物，向日葵，棉花，可可，红花，油棕，椰子，亚麻，蓖麻以及花生。

3.从权利要求1的植物获得的植物的部分。

4.权利要求3的植物的部分，其是种子。

5.产生油类的方法，包括培育权利要求1的转基因植物以及从所述植物回收油类。

6.产生高油表现型植物的方法，所述方法包括：

a)向植物的祖细胞引入包括编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的顺乌头酸酶多肽的核苷酸序列或其互补序列或其直向同源物的植物转化载体，以及

b)培育转化的祖细胞产生转基因植物，所述多核苷酸序列在所述转基因植物中表达，并且所述转基因植物相对于对照植物表现改变的含油量表现型。

7.通过权利要求6的方法获得的植物。

8.权利要求7的转基因植物，其选自油菜，大豆，谷物，向日葵，棉花，可可，红花，油棕，椰子，亚麻，蓖麻以及花生。

9.产生具有高油表现型植物的方法，包括鉴定具有顺乌头酸酶基因的等位基因的植物，所述顺乌头酸酶基因的等位基因引起与缺少等位基因且产生所述鉴定的植物子代的植物相比含油量的增加，其中产生的子代遗传等位基因并且为高油表现型。

10.权利要求9的方法，利用候选基因/QTL法。

11.权利要求9的方法，利用TILLING法。