BRPI0316891B1 - método de produção de uma planta com percentagem de óleo aumentada e método de recuperar um óleo a partir de uma planta transgênica - Google Patents
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
"geração de plantas com conteúdo de óleo alterado". esta invenção é destinada a plantas que exibem um fenótipo de conteúdo de óleo alterado em razão da expressão alterada de ácido nucléico de sintase de citrato. a invenção também é destinada a métodos de geração de plantas com um fenótipo de conteúdo de óleo alterado.
Description
MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA COM PERCENTAGEM DE ÓLEO AUMENTADA E MÉTODO DE RECUPERAR UM ÓLEO A PARTIR DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA
Referência aos requerimentos relacionados
Este requerimento reivindica prioridade ao requerimento provisório da patente norte-americana N°. de Série 60/434,601 preenchido em 18/12/2002, cujo conteúdo está incorporado aqui por referência.
Antecedente da invenção
A capacidade de manipular a composição das sementes para plantio, particularmente o conteúdo e a composição de óleos de semente, possui requerimentos importantes nas indústrias agrícolas, relacionados tanto a óleos de comida processada quanto a óleos para rações animais. Sementes para plantios agrícolas contêm vários componentes importantes, incluindo óleo, proteína e amido. O processamento industrial é capaz de separar alguns ou todos esses componentes para venda individual em requerimentos específicos. Por exemplo, cerca de 60% das sementes de soja norte-americanas é triturada pela indústria de processamento da soja. O processamento da soja produz um óleo purificado, que é vendido a um valor elevado, enquanto o restante é vendido principalmente para rações animais de menor valor (US Soybean Board, 2001 Soy Stats). A semente de canola é triturada para produzir um óleo e o co-produto, farinha de canola (Canola Council of Canada). Aproximadamente 20% do plantio de milho entre 1999 e 2000 nos Estados Unidos foi industrialmente refinado, principalmente para a produção de amido, etanol e óleo (Corn Refiners Association). Por isso, maximizar o conteúdo de óleo das sementes costuma ser desejável. Por exemplo, para sementes oleosas processadas, como soja e canola, aumentar o conteúdo de óleo absoluto da semente elevará o valor desses grãos. Para milho processado, talvez seja necessário aumentar ou diminuir o conteúdo de óleo de acordo com a utilização dos outros componentes principais.
Petição 870190008866, de 28/01/2019, pág. 12/22
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A diminuição do óleo pode melhorar a qualidade do amido isolado, ao reduzir os sabores indesejados associados à oxidação do óleo. Como alternativa, na produção de etanol, em que o sabor não é importante, o aumento do conteúdo de óleo pode elevar o valor geral. Em muitos grãos de ração.
como milho e trigo, é desejável aumentar o conteúdo de óleo da semente, uma vez que o óleo possui um grau de energia maior do que o de outros componentes da semente, como os carboidratos. O processamento de sementes oleosas, assim
como a maioria dos processamentos muito capital. Dessa forma, de grãos, pequenas distribuição dos produtos - de componentes é um negócio de alterações na de menor valor para um componente de óleo com valor elevado podem acarretar impactos econômicos significativos nos processamentos de grãos.
A manipulação biotecnológica dos óleos pode proporcionar a alteração composicional e a melhora do produzido. Entre altamente oléica
N°. 6,229,033 e óleo soja e óleo de milho (Patentes Norte-americanas
6,248,939) e sementes ricas em laurato (Patente Norte-americana N°. 5, 639,790), entre outras. O trabalho na composicional esteve predominantemente voltado para sementes oleosas processadas, mas foi prontamente ampliado para plantios de sementes não25 oleosas, incluindo milho. Embora haja um interesse considerável no aumento do conteúdo de óleo, a única biotecnologia praticada atualmente nesta área é a High-Oil
Corn (HOC) (DuPont, Patente Norte-americana N°. 5,704,160).
A HOC emprega polinizadores de alto óleo desenvolvidos pela seleção clássica para reprodução com fêmeas híbridas de elite (machos estéreis) em um sistema de produção conhecido como TopCross. O sistema TopCross High Oil aumenta o conteúdo de óleo do grão colhido em milho de 3,5% para 7%, o que eleva o grau de energia do grão.
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HOC
Embora tenha sido fecundo, o sistema possui limitações inerentes. Primeiramente, o sistema uma pequena porcentagem de polinizadores responsáveis com por um conjunto inteiro de sementes no campo contém riscos inerentes, particularmente em anos de estiagem. Depois, o conteúdo de óleo em campos HOC atuais foi estabilizado em cerca de 9%. Por fim, o milho de alto óleo não é uma alteração bioquímica principal, e sim um mutante anatômico (tamanho maior do embrião) que possui o resultado indireto de aumentar o conteúdo de óleo. Por essas razões, uma outra estratégia de alto óleo, particularmente uma que derive de um resultado bioquímico alterado, teria um valor especial.
Os plantios mais óbvios para o mercado de óleo processado são soja e colza, e um grande número de trabalhos comerciais (por exemplo, a
Patente Norteamericana
5,952,544;
requerimento
PCT WO9411516) demonstra que
Arabídopsís é um excelente modelo para o metabolismo de óleo nesses plantios. Triagens bioquímicas da composição do óleo da semente identificaram genes
Arabidopsis para muitas enzimas biossintéticas importantes e levaram à identificação de ortólogos genéticos agronomicamente importantes.
Por exemplo, triagens que usam populações mutantes composição mutagenizadas lipídios cujas de ácidos graxos quimicamente identificaram sementes apresentavam uma alterada (Lemieux B, et al.
1990, Theor Appl Genet 80, 234-240; James DW and Dooner HK (1990) Theor Appl Genet 80, 241-245). Triagens de mutagênese T-DNA (Feldmann et al. , Science 243: 1351-1354,
1989) que detectaram composições de ácidos graxos alterada identificaram os genes de desaturases ômega 3 (FAD3) e delta-12 (FAD2) (Patente Norte-americana N°. 5952544; Yadav NS et al. (1993) Plant Physiol 103, 467-476; Okuley et al., Plant Cell. 1994 Jan;6(1):147-58). Uma triagem voltada para o conteúdo de óleo, e não para a sua qualidade, analisou
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mutantes induzidos quimicamente para sementes rugosas ou densidade de sementes alteradaf a partir das quais o conteúdo de óleo alterado foi inferido (Focks N and Benning
C, Plant Physiol 118:91-101, 1998).
desenvolvida para identificar enzimas
Outra triagem, envolvidas na produção de cadeias muito longas de ácidos graxos, identificou uma mutação no gene que codifica diacilglicerol aciltransferase (DGAT) como responsável pelo acúmulo de r· triacilglicerol reduzido em sementes (Katavic V et al,
Plant Physiol. 1995 May;108(1):399-409). Além disso, comprovou-se que a super-expressão específica de sementes da DGAT cDNA estava associada ao conteúdo de óleo aumentado (Jako et al., Plant Physiol. 2001 Jun;126(2):861-74).
Sumário da invenção
A invenção oferece uma planta transgênica com um fenótipo de alto óleo. A planta transgênica consiste em um vetor de transformação que compreende uma sequência nucleotídica que codifica ou complementa uma seqüência codificadora de um polipeptidio sintase de citrato. Em 20 representações preferidas, a planta transgênica é selecionada do grupo que consiste em colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, cártamo, dendezeiro, coqueiro, linho, mamoma e amendoim. A invenção ainda oferece um método de produção de óleo que consiste no crescimento da 25 planta transgênica e a obtenção do óleo dessa planta.
A planta transgênica da invenção é produzida por um método que consiste na introdução, em células progenitoras da planta, um vetor de transformação de planta formado por seqüência nucleotídica que codifica ou complementa uma 30 seqüência codificadora de um polipeptidio sintase de citrato e no crescimento das células progenitoras transformadas para produzir uma planta transgênica, em que a seqüência polinucleotídica sintase de citrato é expressa de forma a causar o fenótipo de alto óleo.
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Descrição detalhada da invenção
Definições
A não ser que seja indicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo 5 significado que teriam para especialistas na arte da presente invenção. Eles são especialmente orientados para consultar Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (Second Edition)f Cold Spring Harbor Press,
Plainview, N.Y.,1989, e Ausubel FM et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1993 r para definições e termos da arte. É entendido que esta invenção não está limitada à metodologia específica, protocolos e reagentes descritos, uma vez que eles podem variar.
Conforme usado aqui, o termo vetor refere-se a um construto de ácido nucléico desenvolvido para transferência entre células hospedeiras diferentes. Um vetor de expressão refere-se a um vetor que tem a capacidade de incorporar e expressar fragmentos DNA heterólogos em uma célula estranha. Muitos vetores de expressão procarióticos
e eucarióticos estão disponíveis comercialmente. A seleção dos vetores de expressão adequados é de conhecimento daqueles especialistas na arte.
Um construto de ácido nucléico heterólogo ou seqüência possui uma parte que não é nativa para a célula da planta em que é expressa. Heterólogo, em relação a uma seqüência de controle, refere-se a uma seqüência de controle (oiz seja, promotor ou otimizador) que não funciona in natura para regular o mesmo gene que a expressão está regulando no momento. Geralmente, as sequências de ácido nucléico heterólogo não são endógenas para a célula ou parte do genoma no qual elas estão presentes, e foram adicionadas à célula, por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação ou similares. Um construto de
6/28 ácido nucléico heterólogo pode conter ·· ♦ · • · • · • ♦ ·· uma sequência de controle/combinação de seqüências de codificação DNA igual ou diferente da seqüência de controle/combinação de seqüências de codificação DNA encontrada na planta nativa.
Conforme usado aqui, o termo gene significa o segmento do
DNA envolvido na produção de uma cadeia polipeptídica, que pode ter ou não regiões anteriores e posteriores à região de codificação, por exemplo, seqüências de 5* não traduzidas (5’ UTR) ou líderes” e r
seqüências de 3T UTR ou extremidades, bem de intervenção (íntrons) entre segmentos individuais (éxons) como seqüências de codificação e seqüências regulatórias nãotranscritas.
Conforme usado aqui, recombinante inclui a referência a uma célula ou vetor, que foi modificado pela introdução de uma seqüência de ácido nucléico heterólogo ou que deriva de uma célula modificada. Dessa forma, por exemplo, células recombinantes expressam genes não encontrados em formas idênticas na forma recombinante) da célula ou genes nativos que são expressos de forma anormal, com ou sem expressões, como resultado de intervenção humana deliberada.
Conforme usado aqui, o termo expressão genética refere-se com base processo ao processo pelo na seqüência inclui tanto assim, expressão” pode polinucleotídica quanto ambas. Às vezes, a de qual um polipeptídio é produzido ácido nucléico de um gene. 0 transcrição quanto a tradução;
se referir tanto a uma seqüência a uma seqüência polipeptídica, ou expressão de uma seqüência polinucleotídica não ocasionará a tradução da proteína.
Super-expressão refere-se à expressão aumentada de uma seqüência polinucleotídica e/ou polipeptídica relativa à sua expressão em uma planta de tipo selvagem (pu outra referência [por exemplo, não-transgênica]) e pode estar
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relacionada a uma sequência que ocorre naturalmente ou não.
A expressão ectópica refere-se à expressão determinado momento, local e/ou nível aumentado em um que não ocorre naturalmente na planta não alterada ou de tipo selvagem. Sub-expressão refere-se de uma sequência polinucleotídica à expressão diminuída e/ou polipeptídica, geralmente de um gene endógeno, relacionada à sua expressão em uma planta de tipo selvagem.
Os termos má expressão e expressão alterada abrangem a super-expressão, a sub10 expressão e a expressão ectópica.
O termo introduzido” no contexto da inserção de uma sequência de transfecção, referência à nucléico a uma ácido nucléico transformação em uma célula.
ou transducção incorporação de uma célula eucariótica ou significa e inclui a sequência.
de ácido procariótica em que a sequência de ácido nucléico pode ser incorporada ao genoma da célula (por exemplo, DNA de cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou de mitocôndria), convertido em um replicon autônomo ou expresso de forma transiente (por exemplo, mRNA transfectado).
Conforme usado aqui, uma célula de planta refere-se a qualquer célula derivada de uma planta, incluindo células de tecidos não diferenciados (por exemplo, caule), bem como sementes de plantas, pólens, propágulos e embriões.
Conforme usados aqui, os termos nativo e tipo selvagem estão relacionados a um determinado traço ou fenótipo da planta que se refere à forma na qual esse traço ou fenótipo é encontrado na mesma variedade de plantas in natura.
Conforme usado aqui, o termo modificado, em relação ao traço de uma planta, se refere a uma alteração no fenótipo de uma planta transgênica para a planta similar não-transgênica. Um fenótipo de conteúdo de óleo alterado refere-se ao fenótipo avaliável de uma planta modificada
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geneticamente, em que planta apresenta um aumento ou diminuição estatisticamente significativos no conteúdo de óleo geral (por exemplo, a porcentagem de massa da semente que é óleo), quando comparados à planta similar, mas não 5 modificada. Um fenótipo de alto óleo refere-se a um aumento no conteúdo de óleo geral.
Conforme usado aqui, uma sequência polinucleotídica mutante ou gene é diferente da sequência polinucleotidica de tipo selvagem correspondente ou gene em termos de 10 sequência ou expressão, em que a diferença contribui para o fenótipo ou traço de uma planta modificada. Em relação a uma planta ou linhagem, o termo mutante se refere a uma planta ou linhagem que tem um fenótipo ou traço de planta modificada, em que o fenótipo ou o traço está associado à 15 expressão modificada de uma sequência polinucleotidica de
tipo selvagem ou gene.
Conforme usado aqui, o termo Tl se refere à geração de plantas a partir da semente de plantas TO. A geração TI é o primeiro conjunto de plantas transformadas que podem 20 ser selecionadas pela aplicação de um agente de seleção, por exemplo, um antibiótico ou herbicida, para o qual a planta transgênica contém o gene de resistência correspondente. O termo T2 refere-se à geração de plantas pela autofertilização das flores das plantas Tl, anteriormente selecionadas como transgênicas. As plantas T3 são geradas a partir das plantas T2 e assim por diante. Conforme usado aqui, a progênia direta de uma determinada planta deriva da semente (ou, às vezes, de outro tecido) dessa planta e está na geração imediatamente subseqüente;
por exemplo, para uma determinada linhagem, uma planta T2 é a progênia direta de uma planta Tl. A progênia indireta de uma determinada planta deriva da semente (ou de outro tecido) da progênia direta dessa planta ou da semente (ou de outro tecido) de gerações subseqüentes dessa linhagem;
9/28 por exemplo, uma planta T3
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indireta de uma é a progênia planta TI.
Conforme usado aqui, o termo parte da planta inclui qualquer órgão ou tecido da planta, incluindo, sem regiões meristemáticas, tecido cauleoso, folhas, raizes, caulinares, gametófitos.
esporófitos, pólen e micrósporos. As células órgão ou da planta tecido da podem ser obtidas a partir de qualquer planta e culturas preparadas a partir plantas que pode ser usada nos métodos da presente invenção costuma ser tão ampla quanto a classe de plantas superiores delas. A classe de acessível às técnicas de transformação, incluindo tanto as plantas monocotiledôneas quanto as dicotiledôneas.
Conforme usado aqui, planta transgênica inclui uma planta que contém em seu genoma um polinucleotídio heterólogo. O polinucleotídio heterólogo pode estar integrado de maneira estável no genoma ou pode ser extracromossômico.
Preferencialmente, o polinucleotídio da presente invenção genoma de forma está integrado de maneira que ele seja transmitido a estável no sucessivas gerações. Uma célula, um tecido ou um planta nos quais os polinucleotídios heterólogos foram introduzidos são considerados transgênicos.
ou células de polinucleotídio transformados,
A progênia direta ou plantas transformadas heterólogo também transfectados ou indireta das plantas que também contêm o são consideradas transgênicas.
Identificação de plantas com um fenótipo de conteúdo de óleo alterado
Foram produzidas plantas transgênicas com o objetivo de super-expressar vários genes codificadores de enzimas do caminho de glioxilato e sementes das plantas transgênicas TI foram testadas em busca de um fenótipo de alto óleo. Descobriu-se que a super-expressão de sintase de citrato
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(At3g58750; GI# 15231130) confere um fenótipo de conteúdo de óleo alterado (especificamente, um fenótipo de alto óleo em semente). Dessa forma, os genes sintase de citrato e/ou polipeptidios podem ser empregados no desenvolvimento de 5 plantas modificadas geneticamente com um fenótipo de conteúdo de óleo modificado. Os genes sintase de citrato podem ser usados na geração de plantios de sementes oleosas que produzem um óleo melhor a partir do processamento de sementes oleosas e na geração de plantios de grãos para 10 ração que oferecem mais energia para a alimentação dos animais. Os genes sintase de citrato também podem ser usados para aumentar o conteúdo de óleo para plantios especiais com o objetivo de aumentar a produção de ácidos graxos desejados incomuns. As plantas transgênicas que 15 foram geneticamente modificadas para expressar sintase de citrato podem ser usadas na produção de óleo, em que as plantas transgênicas crescem, e o óleo é obtido a partir das partes da planta (por exemplo, a semente) usando métodos padrão.
Ácidos nucléicos e polipeptidios sintase de citrato
A sequência de ácido nucléico sintase de citrato de é fornecida na ID SEQ NO: 1 e na entrada Genbank GI# 30694870. A sequência da proteína correspondente é fornecida na ID SEQ NO: 2 e em GI# 15231130. Os ácidos nucléicos e/ou 25 proteínas que são ortólogos ou parálogos de Arabídopsis sintase de citrato, são descritos no Exemplo 2 a seguir.
Conforme usado aqui, o termo polipeptídio sintase de citrato refere-se a uma proteína sintase de citrato completa ou seu fragmento, derivado (variante), ou ortólogo 30 funcionalmente ativo, o que significa que o fragmento da proteína, derivado ou ortólogo, apresenta uma ou mais das atividades funcionais associadas ao polipeptídio da ID SEQ NO: 2. Em uma representação preferida, um polipeptídio sintase de citrato funcionalmente ativo causa um fenótipo
11/28 de óleo de conteúdo alterado quando planta. Em uma representação ainda expressão do polipeptídio sintase • · • · ♦ · • · ··♦ • · ·· • · • · • · em mal expressado mais preferida, a de citrato causa uma má um ♦
· · • · • · · fenótipo de alto óleo em uma planta.
Em outra representação, um polipeptídio sintase de citrato capaz de resgatar uma atividade sintase de citrato endógena funcionalmente ativo é defeituosa (inclusive deficiente) quando expressada em uma
planta ou células da planta. 0 polipeptídio de resgate pode ser ou não da mesma espécie da atividade defeituosa. Em 10 outra representação, um fragmento funcionalmente ativo de um polipeptídio sintase de citrato completo (por exemplo, um polipeptídio nativo com a seqüência da ID SEQ NO:2 ou um ortólogo que ocorre naturalmente) retém uma ou mais das propriedades biológicas associadas ao polipeptídio sintase 15 de citrato completo, como a atividade catalítica. Um fragmento sintase de citrato preferencialmente contém um domínio sintase de citrato, como C-, N-terminal ou catalítico, dentre outros, e preferencialmente contém pelo menos 10, 20, mais preferencialmente pelo menos 25 e na melhor das hipóteses pelo menos 50 aminoácidos contíguos de uma proteína sintase de citrato. Os domínios funcionais podem ser identificados usando-se o programa PFAM (Bateman A et al., 1999 Nucleic Acids Res 27:260-262; no site pfam.wustl.edu). Variantes funcionalmente ativas dos 25 polipeptídios sintase de citrato completos ou seus fragmentos incluem polipeptídios com inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos que retêm uma ou mais das propriedades biológicas associadas ao polipeptídio sintase de citrato completo. Em alguns casos, as variantes geradas 30 alteram o processamento posterior à tradução de um polipeptídio sintase de citrato. Por exemplo, as variantes podem ter alterado as características de localização ou transporte da proteína ou da proteína alterada de meia-vida quando comparadas ao polipeptídio nativo.
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Conforme usado aqui, o termo ácido nucleico sintase
de citrato abrange os ácidos nucléicos com a seqüência fornecida na ou no complemento da seqüência fornecida em ID SEQ NO: 1, bem como fragmentos ativos funcionalmente, derivados ou ortólogos. Um ácido nucléico sintase de citrato desta invenção pode ser DNA, derivado de DNA genômico, cDNA ou RNA.
Em uma representação, um ácido nucléico sintase de citrato funcionalmente ativo codifica ou complementa um 10 ácido nucléico que codifica um polipeptídio sintase de citrato funcionalmente ativo. Incluso nesta definição está o DNA genômico que serve como um modelo para uma transcrição RNA primária (por exemplo, um precursor mRNA) que exige o processamento, como a união, antes de codificar 15 o polipeptídio sintase de citrato funcionalmente ativo. Um ácido nucléico sintase de citrato pode incluir outras seqüências não codificadoras, que podem ou não ser transcritas, como as que incluem 5’ e 3T UTRs, sinais de poliadenilação e seqüências reguladoras que controlam a expressão genética, dentre outras, como conhecidas na arte.
Alguns polipeptídios exigem eventos de processamento, como a divisão proteolítica, a modificação covalente etc., para se tornar totalmente ativos. Dessa forma, ácidos nucléicos funcionalmente ativos podem codificar o polipeptídio sintase de citrato maduro ou pré~processado, ou uma forma intermediária. Um polinucleotídio sintase de citrato também pode incluir seqüências de código heterólogo, por exemplo, seqüências que codificam um marcador incluso para facilitar a purificação do polipeptídio fundido, ou um marcador de 30 transformação.
Em outra representação, um ácido nucléico sintase de citrato funcionalmente ativo pode ser usado na geração de fenótipos sintase de citrato de perda de função, por exemplo, via supressão anti-sense, co-supressão etc.
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Em uma representação sintase de citrato usado consiste em uma sequência de complementa • · • « «· *
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4 sintase de citrato com pelo menos 50%, relação à sequência polipeptídica apresentada em ID SEQ NO:
1.
Em outra representação, um polipeptídio sintase de citrato da invenção consiste em uma sequência polipeptídica
com pelo menos 50% ou 60% da identidade da seqüência polipeptídica sintase de citrato de ID SEQ NO:1, e pode ter pelo menos 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais da identidade da seqüência polipeptídica sintase de citrato em ID SEQ
NO:2. Em outra representação, um polipeptídio sintase de
citrato consiste em uma seqüência polipeptídica com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais de identidade de um fragmento funcionalmente ativo do polipeptídio presente na ID SEQ NO: 2 em relação ao seu tamanho total.
Em outro aspecto, uma seqüência polinucleotídica sintase de citrato é pelo menos de 50% a 60% idêntica ao tamanho total da seqüência de ácido nucléico sintase de citrato apresentada em ID SEQ NO: 1, ou às seqüências de ácido nucléico complementares a essas seqüências de sintase de citrato, e pode conter pelo menos 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais da identidade em relação à seqüência sintase de citrato apresentada em ID SEQ NO: 1 ou um fragmento funcionalmente ativo, ou seqüências complementares.
Conforme usado aqui, % (porcentagem) de igualdade de identidade em relação à seqüência de um objeto específico, ou sua porção especificada, é definida como a porcentagem de nucleotídeos ou aminoácidos na seqüência derivativa candidata idêntica com os nucleotídeos ou aminoácidos na seqüência do objeto (ou sua poção especificada), depois de
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se necessário, alinhar as sequências e introduzir lacunas, para obter a porcentagem de identidade de seqüência máxima, conforme é gerada pelo programa WU-BLAST-2.0al9 (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1997) 215:403-410; site no endereço blast.wustl.edu/blast/README.html) com parâmetros de pesquisa definidos em valores padrão. Os parâmetros HSP S e HSP 82 são valores dinâmicos e estão estabelecidos pelo próprio programa dependendo da composição da seqüência e composição do banco de dados em particular contra a
seqüência de interesse que estiver sendo pesquisada. Uma % de valor de igualdade é determinada pelo número de nucleotideos ou de aminoácidos idênticos dividido pelo comprimento de seqüência para a qual a porcentagem de igualdade está sendo informada. A % (porcentagem) de 15 similaridade de seqüência de aminoácido é determinada pelo mesmo cálculo para determinar a % de igualdade de seqüência de aminoácido, mas inclui no cálculo as substituições de aminoácidos conservantes, além dos aminoácidos idênticos.
Uma substituição de aminoácido conservante é aquela em que um aminoácido é substituído similares como aquela em que o por outro com propriedades dobramento ou a atividade da é afetada de maneira significativa.
proteína não aminoácidos aromáticos que podem ser substituídos entre
Os si são fenilanina, triptofano e tirosina; os aminoácidos hidrofóbicos intercambiáveis são leucina, isoleucina, metionina e valina; aminoácidos polares intercambiáveis são glutamina e asparagina; aminoácidos básicos intercambiáveis são arginina, lisina e histidina; aminoácidos acídicos intercambiáveis são ácido aspártico e ácido glutâmico; e 30 aminoácidos pequenos intercambiáveis são alanina, serina, treonina, cisteína e glicina.
As moléculas de ácido nucléico das moléculas de ácido nucléico do objeto incluem sequências que hibridizam seletivamente para a seqüência de ácido nucléico de ID SEQ
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NO: 1. 0 rigor da hibridização pode ser controlado pela temperatura, força iônica, pH e presença de agentes desnaturadores como formamida durante a hibridização lavagem. As condições usadas rotineiramente são bem conhecidas (consulte, por ex., Current Protocol in
Molecular Biology, Vol.
1, Chap. 2.10, John Wiley & Sons,
Publishers (1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor (1989)). Em algumas representações, uma
molécula de ácido nucléico da invenção é capaz de hibridizar em uma molécula de ácido nucléico que contém a sequência de nucleotideo de ID SEQ NO: 1 sob condições de hibridização estritas que são: pré-hibridização de filtros que contêm ácido nucléico por 8 horas durante a noite a 65° C em uma solução que consiste em solução salina de 15 citrato (SSC) 6X (SSC IX é 0,15 M NaCl, 0,015 M Na citrato;
pH 7,0), solução de Denhardt 5X, 0,05% pirofosfato de sódio e 100 pg/ml DNA de esperma de arenque; hibridização por 1820 horas a 65° C em uma solução que contém SSC 6X, solução de Denhardt IX, 100 pg/ml levedura de tRNA e 0,05% pirofosfato de sódio; e lavagem de filtros a 65° C por 1 h
em uma solução que contém SSC 0,lX e 0,1% SDS (sódio dodecil sulfato). Em outras representações, as condições de hibridização rigorosa moderadamente usadas são: prétratamento de filtros que contêm ácido nucléico por 6 h a 25 40° C em uma solução que contém 35% formamida, SSC 5X, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1%
BSA e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado
DNA; hibridização por 182Oh a 40° C em uma solução que contém 35% formamida, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM
EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 pg/ml DNA de esperma de salmão e 10% (wt/vol) sulfato de dextrano;
seguido por duas vezes a lavagem por 1 hora a 55° C em uma solução que contém SSC 2X e 0,1% SDS. Também é possível usar baixas condições de rigor que consistem em: incubação
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por 8 horas durante a noite a 37° C em uma solução que consiste em 20% formamida, SSC 5X, 50 mM fosfato de sódio (pH 7.6), solução de Denhardt RX, 10% sulfato de dextrano e 20 pg/ml DNA de esperma de salmão desnaturado; hibridização 5 no mesmo tampão por 18 a 20 horas; e lavagem de filtros em SSC IX a aproximadamente 37° C por 1 hora.
Como resultado da degeneração do código genético, várias seqüências de polinucleotidios que codificam um sintase de citrato podem ser produzidas. Por exemplo, os
códons podem ser selecionados para aumentar a taxa em que a expressão do polipeptídio ocorre em uma espécie hospedeira especifica, de acordo com o uso de códon ideal imposto pelo organismo hospedeiro em questão (consulte, por ex.,
Nakamura et al, 1999, Nucleic Acids Res 27:292). Tais 15 variantes de sequência podem ser usadas nos métodos desta invenção.
Os métodos da invenção podem usar ortólogos do Arabidopsís sintase de citrato. Métodos de identificação dos ortólogos em outras espécies de planta são conhecidos
na arte. Normalmente, os ortólogos em diferentes espécies têm a . mesma função, em razão da presença de um ou mais motivos da proteína e/ou estruturas tridimensionais. Na evolução, quando um evento de duplicação genética segue a especificação, um único gene em uma espécie, como
Arabidopsís, pode corresponder a vários genes (parálogos) em outra. Conforme usado aqui, o termo ortólogo inclui os parálogos. Quando os dados da seqüência são disponíveis para uma espécie de planta em particular, os ortólogos são geralmente seqüência, seqüências identificados como análise de isca da por análise de homologia
BLAST, normalmente usando proteína.1 As seqüências de as são determinadas como um possível ortólogo se a melhor seqüência de acerto proveniente do resultado BLAST de avanço recuperar a seqüência de consulta original no BLAST
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reverso (Huynen MA and Bork P, Proc Natl Acad Sei (1998) 95:5849-5856; Huynen MA et al., Genome Research (2000) 10:1204-1210). Programas para alinhamento de seqüência
múltipla, como CLUSTAL (Thompson JD et al, 1994, Nucleic
Acids Res 22:4673-4680) podem ser usados para destacar as regiões conservadas e/ou residuos de proteínas ortólogas e para gerar árvores filogenéticas. Em uma árvore filogenética que representa seqüências homólogas múltiplas de diversas espécies (por ex., recuperadas por análise 10 BLAST), as seqüências ortólogas provenientes de duas espécies geralmente aparecem mais próximas na árvore em relação a todas as outras seqüências a partir dessas duas espécies. 0 enfileiramento estrutural ou outras análises de dobramento de proteínas (por ex., usando o software da
ProCeryon, Biosciences, Salzburg, Áustria) também pode identificar possíveis ortólogos. Os métodos de hibridização de ácido nucléico também podem ser usados para localizar
genes ortólogos e são preferidos quando os dados de seqüência não estão disponíveis. A PCB de degeneração e a 20 triagem de bibliotecas de cDNA ou de DNA genômico são métodos comuns para localizar seqüências genéticas relacionadas e são bem conhecidos na arte (consulte, por ex., Sambrook, supra; Dieffenbach C and Dveksler G (Eds.) Iniciador PCR: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 25 Laboratory Press, NY, 1989). Por exemplo, os métodos para gerar a biblioteca de cDNA com base na espécie da planta de interesse e sondar a biblioteca com sondas genéticas parcialmente homólogas são descritos em Sambrook et al, supra. Uma porção rigorosamente conservada da seqüência de 30 codificação Arabidopsis sintase de citrato pode ser usada como sonda. Os ácidos nucléicos ortólogos de sintase de citrato podem hibridizar para ácido nucléico de ID SEQ NO: 1 sob condições rigorosas elevada, moderada ou baixa. Após o aumento ou isolamento de um segmento de um ortólogo
18/28 putativo, esse segmento pode ser clonado e distribuído em seqüência por técnicas padrão e usado como uma sonda para isolar um clone de cDNA ou genômico completo. Também é possível iniciar o projeto EST para gerar um banco de dados 5 de informações de seqüência para a espécie da planta em questão. Em outra abordagem, os anticorpos que se ligam especificamente aos polipeptídios de sintase de citrato conhecidos são usados para isolamento ortólogo (por ex., Harlow E and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, New York). A análise por técnica Western blot pode determinar se um ortólogo sintase de citrato (ou seja, uma proteína de ortólogo) está presente em um extrato cru de uma determinada espécie de planta. Quando a reatividade é observada, a seqüência que codifica o ortólogo candidato pode ser isolada pelas bibliotecas de expressão de triagem que representam uma determinada espécie de planta. As bibliotecas de expressão podem ser construídas em vários vetores comercialmente disponíveis, incluindo lambda gtll, 20 conforme é descrito em Sambrook, et al. , supra. Assim que
o(s) ortólogo(s) candidato(s) é(são) identificado(s) por qualquer um desses meios, a seqüência do ortólogo candidato é usada como isca (a consulta) para o BLAST reverso contra seqüências de Arabidopsis ou outra espécie em que as 25 seqüências de ácido nucléico e ou polipeptídio de sintase de citrato foram identificadas.
Os ácidos nucléicos e polipeptídios de sintase de citrato podem ser obtidos usando qualquer método disponível. Por exemplo, técnicas para isolar seqüências de cDNA ou DNA 30 genômico em questão por triagem de bibliotecas de DNA ou por reação em cadeia da polimerase (PCR)t conforme foi descrito anteriormente, são bem conhecidas na arte. Além disso, a seqüência de ácido nucléico pode ser sintetizada. Qualquer método conhecido, como mutagênese sítio-dirigida
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(Kunkel TA et al., Methods Enzymol. 204:125-39, 1991), pode ser usado para introduzir alterações desejadas em um ácido nucléico clonado.
Em geral, os métodos da . invenção envolvem a incorporação da forma desejada do ácido nucléico de sintase de ci trato em um vetor de expressão da planta para a transformação em células de planta e o polipeptídio de sintase de citrato é expressado na planta molécula de ácido nucléico de sintase de hospedeira. Uma citrato isolada é *
diferente na forma ou ambiente em que é encontrada ín natura e molécula de identificada e separada de pelo menos uma ácido nucléico contaminante com a qual normalmente associada na fonte natural sintase de citrato. Mas uma molécula sintase de citrato isolada inclui do ácido nucléico de ácido nucléico de de moléculas de ácido nucléico de normalmente sintase de citrato contidas em células que expressam sintase de citrato em que, por exemplo, a molécula de ácido nucléico está em um local cromossômico diferente daquele de células naturais.
Geração de Plantas Modificadas Geneticamente com um
Fenótipo de Conteúdo de Óleo Alterado
Os ácidos nucléicos e polipeptídios de sintase de citrato podem ser usados na geração de plantas modificadas geneticamente e com um fenótipo de conteúdo de óleo 25 modificado. Conforme usado aqui, um fenótipo de conteúdo de óleo modificado pode se referir ao conteúdo de óleo modificado em qualquer parte da planta; o conteúdo de óleo modificado é observado com frequência nas sementes. Em uma representação preferida, a expressão alterada do gene de sintase de citrato em uma planta é usada para gerar plantas com um fenótipo de alto óleo.
Os métodos descritos aqui geralmente são aplicáveis a todas as plantas. Em uma representação preferida, a invenção é destinada às plantas de produção de óleo, que
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produzem e armazenam triacilglicerol em sementes. Essa • · · a · a • a a · a a • a · a • a a a • · a * • · · · a · • « · a a * • a a a a em órgãos específicos, espécie inclui soja colza e canola (incluindo Brassica napus, (Helianthus annus), algc girassol
B.
principalmente (Glycine max), campestris) , [Gossypium hirsutum), milho (Zea mays) cacao}, cártamo (Carthamus tinctorius) , dendezeiro (Elaeis e amendoim guineensis), coqueiro [Cocos nucifera) , linho (Linum usitatissimum) , mamona (Ricinus coimnunis) (Arachis hypogaea). A invenção também pode ser destinada a plantas frutíferas ou geradoras de vegetais e legumes, plantas espécie geradoras de grãos, plantas
Brassica de ciclo rápido, alfalfa geradoras de nozes, (Medicago sativa), tabaco (Nicotiana) , grama seca (família
Poaceae), outros plantios de forragem e espécie selvagem que pode ser uma fonte única de ácidos graxos.
profissional habilidoso reconhecerá que existe uma ampla variedade de novas técnicas estão
Qualquer técnica que técnicas de transformação na arte e continuamente se tornando disponíveis.
seja adequada para a planta hospedeira alvo pode ser empregada no escopo desta invenção. Por
exemplo, os construtos podem ser introduzidos de várias maneiras, entre outras, como um filamento de DNA, em um plasmídeo ou em um cromossomo artificial. A introdução dos construtos nas células da planta alvo pode ser executada por meio de várias técnicas, incluindo, entre outras, transformação mediada por Agrobacterium, eletroporação, microinjeção, co-precipitação de cálcio-fosfato-DNA por bombardeamento de microprojétil ou transformação mediada por liposomo de um ácido nucléico heterólogo. A transformação da planta é, de preferência, permanente, ou seja, por integração dos construtos de expressão introduzidos no genoma da planta hospedeira para que os construtos introduzidos sejam passados para gerações de plantas sucessivas. Dependendo do uso pretendido, um
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construto de ácido nucléico heterólogo que compreende um polinucleotidio de sintase de citrato pode codificar a proteína inteira ou uma porção ativa biologicamente.
Em uma representação, os sistemas vetoriais com base em Ti binário podem ser usados para transferir polinucleotídios. Os vetores binários de Agrobacterium são conhecidos por especialistas na arte e muitos estão comercialmente disponíveis (por ex., pBI121 Clontech
Laboratories, Paio Alto, CA) .
0 procedimento ideal para a transformação de plantas com vetores Agrobacterium variará com o tipo de planta em transformação. Métodos exemplares para a transformação mediada por Agrobacterium incluem a transformação de explantes de hipocotil, ápice caulinar, tecido do talo ou 15 da folha, derivados de mudas estéreis e/ou pequenas plantas.
Essas plantas transformadas podem ser reproduzidas sexualmente ou por cultivo celular ou tecidual. A transformação de Agrobacterium foi descrita anteriormente para um grande número de diferentes tipos de plantas e 20 métodos, pois tais transformações podem ser encontradas na literatura científica. De importância particular são os métodos para transformar plantios comercialmente importantes, como de colza (De Block et al., Plant Physiol. (1989) 91:694-701), girassol (Everett et al.,
Bio/Technology (1987) 5:1201), e soja (Christou et al.,
Proc. Natl. Acad. Sei USA (1989) 86:7500-7504; Kline et al.,
Nature (1987) 327:70).
A expressão (incluindo a transcrição e a tradução) de sintase de citrato pode ser regulada em relação ao nível de 30 expressão, o(s) tipo(s) de tecido em que a expressão ocorre e/ou o estágio de desenvolvimento da expressão. Várias sequências regulatórias heterólogas (por ex., promotores e otimizadores) estão disponíveis para controlar a expressão de um ácido nucléico de sintase de citrato. Elas incluem
22/28 promotores reguláveis, controlam temporal.
promotor
5,783, 393 *
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* induzidos e
ser constituintes, que podem bem como promotores e otimizadores que expressão de maneira especifica do tecido Exemplos de promotores constituintes incluem o E4 da framboesa (Patentes Norte-americana N°s.
ou e 5,783,394), o 35S CaMV (Jones JD et al.
Transgenic
B et al.,
Res 1:285-297 1992), o promotor CsVMV (Verdaguer
Plant Mol Biol 37:1055-1067, 1998) e o promotor de actina de melão (PCT publicado, requerimento W00056863).
Exemplos de promotores específicos do tecido incluem os promotores E4 e E8 de tomate (Patente Norte-americana n°.
5, 859, 330) e o promotor do gene 2AII do tomate (Van Haaren MJJ et al., Plant Mol Bio 21:625-640, 1993).
Em uma representação preferida, a expressão de sintase de citrato está sob controle de sequências reguladoras de genes cuja expressão está associada ao desenvolvimento da semente e/ou embrião. Os genes de legumes cujos promotores estão associados ao desenvolvimento anterior de semente e de embrião incluem V. faba legumin (Baumlein et al., 1991,
Mol Gen Genet 225:121-8; Baumlein et al., 1992, Plant J
2:233-9), V. faba usp (Fiedler et al., 1993, Plant Mol Biol 22:669-79), pea convicílin (Bown et al., 1988, Biochem J 251:717-26), pea lectin (dePater et al., 1993, Plant Cell
5:877-86), P. vulgaris beta phaseolin (Bustos et al., 1991, 25 EMBO J 10:1469-79), P. vulgaris DLEC2 e PHS [beta] (Bobb et al, 1997, Nucleic Acids Res 25:641-7), e soja betaConglycinin, proteina de armazenamento 7S (Chamberland et al., 1992, Plant Mol Biol 19:937-49). Os genes de cereais cujos promotores estão associados ao desenvolvimento anterior de semente e de embrião incluem glutelin de arroz {GluA-3,” Yoshihara e Takaiwa, 1996, Plant Cell Physiol 37:107-11; GluB-l, Takaiwa et al., 1996, Plant Mol Biol 30:1207-21; Washida et al., 1999, Plant Mol Biol 40:1-12;
Gt3,” Leisy et al., 1990, Plant Mol Biol 14:41-50),
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prolamin de arroz (Zhou & Fan, 1993, Transgenic Res 2:1416), prolamin de trigo (Hammond-Kosack et al., 1993, EMBO J
12:545-54), zein de milho (Z4, Matzke et al., 1990, Plant
Mol Biol 14:323-32), e B-hordeins de cevada (Entwistle et al., 1991, Plant Mol Biol 17:1217-31). Outros genes cujos promotores estão associados ao desenvolvimento anterior de semente e embrião incluem dendezeiro GLO7A (7S globulin, Morcillo et al., 2001, Physiol Plant 112:233-243), Brassica napus napin, proteína de armazenamento 2S e gene napA (Josefsson et al., 1987, J Biol Chem 262:12196-201;
Stalberg et al., 1993, Plant Mol Biol 1993 23:671-83;
Ellerstrom et al., 1996, Plant Mol Biol 32:1019-27),
Brassica napus oleosin (Keddie et al., 1994, Plant Mol Biol
24:327-40), Arabidopsis oleosin (Plant et al., 1994, Plant
Mol Biol 25:193-205), Arabidopsis FAE1 (Rossak et al., 2001,
Plant Mol Biol 46:717-25), Canavalia gladiata conA (Yamamoto et al., 1995, Plant Mol Biol 27:729-41), e sintase de estrictosidina de Catharanthus roseus (Str,
Ouwerkerk and Memelink, 1999, Mol Gen Genet 261:635-43). Em outra representação preferida, as sequências reguladoras
provenientes dos genes expressados durante a biossintese do óleo são usados (consulte, por ex., a Patente Norteamericana N°. : 5,952, 544) . Os promotores alternativos são provenientes de genes de proteína de armazenamento de planta (Bevan et al, 1993, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sei 342:209-15) .
Ainda em outro aspecto, em alguns casos pode ser desejável inibir a expressão de sintase de citrato endógeno em uma célula hospedeira. Exemplos de métodos para praticar 30 esse aspecto da invenção incluem, entre outros, a supressão de anti-sense (Smith, et al., Nature 334:724-726, 1988; van der Krol et al., Biotechniques (1988) 6:958-976); cosupressão (Napoli, et al, Plant ríbozimas (Publicação do PCT, WO
Cell 2:279-289, 1990);
97/10328); e combinações
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et al.f Proc. Natl. Acad.
de sense e anti-sense (Waterhouse,
Sei. USA 95:13959-13964, 1998) . Os métodos para supressão de seqüências endógenas em uma célula hospedeira normalmente empregam a transcrição ou transcrição e 5 tradução de pelo menos uma porção da seqüência a ser suprimida. Essas seqüências podem ser homólogas para codificar também as regiões sem codificação da seqüência endógena. A inibição anti-sense pode usar a seqüência cDNA inteira (Sheehy et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) . *
85:8805-8809), uma seqüência cDNA parcial que inclui fragmentos de seqüência de codificação 5’, (Cannon et al.,
Plant Molec. Biol. (1990) 15:39-47), ou seqüências sem codificação 3’ (Ch'ng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1989) 86:10006-10010). Técnicas de compressão podem usar a
seqüência de cDNA inteira (Napoli et al·., supra; van der Krol et al., The Plant Cell (1990) 2:291-299) ou uma seqüência de cDNA parcial (Smith et al., Mol. Gen. Genetics (1990) 224:477-481).
Testes moleculares e genéticos padrão podem ser 20 executados para analisar a associação entre um gene e um fenótipo observado. Técnicas de exemplo são descritas a seguir.
1. Análise de DNA/RNA
Os padrões de expressão genética específica do estágio e do tecido no mutante versus linhagens do tipo selvagem podem ser determinados, por exemplo, por hibridização in situ. A análise do status de metilação do gene, especialmente regiões reguladoras de fIanqueamento, pode ser executada. Outras técnicas adequadas incluem a super30 expressão, expressão ectópica, expressão em outra espécie de planta e retirada do gene (gene knock-out) (genética reversa, knock-out alvo, silenciador do gene [VIGS, consulte Baulcombe D, Arch Virol Suppl 15:189-201, 1999]).
Em um perfilamento de expressão da aplicação preferida,
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para medir é
usado geralmente por análise de microarranjo, simultaneamente as diferenças ou induzir alterações na expressão de muitos genes diferentes.
Técnicas para análise de microarranjo são bem conhecidas na
M et al.,
Science (1995) 270:467-470; Baldwin
D et al.,
Cur Opin
Plant Biol. 2(2):96-103, 1999; Dangond F, Physiol
Genomics (2000) 2:53-58; van
78:271-280; Richmond
Hal NL et al.,
J Biotechnol (2000)
T e Somerville S, Curr Opin Plant Biol rotuladas individuais pode ser executado. Essas análises podem identificar outros genes que são regulados de maneira coordenada como uma consequência da super-expressão do gene de um
2.
de interesse, que pode ajudar a pôr um gene desconhecido em caminho específico.
Análise de
A análise proteína
Produto do Gene de produtos do gene pode incluir expressão recombinante, produção imunolocalização, ensaios catalítica ou de outro fosforilação e análise de de anti-soro.
bioquímicos tipo, análise para de atividade status de interação com outras proteínas
por meio de dois ensaios híbridos de levedura.
3. Análise do Caminho
A análise do caminho pode incluir a colocação de um gene ou produto do gene dentro de um caminho particular bioquímico, metabólico ou de sinalização com base no fenótipo de má expressão ou por homologia de seqüência com genes relacionados. A análise pode compreender também os cruzamentos genéticos com linhagens do tipo selvagem e outras linhagens mutantes (criando mutantes duplos) para ordenar o gene em um caminho, ou determinar o efeito de uma mutação na expressão de genes repórteres de fluxo descendentes em um caminho.
Geração de Plantas que Sofreram Mutação com um Fenótipo de
Conteúdo de Óleo Alterado
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A invenção fornece um método de ♦4 <4 »: 1 ' < 4 * 4 ♦ ♦ ♦·*·< 41 identificação plantas que tenham mutações na sintase de citrato endógeno que fornece o conteúdo de óleo alterado e geração de progênia de conteúdo de óleo alterado dessas plantas que 5 não são geneticamente modificadas. Em um método, chamado TILLING (com as inicias provenientes da definição em inglês: targeting induced local lesions in genomes ~ lesões locais induzidas por alvo em genomas), as mutações são induzidas na semente de uma planta de interesse, por
exemplo, usando tratamento EMS. As plantas resultantes crescem e são autofertilizadas e a progênia é usada para preparar as mostras de DNA. A PCR específica de sintase de citrato é usada para identificar se uma planta que sofreu mutação apresenta a mutação de sintase de citrato. As plantas que apresentam mutações de sintase de citrato podem ser testadas para verificar se há conteúdo de óleo alterado e, em seguida, a PCR específica da sintase de citrato é usada para determinar se uma planta que possui conteúdo de óleo alterado possui um gene sintase de citrato que sofreu mutação. O TILLING pode identificar mutações que podem
alterar a expressão de genes específicos ou a atividade de proteínas codificadas por esses genes (consulte Colbert et al (2001) Plant Physiol 126:480-484; McCallum et al (2000)
Nature Biotechnology 18:455-457).
Em outro método, a abordagem de um gene candidato/Quantitative Trait Locus (QTLs) pode ser usada em um programa de; geração assistida por marcador para identificar alelos de ou mutações no gene sintase de citrato ou ortólogos de .sintase de citrato que podem 30 fornecer conteúdo de óleo alterado (consulte Bert et al.,
Theor Appl Genet. 2003 Jun;107(1);181-9; e Lionneton et al,
Genome. 2002 Dec;45(6):1203-15). Assim, em outro aspecto da invenção, um ácido nucléico sintase de citrato é usado para identificar se uma planta que tenha conteúdo de óleo
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alterado apresente uma mutação na sintase de citrato endógeno ou tenha um alelo particular que origine o conteúdo de óleo alterado.
Todas as publicações citadas aqui são estão incorporadas integralmente para referência com a finalidade de descrever e divulgar composições e metodologias que possam ser usadas com relação à invenção. Todas as patentes citadas, requerimento de patentes e informações sobre a seqüência em sites de referência e bancos de dados públicos
Λ
também foram incorporados para referência.
Exemplos
Exemplo 1
Geração de plantas transgênicas com super-expressão de sintase de citrato
Um.subconjunto de genes codificadores de enzimas do caminho de glioxilato foi super-expressado em Arabídopsís
de tipo selvagem e sementes das plantas transgênicas TI foram testadas em busca de um fenótipo de alto óleo. Para super-expressar os genes, o DNA genômico foi ampliado em 20 PCR com iniciadores específicos de cada gene. O produto PCR foi clonado atrás do promotor CsVMV em um vetor T-DNA com o gene NPTII (que serve como um marcador selecionável) e transformado em plantas Arabidopsis de tipo selvagem. As plantas transgênicas foram selecionadas pelas sementes 25 germinadoras em ágar com canamicina. As sementes resistentes à canamicina foram transplantadas para o solo e cresceram. Plantas Col-0 de tipo selvagem não transformadas foram usadas para controle. As sementes germinaram em ágar (sem canamicina) e as mudas foram transplantadas para o solo e cresceram. O conteúdo de óleo nas sementes coletado tanto das plantas de controle quanto das transgênicas foi avaliado com reflectância no infravermelho próximo (NIR, Near Infrared Spectroscopy). Os espectros de infravermelho NIR foram capturados com Bruker 22 N/F. O software Bruker
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* ♦· • *· ··V •« •· •· « w V • · • · • · »·· b· • * « * • · ♦ · • ·· · *4 · • .4« ·· •· 4 foi usado para estimar o conteúdo de óleo total na semente usando os dados da análise NIR métodos de referência de acordo com as instruções do fabricante.
Os resultados mostraram que a super-expressão do gene
Arabidopisis sintase de citrato (At3g58750) confere um fenótipo de alto óleo na semente. As sementes de 4 linhas transgênicas com super-expressão de At3g58750 (sintase de
citrato codificadora) tinham mais óleo do que todas as plantas de controle testadas. Os valores variaram entre 10 41,6% e 41,2% de óleo para as plantas transgênicas enquanto os valores das sementes de controle variaram entre 40,9% e
38,7%. O conteúdo de óleo médio na semente de controle foi de 39,9%. A super-expressão da sintase de citrato pode conferir no máximo 7% de aumento no óleo da semente.
Exemplo 2
Análise da sintase de citrato de Arabidopsis
As análises da sequência foram executadas com BLAST (Altschul et ai., 1997, J. Mol. Biol. 215:403-410), PFAM (Bateman et al., 1999, Nucleic Acids Res 27:260-262), PSORT (Nakai K, e Horton P, 1999,Trends Biochem Sei 24:34-6),
e/ou CLUSTAL (Thompson JD et al, 1994, Nucleic Acids Res
22:4673-4680) . Vários ortólogos foram identificados com igualdade de sequência e, por isso, espera-se que também confiram um fenótipo de alto óleo quando super-expressados em uma planta. Entre as sintases de citrato ortólogas de várias espécies de plantas estão: GI#1345933 e GI#975633 (Cucurbita cv. ) ; GI#15231128 e GI#11268305 (Arabidopsis thaliana); GI#8928010 (Daucus carota); GI#6647461 (Solanum tuberosum); GI#1352088 (Citrus maxima); GI#15982952 (Prunus pérsica); GI#11066954 (Oryza sativa); GI#2300712 (Nicotiana tabacum) e GI#2300710 (Beta vulgaris) .
Claims (2)
- REIVINDICAÇÕES1. Método de produção de uma planta com percentagem de óleo aumentada quando comparada com plantas controle não transformada caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:a) introduzir em células progenitoras de plantas, o vetor de transformação de plantas que engloba a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1;b) crescer as células progenitoras transformadas para produzir uma planta transgênica, onde a sequência de polinucleotídeos é superexpressa em relação a uma planta não transgênica de controle; ec) selecionar a referida planta transgênica que apresenta um conteúdo de óleo aumentado de pelo menos 41% quando comparada a percentagem de óleo de plantas controle não transformadas.
- 2. Método de recuperar um óleo a partir de uma planta transgênica com uma percentagem de óleo aumentada quando comparada com plantas controle não transformada caracterizado pelo fato de que compreender uma etapa de recuperação do óleo produzido pelas plantas obtidas pelo método conforme definido pela reivindicação 1.
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