MXPA05006761A - Generacion de plantas con contenido alterado de aceite. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a plantas que presentan un fenotipo de contenido alterado de aceite, debido a la expresion alterada de un acido nucleico de citratosintetasa. La invencion tambien se refiere a metodos para generar plantas con un fenotipo de contenido alterado de aceite.

Description

GENERACIÓN DE PLANTAS CON CONTENIDO ALTERADO DE ACEITE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La capacidad para manipular la composición de semillas de un cultivo, en particular el contenido y la composición de aceites de semillas, tiene importantes aplicaciones en las industrias agrícolas, tanto relacionadas con aceites comestibles procesados como a aceites para alimentación de animales. Las semillas de los cultivos agrícolas contienen diversos constituyentes valiosos, tales como aceite, proteínas y almidón. El procesamiento industrial permite separar algunos de estos constituyentes, o todos, para su venta por separado, en las distintas aplicaciones. Por ejemplo, casi el 60% de la cosecha de poroto de soja de los Estados Unidos es utilizada en la industria del procesamiento de la soja. Mediante el procesamiento de la soja se obtiene aceite purificado, que se vende a alto precio, mientras que el resto se vende a menor precio, principalmente como alimento de ganado (U.S. Soybean Board, 2001 Soja Stats) . La semilla de cañóla se muele para obtener aceite y el subproducto harina de cañóla (Cañóla Council of Canadá) . Casi el 20% de la cosecha de maíz de 1999/2000 en los Estados Unidos se refino en la industria, sobre todo en la producción de almidón, etanol y aceite (Corn Refiners Association) . En consecuencia, a menudo es conveniente maximizar el contenido de aceite de las semillas. Por ejemplo, para las semillas de aceite procesadas, tales como soja y cañóla, el incremento del contenido absoluto de aceite aumenta el valor de dichos granos. Para el maíz procesado puede ser de interés incrementar o disminuir el contenido de aceite, según la utilización de otros constituyentes importantes. La disminución de aceite puede mejorar la calidad del almidón aislado, al reducir los sabores no deseados que se asocian a la oxidación del aceite. Como alternativa, en la producción de etanol, donde el sabor no tiene importancia, el incremento del contenido de aceite puede aumentar el valor global . En muchos granos para alimentación, tales como maíz y trigo, interesa aumentar el contenido de aceite de las semillas, dado que el aceite tiene mayor contenido de energía que otros constituyente de las semillas, por ejemplo los hidratos de carbono. El procesamiento de las semillas oleaginosas, al igual que la mayoría de las actividades económicas de procesamiento, es un negocio de capital intensivo; en consecuencia, pequeñas modificaciones en la distribución de productos, desde los componentes de bajo valor hasta los componentes de aceite de alto valor pueden tener impactos económicos sustanciales para los procesadores de granos . La manipulación biotecnológica de los aceites puede causar alteraciones de la composición y mejoramientos de los rendimientos de aceite. Entre las alteraciones de la composición se incluyen los aceites de alto contenido oleico de poroto de soja y de maíz (patentes de los Estados Unidos N.° 6.229.033 y 6.248.939) y semillas con contenido de laureato (patente de los Estados Unidos N.° 5.639.790), entre otras. Los trabajos de alteración de la composición han centrado la atención, sobre todo, en semillas oleaginosas procesadas, pero se han extendido a cultivos de semillas no oleaginosas, por ejemplo maíz. Si bien hay considerable interés en incrementar el contenido de aceite, la única tecnología practicada en la actualidad en este área es la tecnología de maíz de alto contenido de aceite [High-Oil aize.HOC] (DuPont, patente de los Estados Unidos N. ° 5.704.160). HOC utiliza polinizadores de alto contenido de aceite, desarrollados mediante cultivos de selección clásicos, y elementos femeninos de élite híbridos (con elementos masculinos estériles) en un sistema de producción denominado TopCross. El sistema TopCross High Oil aumenta el contenido de aceite en granos de maíz cosechados desde ~ 3,5% a ~ 7%, por lo que aumenta el contenido energético del grano. Si bien ha sido fructífero, el sistema de producción HOC tiene limitaciones inherentes. Primero, el sistema de tener un bajo porcentaje de polinizadores responsables de las semillas de todo un campo contiene riesgos inherentes, particularmente en años de sequía. Segundo, los contenidos de aceite en los actuales campos de HOC muestran una meseta en aproximadamente el 9% de aceite. Por último, el maíz de alto contenido de aceite no es en 1 principio un cambio bioquímico, sino más bien un mutante anatómico (aumento del tamaño del embrión) con el resultado indirecto de aumentar el contenido de aceite. Por estos motivos, sería especialmente valioso contar con una estrategia alternativa de alto contenido de aceite, en particular uno que derive de un producto bioquímico alterado. Los cultivos blanco más obvios para el mercado de aceite procesado son soja, maíz y colza, y gran parte de los trabajos comerciales (por ejemplo, patente de los Estados Unidos N.° 5.952.544; solicitud PCT W09411516) demuestra que Arabidopsis es un excelente modelo para el metabolismo del aceite en estos cultivos. Los estudios bioquímicos sobre la composición de las semillas oleaginosas identificaron genes de Arabidopsis para muchas enzimas biosintéticas esenciales y condujeron a la identificación de ortólogos génicos de importancia agronómica. Por ejemplo, las búsquedas en poblaciones a las que se aplicó mutagénesis química identificaron mutantes lipídicas cuyas semillas presentan alteraciones de la composición de ácidos grasos (Lemieux B, et al. 1990, Theor Appl Genet 80, 234-240; James DW y Dooner HK (1990) Theor Appl Genet 80, 241-245) . Las búsquedas de mutagénesis T-ADN (Feldmann et al., Science 243: 1351-1354, 1989) que detectaron alteraciones de la composición de ácidos grasos identificaron los genes de omega 3 desaturasa (FAD3) y delta- 12 -desaturasa (FAD2) (patente de los Estados Unidos N.° 5952544; Yadav NS et al. (1993) Plant Physiol 103, 467-476; Okuley et al., Plant Cell. 1994 Jan; 6 (1) : 147-58) . Un estudio que centró la atención sobre el contenido de aceite en lugar de sobre la calidad del aceite analizó los mutantes inducidos por acción química para buscar semillas rugosas o alteración de la densidad de las semillas, de lo cual se infirió la alteración del contenido de aceite de las semillas (Focks N y Benning C, Plant Physiol 118:91-101, 1998). Otro estudio, diseñado para detectar las enzimas que intervienen en la producción de ácidos grasos de cadenas muy largas, identificaron una mutación en el gen codificador de una diacilglicerolaciltransferasa (DGAT) , responsable de la acumulación reducida de triacilglicerol en las semillas ( atavic V et al, Plant Physiol. 1995 May; 108 (1) :399-409) . También se demostró que la expresión excesiva del cADN DGAT específico de la semilla se asocia a aumento del contenido de aceite en las semillas (Jako et al., Plant Physiol. 2001 Jun; 126 (2) : 861-74) .

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La invención provee una planta transgénica con un fenotipo de alto contenido de aceite. La planta transgénica comprende un vector de transformación que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica o es vector complementario a una secuencia que codifica un polipéptido de citratosintetasa . En formas de realización de preferencia, la planta transgenica se selecciona del grupo que consiste en colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palmera de aceite, palmera cocotera, lino, ricino y maní. La invención provee, además, un método para la producción de aceite, que comprende el cultivo de la planta transgenica y la recuperación de aceite de dicha planta. La planta transgénica de la invención es producida por un método que comprende la introducción en células progenitoras de la planta un vector de transformación vegetal que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido de citratosintetasa, y cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde la secuencia de polinucleótido de citratosintetasa se expresa para causar el fenotipo con alto contenido de aceite .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A menos que se indique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que para un experto en el arte de la presente invención. En particular se derivan los operadores a Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition) , Cold Spring Harbor Press, Plainview, ?.?., 1989, y Ausubel FM et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, ?.?. , 1993, para las definiciones y los términos del arte. Se debe entender que la presente invención no está limitada por la metodología, los protocolos, y los reactivos particulares descritos, que pueden variar. Tal como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para ser transferida a distintas células huésped. El "vector de expresión" se refiere a un vector con capacidad para incorporar y expresar fragmentos heterólogos de ADN en una célula extraña. En el comercio existen muchos vectores de expresión procariontes y eucariontes . La selección de los vectores de expresión adecuados es parte del conocimiento de los expertos en el arte . Una construcción o secuencia "heteróloga" de ácido nucleico tiene una porción de la secuencia que no es nativa de la célula vegetal en la cual se expresa. Heterólogo respecto de una secuencia control se refiere a una secuencia control (es decir, un promotor o incentivador) que en la naturaleza no actúa en la regulación del mismo gen cuya expresión regula en la actualidad. Por lo general, las secuencias heterólogas de ácidos nucleicos no son endógenas de la célula o de la parte del genoma en la cual se presentan, y se han agregado a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, o similares. Una construcción "heteróloga" de ácidos nucleicos puede contener una combinación de una secuencia control/secuencia de ADN codificadora igual o diferente de una combinación de secuencia control/secuencia de ADN codificadora que se encuentra en la planta nativa. Tal como se usa en la presente, el término "gen" significa el segmento de ADN que interviene en la producción de una cadena de polipéptidos, que puede o no incluir las regiones anteriores y siguientes a la región codificadora, por ejemplo las secuencias 5' no traducidas (5' UTR) o "guía" y las secuencias 3' UTR o "remolque" , además de las secuencias intermedias (intrones) entre cada uno de los segmentos codificadores (exones) y las secuencias reguladoras no transcriptas . Tal como se usa en la presente, "recombinante" incluye referencias a una célula o vector que ha sido modificado por la introducción de una secuencia heteróloga de ácidos nucleicos o que la célula deriva de una célula así modificada. En consecuencia, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresa genes nativos que se expresan de otra forma anormal, se expresan en defecto o no se expresan en absoluto, como consecuencia de la intervención humana deliberada . Tal como se usa en la presente, el término "expresión génica" se refiere al proceso por el cual se prepara un polipéptido en base a la secuencia de ácidos nucleicos de un gen. El proceso incluye la transcripción y la traducción; en consecuencia, "expresión" se puede referir a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos , o arabos. En ocasiones, la expresión de una secuencia de polinucleótidos no conduce a la traducción de una proteina. "Sobreexpresión" se refiere a un incremento de la expresión de la secuencia de un polinucleótido y/o polipéptido respecto de su expresión en una planta de tipo salvaje (u otra referencia [por ejemplo, no transgénica] ) y se puede relacionar con una secuencia natural o no natural . "Expresión ectópica" se refiere a la expresión en un momento, lugar y/o nivel incrementado que no ocurre naturalmente en la planta no alterada o de tipo salvaje. "Subexpresión" se refiere a una expresión disminuida de una secuencia de polinucleótido y/o polipéptido, en general de un gen endógeno, respecto de su expresión en una planta de tipo salvaje. Los términos "error de expresión" y "expresión alterada" incluyen la sobreexpresión, la subexpresión y la expresión ectópica. El término "introducido" , en el contexto de la inserción de una secuencia de ácidos nucleicos en una célula, significa "transíección" , "transformación" o "transducción" , e incluye referencias a la incorporación de una secuencia de ácidos nucleicos en una célula eucarionte o procarionte, en donde se puede incorporar la secuencia de ácidos nucleicos en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, pl stido o ADN ' mitocondrial) , convertido en un replicón autónomo, o expresarlo transitoriamente (por ejemplo, mARN transfectado) . Tal como se usa en la presente, una "célula vegetal" se refiere a cualquier célula derivada de una planta, por ejemplo células provenientes de tejido indiferenciado (por ejemplo, callos) además de semillas, polen, propágulos y embriones vegetales. Tal como se usan en la presente, los términos "nativo" y "tipo salvaje" respecto de determinado rasgo o fenotipo vegetal se refieren a la forma en la cual se encuentra el rasgo o fenotipo en la misma variedad de planta en la naturaleza. Tal como se usa en la presente, el término "modificado" respecto de un rasgo vegetal se refiere a un cambio del fenotipo de una planta transgénica, en relación con la planta similar no transgénica. Un "fenotipo de contenido alterado de aceite" se refiere a un fenotipo mensurable de una planta genéticamente modificada, en donde la planta muestra un incremento o disminución estadísticamente significativo del contenido total de aceite (es decir, el porcentaje de masa de la semilla que es aceite), comparado con la planta similar, pero no modificada. Un fenotipo con mayor contenido de aceite se refiere a un incremento del contenido total de aceite. Tal como se usa en la presente, · una secuencia "mutante" de polinucleotidos o genes difiere de la correspondiente secuencia de polinucleotidos o genes de tipo salvaje, ya sea en términos de secuencia o expresión, en donde la diferencia contribuye a un fenotipo o rasgo vegetal modificado. Respecto de una planta o linea vegetal, el término "mutante" se refiere a una planta o linea vegetal con un fenotipo o rasgo vegetal modificado, en donde el fenotipo o rasgo modificado se asocia con la expresión modificada de una secuencia de polinucleótidos o genes de tipo salvaj e . Tal como se usa en la presente, el término "TI" se refiere a la generación de plantas a partir de las semillas de plantas TO . La generación TI es el primer grupo de plantas transformadas que se pueden seleccionar por solicitud de un agente de selección, por ejemplo, un antibiótico o herbicida, para los cuales la planta transgénica contiene el correspondiente gen de resistencia. El término "T2" se refiere a la generación de plantas por autofertilización de las flores de las plantas TI, previamente seleccionadas como transgénicas . Las plantas T3 se generan a partir de plantas T2 , etc. Tal como se usa en la presente, la "progenie directa" de determinada planta deriva de la semilla (o, en ocasiones otros tejidos) de dicha planta y es la generación inmediata posterior; por ejemplo, para determinado linaje, una planta T2 es la progenie directa de una planta TI. La "progenie indirecta" de determinada planta deriva de la semilla (u otro tejido) de la progenie directa de dicha planta, o de la semilla (u otro tejido) de posteriores generaciones de dicho linaje; por ejemplo, una planta T3 es la progenie indirecta de una planta TI. Tal como se usa en la presente, el término "parte de planta" incluye cualquier órgano o tejido vegetal, tal como, por ejemplo y sin limitaciones, semillas, embriones, regiones meristemáticas , tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas . Las células vegetales se pueden obtener de cualquier órgano o tejido vegetal y los cultivos preparados a partir de ellos. Por lo general, la clase de plantas que se pueden usar en los métodos de la presente invención, es tan amplia como la clase de plantas superiores a las que se pueden aplicar las técnicas de transformación, tales como plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas . Tal como se usa en la presente, "planta transgénica" incluye una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en forma estable al genoma, o puede ser extracromosómico. De preferencia, el polinucleótido de la presente invención se integra en forma estable al genoma, por lo que el polinucleótido se pasa a las sucesivas generaciones. La célula, tejido, órgano vegetal o planta en los cuales se han introducido los polinucleótidos heterólogos se consideran "transformados", "transíectados" o "transgénicos" . La progenie directa e indirecta de las plantas o células vegetales transformadas que también contienen el polinucleótido heterólogo también se considera transgénica.

Identificación de plantas con fenotipo de contenido alterado de aceite Se obtuvieron plantas transgénicas que expresaban en exceso diversos genes codificadores de enzimas de la via de glioxilato, y se estudiaron las semillas de las plantas transgénicas TI para determinar el fenotipo de elevado contenido de aceite . Se descubrió que la expresión excesiva de citratosintetasa (At3g58750; GI# 15231130) confiere un fenotipo de contenido alterado de aceite (específicamente, un fenotipo de alto contenido de aceite en la semilla) . En consecuencia, se pueden utilizar los genes y/o polipétidos de citratosintetasa en el desarrollo de plantas genéticamente modificadas, con fenotipo modificado contenido de aceite. Los genes de citratosintetasa se pueden usar en la generación de cultivos de semillas oleaginosas que proveen un rendimiento mejorado de aceite a partir del procesamiento de semillas oleaginosas y en la generación de cultivos de granos alimenticios que proveen mayor rendimiento de aceite a partir del procesamiento de las semillas de oleaginosa, y en la generación de cultivos de granos alimenticios que proveen mayor energía para la alimentación animal. Además, los genes de citratosintetasa se pueden usar para aumentar el contenido de aceite de cultivos de oleaginosas especiales, a fin de aumentar el rendimiento de los ácidos grasos inusuales buscados. Las plantas transgénicas que han sido genéticamente modificadas para expresar citratosintetasa se pueden usar en la producción de aceite, en donde se cultivan las plantas transgénicas y se obtiene aceite de partes de las plantas (por ejemplo, semilla) mediante métodos estándar. Ácidos nucleicos y polipéptidos de citratosintetasa El ácido nucleico de citratosintetasa de Arabidopsis se provee en SEQ ID N0:1 y en el acceso Genbank GI#30694870. La correspondiente secuencia de proteína se provee en la SEQ ID NO: 2 y en GI#15231130. En el Ejemplo 2 siguiente se describen ácidos nucleicos y/o proteínas que son ortólogos o parálogos de citratosintetasa de Arabidopsis. Tal como se usa en la presente, el término "polipéptido de citratosintetasa" se refiere a una proteína de longitud total citratosintetasa o un fragmento de ella, su derivado (variante) u ortólogo que es "funcionalmente activo" , lo cual significa que el fragmento, derivado u ortólogo de proteína exhibe una o más de las actividades funcionales asociadas con el polipéptido de SEQ ID NO:2. En una forma de realización de preferencia, un polipéptido de citratosintetasa funcionalmente activo genera un fenotipo de contenido alterado de aceite cuando hay error de expresión en una planta. En una forma de realización de preferencia, el error de expresión del polipéptido de citratosintetasa genera un fenotipo con alto contenido de aceite en una planta. En otra forma de realización, un polipéptido de citratosintetasa funcionalmente activo es capaz de rescatar la actividad endógena defectuosa (incluso deficiente) de citratosintetasa cuando se expresa en una planta o en células vegetales; el polipéptido de rescate puede ser de la misma especie o de una especie diferente a la que tiene actividad defectuosa. En otra forma de realización, un fragmento funcionalmente activo de un polipéptido de citratosintetasa de longitud total (es decir, un polipéptido nativo con la secuencia SEQ ID NO: 2 o su ortólogo natural) retiene una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido de citratosintetasa de longitud total, tal como la actividad catalítica. De preferencia, un fragmento de citratosintetasa comprende un dominio de citratosintetasa, por ejemplo un dominio C terminal o N terminal, o catalítico, entre otros, y de preferencia comprende al menos 10, de preferencia al menos 20, con mayor preferencia al menos 25, con mayor preferencia aún al menos 50 aminoácidos contiguos de una proteína de citratosintetasa. Los dominios funcionales se pueden identificar mediante el programa PFAM (Bateman A et al., 1999 Nucleic Acids Res 27:260-262; sitio en la red pfam.wustl.edu). Las variantes funcionalmente activas de los polipéptidos de citratosintetasa de longitud total o sus fragmentos incluyen los polipéptidos con inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que retienen una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipeptido de citratosintetasa de longitud total . En algunos casos se generan variantes que cambian el procesamiento postraduccional de un polipeptido de citratosintetasa. Por ejemplo, las variantes pueden tener características alteradas en el transporte de proteínas o de localización de proteínas, o vida media alterada de la proteína, comparadas con el polipeptido nativo . Tal como se usa en la presente, el término "ácido nucleico de citratosintetasa" abarca los ácidos nucleicos con la secuencia provista en SEQ ID N0:1, además de sus fragmentos, derivados u ortólogos funcionalmente activos . Un ácido nucleico de citratosintetasa de la presente invención puede ser ADN, derivado de ADN o cADN, o ARN genómicos . En una forma de realización, un ácido nucleico de citratosintetasa funcionalmente activo codifica o es complementario a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citratosintetasa funcionalmente activo. En esta definición se incluye el ADN genómico que sirve como plantilla para una transcripción primaria de ARN (es decir, un precursor de mARN) que requiere el procesamiento, por ejemplo el empalme, antes de codificar el polipéptido de citratosintetasa funcionalmente activo. Un ácido nucleico de citratosintetasa puede incluir otras secuencias no codificadoras, que se pueden transcribir o no; dichas secuencias incluyen 5 ' y 3 ' UTR, señales de poliadenilación y secuencias reguladoras que controlan la expresión génica, entre otras, como se conocen en el arte. Algunos polipéptidos requieren eventos de procesamiento tales como escisión proteolítica, modificación covalente, etc., a fin de transformarse en totalmente activos. En consecuencia, los ácidos nucleicos funcionalmente activos pueden codificar el polipéptido de citratosintetasa maduro o preprocesado, o una forma intermedia. Un polinucleótido de citratosintetasa también puede incluir secuencias codificadoras heterólogas, por ejemplo, secuencias que codifican un marcador incluido para facilitar la purificación del polipéptido fusionado, o un marcador de transformación. En otra forma de realización, se puede usar un ácido nucleico de citratosintetasa funcionalmente activo para generar fenotipos de citratosintetasa con pérdida de función, por ejemplo, a través de la supresión antisentido, cosupresión, etc. En una forma de realización de preferencia, un ácido nucleico de citratosintetasa usado en los métodos de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de citratosintetasa con al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o mayor identidad de secuencia con la secuencia de polipeptido presentada en SEQ ID NO: 2. En otra forma de realización, un polipéptido de citratosintetasa de la invención comprende una secuencia de polipéptido con al menos el 50% o el 60% de identidad con la secuencia de polipéptido de citratosintetasa de SEQ ID NO: 2, y puede tener al menos 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o mayor identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de citratosintetasa de SEQ ID NO : 2. En otra forma de realización, un polipéptido de citratosintetasa comprende una secuencia de polipéptido con al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o mayor identidad de secuencia con un fragmento funcionalmente activo del polipéptido presentado en SEQ ID N0:2. En aún otra forma de realización, un polipéptido de citratosintetasa comprende una secuencia de polipéptido con al menos el 50%, 60 %, 70%, 80%, o 90% de identidad con la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 2 en toda su longitud. En otro aspecto, una secuencia de polinucleótidos de citratosintetasa es al menos 50% a 60% idéntica en toda su longitud a la secuencia de ácidos nucleicos de citratosintetasa de SEQ ID N0:1, o la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a dicha secuencia de citratosintetasa, y puede comprender al menos 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o mayor identidad de secuencia con la secuencia de citratosintetasa presentada en SEQ ID N0:1, o su fragmento funcionalmente activo o las secuencias complementarias. Tal como se usa en la presente, "porcentaje (%) de identidad de secuencia" respecto de una específica secuencia de sujeto, o su porción específica, se define como porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en el candidato de secuencia derivada idéntica a los nucleótidos o aminoácidos en la secuencia sujeto (o su porción especifica) , después de alinear las secuencias e introducir brechas, de ser necesario, para obtener el porcentaje máximo de identidad de secuencia, generado por el programa WU-BLAST-2.0al9 (Altschul et al., J. Mol. Biol . (1997) 215:403-410; sitio en la red blast.wustl.edu/blast/README.html) con parámetros de búsqueda fijados en valores predeterminados. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos establecidos por el mismo programa, de acuerdo con la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular en la cual se busca la secuencia de interés. Un "valor % de identidad" se determina por la cantidad de nucleótidos o aminoácidos idénticos concordantes dividido por la longitud de secuencia para la cual se informa el porcentaje de identidad. Se determina el "porcentaje (%) de similitud de secuencia de aminoácidos" mediante el cálculo para determinar el % de identidad de secuencia de aminoácidos, incluso las sustituciones conservadoras de aminoácidos, además de incluir en el cálculo los aminoácidos idénticos . Una sustitución conservadora de aminoácidos es aquella en donde un aminoácido es sustituido por otro aminoácido con propiedades similares, de manera tal que el plegamiento o la actividad de la proteína no se ven afectados en forma significativa. Entre los aminoácidos aromáticos que se pueden sustituir entre sí se cuentan fenilalanina, triptofano y tirosina; los aminoácidos hidrofóbicos intercambiables son leucina, isoleucina, metionina y valina; los aminoácidos polares intercambiables son glutamina y asparagina los aminoácidos básicos intercambiables son arginina, lisina e histidina; los aminoácidos ácidos intercambiables son ácido aspártico y ácido glutámico; y los aminoácidos pequeños intercambiables son alanina, serina, treonina, cisteína y glicina. Las moléculas de ácido nucleico derivadas de las moléculas de ácido nucleico del sujeto incluyen secuencias que se hibridan a la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:l. Se puede controlar la rigurosidad de la hibridación mediante la temperatura, la fuerza iónica, el pH, y la presencia de agentes desnaturalizantes tales como formamida durante la hibridación y el lavado. Las condiciones utilizadas de rutina son bien conocidas (ver por ejemplo, Current Protocol in Molecular Biology, Vol. 1, Cap. 2.10, John Wiley & Sons, Publishers (1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)). En algunas formas de realización, una molécula de ácido nucleico de la invención tiene capacidad para hibridarse a una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N0:1 bajo rigurosas condiciones de hibridación, tales como: prehibridación de los filtros que contienen ácidos nucleicos durante 8 horas a durante toda la noche a 65 °C en una solución que comprende citrato de fuerza simple 6X (SSC) (IX SSC es 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de Na; pH 7,0), solución de Denhardt 5X, 0,05% de pirofosfato de sodio y 100 /ug/ml de ADN de esperma de arenque; hibridación durante 18-20 horas a 65 °C en una solución que contiene 6X SSC, solución de Denhardt IX, 100 µ /??1 de tARN de levadura y 0,05% de pirofosfato; y se lavan los filtros a 65°C durante 1 h en una solución que contiene 0,1X SSC y 0,1% SDS (dodecilsulfato de sodio) . En otras formas de realización se usan las siguientes condiciones de hibridación de rigurosidad: pretratamiento de los filtros que contienen ácidos nucleicos durante 6 h a 40 °C en una solución que contiene 35% de formamida, 5X SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,1% de PVP, 0,1% de Ficol, 1% de BSA, y 500 /ug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado; hibridación durante 18-20 h a 40°C en una solución que contiene 35% de formamida, 5X SSC, 50 de mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficol, 0,2% de BSA, 100 /xg/ml de ADN de esperma de salmón, y 10% (p/vol) de sulfato de dextrán; seguido de dos lavados durante 1 hora a 55°C en una solución que contiene 2X SSC y 0,1% de SDS. Como alternativa, se pueden usar condiciones de ba a rigurosidad que comprenden: incubación durante 8 horas a durante la noche a 37°C en una solución que comprende 20% de formamida, 5 x SSC, 50 mM de fosfato de sodio (pH 7,6) , solución de Denhardt 5X, 10% de sulfato de dextrán, y 20 /xg/ml de ADN de esperma de salmón recortado y desnaturalizado; hibridación en el mismo buffer durante 18 a 20 horas; y lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37°C durante 1 hora. Como consecuencia de la degeneración del código genético se pueden obtener diversas secuencias de polinucleótidos codificadores de polipéptido de citratosintetasa . Por ejemplo, se pueden seleccionar codones para aumentar la tasa a la cual tiene lugar la expresión del polipéptido en una especie de huésped particular, de acuerdo con el uso de codón óptimo dictado por el organismo huésped particular (ver, por ejemplo, Nakamura et al, 1999, Nuciere Acids Res 27:292) . Dichas variantes de secuencia se pueden usar en los métodos de la presente invención. Los métodos de la invención pueden usar ortólogos de citratosintetasa de Arabidopsis . Los métodos para identificar los ortólogos en otras especies vegetales se conocen en el arte. Normalmente, los ortólogos de distintas especies retienen la misma función, debido a la presencia de uno o más motivos de proteina y/o estructuras tridimensionales. En la evolución, cuando un evento de duplicación de genes sigue la especiación, un único gen de una especie, por ejemplo Arabidopsis, puede corresponder a múltiples genes (paralogos) en otra. Tal como se usa en la presente, el término "ortólogos" incluye los paralogos. Cuando están disponibles los datos de secuencia para una especie vegetal particular, por lo general se identifican los ortólogos mediante análisis de homología de secuencia, tal como análisis BLAST, por lo general mediante secuencias de cebos de proteína. Las secuencias se asignan como ortólogos potenciales si el resultado de la secuencia mejor incidida del BLAST hacia adelante permite recuperar la secuencia de averiguación en el BLAST inverso (Huynen MA y Bork P, Proc Nati Acad Sci (1998) 95:5849-5856; Huynen MA et al., Genome Research (2000) 10:1204-1210). Se pueden usar programas para la alineación de secuencias múltiples, tales como CLUSTAL (Thompson JD et al, 1994, Nucleic Acid Res 22:4673-4680) para destacar regiones y/o residuos conservados de proteínas ortologas y generar árboles filogenéticos . En un árbol filogenético que representa secuencias homologas múltiples de diversas especies (por ejemplo, recuperadas por análisis BLAST) , por lo general las secuencias ortologas de dos especies aparecen más cerca en el árbol, respecto de todas las demás secuencias provenientes de estas dos especies. El entramado estructural u otros análisis de plegamiento de proteínas (por ejemplo, mediante software por ProCeryon, Biosciences, Salzburgo, Austria) también puede identificar ortólogos potenciales. Los métodos de hibridación de ácidos nucleicos se pueden usar también para hallar genes ortólogos, y se prefieren cuando no se dispone de datos de la secuencia. El PCR degenerado y el análisis de bibliotecas de cADN o de ADN genómico son métodos comunes para hallar secuencias génicas relacionadas y son bien conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Sambrook, supra; Dieffenbach C y Dveksler G (Eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989) . Por ejemplo, se describen métodos para generar una biblioteca de cADN a partir de especies vegetales de interés y sondear la biblioteca con sondas de genes parcialmente homólogos, en Sambrook et al. Una porción muy conservada de la secuencia codificadora de citratosintetasa de Arabidopsis se puede usar como sonda. Los ácidos nucleicos ortólogos de citratosintetasa se pueden hibridar al ácido nucleico de SEQ ID NO:l bajo condiciones de rigurosidad elevadas, intermedias o bajas. Tras la amplificación o el aislamiento de un segmento de un ortólogo posible se puede clonar y secuenciar dicho segmento mediante técnicas estándar, y utilizar como sonda para aislar un clon cADN completo o genómico. Como alternativa, es posible iniciar un proyecto EST para generar una base de datos de información de secuencia para las especies vegetales de interés. En otro enfoque se usan anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de citratosintetasa conocidos para el aislamiento ortólogo (ver, por ejemplo, Harlow E y Lañe D, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, Nueva York) . Mediante análisis de Western blot se puede determinar que un ortólogo de citratosintetasa (es decir, una proteína ortóloga) está presente en un extracto crudo de una especie vegetal particular. Cuando se observa reactividad se puede aislar la secuencia codificadora del ortólogo candidato a través de bibliotecas de expresión de análisis que representan la especie vegetal particular. Se pueden construir bibliotecas de expresión en diversos vectores disponibles en el comercio, tales como lambda gtll, según se describe en Sambrook, et al., 1989. Una vez identificado (s) los ortólogo (s) candidato (s) por cualquier a de estos medios, se usan las secuencias ortólogas del candidato como cebo (la "averiguación") para el BLAST inverso contra secuencias de Arabidopsis u otras especies en las cuales se han identificado las secuencias de ácido nucleico y/o polipéptido de citratosintetasa . Los ácidos nucleicos y polipeptidos de citratosintetasa se pueden obtener mediante cualquier método disponible. Por ejemplo, son bien conocidas en el arte las técnicas para aislar secuencias de interés cADN o ADN genomico mediante el análisis de bibliotecas de ADN o el uso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , como ya se describió. Como alternativa, se pueden sintetizar las secuencias de ácidos nucleicos . Se puede usar cualquier método conocido, por ejemplo mutagénesis dirigida a sitio (Kunkel TA et al., Methods Enzymol . 204:125-39, 1991), para introducir cambios de interés en un ácido nucleico clonado. En general, los métodos de la invención incluyen la incorporación de la forma buscada de ácido nucleico de citratosintetasa en un vector de expresión vegetal para la transformación en células vegetales, y el polipeptido de citratosintetasa se expresa en la planta huésped. Una molécula de acido nucleico de citratosintetasa es distinta de la forma y la posición en la cual se encuentra en la naturaleza, y se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia normalmente en la fuente natural del ácido nucleico de citratosintetasa. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico de citratosintetasa aislada incluye moléculas de ácido nucleico de citratosintetasa contenidas en células que normalmente expresan de citratosintetasa en las cuales, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica distinta de la de células naturales .

Generación de plantas genéticamente modificadas con fenotipo de contenido alterado de aceite Se pueden usar ácidos nucleicos y polipéptidos de citratosintetasa para la generación de plantas genéticamente modificadas con un fenotipo de contenido modificado de aceite.

Tal como se usa en la presente, un "fenotipo de contenido modificado de aceite" se puede referir al contenido modificado de aceite en cualquier parte de la planta; el contenido modificado de aceite se suele observar en semillas . En una forma de realización de preferencia se usa una expresión alterada del gen de citratosintetasa en una planta, con el fin de generar plantas con un fenotipo con alto contenido de aceite. Los métodos descritos en la presente se aplican generalmente a todas las plantas. En una forma de realización de preferencia, la invención está dirigida a plantas elaboradoras de aceite que producen y almacenan triacilglicerol en órganos específicos, sobre todo en semillas. Dichas especies incluyen poroto de soja (Glycine max) , colza y cañóla (incluso Brassica napus, B. campestris) , girasol (Helianthus annus) , algodón (Gossypium hirsutum) , maíz (Zea mayé) , cacao ( Theobroma cacao) , cártamo (Carthamus tinctorius) , palmera de aceite {Elaeis guineensis) , palmera cocotera {Cocos nucífera) , lino {Linum usitatissimum) , ricino (Ricinus communis) y maní (Arachis hypogaea) . La invención también puede estar dirigida a plantas portadoras de frutos y verduras, plantas productoras de granos, plantas productoras de carozos, especies de Brassica de ciclado rápido, alfalfa {Medicago sativa) , tabaco (Nicotiana) , pasto (familia Poaceae) , otros cultivos forrajeros, y especies salvajes que puedan ser una fuente de ácidos grasos singulares.

El artesano experto reconocerá que existe en el arte una amplia variedad de técnicas de transformación, y continuamente se ponen a disposición nuevas técnicas. Se puede usar cualquier técnica adecuada para la planta huésped blanco, dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, se pueden introducir las construcciones en diversas formas, tales como, sin limitaciones, una cadena de ADN, en un plásmido, o en un cromosoma artificial. Se puede lograr la introducción de las construcciones en las células vegetales blanco mediante una variedad de técnicas, tales como, sin limitaciones, transformación mediada por Agrohacterium, electroporación, microinyección, bombardeo con microproyectiles , coprecipitación de fosfato de calcio-ADN o transformación mediada por liposomas de un ácido nucleico heterólogo. De preferencia, la transformación de la planta es permanente, es decir, por integración de las construcciones de expresión introducidas en el genoma de la planta huésped, de modo tal que las construcciones introducidas se pasen a sucesivas generaciones de plantas . Según el uso pretendido, una construcción heteróloga de ácido nucleico que comprenda un polinucleótido de citratosintetasa puede codificar toda la proteína o una porción biológicamente activa de ella . En una forma de realización, se pueden usar sistemas de vectores con base binaria Ti para transferir polinucleótidos . Los vectores binarios estándar de Agrobacterium son conocidos para los expertos en el arte, y muchos están disponibles en el comercio (por ejemplo, pBI121 Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) . El procedimiento óptimo para la transformación de plantas mediante vectores de Agrobacterium varía con el tipo de planta transformada. Entre los ejemplos de transformación mediada por Agrobacterium se incluye la transformación de explantados de hipocotiledón, punta de brote, tallo o tejido de hoja, derivado de brotes y/o plantines estériles . Dichas plantas transformadas se pueden reproducir sexualmente, o por cultivo de células o tejidos. Se describió previamente la transformación mediada por Agrobacterium para gran cantidad de distintos tipos de plantas y los métodos para dicha transformación se pueden hallar en la bibliografía científica. Tienen particular relevancia los métodos para transformar cultivos de importancia comercial, tales como colza (De Block et al., Plant Physiol . (1989) 91:694-701), girasol (Everett et al., Bio/Technology (1987) 5:1201) y poroto de soja (Christou et al., Proc . Nati. Acad. Sci USA (1989) 86:7500-7504; Kline et al., Nature (1987) 327:70). Se puede regular la expresión (incluso la transcripción y la traducción) de citratosintetasa respecto del nivel de expresión, el (os) tipo(s) de tejido donde tienen lugar la expresión y/o el estadio de desarrollo de la expresión. Se dispone de numerosas secuencias reguladoras heterólogas (por ejemplo, promotores e incentivadores) para el control de la expresión de un ácido nucleico de citratosintetasa . Estos ejemplos incluyen promotores constitutivos, inducibles y regulables, además de promotores e incentivadores que controlan la expresión en forma específica de tejido o tiempo. Entre los ejemplos de promotores constitutivos se incluyen, sin limitaciones, el promotor de frambuesa E4 (patente de los Estados Unidos N. ° 5.783.393 y 5.783.394), el promotor 35S CaMV (Jones JD et al, Transgenic Res 1:285-297 1992), el promotor CsVMV (Verdaguer B et al., Plant Mol Biol 37:1055-1067, 1998), el promotor de actina de melón (solicitud de PCT publicada WO0056863) . Entre los ejemplos de promotores específicos de tejido se incluyen los promotores de tomate E4 y E8 (patente de los Estados Unidos N.° 5.859.330) y el promotor de gen 2AII de tomate (Van Haaren MJJ et al., Plant Mol Bio 21:625-640, 1993) . En una forma de realización de preferencia, la expresión de citratosintetasa está bajo el control de secuencias reguladoras de genes cuya expresión se asocia con el desarrollo de semillas tempranas y/o embrionario. Entre los genes de legumbres cuyos promotores se asocian con el desarrollo de semillas tempranas y embriones se incluyen V. faba legumin (Baumlein et al., 1991, Mol Gen Genet 225:121-8; Baumlein et al., 1992, Plant J 2:233-9), V. faba usp (Fiedler et al., 1993, Plant Mol Biol 22:669-79), convicilina de arveja (Bown et al., 1988, Biochem J 251:717-26), lectina de arveja (de Pater et al., 1993, Plant Cell 5:877-86), beta faseolina de P. vulgaris (Bustos et al., 1991, EMBO J 10:1469-79), DLEC2 y PHS [beta] de P. vulgaris (Bobb et al, 1997, Nucleic Acids Res 25:641-7), y 7Sa' beta conglicinina de poroto de soja, protelna de almacenamiento 7S (Chamberland et al., 1992, Plant Mol Biol 19:937-49) . Entre los genes de cereal cuyos promotores se asocian con el desarrollo de semillas tempranas y embriones se incluyen glutelina de arroz ("GluA-3," Yoshihara y Takaiwa, 1996, Plant Cell Physiol 37:107-11; "GluB-1," Takaiwa et al., 1996, Plant Mol Biol 30:1207-21; Washida et al., 1999, Plant Mol Biol 40:1-12; "Gt3 , " Leisy et al., 1990, Plant Mol Biol 14:41-50), prolamina de arroz (Zhou & Fan, 1993, Transgenic Res 2:141-6), prolamina de trigo (Hammond-Kosack et al., 1993, EMBO J 12:545-54), zeina de maíz (Z4, Matzke et al., 1990, Plant Mol Biol 14:323-32), y B-hordeinas de cebada (Entwistle et al., 1991, Plant Mol Biol 17:1217-31). Otros genes cuyos promotores se asocian con el desarrollo de semillas tempranas y embriones incluyen GL07A de palmera de aceite (7S globulina, Morcillo et al., 2001, Physiol Plant 112:233-243), proteína de depósito 2S, napina de Brassica napus, y gen napA (Josefsson et al., 1987, J Biol Chem 262:12196-201; Stalberg et al., 1993, Plant Mol Biol 1993 23:671-83; Ellerstrom et al., 1996, Plant Mol Biol 32:1019-27), oleosina de Brassica napus (Keddie et al., 1994, Plant Mol Biol 24:327-40), oleosina de Arabidopsis (Plant et al., 1994, Plant Mol Biol 25:193-205), Arabidopsis FAE1 (Rossak et al., 2001, Plant Mol Biol 46:717-25), Canavalia gladiata conA (Yamamoto et al . , 1995, Plant Mol Biol 27:729-41), y estrictosidinasintetasa de Catharanthus roseus (Str, Ouwerkerk y Memelink, 1999, Mol Gen Genet 261:635-43). En otra forma de realización de preferencia se usan las secuencias reguladoras de genes expresados durante la biosíntesis de aceite (patente de los Estados Unidos N.° 5.952.544). Los promotores alternativos provienen de genes de proteínas de depósito vegetales (Bevan et al, 1993, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 342:209-15) . En aún otro aspecto, en algunos casos puede ser deseable inhibir la expresión de citratosintetasa endógena en una célula huésped. Entre los ejemplos de métodos para practicar este aspecto de la invención se incluyen, sin limitaciones, la supresión antisentido (Smith, et al., 1988; van der Krol et al., 1988); la cosupresión (Napoli, et al., 1990); ribozimas (Publicación PCT WO 97/10328); y combinaciones de sentido y antisentido ( aterhouse, et al., 1998) . Los métodos para la supresión de secuencias endógenas en una célula huésped por lo general emplean la transcripción, o la transcripción y la traducción de al menos una porción de la secuencia que se va a suprimir. Dichas secuencias pueden ser homologas a las regiones codificadas, además de las no codificadas de la secuencia endógena. La inhibición antisentido puede usar toda la secuencia cADN (Sheehy et al., 1988, Proc . Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85:8805-8809), una secuencia de cADN parcial que incluya fragmentos de secuencia codificadora 5', (Cannon et al., Plant Molec. Biol . (1990) 15:39-47), o secuencias no codificadoras 3' (Ch'ng et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA (1989) 86:10006-10010). Las técnicas de cosupresión pueden usar toda la secuencia de cADN (Napoli et al., 1990; van der Krol et al., The Plant Cell (1990) 2:291-299), o una secuencia de cADN parcial (Smith et al., Mol. Gen. Genetics (1990) 224:477-481). Se pueden realizar pruebas moleculares y genéticas estándar para analizar la asociación entre un gen y un fenotipo observado. A continuación se describen ejemplos de técnicas . 1. Análisis de ADN/ARN Se pueden determinar los patrones de expresión génica específicos de estadio y de tejido en líneas mutantes versus tipo salvaje, por ejemplo, por hibridación in situ. Se puede realizar el análisis del estado de metilación del gen, en especial las regiones reguladoras de los flancos. Otras técnicas adecuadas incluyen sobreexpresión, expresión ectópica, expresión en otras especies vegetales y knock-out génico (genética inversa, knock-out dirigido, silenciamiento génico inducido por virus [VIGS, ver Baulcombe D, Arch Virol Suppl 15:189-201, 1999]). En un perfilamiento de aplicación de la expresión de preferencia, generalmente por análisis de microdistribución, para medir simultáneamente diferencias o cambios inducidos en la expresión de muchos genes diferentes. Las técnicas de análisis de microdistribucion son bien conocidas en el arte (Schena M et al., Science (1995) 270:467- 470; Baldwin D et al., Cur Opin Plant Biol. 2(2):96-103, 1999; Dangond F, Physiol Genomics (2000) 2:53-58; van Hal NL et al., J Biotechnol (2000) 78:271-280; Richmond T y Somerville S, Curr Opin Plant Biol (2000) 3:108-116). Se puede realizar el perfilamiento de la expresión de líneas con rótulos individuales. Dicho análisis puede identificar otros genes regulados en forma coordinada como consecuencia de la sobreexpresion de los genes de interés, lo cual puede contribuir a ubicar un gen desconocido en una vía particular. 2. Análisis de producto génico El análisis de productos genieos puede incluir expresión de proteínas recombinantes , producción de antisueros, inmunolocalización, ensayos bioquímicos para actividades catalíticas y de otros tipos, análisis de estado de fosforilación, y análisis de la interacción con otras proteínas mediante ensayos de dos híbridos en levaduras . 3. Análisis de vía El análisis de vía puede incluir la ubicación de un gen o producto génico en una vía bioquímica, metabólica o de señal particular en base a su fenotipo de expresión errónea o por homología de secuencia con genes relacionados. Como alternativa, el análisis puede comprender cruzamientos genéticos con líneas de tipo salvaje y otras líneas mutantes (creación de dobles mutantes) a fin de ordenar el gene en una vía, o determinar el efecto de una mutación sobre la expresión de genes "informadores" corriente abajo en una vía.

Generación de plantas mutadas con fenotipo de contenido alterado de aceite.

La invención además provee un método para identificar plantas que contienen mutaciones en la citratosintetasa endógena que confieren contenido alterado de aceite, 'y generan progenie con contenido alterado de aceite de estas plantas, que no se han modificado genéticamente. En un método, denominado "TILLING" (por lesiones locales en genomas inducidos por direccionamiento, targeting induced local lesions in genomas) , se inducen mutaciones en la semilla de una planta de interés, por ejemplo, mediante tratamiento E S . Las plantas obtenidas se cultivan y se autofertilizan, y se usa la progenie para preparar muestras de ADN. Se usa PCR específico de citratosintetasa para identificar si una planta mutada posee una mutación de citratosintetasa. Luego se estudian las plantas que tienen mutaciones de citratosintetasa para determinar el contenido alterado de aceite, o como alternativa, se pueden estudiar las plantas para determinar el contenido alterado de aceite, y luego se usa PCR específico para citratosintetasa, a fin de determinar si una planta con contenido alterado de aceite tiene un gen de citratosintetasa mutado. TILLING permite identificar mutaciones que pueden alterar la expresión de genes específicos o la actividad de proteínas codificadas por estos genes (Colbert et al (2001) Plant Physiol 126:480-484; cCallum et al (2000) Nature Biotechnology 18:455-457). En otro método se puede usar un enfoque de gen candidato/locus de rasgo cuantitativo (QTL) en un programa de cultivo asistido con marcas, a fin de identificar alelos o mutaciones en el gen de citratosintetasa u ortólogos de citratosintetasa que pueden conferir el contenido alterado de aceite (ver Bert et al . , Theor Appl Genet. 2003 Jun; 107 (1) : 181-9 ; y Lionneton et al, Genoma. 2002 Dec;45(6) : 1203-15) . En consecuencia, en otro aspecto de la invención, se usa un ácido nucleico de citratosintetasa para detectar si una planta con contenido alterado de aceite posee una mutación de citratosintetasa endógena o posee un alelo particular que produce el contenido alterado de aceite. Todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan expresamente en la presente como referencia, a los fines de describir y revelar composiciones y metodologías que se pueden usar en conexión con la invención. Todas las patentes, solicitudes de patente e informaciones sobre secuencias citadas como referencias de bases de datos públicas también se incorporan como referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Generación de plantas transgénicas con expresión excesiva de citratosintetasa Un subtipo de los genes codificadores de enzimas de la vía de glioxilato se expresan en exceso en Arabidopsis de tipo salvaje y se estudian las semillas de plantas transgénicas TI para determinar un fenotipo de elevado contenido de aceite. Para sobreexpresar los genes, se amplifica el AND genómico por PCR con cebadores específicos para cada gen. El producto de PCR se clona tras el promotor CsVMV en un vector DNA T que contiene el gen NPTII (que actúa como marcador selectivo) y se transforma en plantas de Arabidopsis de tipo salvaje. Las plantas transgénicas se seleccionan por germinación de las semillas en medio de agar que contiene canamicina. Las semillas germinadas resistentes a canamicina se trasplantan a tierra, y se cultivan hasta la madurez. Como control se usan plantas no transformadas Col-0 de tipo salvaje. Se hacen germinar las semillas en medio de agar (sin canamicina) y las semillas germinadas se trasplantan a tierra y se cultivan hasta la madurez. Se mide el contenido de aceite es semillas cosechadas de las plantas transgénicas y control mediante Espectroscopio Infrarrojo Cercano (NIR) . Los espectros infrarrojos NIR se capturan mediante Bruker 22 N/F. Se usa software Bruker para estimar el contenido total de aceite de las semillas mediante datos provenientes del análisis por NIR y métodos de referencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Los resultados demuestran que la expresión excesiva del gen de citratosintetasa de Arabidopisis (At3g58750) confiere un fenotipo con alto contenido de aceite. Las semillas provenientes de 7 líneas transgénicas con expresión excesiva de At3g58750 (codificadora de citratosintetasa) presentan más aceite que todas las plantas control estudiadas. Los valores varían de 41,6% a 41,2% de aceite de plantas transgénicas, nientras que los valores para las semillas control varían entre 40,9% y 38,7%. El contenido promedio de aceite en las semillas control es de 39,9%. En consecuencia, la expresión excesiva de citratosintetasa puede conferir hasta 5% de aumento en aceite de las semillas.

EJEMPLO 2 Análisis de citratosintetasa en Arabidopsis Los análisis de secuencia se realizaron mediante BLAST (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol . 215:403-410), PFAM (Bateman et al., 1999, Nucleic acids Res 27:260-262), y PSORT (Nakai K, y Horton P, 1999, Trends Biochem Sci 24:34-6) y/o CLUSTAL (Thompson JD et al . , 1994, Nucleic acids Res 22:4673-4680). Se identificaron numerosos ortólogos con elevada identidad de secuencia, y en consecuencia se espera que también confieran un fenotipo de elevado contenido de aceite cuando se expresan en exceso en una planta. Entre las citratosintetasas ortólogas provenientes de diversas especies vegetales se incluyen: GI#1345933, y GI#975633 (Cucúrbita av.); GI#15231128, y GI#11268305 {Arabidopsis thaliana) ; GI#8928010 {Daucus carota) ; GI#6647461 {Solanum tujberosum) ; GI#1352088 [Citrus máxima) ; GI#15982952 {Prunus pérsica) ; GI#11066954 [Oryza sativa) ; GI#2300712 (Nicotiana tabacum) , y GI#2300710 (Beta vulgaris

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una planta transgénica que comprende un vector de transformación vegetal que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de citratosintetasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 2 , o uno de sus ortólogos , por el cual la planta transgénica posee un fenotipo con alto contenido de aceite respecto de plantas control .

2. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palmera de aceite, palmera cocotera, lino, ricino y maní.

3. Una parte de planta obtenida de la planta de acuerdo con la reivindicación 1.

4. La parte de planta de acuerdo con la reivindicación 3, que es una semilla.

5. Un método para producir aceite que comprende el cultivo de la planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 1 y la recuperación de aceite de dicha planta.

6. Un método para producir un fenotipo con alto contenido de aceite en una planta, donde dicho método comprende: a) introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación vegetal que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de citratosintetasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 2 , o uno de sus ortólogos, y b) cultivar las células progenitoras transformadas para obtener una planta transgenica, en donde se expresa dicha secuencia de polinucleótidos, y dicha planta transgénica exhibe un fenotipo de contenido alterado de aceite respecto de plantas control .

7. Una planta obtenida por un método de acuerdo con la reivindicación 6.

8. La planta de acuerdo con la reivindicación 7, que se selecciona del grupo que consiste en colza, soja, maiz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palmera de aceite, palmera cocotera, lino, ricino y maní.

9. Un método para generar una planta con un fenotipo con alto contenido de aceite que comprende identificar una planta que tiene un alelo en su gen de citratosintetasa que da por resultado un contenido aumentado de aceite, comparado con plantas que carecen del alelo y generar una progenie de dicha planta identificada, en donde la progenie generada hereda el alelo y posee el fenotipo con alto contenido de aceite.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9 que utiliza la metodología de gen candidato/QTL.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 9 que utiliza la metodología TILLING.