BRPI0720759A2 - Produção de plantas com conteúdo alterado de óleos, proteínas ou fibras - Google Patents

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃO DE PLANTAS COM CONTEÚDO ALTERADO DE ÓLEOS, PROTEÍNAS OU FIBRAS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO(S) DE PATENTE(S) RELACIONA- DO(S)
Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Pa- tente U.S. Provisório N- 60/870.345, depositado em 15 de dezembro de 2006, cuja totalidade é incorporada aqui como referência.
CAMPO DA DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a plantas modificadas com conte- údo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras, assim como a métodos de pro- dução de plantas modificadas que possuem conteúdo modificado de óleos, proteínas e/ou fibras partindo de tais plantas.
ANTECEDENTES
A capacidade de manipular a composição de sementes de plan- tas de cultivo, particularmente o conteúdo e a composição de óleo e de pro- teína das sementes, assim como a energia metabolizável disponível ("AME") na farinha de sementes no gado, possui aplicações importantes nas indús- trias agrícolas, em relação tanto a óleos para alimentos processados quanto a produtos alimentícios para animais. As sementes de plantas de cultivo a- grícolas contêm uma variedade de constituintes valiosos, incluindo óleo, pro- teína e amido. O processamento industrial pode separar parte ou todos es- tes constituintes para venda individual em aplicações específicas. Por exem- plo, quase 60% da plantação de soja nos Estados Unidos da América são triturados pela indústria de processamento da soja. O processamento da soja produz óleo purificado, que é vendido com alto valor, enquanto que o restante da farinha das sementes é vendido para a alimentação de gado (U.S. Soybean Board, 2001 Soy Stats). A semente de canola também é tritu- rada para produzir óleo e o co-produto farinha de canola (Canola Council of Canada). A farinha de canola contém uma alta porcentagem de proteína e um bom equilíbrio de aminoácidos, mas devido ao fato de que possui um alto teor de fibras e fitato, não é facilmente digerida pelo gado (Slominski, B.A. e outros, 1999 Proceedings of the 10th International Rapeseed Con- gress, Canberra, Austrália) e possui um valor inferior ao da farinha de soja.
Mais de 55% do milho produzido nos EUA são utilizados como produto alimentício para animais (lowa milho Growers Association). O valor do milho está diretamente relacionado com sua capacidade de ser digerido pelo gado. Assim, é desejável maximixar tanto o conteúdo de óleo das se- mentes quanto a AME da farinha. Para as sementes oleosas processadas tais como soja e canola, o aumento do conteúdo absoluto de óleo da semen- te aumentará o valor de tais grãos, enquanto que o aumento da AME da fa- rinha aumentará seu valor. Para o milho processado, um aumento ou um decréscimo no conteúdo de óleo pode ser desejado, dependendo de como os outros constituintes principais serão utilizados. A diminuição de óleo pode aumentar a qualidade do amido isolado através da redução de sabores inde- sejados associados com a oxidação do óleo. Alternativamente, quando o amido é utilizado para a produção de etanol, quando o sabor não é importan- te, o aumento do conteúdo de óleo pode aumentar o valor geral.
Em muitos grãos para alimentação, tais como milho e trigo, é desejável aumentar o conteúdo de óleo das sementes, porque o óleo possui maior conteúdo de energia que os outros constituintes da semente tal como 20 o carboidrato. O processamento de sementes oleosas, como a maior parte dos negócios de processamento de grãos, é um negócio de capital intensivo; assim pequenas alterações na distribuição dos produtos dos componentes de menor valor para o componente de óleo de alto valor podem ter impactos econômicos substanciais para os processadores de grãos. Em adição, o 25 aumento da AME da farinha através do ajuste do conteúdo e da composição de proteínas e de fibras das sementes, sem diminuir o conteúdo de óleo das sementes, pode aumentar o valor do produto alimentício para animais.
A manipulação biotecnológica de óleos tem mostrado fornecer alteração na composição e aumento do rendimento dos óleos. As alterações na composição incluem óleo de soja e de milho com alto conteúdo de ácido oleico (Patentes U.S. N— 6.229.033 e 6.248.939) e sementes contendo Iau- rato (Patente U.S. N2 5.639.790), entre outros. O trabalho na alteração da composição se concentrou predominantemente em sementes oleosas pro- cessadas, mas pode ser facilmente estendido a plantas de cultivo sem ser semente oleosa, incluindo milho. Embora haja interesse considerável no aumento do conteúdo de óleo, a única biotecnologia praticada atualmente 5 nesta área é a tecnologia High-Oil Corn (HOC) (Dupont, Patente U.S. Ns 5.704.160). HOC emprega polinizadores de alto conteúdo de óleo desenvol- vidos atravé do cruzamento por seleção clássico com fêmeas híbridas de elite (estéreis em relação ao sexo masculino) em um sistema de produção referido como TopCross. O sistema TopCross High Oil aumenta o conteúdo 10 de óleo no grão colhido no milho de aproximadamente 3,5% até aproxima- damente 7%, aumentando o conteúdo de energia do grão.
Embora este tenha sido produtivo, o sistema de produção HOC possui limitações inerentes. Em primeiro lugar, o sistema de ter uma baixa porcentagem de polinizadores responsáveis por um conjunto inteiro de se- 15 mentes do campo contém riscos inerentes, particularmente em anos de se- ca. Em segundo lugar, o conteúdo de óleo nos campos de HOC atuais não foi capaz de atingir um conteúdo de óleo de semente acima de 9%. Final- mente, o milho com alto conteúdo de óleo não é primariamente uma altera- ção bioquímica, mas ao invés disso um mutante anatômico (tamanho de 20 embrião maior) que possui o resultado indireto de aumentar o conteúdo de óleo. Por estas razões, uma estratégia de alto conteúdo de óleo alternativa, particularmente uma que deriva de um produto bioquímico alterado, seria especialmente valiosa.
A manipulação da composição das sementes identificou vários 25 componentes que aumentam a qualidade nutritiva, a digestibilidade e a AME na farinha de semente. O aumento do conteúdo de Iisina na canola e na soja (Falco e outros, 1995 Bio/Technology 13:577-582) aumenta a disponibilidade deste aminoácido essencial e diminui a necessidade de suplementos nutri- cionais. Foi mostrado que variedades de soja com maior proteína na semen- 30 te contêm consideravelmente mais energia metabolizável que as variedades convencionais (Edwards e outros, 1999, Poultry Sei. 79:525-527). Foi mos- trado que a diminuição do conteúdo de fitato da semente de milho aumenta a disponibilidade biológica de aminoácidos nos produtos alimentícios para animais (Douglas e outros, 2000, Poultry Sei. 79:1586-1591) e a diminuição do conteúdo de oligossacarídeos na farinha de soja aumenta a energia me- tabolizável na farinha (Parsons e outros, 2000, Poultry Sei. 79:1127-1131).
5 A soja e a canola são as plantas de cultivo alvos mais óbvias
para os mercados de óleo processado e de farinha de semente uma vez que ambas as plantas de cultivo são trituradas para óleo e a farinha remanescen- te é vendida para a alimentação de animais. Um grande grupo de trabalho comercial (por exemplo, Patente U.S. N2 5.952.544; Pedido de Patente PCT 10 N2 W09411516) demonstra que Arabidopsis é um modelo excelente para o metabolismo de óleo nestas plantas de cultivo. Verificações bioquímicas da composição do óleo das sementes identificaram genes de Arabidopsis para muitas enzimas biossintéticas críticas e levaram à identificação de ortólogos de genes importantes para a agronomia. Por exemplo, verificações utilizando 15 populações mutagenizadas quimicamente identificaram mutantes lipídicos cujas sementes exibem composição alterada de ácidos graxos (Lemieux e outros, 1990, Theor. Appi Genet. 80: 234-240; James e Dooner, 1990, The- or. Appi Genet. 80: 241-245). Verificações de mutagênese por T-DNA (Feldmann e outros, 1989, Science 243: 1351-1354) que detectaram compo- 20 sição alterada de ácidos graxos identificaram os genes da ômega 3 dessatu- rase (FAD3) e da delta-12 dessaturase (FAD2) (Patente U.S. N2 5952544; Yadav e outros, 1993, Plant Physioi 103: 467-476; Okuley e outros, 1994, Plant Cell 6(1): 147-158). Uma verificação que se concentrou no conteúdo de óleo ao invés de na qualidade do óleo, analisou mutantes induzidos quimi- 25 camente em relação a sementes enrugadas ou à densidade alterada de se- mentes, cujo conteúdo alterado de óleo da semente foi inferido (Focks e Benning, 1998, Plant Physioi 118:91-101).
Uma outra verificação, planejada para identificar enzimas envol- vidas na produção de ácidos graxos de cadeia muito longa, identificou uma mutação no gene que codifica uma diacilglicerol aciltransferase (DGAT) co- mo sendo responsável pelo acúmulo reduzido de triacil glicerol nas semen- tes (Katavic V e outros, 1995, Plant Physiol. 108(1):399-409). Foi também mostrado que a superexpressão específica à semente do cDNA de DGAT estava associada com o maior conteúdo de óleo na semente (Jako e outros, 2001, Plant Physioi 126(2):861-74). Arabidopsis é também um modelo para o entendimento do acúmulo dos componentes da semente que afetam a 5 qualidade da farinha. Por exemplo, Arabidopsis contém as proteínas de ar- mazenamento de semente albumina e globulina encontradas em muitas plantas dicotiledôneas incluindo canola e soja (Shewry 1995, Plant Cell 7:945-956). As vias bioquímicas para a síntese de componentes de fibra, tais como celulose e lignina, são conservadas dentro das plantas vasculares e 10 mutantes de Arabidopsis que afetam estes componentes foram isolados (re- visado em Chapei e Carpita 1998, Current Opinion in Plant Biology 1:179- 185).
A marcação por ativação em plantas refere-se a um método de produção de mutações aleatórias através da inserção de uma constructos de ácido nucleico heterólogo que compreende seqüências reguladoras (por e- xemplo, um intensificador) no genoma de uma planta. As seqüências regula- doras podem atuar para aumentar a transcrição de um ou mais genes vege- tais nativos; consequentemente, a marcação por ativação é um método pro- dutivo para a produção de mutantes de ganho de função, geralmente domi- nantes (ver, por exemplo, Hayashi e outros, 1992, Science 258: 1350-1353; Weigel D e outros, 2000, Plant Physiology, 122:1003-1013). O constructo inserido fornece uma marcação molecular para a identificação rápida da planta nativa cuja expressão errada causa o fenótipo mutante. A marcação por ativação também pode causar fenótipos de perda de função. A inserção pode resultar na interrupção de um gene vegetal nativo, em cujo caso o fe- nótipo é geralmente recessivo.
A marcação por ativação foi utilizada em várias espécies, inclu- indo tabaco e Arabidopsis, para a identificação de muitos tipos diferentes de fenótipos mutantes e os genes associados com estes fenótipos (Wilson e 30 outros, 1996, Plant Cell 8: 659-671; Schaffer e outros, 1998, Cell 93: 1219- 1229; Fridborg e outros, 1999, Plant Cell 11: 1019-1032; Kardailsky e outros, 1999, Science 286: 1962-1965; e Christensen S e outros, 1998, 9th Internati- onal Conference on Arabidopsis Research, Univ. of Wisconsin-Madison, 24- 28 de junho, Resumo 165).
SUMÁRIO
São fornecidas aqui plantas modificadas que possuem um fenó- tipo alterado. As plantas modificadas com um fenótipo alterado podem incluir um fenótipo de quantidade maior de óleo e/ou de melhor qualidade de fari- nha. O fenótipo alterado em uma planta modificada pode também incluir con- teúdo de óleos, proteínas e/ou fibras alterado em qualquer parte da planta modificada, por exemplo, nas sementes. Em algumas modalidades de uma planta modificada, o fenótipo alterado é um aumento no conteúdo de óleo da semente (um fenótipo de alto conteúdo de óleo). Em outras modalidades, o fenótipo alterado pode ser um aumento no conteúdo de proteínas na semen- te e/ou um decréscimo no conteúdo de fibras da semente. É também forne- cida uma farinha de semente derivada das sementes de plantas modifica- das, em que as sementes possuem conteúdo alterado de proteínas e/ou conteúdo alterado de fibras. É também fornecido um óleo derivado das se- mentes de plantas modificadas, em que as sementes possuem conteúdo de óleo alterado. Qualquer uma destas alterações pode levar a um aumento na AME da semente ou da farinha da semente das plantas modificadas, em relação às plantas de controle ou do tipo selvagem. É também fornecida aqui uma farinha, um produto alimentício ou um alimento produzido partindo de qualquer parte da planta modificada com um fenótipo alterado.
Em certas modalidades, as plantas modificadas descritas inclu- em plantas transgênicas que possuem um vetor de transformação que com- 25 preende uma seqüência de nucleotídeos de HIO (ou pseudônimo do gene HIO) que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um poli- peptídeo "HIO". Em modalidades particulares, a expressão de um polipeptí- deo de HIO em uma planta transgênica causa um conteúdo alterado de óleo, um conteúdo alterado de proteínas e/ou um conteúdo alterado de fibras na 30 planta transgênica. Em modalidades preferidas, a planta transgênica é sele- cionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, inclu- indo canola e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, aça- froa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e arroz. É também fornecido um método de produção de óleo ou de farinha de semen- te, que compreende o cultivo da planta transgênica e a recuperação do óleo e/ou da farinha da semente da dita planta. A descrição fornece ainda produto 5 alimentício, farinha, grão ou semente que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de HIO. A descrição fornece a- inda produto alimentício, farinha, grão ou semente que compreende o poli- peptídeo de HIO ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo.
Os exemplos da planta transgênica descrita são produzidos a- través de um método que compreende a introdução nas células progenitoras da planta de um vetor de transformação de planta que compreende uma se- qüência de nucleotídeos de HIO que codifica, ou é complementar a uma se- qüência que codifica, um polipeptídeo de HIO e o crescimento das células progenitoras transformadas para produzir uma planta transgênica, em que a seqüência de polinucleotídeo de HIO é expressa, causando um fenótipo alte- rado na planta transgênica. Em alguns exemplos não Iimitantes específicos, o método produz plantas transgênicas em que a expressão do polipeptídeo de HIO causa um fenótipo de alto conteúdo (maior) de óleos, de alto conteú- do (maior) de proteínas e/ou de baixo conteúdo (menor) de fibras na planta transgênica, em relação às plantas não transgênicas ou do tipo selvagem de controle.
São descritos aqui métodos adicionais de produção Ed uma planta que possui um fenótipo alterado, em que é identificado que uma plan- ta possui uma mutação ou um alelo em sua seqüência de ácido nucleico de 25 HIO que resulta em um fenótipo alterado, comparada a plantas que não pos- suem a mutação ou o alelo. A planta mutada pode ser gerada utilizando um ou mais agentes mutagênicos, por exemplo, um agente mutagênico químico, radiação ou Iuz ultravioleta. Em algumas modalidades do método, a planta é cruzada para gerar progênie que herda o alelo e expressa o fenótipo altera- 30 do. Em modalidades particulares do método, o método emprega a metodo- logia de gene/QTL candidato ou a metodologia de TILLING.
É também fornecida aqui uma célula vegetal modificada que possui um fenótipo alterado. Em algumas modalidades, a célula vegetal mo- dificada inclui um vetor de transformação que compreende uma seqüência de nucleotídeos de HIO que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um polipeptídeo de HIO. Em modalidades preferidas, a célula 5 vegetal transgênica é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo canola e semente de colza, soja, milho, gi- rassol, algodão, cacau, açafroa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, a- mendoim, trigo, aveia e arroz. Em outras modalidades, a célula vegetal é uma semente, um pólen, um propágulo ou uma célula embrionária. A descri- 10 ção fornece ainda células vegetais provenientes de uma planta que é a pro- gênie direta ou a progênie indireta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras.
DESCRIÇÃO DETALHADA Termos
A não ser que seja indicado de outra maneira, todos os termos
técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que teri- am para um versado na técnica da presente descrição. Os profissionais se direcionam particularmente a Sambrook e outros (Molecular Cloning: A La- boratory Manua\ (Segunda Edição), Cold Spring Harbor Press, Plainview, 20 N.Y., 1989) e Ausubel FM e outros (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova York, N.Y., 1993) para definições e termos da téc- nica. Deve ser entendido que esta descrição não está limitada à metodologi- a, aos protocolos e aos reagentes particulares descritos, uma vez que estes podem variar.
Como utilizado aqui, o termo "fenótipo alterado" refere-se a plan-
tas ou a qualquer parte de uma planta (por exemplo, sementes ou farinha produzida partindo de sementes), com um conteúdo de óleos, proteínas e/ou fibras alterado (fenótipo). Como fornecido aqui, conteúdo de óleos, de prote- ínas (por exemplo, proteína que pode ser digerida) e/ou de fibras alterado 30 inclui um nível maior ou menor de conteúdo de óleos, de proteínas (por e- xemplo, proteína que pode ser digerida) e/ou de fibras nas plantas, nas se- mentes ou na farinha de sementes. Qualquer combinação destas alterações pode levar a um fenótipo alterado. Por exemplo, em um exemplo não- Iimitante específico, um fenótipo alterado pode se referir ao conteúdo maior de óleos e menor de fibras. Em um outro exemplo não Iimitante específico, um fenótipo alterado pode se referir ao conteúdo inalterado de proteínas e menor de fibras. Em um outro exemplo não Iimitante específico, um fenótipo alterado pode se referir ao conteúdo maior de óleos e de proteínas e menor de fibras. Ainda em outros exemplos não limitantes, um fenótipo alterado pode se referir ao conteúdo maior de óleos e de proteínas e inalterado de fibras; ao conteúdo inalterado de óleos, maior de proteínas e menor de fi- bras; ou ao conteúdo maior de óleos, maior de proteínas e menor de fibras. É também fornecido que qualquer combinação destas alterações pode levar a um aumento na AME (energia metabolizável disponível) da semente ou farinha gerada partindo da semente. Um fenótipo alterado também inclui um fenótipo de maior qualidade de semente (ISQ) ou um fenótipo de maior qua- Iidade de farinha da semente.
Como utilizado aqui, o termo "energia metabolizável disponível" (AME) refere-se à quantidade de energia no produto alimentício que é capaz de ser extraída através da digestão em um animal e está correlacionada com a quantidade de proteínas que podem ser digeridas e de óleo na farinha pa- 20 ra animais. A AME é determinada através da estimativa da quantidade de energia no produto alimentício antes da alimentação e da medida da quanti- dade de energia nos excrementos do animal após o consumo do produto alimentício. Em um exemplo não Iimitante específico, uma planta modificada com um aumento na AME inclui plantas modificadas com conteúdo alterado 25 de óleo da semente, de proteínas que podem ser digeridas, de proteína total e/ou de fibras, resultando em um aumento no valor do produto alimentício para animais derivado da semente.
Como utilizado aqui, o termo "conteúdo" refere-se ao tipo e à quantidade relativa de, por exemplo, um componente da semente ou de fari- nha da semente.
Como utilizado aqui, o termo "óleo da semente" refere-se à quantidade total de óleo dentro da semente. Como utilizado aqui, o termo "fibra da semente" refere-se aos componentes que não podem ser digeridos da semente da planta incluindo componentes celulares tais como celulose, hemicelulose, pectina, Iignina e compostos fenólicos.
5 Como utilizado aqui, o termo "farinha" refere-se aos componen-
tes da semente remanescentes após a extração de óleo da semente. Os exemplos de componentes de farinha incluem proteína e fibra.
Como utilizado aqui, o termo "proteína total da semente" refere- se à quantidade total de proteína dentro da semente.
Como utilizado aqui, o termo "proteína que pode ser digerida da
semente" refere-se à proteína da semente que é capaz de ser digerida por enzimas no trato digestivo de um animal. É um subconjunto do conteúdo de proteína total.
Como utilizado aqui, o termo "vetor" refere-se a um constructo 15 de ácido nucleico planejado para a transferência entre células hospedeiras diferentes. Um "vetor de expressão" refere-se a um vetor que possui a capa- cidade de incorporar e expressar fragmentos de DNA heterólogos em uma célula estranha. Muitos vetores de expressão procarióticos e eucarióticos estão disponíveis comercialmente. A seleção de vetores de expressão apro- 20 priados está dentro do conhecimento dos versados na técnica.
Um constructo ou uma seqüência de ácido nucleico "heteróloga" possui uma parte da seqüência que não é nativa à célula vegetal em que é expressa. Heteróloga, em relação a uma seqüência de controle refere-se a uma seqüência de controle (isto é, promotor ou intensificador) que não fun- 25 ciona na natureza para regular o mesmo gene cuja expressão é, no momen- to, de regulação. Geralmente, seqüências de ácidos nucleicos heterólogas não são endógenas à célula ou à parte do genoma em que estão presentes e foram adicionadas na célula por infecção, transfecção, microinjeção, ele- troporação ou similar. Um constructo de ácido nucleico "heterólogo" pode 30 conter uma combinação de seqüência de controle/seqüência codificadora de DNA que é a mesma que ou diferente de, uma combinação de seqüência de controle/seqüência codificadora de DNA encontrada na planta nativa. Os exemplos não Iimitantes específicos de uma seqüência de ácido nucleico heteróloga incluem uma seqüência de ácido nucleico de HIO ou um frag- mento, um derivado (variação) ou um ortólogo ou um parálogo da mesma.
Como utilizado aqui, o termo "gene" significa o segmento de 5 DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo, que pode ou não incluir regiões que precedem e que sucedem a região codificadora, por exemplo, seqüências não- traduzidas a 5' (5' UTR) ou "líderes" e seqüências 3' UTR ou "trailers", assim como seqüências que se estendem (íntrons) entre segmentos codificadores individuais (éxons) e seqüências reguladoras não 10 transcritas.
O termo "homólogo" refere-se a qualquer gene que está relacio- nado a um gene de referência por herança de uma seqüência de DNA an- cestral comum. O termo "ortólogo" refere-se a homólogos em espécies dife- rentes que evoluíram partindo de um gene ancestral comum através da es- 15 peciação. Tipicamente, os ortólogos mantêm a mesma ou uma função simi- lar apesar das diferenças em sua estrutura primária (mutações). O termo "parálogo" refere-se a homólogos na mesma espécie que evoluíram através da duplicação genética de um gene ancestral comum. Em muitos casos, os parálogos exibem funções relacionadas (mas nem sempre idênticas). Como 20 utilizado aqui, o termo homólogo abrange tanto ortólogos quanto parálogos. Até a extensão que uma espécie particular desenvolveu vários genes rela- cionados partindo de uma seqüência de DNA ancestral compartilhada com uma outra espécie, o termo ortólogo pode abranger o termo parálogo.
Como utilizado aqui, "recombinante" inclui referência a uma célu- 25 Ia ou um vetor, que foi modificado através da introdução de uma seqüência de ácido nucleico heteróloga ou que a célula é derivada de uma célula modi- ficada dessa maneira. Assim, por exemplo, as células recombinantes ex- pressam genes que não são encontrados na forma idêntica dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de 30 outra maneira expressos de forma anormal, subexpressos ou não expressos de forma alguma como um resultado da intervenção humana deliberada.
Como utilizado aqui, o termo "expressão gênica" refere-se ao processo através do qual um polipeptídeo é produzido com base na seqüên- cia de ácido nucleico de um gene. O processo inclui tanto transcrição quanto tradução; consequentemente, "expressão" pode se referir a uma seqüência de polinucleotídeos ou de polipeptídeos ou ambas. Algumas vezes, a ex- 5 pressão de uma seqüência de polinucleotídeos não levará à tradução de proteínas. "Superexpressão" refere-se à maior expressão de uma seqüência de polinucleotídeos e/ou de polipeptídeos em relação a sua expressão em uma planta do tipo selvagem (ou outra de referência [por exemplo, não- transgênica]) e pode se referir a uma seqüência que ocorre naturalmente ou 10 que não ocorre naturalmente. "Expressão ectópica" refere-se à expressão em um momento, local e/ou maior nível que não ocorre naturalmente na planta não modificada ou do tipo selvagem. "Subexpressão" refere-se à me- nor expressão de uma seqüência de polinucleotídeos e/ou de polipeptídeos, geralmente de um gene endógeno, em relação a sua expressão em uma 15 planta do tipo selvagem. Os termos "expressão errada" e "expressão altera- da" abrangem superexpressão, subexpressão e expressão ectópica.
O termo "introduzida" no contexto de inserir uma seqüência de ácido nucleico em uma célula, inclui "transfecção", "transformação" e "trans- dução" e inclui referência à incorporação de uma seqüência de ácido nuclei- 20 co em uma célula eucariótica ou procariótica em que a seqüência de ácido nucleico pode ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, DNA cro- mossômico, plasmideal, de plastídeo ou mitocondrial), convertida em um replicon autônomo ou expressa de forma transitória (por exemplo, mRNA transfectado).
Como utilizado aqui, uma "célula vegetal" refere-se a qualquer
célula derivada de uma planta, incluindo células de tecido não diferenciado (por exemplo, calo), assim como de sementes, pólen, propágulos e embriões de plantas.
Como utilizado aqui, os termos "nativa" e "do tipo selvagem" re- Iativos a uma certa característica ou fenótipo da planta referem-se à forma em que tal característica ou fenótipo é encontrado na mesma variedade de planta na natureza. Em uma modalidade, uma planta do tipo selvagem ou nativa é também uma planta de controle. Em uma outra modalidade, uma planta do tipo selvagem ou nativa é uma planta não-transgênica ou não- mutada. Ainda em uma outra modalidade, uma planta do tipo selvagem ou nativa é uma planta não modificada.
5 Como utilizado aqui, o termo "modificada" em relação a uma
planta, refere-se a uma planta com um fenótipo alterado (por exemplo, uma planta gerada através de métodos de engenharia genética, de mutagênese ou de cruzamento). Uma planta engenheirada geneticamente também pode ser uma planta transgênica. Em modalidades particulares, as plantas modifi- 10 cadas geradas através de métodos de cruzamento são primeiramente muta- genizadas utilizando qualquer um de uma variedade de agentes mutagêni- cos, tal como um agente mutagênico químico, radiação ou Iuz ultravioleta. As plantas modificadas podem ter qualquer combinação de um conteúdo alterado de óleos, um conteúdo alterado de proteínas e/ou um conteúdo alte- 15 rado de fibras em qualquer parte da planta transgênica, por exemplo, nas sementes, em relação a uma planta não modificada similar.
Como utilizado aqui, o termo "alterada" refere-se a uma modifi- cação (um aumento ou um decréscimo) de uma característica ou de um fe- nótipo da planta (por exemplo, conteúdo de óleos, conteúdo de proteínas e/ou conteúdo de fibras) em uma planta modificada, em relação uma planta não modificada similar. Em um exemplo não Iimitante específico, uma planta modificada com uma característica alterada inclui uma planta com um maior conteúdo de óleos, maior conteúdo de proteínas e/ou menor conteúdo de fibras em relação a uma planta não modificada similar. Em um outro exem- pio não Iimitante específico, uma planta modificada com uma característica alterada inclui conteúdo de óleos inalterado, maior conteúdo de proteínas e/ou menor conteúdo de fibras em relação a uma planta não modificada si- milar. Ainda em um outro exemplo não Iimitante específico, uma planta modi- ficada com uma característica alterada inclui um maior conteúdo de óleos, um maior conteúdo de proteínas e/ou um conteúdo inalterado de fibras em relação a uma planta não modificada similar.
Um "fenótipo interessante (característica)" com referência a uma planta modificada refere-se a um fenótipo que pode ser observado ou medi- do demonstrado por uma T1 e/ou uma planta de geração subsequente, que não é exibido pela planta não modificada correspondente (isto é, uma planta similar genotipicamente que foi crescida ou analisada sob condições simila- 5 res). Um fenótipo interessante pode representar uma melhoria na planta (por exemplo, maior conteúdo de óleos, maior conteúdo de proteínas e/ou menor conteúdo de fibras nas sementes da planta) ou pode fornecer um meio para produzir melhorias em outras plantas. Uma "melhoria" é uma característica que pode aumentar a utilidade de uma espécie ou variedade de planta atra- 10 vés do fornecimento à planta de um fenótipo ou uma qualidade exclusiva e/ou nova. Tais plantas modificadas podem ter um fenótipo melhorado, tal como um fenótipo de óleo, proteína e/ou fibra alterado. A farinha gerada par- tindo de sementes de uma planta modificada com um fenótipo melhorado pode ter melhor (maior) qualidade de farinha. Em um exemplo não Iimitante 15 específico de farinha com um fenótipo de melhor (maior) qualidade, a farinha é gerada partindo de uma semente de uma planta modificada, em que a se- mente possui maior conteúdo de proteínas e/ou menor conteúdo de fibras, em relação a uma planta não modificada similar.
A expressão "fenótipo de conteúdo alterado de óleos" refere-se a um fenótipo que pode ser medido de uma planta modificada, em que a planta exibe um aumento ou um decréscimo estatisticamente significativo no conteúdo total de óleos (isto é, a porcentagem de massa da semente que é óleo), quando comparada à planta similar, mas não modificada (por exem- plo, uma não transgênica ou uma não mutada). Um fenótipo de alto conteú- do de óleos refere-se a um aumento no conteúdo total de óleos. Um aumen- to no conteúdo de óleos inclui, em várias modalidades, um aumento de a- proximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de óleos. Similarmente, um decréscimo no conteúdo de óleos inclui um decréscimo de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de óleos, em várias modalidades.
A expressão "fenótipo de conteúdo alterado de proteínas" refere- se ao fenótipo que pode ser medido de uma planta modificada, em que a planta exibe um aumento ou um decréscimo estatisticamente significativo no conteúdo total de proteínas (isto é, a porcentagem de massa da semente que é proteína), quando comparada à planta similar, mas não modificada 5 (por exemplo, não transgênica ou não mutada). Um fenótipo de alto conteú- do de proteínas refere-se a um aumento no conteúdo total de proteínas. Um aumento no conteúdo de proteínas inclui, em várias modalidades, um au- mento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo total de proteínas. Similarmen- 10 te, um aumento no conteúdo de proteínas que podem ser digeridas inclui, em várias modalidades, um aumento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de proteínas que podem ser digeridas. Um decréscimo no conteúdo de pro- teínas inclui um decréscimo de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 15 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo total de pro- teínas, em várias modalidades. Similarmente, um decréscimo no conteúdo de proteínas que podem ser digeridas inclui, em várias modalidades, um de- créscimo de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de proteínas que podem ser 20 digeridas. A expressão "fenótipo de conteúdo alterado de fibras" refere-se ao fenótipo que pode ser medido de uma planta modificada, em que a planta exibe um aumento ou um decréscimo estatisticamente significativo no con- teúdo total de fibras (isto é, a porcentagem de massa da semente que é fi- bra), quando comparada à planta similar, mas não modificada (por exemplo, 25 não transgênica ou não mutada). Um fenótipo de baixo conteúdo de fibras refere-se à diminuição no conteúdo total de fibras. Um aumento no conteúdo de fibras inclui um aumento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de fibras. Similarmente, um decréscimo no conteúdo de fibras inclui um decréscimo de 30 aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de fibras.
Como utilizado aqui, uma seqüência de polinucleotídeos ou um gene "mutante" ou "mutado" difere da seqüência de polinucleotídeos ou do gene do tipo selvagem correspondente em termos de seqüência ou de ex- pressão, em que a diferença contribui para um fenótipo ou uma característi- ca alterada da planta. Em relação a uma planta ou uma linhagem de planta, 5 o termo "mutante" ou "mutada" refere-se a uma planta ou uma linhagem de planta que possui um fenótipo ou uma característica alterada da planta, em que o fenótipo ou a característica alterada está associada com a expressão alterada de uma seqüência de polinucleotídeos ou um gene do tipo selva- gem. A seqüência de polinucleotídeos ou o gene mutado pode ser gerado 10 através de métodos de engenharia genética (tal como marcação por ativa- ção ou transformação), através da utilização de um ou mais agentes muta- gênicos (por exemplo, agentes mutagênicos químicos, radiação ou Iuz ultra- violeta) ou através da utilização de métodos para alterar uma seqüência de DNA (por exemplo, PCR propensa a erros, cruzamento molecular com em- 15 baralhamento de DNA, mutagênese direcionada ao sítio ou introdução do gene em um organismo que induz mutagênese tal E. coli ou cepas de leve- duras que são deficientes em relação à atividade de reparo do DNA).
Como utilizado aqui, o termo "T1" refere-se à geração de plantas partindo da semente de plantas TO. A geração T1 é o primeiro conjunto de plantas modificadas que pode ser selecionado através da aplicação de um agente de seleção, por exemplo, um antibiótico ou um herbicida, para o qual a planta modificada contém o gene de resistência correspondente. O termo "T2" refere-se à geração de plantas através de autofertilização de flores de plantas T1, previamente selecionadas como sendo modificadas. As plantas T3 são geradas partindo de plantas T2 etc. Como utilizado aqui, a "progênie direta" de uma certa planta deriva da semente (ou, algumas vezes, outro tecido) de tal planta e está na geração imediatamente subsequente; por e- xemplo, para uma certa linhagem, uma planta T2 é a progênie direta de uma planta Tl. A "progênie indireta" de uma certa planta deriva da semente (ou outro tecido) da progênie direta de tal planta ou da semente (ou outro tecido) de gerações subsequentes em tal linhagem; por exemplo, uma planta T3 é a progênie indireta de uma planta T1. Como utilizado aqui, o termo "parte da planta" inclui qualquer órgão ou tecido da planta, incluindo, sem limitação, sementes, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. As células vegetais podem ser obtidas par- 5 tindo de qualquer órgão ou tecido da planta e culturas preparadas partindo do mesmo. É fornecida aqui uma célula vegetal modificada que possui um fenótipo alterado. Em modalidades particulares, a célula vegetal modificada é uma célula vegetal transgênica. A célula vegetal transgênica inclui um ve- tor de transformação que compreende uma seqüência de nucleotídeos de 10 HIO que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um poli- peptídeo de HIO. Em modalidades preferidas, a célula vegetal transgênica é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo canola e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, açafroa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e ar- 15 roz. Em outras modalidades, a célula vegetal é uma semente, um pólen, um propágulo ou uma célula embrionária. A descrição fornece ainda células ve- getais de uma planta que é a progênie direta ou a progênie indireta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras. A classe de plantas que pode ser utilizada nos métodos da presente invenção é geralmente tão 20 ampla quanto a classe de plantas superiores sensíveis às técnicas de trans- formação, incluindo tanto plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas.
Como utilizado aqui, "planta transgênica" inclui uma planta que compreende dentro de seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. O poli- nucleotídeo heterólogo pode estar integrado de forma estável no genoma ou 25 pode ser extracromossômico. Preferencialmente, o polinucleotídeo da pre- sente invenção está integrado de forma estável no genoma de forma que o polinucleotídeo é passado a diante para gerações sucessivas. Uma célula, um tecido, um órgão vegetal ou uma planta na qual os polinucleotídeos hete- rólogos foram introduzidos é considerada "transformada", "transfectada" ou 30 "transgênica". As progênies diretas e indiretas de plantas ou células vegetais transformadas que também contêm o polinucleotídeo heterólogo também são consideradas transgênicas. São descritas aqui plantas modificadas que possuem um fenóti- po alterado. As plantas modificadas com um fenótipo alterado podem incluir uma quantidade melhorada (maior) de óleos e/ou uma qualidade melhor (maior) de farinha, quando comparadas à planta similar, mas não modificada 5 (por exemplo, não transgênica ou não mutada). As plantas modificadas com um fenótipo alterado podem inclui conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras em qualquer parte da planta modificada, por exemplo, nas se- mentes, quando comparadas à planta similar, mas não modificada (por e- xemplo, não transgênica ou não mutada). Em algumas modalidades de uma 10 planta modificada, por exemplo, em plantas com um fenótipo de conteúdo melhorado ou maior de óleos, o fenótipo alterado inclui um aumento no con- teúdo de óleos da semente (um fenótipo de alto conteúdo de óleos) da plan- ta, quando comparado ao da planta similar, mas não modificada (não trans- gênica ou não mutada). Um aumento no conteúdo de óleos inclui, em várias 15 modalidades, um aumento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de óleos. O fenótipo alterado pode ser um aumento em um ou mais ácidos graxos, tal como ácido oleico, com um decréscimo concomitante em outros ácidos gra- xos tais como os ácidos Iinoleicos ou linolínicos. Uma alteração no conteúdo 20 de ácidos graxos inclui um aumento de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em um ácido graxo específico. Em outras modalidades de uma planta modificada, por exemplo, em plantas com um fenótipo de qualidade melhorada ou maior de farinha, o fenótipo alterado pode ser um aumento no conteúdo de proteínas na semen- 25 te e/ou um decréscimo no conteúdo de fibras da semente. Um aumento no conteúdo de proteínas inclui um aumento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de proteínas, por exemplo, no conteúdo total de proteínas ou no conteúdo de proteínas que podem ser digeridas. Esta alteração no conteúdo de proteínas 30 da semente pode ser o resultado de quantidades alteradas de proteínas de armazenamento da semente tais como albuminas, globulinas prolaminas e glutelinas. Um decréscimo no conteúdo de fibras inclui um decréscimo de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de fibras. Esta alteração no conteúdo de fibras pode ser o resultado de quantidades alteradas de componentes fibro- sos tais como celulose, hemicelulose, Iignina e pectinas.
5 É também fornecida farinha de semente derivada das sementes
de plantas modificadas, em que as sementes possuem conteúdo alterado (por exemplo, maior) de proteínas (por exemplo, que pode ser digerida) e/ou conteúdo alterado (por exemplo, menor) de fibras. É adicionalmente forneci- do óleo derivado das sementes de plantas modificadas, em que as sementes 10 possuem conteúdo alterado de óleos. Qualquer uma destas alterações pode levar a um aumento na AME da semente ou da farinha da semente de plan- tas modificadas, em relação a plantas de controle, não transgênicas ou do tipo selvagem. Um aumento na AME inclui um aumento de aproximadamen- te 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou 15 mais na AME na semente ou na farinha da semente, em várias modalidades. É também fornecida aqui farinha, produto alimentício ou alimento produzido partindo de qualquer parte da planta modificada com um fenótipo alterado.
Em certas modalidades, as plantas transgênicas descritas com- preendem um vetor de transformação que compreende uma seqüência de nucleotídeos de HIO que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um polipeptídeo de "HIO". Em modalidades particulares, a expres- são de um polipeptídeo de HIO em uma planta transgênica causa um conte- údo alterado de óleos, um conteúdo alterado de proteínas e/ou um conteúdo alterado de fibras na planta transgênica. Em modalidades preferidas, a plan- ta transgênica é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo canola e semente de colza, soja, milho, girassol, algo- dão, cacau, açafroa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e arroz. É também fornecido um método de produção de óleo ou fari- nha da semente, que compreende o cultivo da planta transgênica e a recu- peração do óleo e/ou da farinha da semente da dita planta. A descrição for- nece ainda produto alimentício, farinha, grão ou semente que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de HIO. A descrição fornece ainda produto alimentício, farinha, grão ou semente que compreende o polipeptídeo de HIO ou um ortólogo ou um parálogo do mes- mo.
Vários métodos para a introdução de uma seqüência de polinu- 5 cleotídeos desejada que codifica a proteína desejada nas células vegetais estão disponíveis e são conhecidos pelos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a: (1) métodos físicos tais como microinjeção, ele- troporação e fornecimento mediado por microprojéteis (biolística ou tecnolo- gia de pistola gênica); (2) métodos de fornecimento mediado por vírus; e (3) 10 métodos de transformação mediada por Agrobacterium.
Os métodos mais comumente utilizados para a transformação de células vegetais são o processo de transferência de DNA mediada por Agro- bacterium e o processo de biolística ou mediado por bombardeio de micro- projéteis (isto é, a pistola gênica). Tipicamente, a transformação nuclear é 15 desejada, mas quando é desejável transformar especificamente plastídeos, tais como cloroplastos ou amiloplastos, os plastídeos vegetais podem ser transformados utilizando um fornecimento mediado por microprojéteis do polinucleotídeo desejado.
A transformação mediada por Agrobacterium é conseguida atra- 20 vés do uso de uma bactéria do solo engenheirada geneticamente que per- tence ao gênero Agrobaeterium. Um número de cepas do tipo selvagem e desarmadas de Agrobaeterium tumefaeiens e Agrobaeterium rhizogenes por- tando os plasmídeos Ti ou Ri pode ser utilizado para a transferência de ge- nes para as plantas. A transferência de genes é feita através da transferên- 25 cia de um DNA específico conhecido como "T-DNA" que pode ser engenhei- rado geneticamente para carregar qualquer pedaço desejado de DNA para dentro de muitas espécies de plantas.
A transformação genética de plantas mediada por Agrobaeterium envolve várias etapas. A primeira etapa, na qual o Agrobaeterium virulento e as células vegetais são primeiramente colocados em contato um com o ou- tro, é geralmente chamada de "inoculação". Após a inoculação, é permitido que o Agrobaeterium e as células/tecidos vegetais sejam cultivados juntos durante um período de várias horas até vários dias ou mais sob condições adequadas para crescimento e para transferência do T-DNA. Esta etapa é denominada de "co-cultura". Após a co-cultura e o fornecimento do T-DNA1 as células vegetais são tratadas com agentes bactericidas ou bacteriostáti- 5 cos para matar ou limitar o crescimento do Agrobacterium remanescente em contato com o explante e/ou no recipiente contendo o explante. Se isto for realizado na ausência de quaisquer agentes seletivos para promover o cres- cimento preferencial de células vegetais transgênicas versus não transgêni- cas, então esta é tipicamente referida como a etapa de "retardo". Se for rea- 10 Iizada na presença de pressão seletiva favorecendo as células vegetais transgênicas, então é referida como uma etapa de "seleção". Quando um "retardo" é utilizado, este é tipicamente seguido por uma ou mais etapas de "seleção".
Em relação ao bombardeio de microprojéteis (Patente U.S. N2 15 5.550.318; Patente U.S. N2 5.538.880. Patente U.S. N2 5.610.042; e Publi- cação PCT WO 95/06128; das quais cada uma é especificamente incorpora- da aqui como referência em sua totalidade), as partículas são revestidas com ácidos nucleicos e fornecidas para dentro das células através de uma força de propulsão. Os exemplos de partículas incluem as compreendidas de 20 tungstênio, platina e preferencialmente, ouro.
Uma modalidade ilustrativa de um método para o fornecimento de DNA para dentro das células vegetais através da aceleração é o Biolistics Particle Delivery System (BioRad, Hercules, CA), que pode ser utilizado para empurrar partículas revestidas com DNA ou células através de uma tela, tal 25 como uma tela de aço inoxidável ou uma tela Nytex, sobre uma superfície de filtro coberta com células de plantas monocotiledôneas cultivadas em sus- pensão.
As técnicas de bombardeio de microprojéteis podem ser ampla- mente aplicadas e podem ser utilizadas para transformar virtualmente qual- quer espécie de planta. Os exemplos de espécies que foram transformadas através do bombardeio de microprojéteis incluem espécies de monocotiledô- neas tais como milho (Publicação PCT N2 WO 95/06128), cevada, trigo (Pa- tente U.S. Ns 5.563.055, incorporada aqui como referência em sua totalida- de), arroz, aveia, centeio, cana-de-açúcar e sorgo, assim como um número de dicotiledôneas incluindo tabaco, soja (Patente U.S. N- 5.322.783, incorpo- rada aqui como referência em sua totalidade), girassol, amendoim, algodão, 5 tomate e verduras em geral (Patente U.S. Ns 5.563.055, incorporada aqui como referência em sua totalidade).
Para selecionar ou classificar as células vegetais independente- mente da metodologia de transformação, o DNA introduzido na célula con- tém um gene que funciona em um tecido vegetal que pode ser regenerado 10 para produzir um composto que confere ao tecido vegetal resistência a um composto que seria de outra maneira tóxico. Os genes de interesse para uso como um marcador que pode ser selecionado, verificado ou classificado in- cluiriam, mas não estão limitados a GUS, proteína fluorescente verde (GFP), Iuciferase (LUX), genes de tolerância a antibióticos ou herbicidas. Os exem- 15 pios de genes de resistência a antibióticos incluem penicilinas, canamicina, neomicina, G418, bleomicina, metotrexato (e trimetoprim), cloranfenicol e tetraciclina. As moléculas de polinucleotídeos que codificam as proteínas envolvidas na tolerância a herbicidas são conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a uma molécula de polinucleotídeo que codifica a 5- 20 enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) descrita na Patente U.S. N- 5.627.061, na Patente U.S. Ns 5.633.435 e na Patente U.S. Ns 6.040.497 e aroA descrita na Patente U.S. Ns 5.094.945 para tolerância ao glifosato; uma molécula de polinucleotídeo que codifica bromoxinil nitrilase (Bxn) descrita na Patente U.S. Ns 4.810.648 para tolerância ao Bromoxinil; uma molécula 25 de polinucleotídeo que codifica fitoeno dessaturase (crtl) descrita em Misawa e outros, (Plant J. 4:833-840, 1993) e Misawa e outros, (Plant J. 6:481-489, 1994) para tolerância ao norflurazon; uma molécula de polinucleotídeo que codifica acetohidroxiácido sintase (AHAS, também conhecida como ALS) descrita em Sathasiivan e outros (Nucl. Acids Res. 18:2188-2193, 1990) pa- 30 ra tolerância a herbicidas de sulfoniluréia; e o gene bar descrito em DeBIock e outros, (EMBO J. 6:2513-2519, 1987) para tolerância ao glufosinato e ao bialaphos. A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas partin- do de vários explantes são bem documentados na técnica. Este processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção de célu- las transformadas e de cultivo de células individualizadas através dos está- 5 gios usuais de desenvolvimento embrionário até o estágio de planta jovem enraizada. Os embriões e as sementes transgênicos são similarmente rege- nerados. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são depois disso plantados em um meio de cultivo de planta apropriado tal como solo. As cé- lulas que sobrevivem à exposição ao agente seletivo ou as células que tive- 10 ram classificação positiva em um ensaio de verificação, podem ser cultiva- das em meio que sustenta a regeneração de plantas. As plantas jovens em desenvolvimento são transferidas para o solo menos a mistura de cresci- mento de planta e estabilizadas, antes da transferência para uma estufa ou câmara de crescimento para maturação.
A presente invenção pode ser utilizada com qualquer célula ou
tecido que pode ser transformado. Como utilizado aqui, o que pode ser transformado é entendido como uma célula ou um tecido capaz de se pro- pagar adicionalmente para dar origem a uma planta. Os versados na técnica reconhecem que pode ser transformado um número de células ou tecidos 20 vegetais em que após a inserção do DNA exógeno e de condições de cultura apropriadas as células ou os tecidos vegetais podem ser formar em uma planta diferenciada. O tecido adequado para estas finalidades pode incluir, mas não está limitado a embriões imaturos, tecido escutelar, culturas de cé- lulas em suspensão, inflorescência imatura, meristema de broto, explantes 25 nodais, tecido de calo, tecido hipocotiledôneo, cotilédones, raízes e folhas.
Qualquer meio de cultura de planta adequado pode ser utilizado. Os exemplos de meios adequados incluiriam, mas não estão limitados a meios à base de MS (Murashige e Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962) ou a meios à base de N6 (Chu e outros, Scientia Sinica 18:659, 1975) su- 30 plementados com reguladores de crescimento vegetal adicionais incluindo, mas não limitados a auxinas, citocininas, ABA e giberelinas. Os versados na técnica estão familiarizados com a variedade de meios de cultura de tecidos, que quando suplementados apropriadamente, sustentam o crescimento e o desenvolvimento do tecido vegetal e são adequados para a transformação e para a regeneração de plantas. Estes meios de cultura de tecidos podem ser obtidos na forma de uma preparação comercial ou preparados e modificados 5 pelo usuário. Os versados na técnica estão a par dos meios e dos suplemen- tos de meios tais como nutrientes e reguladores do crescimento para uso na transformação e na regeneração e outras condições de cultura tais como intensidade da Iuz durante a incubação, pH e temperaturas de incubação que podem ser otimizadas para a variedade particular de interesse.
Um versado na técnica considerará que, após um cassete de
expressão ser incorporado de forma estável em plantas transgênicas e con- firmado como sendo operacional, este pode ser introduzido em outras plan- tas através de cruzamento sexual. Qualquer uma de um número de técnicas de cruzamento padronizadas pode ser utilizada, dependendo da espécie que será cruzada.
Identificação de Plantas com um Fenótipo Alterado
Uma varredura de marcação por ativação com Arabidopsis (ACTTAG) foi utilizada para identificar a associação entre 1) linhagens de plantas ACTTAG com um conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras 20 (ver as colunas 4, 5 e 6 respectivamente, da Tabela 1, a seguir) e 2) as se- qüências de ácidos nucleicos identificadas na coluna 3 das Tabelas 2 e 3, em que cada seqüência de ácido nucleico é fornecida dentro de um pseudô- nimo de gene ou uma denominação de HIO (HIO#; ver a coluna 1 nas Tabe- las 1, 2 e 3). A denominação de HIO é arbitrária e não se refere necessaria- 25 mente a uma planta que possui um fenótipo de alto conteúdo de óleos (HIO).
Sucintamente e como descrito adicionalmente nos Exemplos, um grande número de plantas de Arabidopsis foi mutado com o vetor pS- KI015, que compreende um T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumi- faciens, um elemento intensificador viral e um gene marcador que pode ser 30 selecionado (Weigel e outros, 2000, Plant Physiology, 122:1003-1013). Quando os insertos de T-DNA no genoma das plantas transformadas, o e- Iemento intensificador pode causar a regulação para mais dos genes na vizi- nhança, geralmente dentro de aproximadamente nove kilobases (kb) dos intensificadores. As plantas T1 foram expostas ao agente seletivo com a fi- nalidade de recuperar especificamente as plantas transformadas que ex- pressavam o marcador que pode ser selecionado e, portanto, carregavam as 5 inserções do T-DNA. Foi permitido que as plantas T1 crescessem até a ma- turidade, se autofertilizassem e produzissem semente. A semente T2 foi co- lhida, rotulada e armazenada. Para a amplificação dos estoques de semen- tes, aproximadamente dezoito T2 foram plantadas no solo e, após a germi- nação, expostas ao agente seletivo para recuperar as plantas T2 transfor- 10 madas. A semente T3 destas plantas foi colhida e agrupada. O conteúdo de óleos, proteínas e fibras da semente foi estimado utilizando Near Infrared Spectroscopy (NIR) como descrito nos Exemplos.
A associação de uma seqüência de ácido nucleico de HIO com um fenótipo alterado foi descoberta através da análise da seqüência de DNA genômico flanqueando a inserção do T-DNA na linhagem ACTTAG identifi- cada na coluna 3 da Tabela 1. Uma linhagem ACTTAG é uma família de plantas derivada de uma única planta que foi transformada com um elemen- to de T-DNA contendo quatro cópias em tandem dos intensificadores do 35S do CaMV. Consequentemente, as seqüências de ácidos nucleicos e/ou de polipeptídeos de HIO descritas podem ser empregadas no desenvolvimento de plantas transgênicas que possuem um fenótipo alterado, por exemplo, alto conteúdo de óleos. As seqüências de ácidos nucleicos de HIO podem ser utilizadas na produção de plantas transgênicas, tais como plantas de cultivo de sementes oleosas, que fornecem maior rendimento de óleo partin- do do processamento das sementes oleosas e resultam em um aumento na quantidade de óleo recuperado das sementes da planta transgênica. As se- qüências de ácidos nucleicos de HIO também podem ser utilizadas na pro- dução de plantas transgênicas, tais como plantas de cultivo de grãos para produto alimentício, que fornecem um fenótipo alterado resultando em maior energia para a alimentação de animais, por exemplo, sementes ou farinha da semente com um conteúdo alterado de proteínas e/ou de fibras, resultan- do em um aumento na AME. As seqüências de ácidos nucleicos de HIO po- dem ser adicionalmente utilizadas para aumentar o conteúdo de óleos de plantas de cultivo oleosas especiais, com a finalidade de aumentar o rendi- mento e/ou a recuperação de ácidos graxos não usuais desejados. Os e- xemplos não Iimitantes específicos de ácidos graxos não usuais são ácido 5 ricinoleico, ácido vernólico e os ácidos graxos poli-insaturados de cadeia muito longa ácido docosahexaenoico (DHA) e ácido eicosapentaenoico (E- PA). As plantas transgênicas que foram modificadas geneticamente para expressarem polipeptídeos de HIO podem ser utilizadas na produção de sementes, em que as plantas transgênicas são crescidas e o óleo e a farinha 10 da semente são obtidos de partes da planta (por exemplo, semente) utilizan- do métodos padronizados.
Ácidos Nucleicos e Polipeptídeos de HIO
A denominação de HIO para cada uma das seqüências de áci- dos nucleicos de HIO descobertas na verificação com a marcação por ativa- ção descrita aqui estão listadas na coluna 1 das Tabelas 1-3, a seguir. Os polipeptídeos de HIO descritos estão listados na coluna 4 das Tabelas 2 e 3, a seguir. A denominação de HIO é arbitrária e não se refere necessariamen- te a uma planta que possui um fenótipo de alto conteúdo de óleos (HIO). Como utilizado aqui, o pseudônimo de gene ou a denominação de HIO refe- re-se a qualquer seqüência de polipeptídeo (ou à seqüência de ácido nuclei- co que codifica a mesma) que quando expressa em uma planta causa um fenótipo alterado em qualquer parte da planta, por exemplo, nas sementes. Em uma modalidade, um polipeptídeo de HIO refere-se a uma proteína HIO de comprimento completo ou a um fragmento, um derivado (variação) ou um ortólogo ou um parálogo da mesma que é "funcionalmente ativo", de forma que o fragmento, o derivado ou o ortólogo ou o parálogo da proteína exibe uma ou mais ou as atividades funcionais associadas com um ou mais dos polipeptídeos de HIO de comprimento completo descritos, por exemplo, as seqüências de aminoácidos fornecidas na entrada do GenBank referida na coluna 4 das Tabelas 2 e 3 que correspondem às seqüências de aminoáci- dos apresentadas como a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma. Em uma modalidade pre- ferida, um polipeptídeo de HIO funcionalmente ativo causa um fenótipo alte- 5 rado em uma planta transgênica. Em uma outra modalidade, um polipeptí- deo de HIO funcionalmente ativo causa um fenótipo de conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras (por exemplo, um fenótipo de conteúdo alterado da farinha da semente) quando expresso de forma errada em uma planta. Em outras modalidades preferidas, a expressão errada do polipeptídeo de 10 HIO causa um fenótipo de alto conteúdo de óleos (tal como, mais óleo), de alto conteúdo de proteínas (tal como, maior conteúdo de proteína total ou de proteínas que podem ser digeridas) e/ou de baixo conteúdo de fibras (tal como, menos fibra) em uma planta. Ainda em outras modalidades preferidas, a expressão errada do polipeptídeo de HIO causa fenótipo inalterado de ó- 15 leos, de alto conteúdo de proteínas (tal como, maior conteúdo de proteína total ou de proteínas que podem ser digeridas) e/ou de baixo conteúdo de fibras (tal como, menos fibra) em uma planta. Em uma outra modalidade, a expressão errada do polipeptídeo de HIO causa uma maior AME da farinha. Ainda em uma outra modalidade, um polipeptídeo de HIO funcionalmente 20 ativo pode recuperar a atividade defeituosa do polipeptídeo de HIO endóge- no (incluindo deficiente) quando expresso em uma planta ou em células ve- getais; o polipeptídeo de recuperação pode ser proveniente da mesma ou de uma espécie diferente da espécie com a atividade defeituosa do polipeptí- deo. A descrição fornece ainda produto alimentício, farinha, grão, alimento 25 ou semente que compreende o polipeptídeo de HIO ou um fragmento, um derivado (variação) ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo.
Em uma outra modalidade, um fragmento funcionalmente ativo de um polipeptídeo de HIO de comprimento completo (por exemplo, um fragmento funcionalmente ativo de um polipeptídeo nativo que possui a se- 30 quência de aminoácidos apresentada como a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 ou um ortólogo ou um parálogo que ocorre naturalmente da mesma) mantém uma ou mais das propriedades biológicas associadas com o polipeptídeo de HIO de comprimento completo, tal como atividade de 5 sinalização, atividade de ligação, atividade catalítica ou atividade de locali- zação celular ou extracelular. Um fragmento de HIO preferencialmente com- preende um domínio de HIO, tal como um domínio C- ou N-terminal ou cata- lítico, entre outros e compreende preferencialmente pelo menos 10, prefe- rencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 25 e mais 10 preferencialmente pelo menos 50 aminoácidos contíguos de uma proteína HIO. Os domínios funcionais dos genes HIO estão listados na coluna 6 da Tabela 2 e podem ser identificados utilizando o programa PFAM (Bateman A e outros, 1999, Nucleic Acids Res. 27:260-262) ou o programa INTERPRO (Mulder e outros, 2003, Nueleic Aeids Res. 31, 315-318). As variações fun- 15 cionalmente ativas de polipeptídeos de HIO de comprimento completo ou fragmentos dos mesmos, incluem polipeptídeos com inserções, deleções ou substituições de aminoácidos que mantêm uma ou mais das propriedades biológicas associadas com o polipeptídeo de HIO de comprimento completo. Em alguns casos, são geradas variações que alteram o processamento pós- 20 tradução de um polipeptídeo de HIO. Por exemplo, as variações podem ter características alteradas de transporte de proteínas ou de localização de proteínas ou meia-vida alterada de proteínas, comparadas com o polipeptí- deo nativo.
Como utilizado aqui, o termo "ácido nucleico de HIO" refere-se a 25 qualquer polinucleotídeo que quando expresso em uma planta causa um fenótipo alterado em qualquer parte da planta, por exemplo, nas sementes. Em uma modalidade, um polinucleotídeo de HIO abrange ácidos nucleicos com a seqüência fornecida na ou complementar à entrada do GenBank refe- rida na coluna 3 das Tabelas 2 e 3, que correspondem às seqüências de 30 ácidos nucleicos apresentadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33, assim como fragmentos, derivados ou ortólogos ou parálo- gos funcionalmente ativos das mesmas. Um ácido nucleico de HIO desta descrição pode ser DNA, derivado de DNA genômico ou cDNA ou RNA.
5 Em uma modalidade, um ácido nucleico de HIO funcionalmente
ativo codifica ou é complementar a um ácido nucleico que codifica um poli- peptídeo de HIO funcionalmente ativo. Um ácido nucleico de HIO funcional- mente ativo também inclui DNA genômico que serve como um molde para um produto da transcrição primária de RNA (isto é, um precursor de mRNA) 10 que requer processamento, tal como "splicing", antes de codificar o polipep- tídeo de HIO funcionalmente ativo. Um ácido nucleico de HIO pode incluir outras seqüências não codificadoras, que podem ou não ser transcritas; tais seqüências incluem 5' e 3' UTRs, sinais de poliadenilação e seqüências re- guladoras que controlam a expressão gênica, entre outros, que são conheci- 15 dos na técnica. Alguns polipeptídeos requerem eventos de processamento, tais como clivagem proteolítica, modificação covalente etc., com a finalidade de se tornarem completamente ativos. Consequentemente, os ácidos nuclei- cos funcionalmente ativos podem codificar o polipeptídeo de HIO maduro ou pré-processado ou uma forma intermediária. Um polinucleotídeo de HIO 20 também pode incluir seqüências codificadoras heterólogas, por exemplo, seqüências que codificam um marcador incluído para facilitar a purificação do polipeptídeo fundido ou um marcador de transformação. Em uma outra modalidade, um ácido nucleico de HIO funcionalmente ativo é capaz de ser utilizado na produção de fenótipos de HIO de perda de função, por exemplo, 25 através da supressão antissenso, da co-supressão, etc. A descrição fornece ainda produto alimentício, farinha, grão, alimento ou semente que compre- ende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de HIO.
Em uma modalidade preferida, um ácido nucleico de HIO utiliza- do nos métodos descritos compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica, um polipeptídeo de HIO que possui pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência em relação a uma seqüência de polipeptídeo de HIO descrita, por exemplo, a seqüência de aminoácidos apresentada como a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID 5 NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34.
Em uma outra modalidade, um polipeptídeo de HIO compreende uma seqüência de polipeptídeo com pelo menos 50% ou 60% de identidade em relação a uma seqüência de polipeptídeo de HIO descrita (por exemplo, a seqüência de aminoácidos apresentada como a SEQ ID NO: 2, SEQ ID 10 NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:
22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34) e pode ter pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência em relação a uma se- 15 quência de polipeptídeo de HIO descrita. Em uma modalidade adicional, um polipeptídeo de HIO compreende 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência em relação a uma seqüência de polipeptídeo de HIO descrita e pode incluir um domínio de proteína con- servado do polipeptídeo de HIO (tal como o(s) domínio(s) listado(s) na colu- 20 na 6 da Tabela 2). Em uma outra modalidade, um polipeptídeo de HIO com- preende uma seqüência de polipeptídeo com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência em relação a um fragmento funcionalmente ativo do polipeptídeo referido na co- luna 4 da Tabela 2. Ainda em uma outra modalidade, um polipeptídeo de 25 HIO compreende uma seqüência de polipeptídeo com pelo menos 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade em relação à seqüência de polipeptídeo da entrada do GenBank referida na coluna 4 da Tabela 2 ao longo de todo seu comprimento e compreende um(ou mais) domínio(s) de proteína conservado(s) listado(s) na coluna 6 da Tabela 2.
Em um outro aspecto, uma seqüência de polinucleotídeo de HIO
é pelo menos 50% até 60% idêntica ao longo de seu comprimento inteiro a uma seqüência de ácido nucleico de HIO descrita, tal como a seqüência de ácido nucleico apresentada como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:
23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33 ou as seqüências de ácidos nucleicos que são complemen- tares a tal seqüência de HIO e pode compreender pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência em relação à seqüência de HIO descrita ou a um fragmento funcionalmente ativo da mesma ou seqüências complementares. Em uma outra modalidade, um áci- do nucleico de HIO descrito compreende uma seqüência de ácido nucleico que é mostrada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33 ou seqüências de ácidos nucleicos que são complementares a tal seqüência de HIO e seqüências de ácidos nucleicos que possuem homologia de se- qüência substancial a tais seqüências de HIO. Como utilizado aqui, a ex- pressão "homologia de seqüência substancial" refere-se às seqüências de ácidos nucleicos que possuem variações de seqüência pequenas ou sem importância partindo de tais seqüências de HIO, isto é, as seqüências fun- cionam substancialmente da mesma maneira e codificam um polipeptídeo de HIO.
Como utilizado aqui, "porcentagem (%) de identidade de se- qüência" em relação a uma seqüência de objetivo especificada ou a uma 25 parte especificada da mesma, é definida como a porcentagem de nucleotí- deos ou de aminoácidos em uma seqüência identificada idêntica aos nucleo- tídeos ou aos aminoácidos na seqüência de objetivo (ou na parte especifica- da da mesma), após o alinhamento das seqüências e da introdução de es- paços, se necessário, para atingir uma porcentagem de identidade de se- 30 quência máxima, que é gerada através do programa WU-BLAST-2,0 a 19 (Altschul e outros, J. Mo!. Biol., 1990, 215:403-410) com parâmetros de bus- ca ajustados nos valores predeterminados. Os parâmetros HSP S e HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio programa depen- dendo da composição da seqüência particular e da composição do banco de dados particular contra o qual a seqüência de interesse será pesquisada. Um "valor de identidade percentual (%)" é determinado pelo número de combinações de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos dividido pelo com- primento da seqüência para a qual a porcentagem de identidade está sendo relatada. A "porcentagem (%) de similaridade de seqüência de aminoácidos" é determinada realizando o mesmo cálculo que para a determinação da % de identidade de seqüência de aminoácidos, mas incluindo substituições conservativas de aminoácidos em adição a aminoácidos idênticos no cálcu- lo. Uma substituição conservativa de aminoácido é uma em que um aminoá- cido é substituído por um outro aminoácido que possui propriedades simila- res de forma que o dobramento ou a atividade da proteína não seja significa- tivamente afetada. Os aminoácidos aromáticos que podem ser substituídos por cada outro são fenilalanina, triptofano e tirosina; os aminoácidos hidrofó- bicos intercambiáveis são leucina, isoleucina, metionina e valina; os aminoá- cidos polares intercambiáveis são glutamina e asparagina; e os aminoácidos básicos intercambiáveis são arginina, Iisina e histidina; os aminoácidos áci- dos intercambiáveis são ácido aspártico e ácido glutâmico; e os aminoácidos pequenos intercambiáveis são alanina, serina, treonina, cisteína e glicina.
Moléculas de ácidos nucleicos derivadas das moléculas de áci- dos nucleicos de objetivo incluem seqüências que se hibridizam seletiva- mente às seqüências de ácidos nucleicos de HIO descritas (por exemplo, a seqüência de ácido nucleico apresentada como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID 25 NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33). A estringência da hibridização pode ser con- trolada pela temperatura, pela força iônica, pelo pH e pela presença de a- 30 gentes desnaturantes tais como formamida durante a hibridização e a lava- gem. As condições utilizadas rotineiramente são bem-conhecidas (ver, por exemplo, Current Protocol in Molecular Biology, Vol. 1, Cap. 2,10, John Wi- Iey & Sons, Publishers (1994); Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Segunda Edição), Cold Spring Harbor Press, Plainvi- ew, N.Y.).
Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da descrição é capaz de se hibridizar com uma molécula de ácido nucleico que contém a seqüência de nucleotídeos descrita sob condições de hibridização estringentes que são: pré-hibridização de filtros contendo ácido nucleico du- rante 8 horas até durante a noite a 65°C em uma solução que compreende 6X citrato de concentração simples (SSC) (1X SSC é 0,15 M de NaCI, 0,015 M de de citrato de Na; pH 7,0), 5X solução de Denhardt, 0,05% de pirofosfa- to de sódio e 100 pg/mL de DNA de esperma de arenque; hibridização du- rante 18-20 horas a 65° C em uma solução contendo 6X SSC, 1X solução de Denhardt, 100 pg/mL de tRNA de levedura e 0,05% de pirofosfato de sódio; e lavagem of filtros a 65° C durante 1 h em uma solução contendo 0,1 X SSC e 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sódio). Em outras modalidades, são utili- zadas condições de hibridização de estringência moderada que são: pré- tratamento dos filtros contendo ácido nucleico durante 6 h a 40° C em uma solução contendo 35% de formamida, 5X SSC, 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), mM de EDTA, 0,1% de PVP, 0,1% de Ficoll, 1% de BSA e 500 pg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado; hibridização durante 18-20 h a 40° C em uma solução contendo 35% de formamida, 5X SSC, 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,2% de BSA, 100 pg/mL de DNA de esperma de salmão e 10% (p/vol) de sulfato de dextran; seguida pela lavagem duas vezes durante 1 hora a 55° C em uma solução contendo 2X SSC e 0,1% de SDS. Alternativamente, podem ser uti- lizadas condições de baixa estringência que compreendem: incubação du- rante 8 horas até durante a noite a 37° C em uma solução que compreende 20% de formamida, 5 x SSC, 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5X solu- ção de Denhardt, 10% de sulfato de dextran e 20 Mg/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado desnaturado; hibridização no mesmo tampão durante 18 até 20 horas; e lavagem dos filtros em 1 x SSC a aproximadamente 37° C durante 1 hora. Como um resultado da degeneração do código genético, pode ser produzido um número de seqüências de polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de HIO. Por exemplo, os códons podem ser selecionados para aumentar a taxa em que a expressão do polipeptídeo ocorre em uma 5 espécie hospedeira particular, de acordo com o uso ótimo de códons deter- minado pelo organismo hospedeiro particular (ver, por exemplo, Nakamura e outros, 1999, Nucleic Acids Res. 27:292). Tais variações de seqüências po- dem ser utilizadas nos métodos descritos aqui.
Os métodos descritos podem utilizar ortólogos (e/ou parálogos) de uma seqüência de ácido nucleico de HIO de Arabidopsis descrita. Os su- postos ortólogos (e/ou parálogos) representantes de cada um dos genes HIO de Arabidopsis descritos são identificados na coluna 5 da Tabela 3, a seguir. Os métodos de identificação dos ortólogos em outras espécies de plantas são conhecidos na técnica. Em geral, os ortólogos em espécies dife- rentes mantêm a mesma função, devido à presença de um ou mais motivos de proteína e/ou estruturas tridimensionais. Na evolução, quando um evento de duplicação gênica sucede a especiação, um único gene em uma espécie, tal como Arabidopsis, pode corresponder a vários genes (parálogos) em uma outra. Quando os dados das seqüências estão disponíveis para uma espécie de planta particular, os ortólogos são geralmente identificados através da análise de homologia de seqüência, tal como a análise de BLAST, geralmen- te utilizando seqüências de isca de proteínas. As seqüências são designa- das como um ortólogo potencial se a melhor coincidência de seqüência par- tindo do resultado de BLAST para frente recuperar a seqüência de busca original no BLAST inverso (Huynen MA e Bork P, 1998, Proe. Nati Aead. Sei., 95:5849-5856; Huynen MA e outros, 2000, Genome Research, 10:1204-1210).
Programas para alinhamento de várias seqüências, tal como CLUSTAL (Thompson JD e outros, 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) podem ser utilizados para destacar regiões e/ou resíduos conservados de proteínas homólogas (ortólogas e/ou parálogas) e para gerar árvores filoge- néticas. Em uma árvore filogenética que representa várias seqüências ho- mólogas provenientes de espécies distintas (por exemplo, recuperadas atra- vés da análise de BLAST), as seqüências ortólogas de duas espécies ge- ralmente aparecem mais próximas na árvore em relação a todas as outras seqüências destas duas espécies. O "rosqueamento" estrutural ou outras 5 análises de dobramento das proteínas (por exemplo, utilizando o software da ProCeryon1 Biosciences, Salzburg, Áustria) podem também identificar ortó- logos potenciais. Os métodos de hibridização de ácidos nucleicos também podem ser utilizados para encontrar genes ortólogos e são preferidos quan- do os dados das seqüências não estão disponíveis. A PCR degenerada e a 10 verificação de bibliotecas de cDNA ou de DNA genômico são métodos co- muns para encontrar seqüências gênicas relacionadas e são bem- conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Sambrook, 1989, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual (Segunda Edição), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Dieffenbach e Dveksler, 1995, PCR Primer: A Laboratory 15 Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). Por exemplo, os méto- dos para gerar uma biblioteca de cDNA partindo da espécie de planta de interesse e submetendo a biblioteca a sondas com sondas de genes parci- almente homólogos são descritos em Sambrook e outros. Uma parte alta- mente conservada da seqüência codificadora de HIO de Arabidopsis pode 20 ser utilizada como uma sonda. Os ácidos nucleicos ortólogos de HIO podem se hibridizar ao ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID 25 NO: 33, sob condições de estringência alta, moderada ou baixa. Após a am- plificação ou o isolamento de um segmento de um suposto ortólogo, tal segmento pode ser clonado e sequenciado através de técnicas padroniza- das e utilizado como uma sonda para isolar um clone completo de cDNA ou de DNA genômico.
Alternativamente, é possível iniciar um projeto de EST para ge-
rar um banco de dados de informação de seqüência para a espécie de plan- ta de interesse. Em uma outra abordagem, os anticorpos que se ligam espe- cificamente a polipeptídeos de HIO conhecidos são utilizados para o isola- mento de ortólogos (e/ou parálogos) (ver, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, 1999, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York). A análise de Western blot pode determinar se um ortólo- 5 go de HIO (isto é, um ortólogo de proteína para um polipeptídeo de HIO des- crito) está presente em um extrato bruto de uma espécie de planta particular. Quando a reatividade é observada, a seqüência que codifica o ortólogo can- didato pode ser isolada através da verificação de bibliotecas de expressão que representam a espécie de planta particular. As bibliotecas de expressão 10 podem ser construídas em uma variedade de vetores disponíveis comerci- almente, incluindo Iambda gt11, como descrito em Sambrook e outros, 1989. Uma vez que o(s) ortólogo(s) candidato(s) é(são) identificado(s) através de qualquer um destes meios, as seqüências ortólogas candidatas são utiliza- das como isca (a "busca") para o BLAST inverso contra seqüências de Ara- 15 bidopsis ou de outras espécies em que as seqüências de ácidos nucleicos de HIO e/ou de polipeptídeos foram identificadas.
Os ácidos nucleicos e os polipeptídeos de HIO podem ser obti- dos através da utilização de qualquer método disponível. Por exemplo, as técnicas para o isolamento de seqüências de cDNA ou de DNA genômico de 20 interesse através da verificação de bibliotecas de DNA ou através da utiliza- ção da reação em cadeia da polímerase (PCR), como descrito anteriormen- te, são bem-conhecidas na técnica. Alternativamente, a seqüência de ácido nucleico pode ser sintetizada. Qualquer método conhecido, tal como a muta- gênese direcionada ao sítio (Kunkel TA e outros, 1991, Methods Enzymoi 25 204:125-39), pode ser utilizado para introduzir alterações desejadas em um ácido nucleico clonado.
Em geral, os métodos descritos aqui envolvem a incorporação da forma desejada do ácido nucleico de HIO em um vetor de expressão de planta para a transformação de células vegetais e o polipeptídeo de HIO é 30 expresso na planta hospedeira. As plantas e as células vegetais transforma- das que expressam um polipeptídeo de HIO expressam um fenótipo alterado e, em um exemplo não Iimitante específico, podem ter conteúdo alto (maior) de óleos, alto (maior) de proteínas e/ou baixo (menor) de fibras.
Uma molécula de ácido nucleico de HIO "isolada" é outra que na forma ou no ambiente em que é encontrada na natureza e é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com 5 a qual está comumente associada na fonte natural do ácido nucleico de HIO. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico de HIO isolada inclui moléculas de ácidos nucleicos de HIO contidas nas células que expressam comumente o polipeptídeo de HIO quando, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização cromossômica diferente daquela das células natu- 10 rais.
Produção de Plantas Modificadas Geneticamente com um Fenótipo Alterado Os ácidos nucleicos e os polipeptídeos de HIO descritos podem ser utilizados na produção de plantas transgênicas que possuem um fenóti- po modificado ou alterado, por exemplo, um fenótipo de conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras. Como utilizado aqui, um "conteúdo (fenótipo) alterado de óleos" pode se referir ao conteúdo alterado de óleos em qual- quer parte da planta. Em uma modalidade preferida, a expressão alterada do gene HIO em uma planta é utilizada para gerar plantas com um conteúdo (fenótipo) alto de óleos. Como utilizado aqui, um "conteúdo (fenótipo) altera- do de proteínas totais" ou um "conteúdo (fenótipo) alterado de proteínas que podem ser digeridas" pode se referir ao conteúdo alterado de proteínas (to- tais ou que podem ser digeridas) em qualquer parte da planta. Em uma mo- dalidade preferida, a expressão alterada do gene HIO em uma planta é utili- zada para gerar plantas com um conteúdo (fenótipo) alto (ou maior) de pro- teínas totais ou que podem ser digeridas. Como utilizado aqui, um "conteúdo (fenótipo) alterado de fibras" pode se referir ao conteúdo alterado de fibras em qualquer parte da planta. Em uma modalidade preferida, a expressão alterada do gene HIO em uma planta é utilizada para gerar plantas com um conteúdo (fenótipo) baixo (ou menor) de fibras. O conteúdo alterado de ó- leos, proteínas e/ou fibras é frequentemente observado nas sementes. Os exemplos de uma planta transgênica incluem plantas que compreendem um vetor de transformação de planta com uma seqüência de nucleotídeos que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um polipeptídeo de HIO que possui a seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID 5 NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma.
As plantas transgênicas, tais como milho, soja e canola que con- têm as seqüências de ácidos nucleicos descritas, podem ser utilizadas na produção de óleo e farinha vegetal. O óleo vegetal é utilizado em uma varie- dade de produtos alimentícios, enquanto que a farinha da semente é utiliza- da como um produto alimentício para animais. Após a colheita da semente das plantas transgênicas, a semente é limpa para remover os talos da planta e outro material e então fendidas em lascas em um moinhos de rolo para quebrar as cascas. A semente triturada é aquecida a 75-100° C para desna- turar as enzimas hidrolíticas, Iisar as células não rompidas que contêm óleo e permitir que as pequenas gotículas de óleo se unam. A maior parte do óleo é então removida (e pode ser recuperada) através da pressão do material da semente em uma prensa de rosca. O restante do óleo é removido da torta da prensa através da extração com e solventes orgânicos, tal como hexano. O solvente é removido da farinha através do aquecimento da mesma a aproxi- madamente 100° C. Após a secagem, a farinha é então granulada em uma forma consistente. A farinha, contendo a proteína, o carboidrato que pode ser digerido e a fibra da semente, pode ser misturada com outros materiais antes de ser utilizada como um produto alimentício para animais.
Os métodos descritos aqui para a produção de plantas transgê- nicas podem ser geralmente aplicados a todas as plantas. Embora a marca- ção por ativação e a identificação gênica sejam realizadas em Arabidopsis, a seqüência de ácido nucleico de HIO (ou um ortólogo, um parálogo, uma va- 30 riação ou um fragmento da mesma) pode ser expressa em qualquer tipo de planta. Em uma modalidade preferida, as plantas que produzem óleo produ- zem e armazenam triacilglicerol em órgãos específicos, primariamente nas sementes. Tais espécies incluem soja (Glicine max), semente de colza e canola (incluindo Brassica napus, B. campestris), girassol (Helianthus an- nus), algodão (Gossypium hirsutum), milho (Zea mays), cacau (Theobroma cacao), açafroa (Carthamus tinctorius), dendezeiro (Elaeis guineensis), co- 5 queiro (Cocos nucifera), linho (Linum usitatissimum), mamona (Ricinus communis) e amendoim (Arachis hypogaea), assim como trigo, arroz e avei- a. As plantas que carregam frutos e verduras, as plantas que produzem grãos, as plantas que produzem nozes, as espécies de Brassica de ciclo rápido, alfalfa (Medieago sativa), tabaco (Nieotiana), turfa (família Poaceae), 10 outras plantas de cultivo de forragem e espécies selvagens também podem ser uma fonte de ácidos graxos exclusivos. Em outras modalidades, qual- quer planta que expressa a seqüência de ácido nucleico de HIO também pode expressar conteúdo maior de proteínas e/ou menor de fibras em uma parte ou um órgão específico da planta, tal como nas sementes.
O versado na técnica reconhecerá que exite uma ampla varie-
dade de técnicas de transformação na técnica e novas técnicas estão conti- nuamente se tornando disponíveis. Qualquer técnica que seja adequada pa- ra a planta hospedeira alvo pode ser empregada dentro do âmbito da pre- sente invenção. Por exemplo, os constructos podem ser introduzidos em 20 uma variedade de formas incluindo, mas não limitadas a, na forma de um filamento de DNA, em um plasmídeo ou em um cromossomo artificial. A in- trodução dos constructos nas células vegetais alvos pode ser realizada atra- vés de uma variedade de técnicas, incluindo, mas não limitadas a transfor- mação mediada por Agrobaeterium, eletroporação, microinjeção, bombar- 25 deio de microprojéteis, co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio ou transformação mediada por Iipossomos de um ácido nucleico heterólogo. A transformação da planta é preferencialmente permanente, isto é, através da integração dos constructos de expressão introduzidas no genoma da planta hospedeira, de forma que os constructos introduzidos são passados para 30 gerações de plantas sucessivas. Dependendo do uso pretendido, um cons- tructo de ácido nucleico heteróloga que compreende um polinucleotídeo de HIO pode codificar a proteína inteira ou uma parte biologicamente ativa da mesma.
Em uma modalidade, sistemas de vetores binários baseados em Ti podem ser utilizados para transferir polinucleotídeos. Vetores binários pa- dronizados de Agrobacterium são conhecidos pelos versados na técnica e 5 muitos estão disponíveis comercialmente (por exemplo, pB1121 Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). Um constructo ou um vetor pode incluir um promotor de planta para expressar a molécula de ácido nucleico de escolha. Em uma modalidade preferida, o promotor é um promotor de planta.
O procedimento ótimo para a transformação de plantas com ve- tores de Agrobacterium variará com o tipo de planta que será transformado. Os exemplos de métodos para a transformação mediada por Agrobaeterium incluem a transformação de explantes hipocotiledôneos, de extremidade do broto, de tecido do caule ou foliar, derivado de mudas e/ou plantas jovens esterilizadas. Tais plantas transformadas podem ser reproduzidas sexual- mente ou através da cultura de células ou de tecido. A transformação com Agrobaeterium foi descrita anteriormente para um grande número de tipos diferentes de plantas e os métodos para tal transformação podem ser encon- trados na literatura científica. São de relevância particular os métodos para a transformação de plantas de cultivo importantes comercialmente, tais como plantas das espécies de Brassiea, incluindo canola e semente de colza, (De Block e outros, 1989, Plant Physiol., 91:694-701), milho (Ishida e outros, 1996 Nature Bioteehnol. 14:745-750, Zhang e outros, 2002 Plante Cell Rep. 21:263-270), girassol (Everett e outros, 1987, Bio/Teehnology, 5:1201), soja (Christou e outros, 1989, Proe. Natl. Aead. Sei USA, 86:7500-7504; Kline e outros, 1987, Nature, 327:70), trigo, arroz e aveia.
A expressão (incluindo a transcrição e a tradução) de uma se- qüência de ácido nucleico de HIO pode ser regulada em relação ao nível de expressão, ao(s) tipo(s) de tecido(s) onde a expressão ocorre e/ou ao está- gio do desenvolvimento da expressão. Está disponível um número de se- 30 quências reguladoras heterólogas (por exemplo, promotores e intensificado- res) para o controle da expressão de um ácido nucleico de HIO. Estas inclu- em promotores constitutivos, que podem ser induzidos e que podem ser re- guiados, assim como promotores e intensificadores que controlam a expres- são de uma maneira específica ao tecido ou ao tempo. Os exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor E4 da framboesa (Patentes U.S. N— 5.783.393 e 5.783.394), o promotor da nopalina sintase (NOS) (E- 5 bert e outros, Proc. Nati Acad. Sei. (U.S.A.) 84:5745-5749, 1987), o promo- tor da octopina sintase (OCS) (que é carregado nos plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton e ou- tros, Plant Mol. Biol. 9:315-324, 1987) e o promotor 35S do CaMV (Odell e 10 outros, Nature 313:810-812, 1985 e Jones JD e outros, 1992, Transgenic Res., 1:285-297), o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária (Patente U.S. N2 5.378.619), o promotor que pode ser induzido pela Iuz da subunida- de pequena da ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase (ssRUBISCO), o promo- tor Adh (Walker e outros, Proc. Nati Acad. Sei. (U.S.A.) 84:6624-6628, 15 1987), o promotor da sacarose (Yang e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 87:4144-4148, 1990), o promotor do complexo do gene R (Chandler e outros, The Plant Cell 1Λ175-1183, 1989), o promotor do gene da proteína de ligação à clorofila a/b, o promotor do CsVMV (Verdaguer B e outros, 1998, Plant Mol Biol., 37:1055-1067) e o promotor da actina do melão (Pedi- 20 do de Patente PCT publicado W00056863). Os exemplos de promotores específicos ao tecido incluem os promotores E4 e E8 do tomate (Patente U.S. Ns 5.859.330) e o promotor do gene 2AII do tomate (Van Haaren MJJ e outros, 1993, PIantMoIBio., 21:625-640).
Em uma modalidade preferida, a expressão da seqüência de 25 ácido nucleico de HIO está sob o controle de seqüências reguladoras dos genes cuja expressão está associada com o desenvolvimento inicial da se- mente e/ou do embrião. Na verdade, em uma modalidade preferida, o pro- motor utilizado é um promotor intensificado na semente. Os exemplos de tais promotores incluem as regiões reguladoras a 5' de genes tais como da napi- 30 na (Kridl e outros, Seed Sei. Res. 1:209:219, 1991), da globulina (Belanger e Kriz, Genet., 129: 863-872, 1991, N0 de Acesso de GenBank L22295), da gama zeína Z 27 (Lopes e outros, Mol Gen Genet., 247:603-613, 1995), do promotor da L3 oleosina (Patente U.S. Ne 6,433,252), da faseolina (Bustos e outros, Plant Cell, 1(9):839-853, 1989), da arcelina5 (Pedido de Patente U.S. N2 2003/0046727), de um promotor 7S da soja, de um promotor 7Soc (Pedido de Patente U.S. Ns 2003/0093828), do promotor da 7Sa' beta conglicinina da soja, de um promotor 7Sa' (Beachy e outros, EMBO J., 4:3047, 1985; Schu- Ier e outros, Nucleic Acid Res., 10(24):8225-8244, 1982), inibidor da tripsina da soja (Riggs e outros, PIantCeI11(6):609-621, 1989), ACP (Baerson e ou- tros, Plant Mol. Biol., 22(2):255-267, 1993), da estearoil-ACP dessaturase (Slocombe e outros, Plant Physiol. 104(4):167-176, 1994), da subunidade a' da β-conglicinina da soja (Chen e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. 83:8560- 8564, 1986), de USP de Vicia faba (P-Vf.Usp, SEQ ID NO: 1, 2 e 3 no (Pedi- do de Patente U.S. N2 2003/229918) e do promotor da L3 oleosina de Zea mays (Hong e outros, Plant Mol. Bioi, 34(3):549-555, 1997). São também incluídas as zeínas, que são um grupo de proteínas de armazenamento en- contradas no endosperma do milho. Clones genômicos para os genes da zeína foram isolados (Pedersen e outros, Cell, 29:1015-1026, 1982; e Rus- sell e outros, Transgenie Res. 6(2):157-168) e os promotores destes clones, incluindo 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD e os genes, podiam ser utiliza- dos. Outros promotores conhecidos como sendo funcionais, por exemplo, no milho incluem os promotores para os genes a seguir: waxy, Brittle, Shrunken
2, Enzimas de ramificação I e II, amido sintases, enzimas de desramificação, oleosinas, glutelinas e sacarose sintases. Os genes de verduras cujos pro- motores estão associados com o desenvolvimento inicial da semente e do embrião incluem Iegumin de V. faba (Baumlein e outros, 1991, Mol. Gen. 25 Genet. 225:121-8; Baumlein e outros, 1992, Plant J. 2:233-9), usp de V. faba (Fiedler e outros, 1993, Plant Moi Biol. 22:669-79), eonvicilin da ervilha (Bown e outros, 1988, Bioehem. J. 251:717-26), Ieetin da ervilha (dePater e outros, 1993, Plant Cell 5:877-86), beta phaseolin de P. vulgaris (Bustos e outros, 1991, EMBO J. 10:1469-79), DLEC2 e PHS de P. vulgaris [beta] 30 (Bobb e outros, 1997, Nueleic Aeids Res. 25:641-7) e beta-Conglieinin da soja, proteína 7S de armazenamento (Chamberland e outros, 1992, Plant Mol. Bioi 19:937-49). Os genes de cerais cujos promotores estão associados com o desenvolvimento inicial da semente e do embrião incluem glutelin do arroz ("GluA-3", Yoshihara e Takaiwa, 1996, Plant Cell Physioi 37:107-11; "GIuB- 1", Takaiwa e outros, 1996, Plant Mol. Biol. 30:1207-21; Washida e outros, 5 1999, Plant Mol. Biol. 40:1-12; "Gt3", Leisy e outros, 1990, Plant Moi Biol. 14:41-50), prolamin do arroz (Zhou & Fan, 1993, Transgenic Res. 2:141-6), prolamin do trigo (Hammond-Kosack e outros, 1993, EMBO J. 12:545-54), zein do milho (Z4, Matzke e outros, 1990, Plant Mol. Biol. 14:323-32) e B- hordeins da cevada (Entwistlee outros, 1991, Plant Mol. Biol. 17:1217-31).
Outros genes cujos promotores estão associados com o desen-
volvimento inicial da semente e do embrião incluem GL07A do dendezeiro (7S globulina, Morcillo e outros, 2001, Physiol. Plant 112:233-243), napin de Brassica napus, proteína de armazenamento 2S e gene napA (Josefsson e outros, 1987, J. Biol. Chem. 262:12196-201; Stalberg e outros, 1993, Plant 15 Mol. Biol. 1993 23:671-83; Ellerstrom e outros, 1996, Plant Mol. Biol. 32:1019-27), oleosin de Brassiea napus (Keddie e outros, 1994, Plant Mol. Biol. 24:327-40), oleosin de Arabidopsis (Plant e outros, 1994, Plant Mol. Biol. 25:193-205), FAE1 de Arabidopsis (Rossak e outros, 2001, Plant Mol. Biol. 46:717-25), conA de Canavalia gladiata (Yamamoto e outros, 1995, 20 Plant Mol. Biol. 27:729-41) e estrictosidina sintase de Catharanthus roseus (Str, Ouwerkerk e Memelink, 1999, Mol. Gen. Genet. 261:635-43). Em uma outra modalidade preferida, são utilizadas as seqüências reguladoras de ge- nes expressos durante a biossíntese de óleo (ver, por exemplo, a Patente U.S. Ns 5.952.544). Os promotores alternativos são de genes de proteínas 25 de armazenamento de plantas (Bevan e outros, 1993, Philos. Trans. R. Soe. Lond. B. Biol. Sei. 342:209-15). Os promotores adicionais que podem ser utilizados são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N— 5.378.619; 5.391.725; 5.428.147; 5.447.858; 5.608.144; 5.608.144; 5.614.399; 5.633.441; 5.633.435; e 4.633.436.
Em uma outra modalidade, o gene HIO endógeno pode ser colo-
cado sob o controle de um fator de transcrição transgênico ou utilizado para planejar sítios de ligação que modulam sua expressão. Uma tal classe de fatores de transcrição é constituída das proteínas de dedo de zinco Cys2- H1S2 (ZFPs). As ZFPs são proteínas de ligação ao DNA comuns e podem ser planejadas para se ligarem especificamente a seqüências de DNA específi- cas (Beerli & Barbas, Nat Biotechnol., 2002, 20:135-141,; Gommans e ou- tros, J Mol Biol., 2005, 354:507-519). Os domínios de dedo de zinco indivi- duais são compostos de aproximadamente 30 aminoácidos, são estrutural- mente conservados e podem interagir com 3-4 pb de DNA. Pode ser sinteti- zado um polipeptídeo que contém vários dedos de zinco planejados para se ligarem a uma seqüência de DNA específica no promotor de um gene HIO. Os princípios para 0 planejamento dos domínios de dedo de zinco para a interação com seqüências de DNA específicas foram descritos em Segal e outros, (Segai e outros, Proc Natl Acad Sci U S A., 1999, 96:2758-2763), Dreier e outros (Dreier e outros, J Mol Biol., 2000, 303:489-502) e Beerli e Barbas (Beerli & Barbas, Nat Biotechnol., 2002, 20:135-141). Estes domínios de ligação ao DNA podem ser fundidos a domínios efetores para formar uma ZFP sintética que pode regular a transcrição de genes aos quais se liga. Os domínios efetores que podem ativar a transcrição incluem, mas não estão limitados à parte ácida da proteína VP16 do vírus herpes simplex (Sadowski e outros, Nature., 1988, 335:563-564) e da VP64 (Beerli e outros, Proc Natl Acad Sci U S A., 1998, 95:14628-14633) e o domínio p65 do fator de trans- crição do NF-κΒ (Bae e outros, Nat Biotechnol., 2003, 21:275-280, Liu e ou- tros, J Biol Chem., 2001, 276:11323-11334). Os domínios efetores que po- dem reprimir a transcrição incluem, mas não estão limitados a mSIN3 e KRAB (Ayer e outros, Mol Cell Biol., 1996, 16:5772-5781, Beerli & Barbas, Nat Biotechnol., 2002, 20:135-141, Beerli e outros, Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:14628-14633, Margolin e outros, Proc Natl Acad Sci USA., 1994, 91:4509-4513). Foi mostrado que estas abordagens funcionam em plantas (Guan e outros, Proc Natl Acad Sci U S A., 2002, 99:13296-13301, Stege e outros, Plant J., 2002, 32:1077-1086, Van Eenennaam e outros, Metab Eng., 2004,6:101-108).
Ainda em um outro aspecto, em alguns casos pode ser desejá- vel inibir a expressão da seqüência de ácido nucleico de HIO endógena em uma célula hospedeira. Os exemplos de métodos para a prática deste as- pecto da invenção incluem, mas não estão limitados à supressão antissenso (Smith e outros, 1988, Nature, 334:724-726; van der Krol e outros, 1988, Bi- oTechniques, 6:958-976); co-supressão (Napoli e outros, 1990, Plant Cell, 2:279-289); ribozimas (Publicação PCT WO 97/10328); e combinações de senso e antissenso (Waterhouse e outros, 1998, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 95:13959-13964). Os métodos para a supressão de seqüências endógenas em uma célula hospedeira empregam tipicamente a transcrição ou a trans- crição e a tradução de pelo menos uma parte da seqüência que deve ser suprimida. Tais seqüências podem ser homólogas às regiões codificadoras assim como não codificadoras da seqüência endógena. A inibição antissen- so pode utilizar a seqüência de cDNA inteira (Sheehy e outros, 1988, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 85:8805-8809), uma seqüência de cDNA parcial inclu- indo fragmentos da seqüência codificadora a 5' (Cannon e outros, 1990, Plant Mol. Biol., 15:39-47) ou seqüências não codificadoras a 3' (Ch'ng e outros, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:10006-10010). As técnicas de co-supressão podem utilizar a seqüência de cDNA inteira (Napoli e outros, 1990, Plant Cell, 2:279-289; van der Krol e outros, 1990, Plant Cell, 2:291- 299) ou uma seqüência de cDNA parcial (Smith e outros, 1990, Mol. Gen. Genetics, 224:477-481).
Os testes moleculares e genéticos padronizados podem ser rea- lizados para analisar adicionalmente a associação entre uma seqüência de ácido nucleico e um fenótipo observado. Os exemplos de técnicas são des- critos a seguir.
1. Análise de DNA/RNA
Os padrões de expressão gênica específica ao estágio e ao te- cido em linhagens mutantes versus do tipo selvagem podem ser determina- dos, por exemplo, através da hibridização in situ. A análise da condição de metilação do gene, especialmente das regiões reguladoras flanqueadoras, 30 pode ser realizada. Outras técnicas adequadas incluem a superexpressão, a expressão ectópica, a expressão em outras espécies de plantas e o nocaute gênico (genética inversa, nocaute direcionado, silenciamento gênico induzi- do por vírus (VIGS; ver, Baulcombe D, 1999, Arch. Virol. Suppl. 15:189-201).
Em uma aplicação preferida, a obtenção de um perfil de expres- são, geralmente através da análise de microarranjos, é utilizada para medir simultaneamente diferenças ou alterações induzidas na expressão de vários 5 genes diferentes. As técnicas para a análise de microarranjo são bem- conhecidas na técnica (Schena M e outros, Science 1995 270:467-470; Baldwin D e outros, 1999, Cur. Opin. Plant Biol. 2(2):96-103; Dangond F, Physiol Genomics (2000) 2:53-58; van Hal NL e outros, J Biotechnol. (2000) 78:271-280; Richmond T e Somerville S, Curr. Opin. Plant Biol. 2000 3:108- 10 116). Pode ser realizada a obtenção do perfil de expressão de linhagens marcadas individuais. Tal análise pode identificar outros genes que são co- ordenadamente regulados como uma conseqüência da superexpressão do gene de interesse, que pode ajudar a colocar um gene desconhecido em uma via particular.
2. Análise dos Produtos Gênicos
A análise dos produtos gênicos pode incluir a expressão de pro- teínas recombinantes, a produção de antissoro, a imunolocalização, os en- saios bioquímicos para atividade catalítica ou outra, a análise da condição de fosforilação e a análise da interação com outras proteínas através de en- saios de duplo híbrido de levedura.
3. Análise das Vias
A análise das vias pode incluir a colocação de um gene ou de um produto gênico dentro de uma via bioquímica, metabólica ou de sinaliza- ção particular com base em seu fenótipo de expressão errada fenótipo ou 25 através da homologia de seqüência com genes relacionados. Alternativa- mente, a análise pode compreender cruzamentos genéticos com linhagens do tipo selvagem e outras linhagens mutantes (criando duplos mutantes) para ordenar o gene em uma via ou determinar o efeito de uma mutação sobre a expressão de genes "repórteres" a jusante em uma via.
Produção de Plantas Mutadas com um Fenótipo Alterado
São descritos aqui métodos adicionais de produção de uma planta que possui um fenótipo alterado, em que é identificada uma planta que possui uma mutação ou um alelo em sua seqüência de ácido nucleico de HIO que resulta em um fenótipo alterado, comparada a plantas que pos- suem a mutação ou o alelo. A planta mutada pode ser gerada utilizando um ou mais agentes mutagênicos, por exemplo, um agente mutagênico químico (tal como sulfonato de etilmetano, sulfonato de metil metano, dietilsulfato e nitrosoguanidina ou 5-bromo-deoxiuridina), radiação ou Iuz ultravioleta. Em algumas modalidades do método, a planta mutada pode ser cruzada para gerar progênie, que herda a mutação ou o alelo e possui um fenótipo altera- do. Por exemplo, é fornecido aqui um método de identificação de plantas que possui uma ou mais mutações na seqüência de ácido nucleico de HIO endógena que confere um fenótipo alterado e de produção de progênie des- tas plantas mutadas que possuem tal fenótipo que não é transgênica. As plantas mutadas com um fenótipo alterado podem ter um conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras ou um conteúdo alterado de farinha da se- mente.
Em uma modalidade específica do método, chamado de "Tl L- LlNG" (para targeting induced local Iesions in genomes - direcionamento de lesões locais induzidas nos genomas), são induzidas mutações na semente de uma planta de interesse, por exemplo, utilizando tratamento com EMS 20 (sulfonato de etilmetano) tratamento. As plantas resultantes são crescidas e autofertilizadas e a progênie é utilizada para preparar amostras de DNA. A amplificação através da PCR e o sequenciamento da seqüência de ácido nucleico de HIO são utilizados para identificar se uma planta mutada possui uma mutação na seqüência de ácido nucleico de HIO. As plantas que pos- 25 suem mutações HIO podem ser então testadas em relação ao conteúdo alte- rado de óleos, proteínas e/ou fibras. Para confirmar se a mutação HIO causa o fenótipo modificado, podem ser realizados experimentos que correlacio- nam a presença do gene modificado e o fenótipo modificado através de cru- zamentos genéticos. O TILLING pode identificar mutações que alteram a 30 expressão de genes específicos ou a atividade de proteínas codificadas por estes genes (ver Colbert e outros, 2001, Plant Physioi 126:480-484; McCaI- Ium e outros, 2000, Nature Biotechnology 18:455-457). Em uma outra modalidade específica do método, uma aborda- gem de gene/Lócus de Característica Quantitativa (QTLs) candidato pode ser utilizada em um programa de cruzamento auxiliado por marcadores para identificar alelos de ou mutações na seqüência de ácido nucleico de HIO ou 5 ortólogos (e/ou parálogos) da seqüência de ácido nucleico de HIO que po- dem conferir conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras (ver Bert e outros, Theor Appl Genet., 2003 Jun;107(1):181-9; e Lionneton e outros, Genome, 2002 Dez;45(6): 1203-15). Assim, em um aspecto adicional da des- crição, um ácido nucleico de HIO é utilizado para identificar se uma planta 10 que possui conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras possui uma mutação em uma seqüência de ácido nucleico de HIO endógena ou possui um alelo particular que causa conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras na planta.
Embora a descrição tenha sido descrita com referência a méto- 15 dos e modalidades específicos, será considerado que várias modificações e alterações podem ser feitas sem divergir da descrição. Todas as publicações citadas aqui são expressamente incorporadas aqui como referência com a finalidade de descrever e divulgar composições e metodologias que poderi- am ser utilizadas em associação com a descrição. Todas as patentes, os 20 pedidos de patentes e a informação de seqüências citados nos bancos de dados públicos referidos também são incorporados aqui como referência.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
Produção de Plantas com um Fenótipo HIO através da Transformação com um Constructo de Marcacão por Ativação
Este Exemplo descreve a produção de plantas transgênicas com conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras.
Os mutantes foram gerados utilizando o vetor "ACTTAG" de marcação por ativação, pSKI015 (Gl#6537289; Weigel D e outros, 2000, Plant Physiology, 122:1003-1013). Métodos padronizados foram utilizados para a produção de plantas transgênicas de Arabidopsis e eram essencial- mente como descritos no pedido de patente publicado PCT W00183697. Sucintamente, plantas de Arabidopsis TO (CoI-O) foram transformadas com Agrobacterium carregando o vetor pSKI015, que compreende o T-DNA deri- vado do plasmídeo Ti de Agrobacterium, um gene marcador que pode ser selecionado de resistência a herbicida e o elemento intensificador 4X CaMV 5 35S. As plantas transgênicas foram selecionadas na geração T1 com base na resistência ao herbicida. A semente 12 (proveniente das plantas T1) foi colhida e plantada no solo. As plantas T2 foram expostas ao herbicida para matar as plantas que não possuem o vetor ACTTAG. As plantas T2 foram crescidas até a maturidade, permitidas que fossem autofertilizadas e produ- 10 zissem semente. A semente T3 (proveniente das plantas T2) foi colhida em grandes quantidades para cada linhagem.
A semente T3 foi analisada através de Near Infrared Spectros- copy (NIR) no momento da colheita. Os espectros de NIR foram capturados utilizando um espectrômetro perto do infravermelho Bruker 22. O Software 15 Bruker foi utilizado para estimar o conteúdo total de óleos da semente, o conteúdo total de proteínas da semente e o conteúdo total de fibras da se- mente utilizando os dados provenientes da análise de NIR e métodos de re- ferência de acordo com as instruções do fabricante. As calibrações que pre- vêm o conteúdo de óleos foram desenvolvidas seguindo o método geral do 20 AOCS Procedure Am1-92, Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemists Society, 5â Ed., AOCS, Champaign, III. Uma cali- bração que prevê o conteúdo total de proteínas por NIR foi desenvolvida uti- lizando dados do conteúdo de nitrogênio total de amostras de sementes se- guindo o método geral do Dumas Procedure AOAC 968.06 (Official Methods 25 of Analysis of AOAC International 17â Edição AOAC, Gaithersburg, MD). Uma calibração que prevê o conteúdo de fibras por NIR foi desenvolvida uti- lizando os dados de conteúdo de fibras brutas de amostras de sementes seguindo o método geral do AOAC Official Method 962.09 (Official Methods of Analysis of AOAC International 17â Edição AOAC, Gaithersburg, MD). 30 Uma calibração que prevê o conteúdo de ácido oleico por NIR foi desenvol- vida utilizando os dados do conteúdo de ácido oleico de amostras de semen- te determinados seguindo o método de Browse e outros (1986 Anal. Bio- chem. 152:141-145). Foi desenvolvida uma curva de calibração de NIR para prever o conteúdo de proteínas que podem ser digeridas através da medida do conteúdo de proteínas que podem ser digeridas em um conjunto de a- mostras de sementes. O conteúdo total de proteínas em uma massa conhe- 5 cida de semente foi determinado através da medida do conteúdo de nitrogê- nio total da semente utilizando o método de Dumas (AOAC Official Method 968.06). A fibra da semente é extraída de uma amostra de semente separa- da utilizando o método de Honig e Rackis1 (1979, J. Agri. Food Chem., 27: 1262-1266). A proteína não digerida remanescente associada com a fibra é 10 medida através do método de Dumas (AOAC Official Method 968.06). O conteúdo de proteínas que podem ser digeridas é determinado através da subtração da quantidade de proteína não digerida associada com a fibra da quantidade total de proteína na semente.
As previsões de óleos, proteínas e fibras partindo dos espectros 15 de NIR foram comparadas para 82.274 linhagens ACTTAG individuais. Sub- sequente à análise da composição das sementes, a posição do elemento ACTTAG no genoma em cada linhagem foi determinada através da PCR inversa e do sequenciamento. 37.995 linhagens com seqüências flanquea- doras recuperadas foram consideradas nesta análise.
Os valores de óleos e de proteínas das sementes em 82.274
linhagens foram determinados através da espectroscopia por NIR e normali- zados para permitir a comparação dos valores dos componentes das semen- tes nas plantas crescidas em tempos diferentes. Os valores de óleos, proteí- nas e fibras foram normalizados através do cálculo dos valores médios de 25 óleos, proteínas e fibras na semente de todas as plantas plantadas no mes- mo dia (incluindo um grande número de outras plantas ACTTAG, incluindo plantas de controle, do tipo selvagem ou não transgênicas). Os componen- tes das sementes para cada linhagem foram expressos na forma de um "va- lor relativo percentual" que foi calculado através da divisão do valor do com- 30 ponente para cada linhagem pelo valor médio do componente para todas as linhagens plantadas no mesmo dia (que deve se aproximar ao valor nas plantas de controle, do tipo selvagem ou não transgênicas). A "porcentagem relativa de proteínas" e a "porcentagem relativa de fibras" foram calculadas similarmente.
A PCR inversa foi utilizada para recuperar o DNA genômico que flanqueia a inserção do T-DNA. O produto da PCR foi submetido à análise de seqüência e posicionado no genoma utilizando uma busca de BLASTN básica e/ou uma busca do banco de dados Information Resource (TAIR) de Arabidopsis (disponível no website disponível ao público). Geralmente, pro- motores dentro de 9 kb dos intensificadores no elemento ACTTAG são con- siderados como estando dentro do "espaço de ativação". Os genes com in- sertos de T-DNA dentro das seqüências codificadoras não foram considera- dos como estando dentro do "espaço de ativação". As linhagens ACTTAG identificadas estão listadas na coluna 3 da Tabela 1. Em alguns casos, mais de uma linhagem ACTTAG está associada com um gene. Os valores relati- vos de óleos, proteínas, fibras e ácido oleico nas colunas 4, 5, 6 e 7, respec- tivamente, são determinados através da comparação do componente da semente na planta identificado na coluna 3 em relação a outras plantas crescidas ao mesmo tempo e que não exibem a característica. TABELA 1 1. Pseudônimo 2. TAIR ID 3. ID da Planta 4. (%) Relativa 5. (%) Relativa 6. (%) Relativa 7. Ácido Oleico de Óleo de Proteína de Fibra Relativo HI02011 B At4g10540 IN081274 121,52 85,77 112,19 170,91 HI02022A At1g21160 IN070576 117,87 86,36 105,35 131,71 HI02022A At1g21160 IN081625 108,6 94,24 102,16 127,55 HI02024A At5g43820 IN078194 117,12 84,22 98,87 93,6 H102024A At5g43820 IN077533 110,52 97,43 97,63 101,01 HI02029 A At4g21880 IN040221 112,12 91,32 105,08 98,4 HI02036A At1g35610 IN003383 110,63 95,26 102,61 107,39 HI02044A At1g07200 IN085633 136,02 215,34 33,73 HI02044 A At1g07200 IN065584 110,22 94,36 107,98 109,02 HI02062 B At3g21530 IN075911 112,25 97,43 128,26 121,82 HI02062 B At3g21530 IN010283 105,43 87,91 103,95 102,14 HI02070 B At1g03230 IN051870 110,64 97,08 92,8 99,68 HI02070 B At1g03230 IN027452 106,6 95,11 104,3 103,25 HI02079 B At1g71420 IN083604 131,01 83,85 99,94 139,75 HI02079 B At1g71420 IN090912 111,54 94,45 102,28 121,4 TABELA 1 - continuação 1. Pseudônimo 2. TAIR ID 3. ID da Planta 4. (%) Relativa 5. (%) Relativa 6. (%) Relativa 7. Ácido Oleico de Óleo de Proteína de Fibra Relativo HI02084A At3g 12020 IN003802 115,88 86,87 92,23 35,51 HI02084A At3g 12020 IN090757 114,25 89,69 104,06 190,46 HI02091 B At1g09850 IN086447 139,97 124,86 65,1 HI02091 B At1g09850 IN056625 104,65 106,59 100,56 103,87 H102093 A At5g61370 IN088828 137,19 136,19 56,9 HI02093A At5g61370 IN013278 107,74 98,35 105,92 114,61 HI02093C At5g61390 IN088828 137,19 136,19 56,9 HI02093C At5g61390 IN000614 109,24 92,2 104,2 106,81 HI02094 C At3g 13224 IN090531 128,14 75,88 117,6 HI02094 C At3g 13224 IN041823 108,28 98,85 97,35 102,03 HI02094 D At3g 13227 IN090531 128,14 75,88 117,6 HI02094 D At3g13227 IN041823 108,28 98,85 97,35 102,03 HI02104 B At4g33900 IN067514 117,59 88,13 96,25 121,81 TABELA 2 1. Lócus 2. Tair ID 3. Seq. de ácido 4. Seq. de Poli- 5. Suposta função bioquími 6. Domínio conservado nucleicoGI# peptídeo Gl# ca/nome da proteína da proteína H102022A At1g21160 gi|42562216 gi|15218159 proteína da família do fator de iní¬ IPR000795 Fator de síntese de cio da tradução eucariótica proteína, ligação a GTP 2/proteína da família elF-2 IPR002917 proteína de ligação a GTP, relacionada a HSR1 IPR004161 Fator de alongamento Tu1 domain 2 IPR010528 ToIA IPR004130 Proteína de ligação a ATP hipotética conservada H102024A At5g43820 gi| 18422375 gi| 15239991 proteína contendo repetição de IPR002885 Repetição de pentatri¬ pentatricopeptídeo (PPR) copeptídeo HI02029 A At4g21880 gi|30685605 gi|30685606 proteína contendo repetição de IPR002885 Repetição de pentatri¬ pentatricopeptídeo (PPR) copeptídeo HI02036 A At1g35610 gi| 18399770 gi|15219660 Proteína contendo domínio DC1 IPR004146 DC1 IPR011424 similar a C1 TABELA 2 - continuação 1. Lócus 2. Tair ID 3. Seq. de ácido 4. Seq. de Poli- 5. Suposta função bioquími 6. Domínio conservado nucleicoGI# peptídeo GI# ca/nome da proteína da proteína IPR001965 similar a dedo de Zn, dedo de PHD H102044A At1g07200 gi|30680018 gi|22329388 Relacionada à proteína CIpB Clp IPR001270 Chaperonina dpA/B protease dependente de ATP HI02062 B At3g21530 Gl:42565085 gi|42565086 proteína da família de endonuclea- IPR005135 Endonuclease/ exonu- se/exonuclease/fosfatase clease/fosfatase IPR004808 Exodeoxirribonuclease Ill xth IPR000097 AP endonuclease, fa¬ mília 1 HI02070 B At1g03230 gi |42561644 gi| 18379072 suposta glicoproteína dérmica ex- tracelular/suposta EDGP HI02079 B At1g71420 gi| 18409850 gi|15217470 proteína contendo repetição de IPR002885 Repetição de pentatri¬ pentatricopeptídeo (PPR) copeptídeo H102084A At3g12020 gi|22331005 gi|22331006 relacionada à proteína motora qui- IPR001752 Quinesina, região mo¬ nesina tora HI02091 B At1g09850 gi |30681401 gi|18391078 cisteína protease, similar à papaína IPR000169 Peptidase, sítio ativo (XBCP3) da cisteína peptidase eucariótica TABELA 2 - continuação 1. Lócus 2. Tair ID 3. Seq. de ácido 4. Seq. de Poli- 5. Suposta função bioquími 6. Domínio conservado nucleicoGI# peptídeo GI# ca/nome da proteína da proteína IPR000668 Peptidase C1A, papaí- na IPR000118 Granulina HI02093 A At5g61370 gi|30697519 gi| 15240232 proteína contendo repetição de IPR002885 Repetição de pentatri¬ pentatricopeptídeo (PPR) copeptídeo HI02093C At5g61390 gi|42568688 gi|42568689 proteína da família de exonuclease IPR006055 Exonuclease IPR006054 DNA polimerase III, subunidade épsilon H102094 C At3g13224 Gl:30682549 Gl:30682550 Proteína contendo o motivo de re¬ IPR000504 Região RNP-1 de liga¬ conhecimento de RNA (RRM) ção ao RNA (motivo de reconheci¬ mento de RNA) IPR009909 Nmi/IFP 35 IPR002343 Antígeno de encefalo- mielite paraneoplásica HI02094 C At3g13224 GI.30682552 Gl .30682553 Proteína contendo o motivo de re¬ IPR000504 Região RNP-1 de liga¬ conhecimento de RNA (RRM) ção ao RNA (motivo de reconheci¬ mento de RNA) TABELA 2 - continuação 1. Lócus 2. Tair ID 3. Seq. de ácido 4. Seq. de Poli- 5. Suposta função bioquími 6. Domínio conservado nucleicoGI# peptídeo GI# ca/nome da proteína da proteína IPR009909 Nmi/IFP 35 IPR002343 Antígeno de encefalo- mielite paraneoplásica HI02094 D At3g13227 Gl:30682556 gi|22331053 relacionada à proteína rica em se- rina HI02011 B At4g 10540 gi|18413350 gi|18413351 proteína da família subtilase IPR010259 Inibidor de proteinase 19, pró-peptídeo de subtilisina IPR003137 Associado à protease PA IPR000209 Peptidase S8 e S53, subtilisina, kexina, sedolisina HI02104 B At4g33900 gi|18418316 gi|18418317 proteína da família F-box contendo IPR006652 Repetição kelch repetições kelch IPR011498 Kelch IPR001810 F-box similar à ciclina TABELA 3 1. Lócus 2. Tair ID 3. Seq. de ácido 4. Seq. de Poli- 5. Ortólogos Ácido Polipeptídeo Espécie nucleico GI# GI# HI02022A At1g21160 gi|42562216 gi|15218159 gi|42563274 gi|42563275 Arabidopsis thaliana gi|30699194 gi|30699195 Arabidopsis thaliana gi|23452070 gi|23452071 Pisum sativum H102024A At5g43820 gi| 18422375 gi| 15239991 gi|30685153 gi| 15242190 Arabidopsis thaliana gi|50918926 gi|50918927 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|34896697 gi|34896698 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) HI02029A At4g21880 gi|30685605 gi|30685606 gi|30679876 gi|30679877 Arabidopsis thaliana gi|50905060 gi|50905061 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|18415436 gi| 15235288 Arabidopsis thaliana HI02036A At1g35610 gi| 18399770 gi|15219660 gi| 18400150 gi|15231357 Arabidopsis thaliana gi|42572370 gi|42572371 Arabidopsis thaliana gi| 18399212 gi| 15229741 Arabidopsis thaliana TABELA 3 - continuação 1. Lócus 2. Tair ID 3. Seq. de ácido 4. Seq. de Poli- 5. Ortólogos Ácido Polipeptideo Espécie nucleico GI# GI# 102044 A At1g07200 gi|30680018 gi|22329388 gi|30680018 gi|22329388 Arabidopsis thaliana gi|42569462 gi|18402202 Arabidopsis thaliana gi|42568597 gi| 15242850 Arabidopsis thaliana H102062 B At3g21530 Gl:42565085 gi|42565086 gi|42570014 gi|18407510 Arabidopsis thaliana gi|34898867 gi|34898868 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|21229478 gi|21231641 Xanthomonas campestrís pv. campestris cepa ATCC 33913 HI02070 B At1g03230 gi|42561644 gi| 18379072 gi|30678499 gi| 15218740 Arabidopsis thaliana gi|285740 gi|285741 Daucus carota gi|32482805 gi|32482806 Solanum tuberosum HI02079 B At1g71420 gi| 18409850 gi|15217470 gi|18416131 gi| 15242550 Arabidopsis thaliana gi|30693149 gi|30693150 Arabidopsis thaliana gi]50899005 gi|50899006 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) TABELA 3 - continuação 1. Lócus 2. Tair ID 3. Seq. de ácido 4. Seq. de Poli- 5. Ortólogos Ácido Polipeptídeo Espécie nucleico GI# GI# H102084A At3g12020 gi|22331005 gi|22331006 gi|22326628 gi|22326629 Arabidopsis thaliana gi|30687505 gi|30687506 Arabidopsis thaliana gi|50924423 gi|50924424 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) HI02091 B At1 g09850 gi|30681401 gi|18391078 gi|50932272 gi|50932273 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|30694200 gi| 18422289 Arabidopsis thaliana gi|30141018 gi|30141019 Helianthus annuus HI02093 A At5g61370 gi|30697519 gi| 15240232 gi|37534457 gi|37534458 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|30697448 gi| 15239488 Arabidopsis thaliana gi|30693231 gi| 15229604 Arabidopsis thaliana HI02093 C At5g61390 gi|42568688 gi|42568689 gi|42567730 gi| 15240840 Arabidopsis thaliana gi|22330631 gi| 15221225 Arabidopsis thaliana gi|37534221 gi|37534222 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) TABELA 3 - continuação 1. Lócus 2. Tair ID 3. Seq. de ácido 4. Seq. de Poli- 5. Ortólogos Ácido Polipeptídeo Espécie nucleico GI# GI# HI02094 C At3g13224 Gl: 30682549 Gl:30682550 gi|30682552 gi|30682553 Arabidopsis thaliana gi|50944098 gi|50944099 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi |50947154 gi|50947155 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) Gl:51964985 Gl:51964986 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) HI02094 C At3g 13224 Gl:30682552 Gl:30682553 gi|30682549 gi|30682550 Arabidopsis thaliana gi|50944098 gi|50944099 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|50947154 gi|50947155 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) Gl:51964985 Gl:51964986 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) H102094 D At3g13227 Gl:30682556 gi|22331053 Gl:4105789 Gl:4105790 Petunia x híbrida TABELA 3 - continuação 1. Lócus 2. Tair ID 3. Seq. de ácido 4. Seq. de Poli- 5. Ortólogos Ácido Polipeptídeo Espécie nucleico GI# GI# Gl:50905728 Gl:50905729 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) Gl:30697586 GI: 15220581 Arabidopsis thaliana HI02011 B At4g 10540 gi| 18413350 gi|18413351 gi|30681486 gi| 18413353 Arabidopsis thaliana gi| 18413344 gi|18413345 Arabidopsis thaliana gi|30692780 gi| 18398655 Arabidopsis thaliana HI02104 B At4g33900 gi|18418316 gi|18418317 GI: 18416176 gi| 15236530 Arabidopsis thaliana GI: 18418391 gi| 15235260 Arabidopsis thaliana GI: 18407622 gi|15229754 Arabidopsis thaliana EXEMPLO 2
Análise da Seqüência de HIO de Arabidopsis
As análises de seqüência foram realizadas com BLAST (Altschul e outros, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410), PFAM (Bateman e outros, 1999, 5 Nucleic Aeids Res. 27:260-262), INTERPRO (Mulder e outros 2003 Nucleie Aeids Res. 31, 315-318), PSORT (Nakai K e Horton P, 1999, Trends Bio- ehem. Sei. 24:34-6) e/ou CLUSTAL (Thompson JD e outros, 1994, Nueleie Aeids Res. 22:4673-4680).
EXEMPLO 3 Experimentos de Resumo
Para testar se a superexpressão dos genes nas Tabelas 1 e 2 alteram o fenótipo de composição das sementes, o conteúdo de proteínas, de proteínas que podem ser digeridas, de óleos e de fibras nas sementes das plantas transgênicas que expressam estes genes foi comparado com o 15 conteúdo de proteínas, de proteínas que podem ser digeridas, de óleos e de fibras nas sementes das plantas de controle não transgênicas. Para fazer isso, os genes foram clonados nos vetores de transformação de plantas a- trás do promotor de CsVMV constitutivo forte e do promotor PRU específico de semente. Estes constructos foram transformados em plantas de Arabi- 20 dopsis utilizando o método de imersão floral. O vetor de transformação de plantas contém um gene, que fornece resistência a um composto tóxico e serve como um marcador que pode ser selecionado. A semente das plantas transformadas foram plantadas em meio com ágar contando o composto tóxico. Após 7 dias, as plantas transgênicas foram identificadas como plan- 25 tas verdes saudáveis e foram transplantadas para o solo. As plantas de con- trole não transgênicas foram germinadas em meio com ágar, permitidas que crescessem durante 7 dias e então transplantadas para o solo. As mudas transgênicas e as plantas de controle não transgênicas foram transplantadas em vasos de 5,08 cm (duas polegadas) que foram colocados em posições 30 aleatórias em uma bandeja de 25,4 cm (10 polegadas) por 50,8 cm (20 pole- gadas). As plantas foram crescidas até a maturidade, permitidas que sofres- sem autofertilização e produzissem semente. A semente foi colhida de cada planta e seu conteúdo de óleos foi estimado através de Near Infrared (NIR) Spectroscopy utilizando métodos descritos anteriormente. O efeito de cada construção sobre a composição da semente foi verificado em pelo menos dois experimentos.
5 A Tabela 4 lista os constructos testados por causarem um au-
mento significativo no conteúdo de óleos, proteínas, proteínas que podem ser digeridas ou um decréscimo significativo no conteúdo de fibras foi identi- ficado através do teste de Análise de Variância em duas vias (ANOVA) em um valor de p <0,05. Estes constructos estão listados na Tabela 4. Os valo- 10 res de p de ANOVA para Proteína, Óleo, Proteína Que Pode Ser Digerida e Fibra estão listados nas colunas 4-7, respectivamente. Aqueles com valor de p significativo estão listados em negrito. Os valores médios para Proteína, Óleo, Proteína Que Pode Ser Digerida e Fibra estão listados nas colunas 8- 11, respectivamente e foram calculados através da média dos valores mé- 15 dios determinados para as plantas transgênicas em cada experimento. TABELA 4 ANOVA Média 1. Pseudônimo 2. Tair 3.Construção 4. Proteína 5. Óleo 6. Proteína 7. Fibra 8. Proteína 9. Óleo 10. Proteína 11. Fibra que pode que pode ser digerida ser digerida HI02011 B At4g10540 CsVMV:: At4g10540 0,498 0,736 0,854 0,789 98,5% 100,7% 100,2% 100,3% HI02011 B At4g 10540 Pru ::At4g 10540 0,680 0,107 0,004 0,002 99,4% 103,3% 102,9% 95,9% HI02022A At1g21160 CsVMV:: At1 g21160 0,245 0,689 0,084 0,067 103,5% 98,2% 99,6% 100,7% HI02022A At1g21160 Pru::At1g21160 0,538 0,119 0,034 0,003 101,5% 102,3% 102,9% 96,0% H102024A At5g43820 CsVMV: :At5g43820 0,582 0,131 0,005 0,047 99,3% 102,6% 102,4% 96,9% HI02024A At5g43820 Pru::At5g43820 0,074 0,864 0,033 0,039 103,5% 99,8% 102,0% 97,3% HI02029A At4g21880 CsVMV: :At4g21880 0,119 0,159 0,002 0,372 101,4% 98,3% 102,1% 99,2% HI02029A At4g21880 Pru::At4g21880 0,533 0,054 <,0001 <,0001 101,1% 102,8% 104,2% 94,5% HI02036A At1g35610 CsVMV: :At1g35610 0,040 0,001 0,314 0,005 97,0% 106,5% 100,9% 96,3% H102036 A At1g35610 Pru::At1g35610 0,776 0,780 0,008 0,025 100,6% 100,6% 103,0% 97,2% H102044A At1g07200 CsVMV: :At1g07200 0,815 0,336 0,037 0,069 100,3% 101,8% 101,7% 97,7% HI02044A At1g07200 Pru::At1g07200 0,134 0,202 0,000 0,001 102,0% 102,3% 103,3% 95,7% H102062 B At3g21530 CsVMV: :At3g21530 0,709 0,423 0,256 0,145 99,5% 100,7% 100,7% 99,1% HI02062 B At3g21530 Pru::At3g21530 0,316 0,024 0,756 0,160 98,3% 102,8% 99,8% 98,8% HI02070 B At1g03230 CsVMV:: At1g03230 0,966 0,618 0,258 0,044 100,1% 101,1% 101,0% 98,1% HI02070 B At1g03230 Pru::At1g03230 0,995 0,019 0,018 0,003 100,1% 102,8% 102,3% 96,8% TABELA 4 - continuação ANOVA Média 1. Pseudônimo 2. Tair 3.Construção 4. Proteína 5. Óleo 6. Proteína 7. Fibra 8. Proteína 9. Óleo 10. Proteína 11. Fibra que pode que pode ser digerida ser digerida H102079B At1g71420 CsVMV::At1g71420 0,297 0,033 0,083 0,058 99,0% 102,7% 101,2% 98,0% HI02079 B At1g71420 Pru::At1g71420 0,114 0,810 0,008 0,002 102,6% 99,8% 102,3% 97,1% HI02084A At3g12020 CsVMV:: At3g 12020 0,076 0,728 0,063 0,200 102,4% 99,5% 101,6% 98,3% HI02084A At3g12020 Pru ::At3g 12020 0,487 0,019 0,022 0,001 98,6% 103,7% 102,0% 96,1% HI02091 B At1g09850 CsVMV:: At1 g09850 0,041 0,065 0,760 0,830 97,2% 102,8% 99,8% 100,4% HI02091 B At1g09850 Pru::At1g09850 0,354 0,170 0,475 0,748 101,9% 98,4% 101,1% 100,2% HI02093A At5g61370 CsVMV: :At5g61370 0,337 0,098 0,224 0,074 98,8% 102,4% 101,0% 97,9% HI02093A At5g61370 Pru ::At5g61370 0,535 0,139 <,0001 <,0001 100,8% 101,9% 103,4% 94,0% HI02093C At5g61390 CsVMV: :At5g61390 0,058 0,065 0,064 0,051 97,1% 103,0% 101,1% 98,1% HI02093C At5g61390 Pru::At5g61390 0,949 0,068 0,005 0,000 100,1% 101,9% 102,7% 95,6% HI02094C At3g 13224 CsVMV: :At3g 13224 0,710 0,065 0,186 0,070 99,5% 101,7% 101,2% 98,2% HI02094 C At3g13224 Pru::At3g 13224 0,034 0,173 0,025 0,125 104,5% 98,4% 102,6% 98,0% HI02094 D At3g13227 CsVMV: :At3g 13227 0,096 0,030 0,153 0,042 97,3% 104,5% 101,2% 97,2% HI02094 D At3g13227 Pru ::At3g 13227 0,042 0,004 0,430 <0001 97,9% 97,8% 101,3% 105,0% HI02104 B At4g33900 CsVMV: :At4g33900 0,846 0,722 0,374 0,064 100,0% 99,6% 99,5% 102,5% HI02104 B At4g33900 Pru::At4g33900 0,152 0,015 0,048 0,002 98,3% 103,5% 101,7% 95,6% LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> Agrinomics LLC Davi es, John p.
Ng, Hein Tsoeng
<120> PRODUÇÃO DE PLANTAS COM CONTEÚDO ALTERADO DE ÓLEOS, PROTEÍNAS OU FIBRAS
<130> 6616-72632-27 <150> 60/870,345 <151> 2006-12-15 <160> 34 <170> Patentin version 3. 3 <210> 1 <211> 3603 <212> DNA <21B> Arabidops is thaliana <400> 1 ctcaaatata tctctgcaac gaaaagaaat cacctgctta ctcttctcct gaaagacctg 60 atcttctccg gtgaattgtt ttttgttccg tcaatcttcc gagtttgttt ttgcctaata 120 tgaagttaaa cccattacag aaaaaggcta tattcatatt tgatttctat caatggatcc 180 gaggaattcg agtgcgtggg gtgggggtga tggtctcccc cttatctcat ccatgggagg 240 tgttgaatca aagaatagat gctgtgtgac tgacgacgat ggctctattg gtacgaagct 300 atgtgagaaa cctaaagctg aggagattga tttttctgct cggaaaaaga agttgaaatc 360 gaagaaaggc gggtctgtta gctttgctct tctcgatgtt gaagatgaca aggaggaagc 420 agaggatgga gacgacaaaa atccttctat taggagtgat gaggtggttg gagaaacttc 480 aatgagtaag aaaaagaaga aggataagag tggcaagcat ggggtatgtg aagaagatga 540 tgatgcggac aagattcttg ctcaacatgg gataacaact actgtttcaa cagggcctga 600 agcggagata gctctagctc aacctgagca agttgcatct gcagatgggg ctgttgacaa 660 ggacggagaa gaaaagactg ttgagtcagc tacagcgaag aaaaagaaaa agaagaagga 720 caaggacaag aaagcaagtg cttctttagc tatttcttct gtggaggcta aggaggatag 780 acaagggaag aaagatgtaa agattaaagt agcggaaaag aaagttccta aacatgttcg 840 agagaagcaa gagactcttg cgcggtggaa agaagctgaa gatgggaaga agaaggaaga 900 agaagagaga ttgaggaaag aggaagagga gcgccgtata gaggaagagc gagaaaggga 960 agctgaagag attaggcaga agagaaagat gattctaaca gcaaagcaaa agcgtgatgc gttgactgat gctggaagtc ttcttgttgc catatatggc aataaaaaca aattagcttg 5 ggctaaaggt gatggggaaa ccaaggaaaa tgacttggtt tcagttgaag atagaagggt gacacatgaa tctgttgatg tatcacaaga aaaaactaat tttaccatca agggtgattc gttcaagaaa ggtttaaaag acactgcatc 10 gaagcctgga ggttctggca agccaaaaac tgatactacc cggccgaaag atacttctaa tgctaaagaa gtagaagaaa atcttcgctc ttctggtaaa acaaagctgt tggattgcat tggaggtatt actcaacaga ttggtgcaac 15 gaccaaagag ttacaagcta atgctaaact acctggacac gagtcattca caaatctgcg aattctagtg gttgatataa tgcgaggtct tttgagaaga aggaatgtaa agttcattat gtgggaaaaa agcaagaatg ctcctataag 20 ggttaaggaa tttaaaatga ggctaaaccg caacagtatg ctttattaca agaacagaga tagcgctatt agtggggaag ggattccaga gaaaacgatg gtggagaaac ttacatatgt caaagttatt gaaggccatg gtattacagt 25 tgaaggtgat caaattgttg tttgtgggtc attgttgact ccttatccta tgaacgagat agaagtaaag gctgcgcagg gtatcaaaat tggtactgcc ttgcatgtga ttggacctaa catggaagat attgagtcag ttatgaaccg 30 acaagcatct acattagggt ccttggaagc aaaaatacct gtcagtggta ttggcatagg cggggtaatg ctagagaaga aaaaagagtt
caggaaaatg gagaagaagc aagaaggcct 1020 tgctaagaat gaggctttca gaaaaagggt 1080 agataaaaac ggtgattcct caaaacgtcc 1140 caaaaaagca aacgatcctg cttctgtcca 1200 tcatgcagca gatgaaccat gtactttacc 1260 tggtattatc gaatcagtag acacagaaga 1320 gaatggtgat gaggaagatg tgtgggatgc 1380 tgatgatgag gaggaaaaac ctcagcctgt 1440 aaaggcacat gattcagata gaccaacagt 1500 agctgccaaa aaagctatgc ctaaggtgga 1560 aaaggatgaa ggcttagtac tgaatgaact 1620 tccaatttgc tgcatcatgg gtcatgttga 1680 cagaggaaca aatgttcagg aaggtgaagc 1740 CtttttCCCt gcagaaaaca tccgtgagag 1800 caaggtgcca ggtatattgg ttatcgatac 1860 gtcaaggggt tcaaatttgt gtgaccttgc 1920 agagccacaa accatagaat ctcttaatct 1980 tgccttgaat aaggtggata ggctatatgg 2040 gaagacaatg atgcaacaaa cgggagatgt 2100 agttcaaaac cagttccaag aacaaggact 2160 aatgggagaa actatcagta tcctacctgc 2220 tcttttactg ttcttggttc aatgggctca 2280 tgacaaagtg cagtgtaccg tccttgaggt 2340 tgatgttgtt ttggtcaacg gtgtactccg 2400 acagggacca attgtaacaa ctattagatc 2460 gcgggtgacg ggtacctata tgcctcacag 2520 tgctgcacag ggccttgaac acgccattgc 2580 tgaggacatg gaagaagcca agaaaaatgc 2640 cattgacaaa agtggtgaag gcgtttatgt 2700 attgctcgag ttcttgaagt cctcagatgt 2760 acctgtgcat aagaaggata tcatgaaggc 2820 tgcaacgatt ttggcctttg atgtgaaaat 2880 aagtgcagaa gctcgtgaac ttgcagacaa aatgggagta aaaatcttct gcgatgatac 2940 catctattgt ctgttcgata agtttaagag ttacatagag ggtatcaaag aggagaaaaa 3000 gaaagaaaca gcttgtgaag cagttttccc atgtatcctt cagattttac caaaccatat 3060 ctacaatcag agggacccaa ttatccttgg agttaaagtc aatgatggaa tactaaaggt 3120 5 tggaactccc atttgcattg ttaaaaggat tgagaatgta agagtgttta tggacattgg 3180 gcgcgtctca tcaattaaga ataacaacaa catgccagtt gattatgcaa ggaaaggaca 3240 ggaggtggct attaagatca ttgcttctaa cccagaagaa cagaaaatgt ttgggaggca 3300 ctttggtgta gacgacaggc ttatcagtca catttctagt cgatccgtgg acgtaatcag 3360 aactaattac tggaatgagt tatctaacga cgagaaggat cttgttttga gacttaaaag 3420 10 gatattcaag atacaatgaa gatttttgag atttgagagt gagggactta aacttatgta 3480 ttttttttct ttttttgaag tgctgatttt tttatttttt tttcgttttt aataatatag 3540 acaaacaact cctttaatgc ccctaaatac tttatggaag caattgtctt ttgtttttgg 3600 cta 3603
<210> 2 <211> 1088 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 2
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Thr Asp Asp Asp Gly Ser Ile Gly Thr Lys Leu Cys Glu Lys Pro Lys 35 40 45
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Glu Glu Ala Glu Asp Gly Asp Asp Lys Asn Pro Ser Ile Arg Ser Asp 85 90 95
Glu Val Val Gly Glu Thr Ser Met Ser Lys Lys Lys Lys Lys Asp Lys 100 105 110 Ser Gly Lys His Gly Val Cys Glu Glu Asp Asp Asp Ala Asp Lys Ile 115 120 125
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Glu Ile Ala Leu Ala Gln Pro Glu Gln vai Ala ser Ala Asp Gly Ala 145 150 155 160
val Asp Lys Asp Gly Glu Glu Lys Thr vai Glu ser Ala Thr Ala Lys 165 170 175
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asp Lys Asp Lys Lys Ala Ser Ala Ser Leu 180 185 190
Ala Ile ser ser val Glu Ala Lys Glu Asp Arg Gln Gly Lys Lys Asp 195 200 205
val Lys Ile Lys val Ala Glu Lys Lys val Pro Lys His val Arg Glu 210 215 220
Lys Gln Glu Thr Leu Ala Arg Trp Lys Glu Ala Glu Asp Gly Lys Lys 225 230 235 240
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Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Glu Glu Ile Arg Gln Lys Arg Lys 260 265 270
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Asn His Ala Ala Asp Glu Pro Cys Thr Leu Pro Asp Leu val Ser val 355 360 365 Glu Asp Arg Arg Val Gly Ile Ile Glu Ser Val Asp Thr Glu Glu Thr 370 375 380
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405 410 415
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485 490 495
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740 745 750
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<213> Arabidopsis thaliana
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atgcttagga gatggaacat agttattgaa tcgctacgtc gcgttcatag cagtgattta 60 gaaaacctaa tttcggcttc cctatacaat cgaacacttt gcacagcctc agaatcattg 120 aatcatggtg ttgttgatga gagttatgtt ctagctgaat tatcttcatt gcttccaatt 180 tcatctaata aaacctcagt gtcaaaggaa gacagtagct caaagaatca agtagctatt 240 gattcgtttt tgtcagcaga ggacaaactt agaggtgtgt ttcttcagaa attgaaaggc 300 aagtctgcta ttcagaagag tttgagtagt cttggtattg gtttgagtat tgacattgtt 360 gccgatgtat tgaatcgagg gaatttaagc ggcgaagcga tggtaacgtt ctttgattgg 420 gcggttcgtg agcctggtgt gactaaagat gttggtagct acagtgtgat tttaagagcg 480 ttaggaagga gaaagctttt ctcttttatg atggatgttc taaagggaat ggtatgtgaa 540 ggtgttaatc ctgatctgga gtgtttaact attgctatgg atagctttgt tagggttcat 600 tatgtgcgta gagcgataga gttgtttgag gaaagtgaaa gttttggggt gaaatgtagt 660 actgagtctt tcaatgcatt gttacggtgt ctatgtgagc gttcacatgt gagtgctgca 720 aagtcagtat ttaatgctaa gaaaggtaat ataccttttg atagttgtag ttataacatt 780 atgattagtg ggtggtcaaa gctcggtgag gttgaagaga tggaaaaggt tttgaaggag 840 atggtggaga gtggatttgg tcctgactgt ttgtcttata gccatcttat tgaagggttg 900 ggaagaactg gtcgtatcaa tgattctgtt gagatctttg ataatataaa acacaagggt 960 aatgttcctg atgcaaatgt ttacaatgct atgatctgta atttcatatc tgctcgagat 1020 tttgatgagt ctatgaggta ctaccgaagg atgctggatg aggaatgtga acctaacttg 1080 gaaacctatt ccaagcttgt ttctgggctc attaaaggcc gtaaggtttc tgatgcgctt 1140 gagatattcg aagagatgtt atcaagaggg gttcttccca ccacagggct tgttacctct 1200 ttcctcaagc ctctttgcag ctatggtcca ccacacgctg caatggttat ctatcagaaa 1260 tcaagaaaag ccgggtgtag gatatcagaa agcgcatata agctgttgct taagcggcta 1320 tcaagatttg gaaaatgcgg gatgctgttg aacgtatggg atgaaatgca agagtctgga 1380 tatccttctg acgtggaagt ctacgagtat attgtggatg ggctctgtat cattgggcat 1440 ctagagaatg ctgtgcttgt gatggaagaa gctatgcgta aagggttttg cccaaaccgc 1500 tttgtttata gtaggcttag cataattagg aaatggcagc agaagttcag aaaagggaag 1560 gaggagatgg aaaagtggga ggcacttcaa gttcgatggg tgtccctctt caggaacgct 1620 tcttctatca tccagagatt acaggaaatg caaaatcatg ggagctatgg agctttgaga 1680 tgcctgaaag ggattgaaga cgcagttgtg cagcaacaga tgggtcaact ggagtctcta 1740 ttgcgttcca tgaaaaacgt tatggaggaa ttctggggct gtgttttgac atttgagaag 1800 ctacatcggg acggtttaca gttacgtgaa attgaatcaa gcaagaggcg agtagaggaa 1860 cgaattggag taaaaccgtg cattactgat tgcttggagg atgcatcaat cagatcctgg tgatctaaac gcgctacaat aatatcccga aagatgaagt acaacacatt ttcgatgtca tga
<210> 4 <211> 680 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 4
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gactttctat tctttatgac 1920 acctcgtggt tgatcagccg 1980 tattcgcgga agagatcaaa 2040
2043
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<213> Arabidopsis thaliana
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ο cgttctaggc cttgattcga ttttgttaac aaggcgaaga aaagcttaag cgcgatattt gccgaagttg aagccaaagc cgtagccgga tcaatgtctt taataccgga ttttctctca attggtcaag attttggtga accggcactt 10 aaatctattg gatataatct tcttcgagaa gtattggaaa ccttagattt actgtctagg gcttcacgtg gtaggatgct gacagaaaat aagcttgcca agggatgtgt tcggaagttg aaaatgggga aagaagcggg tgagaaagaa 15 cgtgcgagga gaagcaatga tgcagaatat catctcaaag aaatgagaca gcttggattc tttaagtact tagttgatat ggaaatggta aaggaggcat gtcctgagtc ttgtgggaga caagtcaacg acgaagagaa gatccacaaa 20 agtttatcaa tcctacaaga tggagtggag acctgcatcc caaattcaac ggtagaggat gaactagata tcgtgccttc atctacatct tcaaatgagg tggtcactgc tcttgatata atatcagcaa acatcctgca ctcattgtta 25 ttggtgcaaa gaatctattc aataatgagc ttcaggaaat ctataaattt gtgcataaga tatgctgttt ctcacagaac tttttgttat ggttccgtgc agtttgaagg tgcatataac gcaccgaact ctagcatgta caattctata 30 aacagtgcct taaaggtcct caaggaaatg acttttagct atctaataaa ctattgtggc gagatgaagc aagcaggagt tgaagttaat
tgttgtaaat gtgaaaaaac aatggcttta 60 cgctttgcga tgagaaacgc tgccaaaact 120 gattctctga tttcagacac tggaccagtg 180 tcgcttaagt ctccggaaga ttcttccaac 240 gcgggtcagg tctcgtctgc gttagatgtt 300 agaaatggcg agaaagtttt tccgaagaac 360 aaaggttgtt cgtcgcaaaa gccaaagcag 420 taccagaaca aacagtctga gattatggag 480 ggaactgaga ctatgtttga ggtgttgact 540 tacaatgcaa tgactaaact ttgcatacaa 600 gctcttgatc aaattgggaa ggctattgaa 660 tctattggag aaggagctta tggccctttt 720 gcggagttcc aaattctcaa ggattttatt 780 cttgtctact atgaaatgct tctttggatc 840 ctttgcaata aagttgatga tagtgggcta 900 acagtttcaa atctcatatt cagctatgca 960 gccattttca agtttaacaa gttgcatgaa 1020 tatgagaatc ttgtcagtta tctttgtggc 1080 gttgaaaata tgtgtgaagc aggtctggta 1140 caggccattg agcagattct tgagtttaat 1200 aacaagagtg tgaagccaaa tagtgagact 1260 atcaaagata ctctagcaat gaagtatgaa 1320 ccaaccataa caatttgcta tcaacctatt 1380 atgcttggta atttaaagaa tttcaatttg 1440 atggcaggat atttccggga gaaaaaagtg 1500 aaagaagctg atgttaaacc tgattcggtg 1560 gaggaggcga ctattgcgaa gtattataag 1620 aagcacgttt acatgtccct tgttaaagca 1680 tatgcatcat gcggacagtt tgaaaaggca aaacaggtgc tcatggacct ggaagttccg 1740
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cagttcaagg ctacaatgat atccggtgaa gtcaggtatg ttacctcgtc ttggtgcaaa 2460
ccttacacaa agctcacctt aactctactg tttgttgttg aggtggttgc tattgtacca 2520
gataagtcag atggaacttc aggtccgatc attatgatct gcacggttcc taaaccatta 2580
agcaagtga 2589 <210> 6 <211> 845 <212> PRT 20 <213> Arabidopsis thaliana <400> 6
Met Ala Leu Lys Ala Lys Lys Ser Leu Ser Ala Ile Phe Arg Phe Ala 15 10 15
Met Arg Asn Ala Ala Lys Thr Ala Glu Val Glu Ala Lys Ala Val Ala 20 25 30
Gly Asp ser Leu Ile Ser Asp Thr Gly Pro Val Ser Met Ser Leu Ile 35 40 45
Pro Asp Phe Leu Ser Ser Leu Lys Ser Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ile 50 55 60 Gly Gln Asp Phe Gly Glu Pro Ala Leu Ala Gly Gln Val Ser Ser Ala
65 70 75 80
Leu Asp Val Lys Ser Ile Gly Tyr Asn Leu Leu Arg Glu Arg Asn Gly 85 90 95
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165 170 175
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Arg Gln Leu Gly Phe Ser Ile Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Pro Phe Phe 210 215 220
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Asp Phe Ile Lys Glu Ala Cys Pro Glu Ser Cys Gly Arg Leu Val Tyr
245 250 255
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Leu His Glu Glu Leu Asp Ile Val Pro ser Ser Thr Ser Tyr Glu Asn
325 330 335
Leu Val ser Tyr Leu Cys Gly Ser Asn Glu Val val Thr Ala Leu Asp 340 345 350
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<210> 7 <211> 1839
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 7
5 atgggttttg aagatggacc aagatgtctt ttgtccgttc gatacagatt caactttcgt gctgctacga cgccggattg tctctactac aatggttgcc atcaacgtcc aagaaggata actctcttct atcgaaaccc cgaaaccaga 10 cctggtaaaa ttgaggatac atcaggtcca tataagtctg atatcatatt caacaaatgc tggttttatc gttgtttgat ctgtagtttt ccacttctta ctattacaaa cccgaaaagc ccattattag ttccatgtga tgcttgtggg 15 tgtttccaat gtaattacat ggttcatcag atcacgcgtc acccgcaccg gctctctcat tgccaaatct gctataaaga ggttgatatc gattgttttt atgtagtcca ttctaaatgt gaactcgagt gggaaatcga gtctgatgaa 20 ggtgatggtt tcataaagca tttttgtcac ggtgctcgag acacagaaaa gcaatgtcga ttttaccatt gcaagaaatg caattactct aaactggatc atgcattgca caatcacact tgttgttcag cttgttcccg agaatccact 25 tgccaagatt ttgttctaga tgttcgatgc agtcacgaac atcccatttt tatctccaca aaagtttgca agaaaagatg tttgggggct atgtgttact catgtgctat cattccagat ctcacccttt cttgtgggga aagcgcggat 30 caattggatc caaaagaatg gttctacaca cattgcatat ttggatcttc tgtctttatg ggaaaggtgc aagtttttcg aaacaatagt
atgtctcatc cagctcaccc ttctcataac 60 atcggttgct ttacatgtgg cgggaaagca 120 tactgcacca cctgcgaggt gacgttccac 180 acacatcctt atcacctcca acatcctctt 240 gttatatcca acatcatccc tgatgcttgt 300 gagaagtatg aattcgtgga tatcgtcccg 360 acttggtgtg caaaagattt caaaggtgat 420 tgcttggatc tctcttgtgc ggcaactctt 480 catcaccact ctctcgtctt cttaccccgg 540 ttggttgacg ggttggaacc aagttatgct 600 aattgcatag acttaccccg agtcataaaa 660 actccttatt gttcatcttt gacttcgtca 720 aagtatgggc aatattcttg ccatctccaa 780 gcaacacatg aaaatgtttg ggatgggaag 840 actgaagata tttcaccttt taggaaccta 900 aaacaccgtt tgaagctcaa gaatcatgat 960 gcgtgcatat atccaattgt ttctcaccaa 1020 ctccacgagg tatgtgctgg cctttctcga 1080 cttatcctat ctccatctcc cggaaagttt 1140 ggtttcagtt acatatgctc taataaaggt 1200 atctcagtgc tagagtattt catccataga 1260 tcctacaaca gtaaagacga gatcctctgc 1320 catctacagt gtacgttatg cgagtttact 1380 gaaatacact acaaatttga caagcatcct 1440 aacacgtatt ggtgcgaggt gtgtgaaaaa 1500 tgtaacaaat gttgcatcac catccacctt 1560 aaacctggtt ccatatttcg tgattattat 1620 aacactcgac aactctgtta tatgtgtcac 1680 I
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1839
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aaccgttgta ccggtttgat cttctacgaa ggctacagaa aatcatagca atcgatcaac tcatagaatg attttttgct gggatgagaa aacgtcgtct catccgtctt ccgaggtaa <210> 8 <211> 612 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 8
Met Gly Phe Glu Asp Gly Pro Arg 5 Asp Gly Leu Glu Pro Ser Tyr Ala Cys Phe Gln Cys Asn Tyr Met Val 195 200 205
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Pro His Arg Leu Ser His Thr Pro Tyr Cys Ser Ser Leu Thr Ser Ser 225 230 235 240
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Gly Ala Arg Asp Thr Glu Lys Gln Cys Arg Ala Cys Ile Tyr Pro Ile 325 330 335
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Cys Ala Ile Ile Pro Asp Glu Ile His Tyr Lys Phe Asp Lys His Pro 465 470 475 480
Leu Thr Leu Ser Cys Gly Glu Ser Ala Asp Asn Thr Tyr Trp Cys Glu
485 490 495
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Asn Arg Cys Thr Gly Leu Ile Phe Tyr Glu Gly Tyr Arg Arg Asn Ala
565 570 575
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<213> Arabidopsis thaliana <400> 9
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15
20
25
30
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Met Glu Asp Leu Thr Ala Ser Val Thr Asn Arg Thr Val Ser Leu Pro 15 10 15
Leu Ser Cys Val Thr Thr Asp Phe Gly Leu Gly Val Ile Tyr Ala Ser 20 25 30
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Asn Gln Ala Ser Gly Ile Trp Leu Ala Leu Leu Gly Pro Asp Lys val
100 105 HO
Gly Lys Lys Lys Val Ala Met Thr Leu Ser Glu val Phe Phe Gly Gly 115 120 125
Lys Val Asn Tyr Ile Cys Val Asp Phe Gly Ala Glu His Cys Ser Leu 130 135 140
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Leu Ser Arg Lys Pro His Ser val val Leu Leu Glu Asn val Glu Lys 165 170 175
Ala Glu Phe Pro Asp Gln Met Arg Leu Ser Glu Ala Val Ser Thr Gly
180 185 190
Lys Ile Arg Asp Leu His Gly Arg Val Ile Ser Met Lys Asn Val Ile 195 200 205
val Val val Thr Ser Gly Ile Ala Lys Asp Asn Ala Thr Asp His val 210 215 220
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Ό5 Ile Leu Ala Ala Ser Trp ser Ser Leu Ser Ser Gly Glu Glu Glu Gly 355 360 365
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385 390 395 400
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Lys Val Asp val Ile Trp 420
25 <210> 11 <211> 1496 <212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana <400> 11
30 tgaaaagttc aaatctttgt tttgaaaact ctcaaagtgt taatcttttg tagctgtttc 60 cattttttga agcagaataa cagagagatt acatgttgtg tgtgtttaga aggaagcttg 120 gttgcctttt ttcaagactt agatgggtta tcaagaaacg ggtgagggct agagttatag 180 tcaggaggtt caggaaagca aggtggagag ctcgaagaaa agagagtccg gaatctgaag 240
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ggaaactagg aaatctgatg tcttcataaa gtttggacac tgattaagaa acaaca 1496 <210> 12 <211> 458 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 12
Met Leu Cys Val Phe Arg Arg Lys Leu Gly Cys Leu Phe Ser Arg Leu 15 10 15
Arg Trp Val Ile Lys Lys Arg Val Arg Ala Arg Val Ile Val Arg Arg
20 25 30
Phe Arg Lys Ala Arg Trp Arg Ala Arg Arg Lys Glu Ser Pro Glu Ser 40 45
Glu Val Ser Ser Ile His Leu Ser Ser Asn Ser Gly Arg His Ile Arg 50 55 60
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Thr Cys Pro Ser Pro Lys Gly Ile Leu Lys Gln Ser Pro Leu His Ser 100 105 110
Ser Ala Val Arg Lys Pro Lys Val Cys Ile Asn Leu Pro Asp Asn Glu 115 120 125
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Cys Leu Pro Ser Cys Trp Trp Asp Gln Glu Ser Phe Asn Gly Tyr Ser 165 170 175
Ser Arg Arg Ser Ile Ala Glu Leu Leu Arg Glu Leu Asp Ala Asp Ile 180 185 190
Leu Ala Leu Gln Asp Val Lys Ala Glu Glu Glu Thr Leu Met Lys Pro 195 200 205
Leu Ser Asp Leu Ala Ser Ala Leu Gly Met Lys Tyr Val Phe Ala Glu 210 215 220
Ser Trp Ala Pro Glu Tyr Gly Asn Ala Ile Leu Ser Lys Trp Pro Ile 225 230 235 240
Lys Lys Trp Arg Val Gln Arg Ile Ala Asp Val Asp Asp Phe Arg Asn 245 250 255
val Leu Lys Val Thr Val Glu Ile Pro Trp Ala Gly Asp val Asn val 260 265 270
Tyr Cys Thr Gln Leu Asp His Leu Asp Glu Asn Trp Arg Met Lys Gln 275 280 285
Ile Asp Ala Ile Thr Arg Gly Asp Glu Ser Pro His Ile Leu Leu Gly 290 295 300
Gly Leu Asn Ser Leu Asp Gly Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Arg Trp Asn 305 ΒΙΟ 315 320
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<210> 13 <211> 1502 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 13
tcctcattca tctctaacaa tggcgtcttc tcgaatcatc atcttctccg ttcttcttct 60 ctccatcttc tcactctcat catctgccca accatctttc cgccccaaag ctctccttct 120 cccagtaaca aaagacccat ctaccctcca gtacacaacc gtcatcaacc aacgcacacc 180 30 tctcgtcccc gcttccgtcg tattcgacct cggtggtcga gaattctggg tcgactgtga 240 ccaaggctac gtctccacca cttaccgctc tcctcgctgc aactccgctg tctgctcacg 300 cgccggctcc atcgcctgcg gcacatgctt ctctcctccg agacctggct gtagtaacaa 360 cacttgcggc gcttttccag ataactccat caccggatgg gcaacctcgg gcgaatttgc 420 tttagacgtt gtgtctatcc agtccactaa cggatccaat ccgggtcggt tcgttaaaat 480 ccccaatcta atattcagtt gcggatcaac gtctcttctt aaaggactcg ctaaaggagc 540 cgttggtatg gctggaatgg gacgtcacaa catcggctta ccgttgcagt tcgccgccgc 600 gtttagcttc aaccgcaaat tcgccgtgtg tcttacttcc ggtagaggcg tcgccttctt 660 cggcaacgga ccttacgttt tcctccccgg gatccagatc tcaaggcttc aaaagacacc 720 gcttctcatc aatccaggga ccactgtttt tgagttttca aaaggcgaga agtcgccgga 780 gtattttatc ggcgtgacgg cgattaagat cgtcgagaaa acacttccaa tcgatccaac 840 gcttttgaag ataaacgcaa gtactggaat aggaggaacc aaaatcagct ccgtcaatcc 900 ttacacggtg ttggagtcat cgatctacaa agcttttacg tcggagttta ttagacaagc 960 agcggcgagg agcatcaaga gagtagcgtc ggtgaaaccg ttcggcgcgt gtttcagcac 1020 gaagaacgtt ggcgtcacgc gcctaggata cgccgtaccg gagattcagc tcgtgcttca 1080 tagcaaagac gtcgtttgga gaatctttgg agctaactcg atggtgagtg tcagtgatga 1140 cgtcatctgt ttgggtttcg ttgacggagg agtcaaccca ggagcctctg tggtgatcgg 1200 agggttccag ttggaggata atttgatcga atttgatttg gcgagtaaca aatttgggtt 1260 tagttccacg ttattgggcc gtcaaactaa ctgcgccaac tttaatttca cttccactgc 1320 ttgattaaat ttagttgatg cactttctcc aaaataaatg tgtttcagta acactaaata 1380 aatgtattgt attatgttta atttgatcag gagccaatgg aatcatttct aagcattttt 1440 atcacttgat ctgaataatt atgtaatgag tgagtatttg attttaaaaa tttaaattta 1500 gc 1502
<210> 14 <211> 434 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 14
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20
25
30
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<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 16 Met Ile Thr Ser Leu Ser Gln Ile Ser Phe Gly Thr Leu Arg Arg Phe 15 10 15
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Ala Asp ser Glu Ile Ser Asp ser Ile Ser Glu Thr Arg Gln Thr
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<213> Arabidopsis thaliana <400> 19
ttctaggcca aaactatctc cacgattcta acaaacaaaa attacagaaa tgtcaatgtc 60 atcgtcctcc tttatctctc tcactttctt cttccttctt ctcgtttctt catcgtcatc 120 ttccgatgac atctctgagc tattcgacga ctggtgccag aaacatggca aaacgtacgg 180 ttcagaagaa gagaggcaac agaggattca aatctttaaa gataatcacg acttcgttac 240 gcaacacaat ctcatcacta acgctactta ctctctctct ctcaatgctt tcgcggatct 300 gactcaccac gagttcaagg cttctcgtct tggtctctct gtttccgctc cgtcggtgat 360 aatggctagt aagggacaga gtctcggtgg tagcgtaaag gttccagatt ctgttgattg 420 gagaaagaag ggagctgtta ctaatgtcaa agatcaagga agctgcgggg catgttggtc 480 gttctcggcg actggagcta tggagggaat taaccagata gtaacaggag atctcatcag 540 cctctctgag caggaactga ttgattgtga caagtcctac aatgctggct gtaatggtgg 600 tctcatggac tatgcttttg aatttgtcat taaaaaccat ggaatagaca cagagaaaga 660 ctatccttat caagaacgtg atggcacctg taagaaggat aagttgaaac aaaaggttgt 720 gacaattgat agctatgctg gtgtaaaatc aaatgatgag aaagcgttaa tggaggctgt 780 agcggctcag ccagttagtg ttggcatctg tggaagcgag agagcgtttc agctatattc 840 tagtggaata ttctctggcc cgtgttcgac atcattggat catgctgtgc tcatagtagg 900 atatggttca cagaatggtg ttgattattg gattgtgaaa aactcatggg gaaaaagttg 960 gggaatggat gggtttatgc acatgcagcg taacactgaa aattcagacg gcgtttgcgg 1020 aatcaacatg cttgcttcat atcccatcaa gacacatcca aacccgcctc caccgtcccc 1080 tcctggccct acaaaatgca accttttcac gtattgttca tctggagaga cttgttgctg 1140 tgcaagagaa ttgtttggtt tatgcttctc atggaaatgc tgcgagatag aatccgctgt 1200 gtgttgcaag gatggtcgtc attgttgtcc acatgattac cctgtttgtg atacaaccag 1260 aagtctctgc cttaagaaaa ctggtaattt cactgcgatc aagcccttct ggaagaagaa 1320 ttcttcaaaa caacttggcc gatttgagga atgggttatg tgagagaagt tttacgcaca 1380 tgttacagaa aattcaaact catccataca aaaacctcgt agattcgatt atctgcgagg 1440 ggattatttg tagctgttat tgagatagat atatacgata tcatcacgga tgtattttta 1500 gtctctcatt tggatgtata caacttctga gtcaataaag gacacttgca ggacaagcac 1560 agtatttgta tctgcaagac acataaagta ataagagtat catctatgta tattatagag 1620 agactaagct tcactgtt 1638 <210> 20
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<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 20
Met Ser Met Ser Ser Ser Ser Phe Ile Ser Leu Thr Phe Phe Phe Leu
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85 90 95
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atgaaatctg caaatttagg tcttttaata gaaatctgaa tttcatgttg ctgaaagaat 60 ttacaacgaa gttgtaaata ctctgagaaa catgtaagtc aggagagagt cccttctatg 120 gtttatattt ggcggctttt aagaagcata cgcatatcaa gtgtttgatg aaattcctca 180 gagaagatga tgtccaccac agtcagatta aacaggttta cgtatctaac gagtactgca 240 aaactgacac gttacttttg ctctcaccat ttagttgacc gatcggaaac ggcgttgcat 300 gaagttattc ggatagtttc ttctccagtt ggtggtctag atgaccttga agaaaacttg 360 aaccaggttt ctgtttctcc atcatcaaac cttgttaccc aagtgattga gtcttgcaag 420 aacgagactt caccgagaag gctgttgagg tttttctcct ggtcgtgtaa aagcttggga 480 tctagtttac acgacaagga attcaactat gtcctaagag ttttggctga gaagaaggat 540 cacacagcta tgcagatact cttatcagat ctcaggaagg agaatcgggc gatggacaag 600 caaacgttta gcattgtcgc tgaaactctg gttaaggttg gtaaggaaga agatgcaata 660 ggtatcttca agatcttgga caaattttct tgcccacaag atggtttcac tgtgacggct 720 attataagcg ctctttgttc cagaggacat gtgaagagag cattgggagt tatgcatcat 780 cacaaggatg taatatccgg gaatgaattg tctgtgtata gaagtctttt attcgggtgg 840 tcggtacaaa gaaacgtgaa ggaagcaaga agagttatac aagatatgaa atcagcaggg 900 attacaccgg atttgttctg tttcaactcg ttgctgacct gcctttgcga aagaaacgtg 960 aatcgaaacc cgtctgggct tgttcctgaa gctttgaata ttatgttgga gatgaggtct 1020 tacaaaatcc aacctacgtc tatgagttac aacattttgc tctcttgttt gggaaggact 1080 aggagggtga gagagtcctg ccagatttta gaacagatga aaagatcggg atgtgatccg 1140 gatacaggga gctattactt cgttgtgagg gtcctgtatt tgacaggaag gtttggtaaa 1200 ggcaaccaaa ttgtggatga gatgatcgag agaggattta gacccgaacg caaattctat 1260 tatgatctga tcggggttct ttgtggggtc gagcgggtta actttgctct tcaattgttt 1320 gagaagatga agagaagctc agtgggtggt tatggtcagg tttatgatct gctcatacca 1380 aaactatgta aaggaggaaa ctttgagaaa ggaagagagc tttgggaaga ggcattgtca 1440 attgatgtta cacttagttg ctccattagt ttgcttgatc catctgtcac agaggttttc 1500 aaacctatga agatgaaaga agaagctgca atggtggatc gtcgtgctct taacttgaag 1560 attcacgcta gaatgaacaa aacaaagcca aaactgaaac taaaaccgaa acgcaggagc 1620 aagacaaaga agaagaatct gcaacattga ttgatttctt ctacccattg ttaagaacat 1680 ctgatatagc aggcaatgta tcacaagaaa ctcaagtaag atgttctgct ttttatgtat 1740 tagtagtaat gcagaagcaa aggacatgag attcttttgt tgttctcttt gtcccattga 1800 ttcttattac gaaaaatatg ggttctgaag aatacaaaac aagagacaag aatattgtga 1860
tc 1862 <210> 22
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<213> Arabidopsis thaliana
<400> 22
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<213> Arabidopsis thaliana
<400> 23
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20
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<213> Arabidopsis thaliana <400> 24
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<213> Arabidopsis thaliana <400> 25
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<213> Arabidopsis thaliana <400> 26
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<213> Arabidopsis thaliana <400> 27
aattagatga agagacatca gatcttatca aaaccctagc tttcggtgtc tctctcgatc 60 ctttagctca atcgaaaact gaatttagga gctgcgatgg gttccagatc tcgtaatgat 120 aatttccagt ccggcgatgg cgctagtcct gggaaaatat tcattggagg attgcacaaa 180 gacacgacta atactgtgtt caataagcac tttggcaagt acggggagat tacagattct 240 gtcattatgc gagatcgaca tactggacaa gacccttctg ttgttgacaa agttatcgaa gagatcaaaa ggactattcc gaaaggtgct aagaagattt tcgttggtgg tataccctca tttgccaagt atgggaacgt ggtggagcac tccagaggtt ttggttttgt aatttttgat aaaggaaaca tgatcgatat ggcagacact aaatctctaa accgttcacc tccttcttac gatagttatg caagttatgg tggaccttac ccaggtccca ttaggtcaca tggaggtcct ggtcgtggca gtgtaggccc tgaatttgga ttaggaggtt accggaatga accacccctt agtgggtttg gtggtgaggg atatggccgt cgtggaggag gggaaggcta tgggggatat tctggtggcc caggtggcag ttatgaagga agcagtagtc gataccatcc gtatgcaagg ctatagaagc ttctctcaca ggttcctcta gagttatcat gtagcgccaa catcaggaag gcttttatta gtcatctttt agttgtgtgt taacttagat tgtgttatgt agactttagc gcacaagaat gatttatcat ttggtagtct gttttcacaa tcatacgaat tagcttaaga ttagagctca agttgaatgc tttatgtggt gaacaaaggt ttgacggcag ttagtgcatg acgtaggttc tagctacaaa ttggaattgt atgtttttga aaatcatcta tacaagcatg gggtaagggc cacggataat tggttagaca gtaatttctc gtcaaaatga tgtactgtat ttttataagt taattgaaat ccaaactctt <210> 28 <211> 358 <212> PRT
cctaggggtt tcggtttcat caccttcgct 300 gatactcatg tcatcaatgg caaacaggtt 360 ggtggcaatc agtcaaagga catcaaaaca 420 acggttacag aagatgaact taaggacttc 480 caggttattc gagaccatga aacaaacagg 540 agcgaagaag tcgtagatga attattgtcc 600 caggtggaga tcaagaaagc tgaaccaaag 660 ggtagtcacc ctagaggtcg ttcttctaac 720 ggaggttttg atggagggta tggtcatcct 780 gctagtagat atgctggggg atatgggtat 840 ggaggttata ataattatgg gggtggtagt 900 ggctattcta gtcgttttgg accctatggg 960 ggaggagaag gagcctattt gggatatcct 1020 ggtgggcctg gttacggcgg tgcatatgaa 1080 gcaggtggtc catatgggag gggttatagt 1140 tagggtcgag gtaatagcaa tcagttggag 1200 gattgttcca attgctctag gtgcattcta 1260 ggttgctaag gacaggaaga gcatcaaaaa 1320 ttacctaatt taagtgttgt cttatctcta 1380 atatttgggc ttggagtttg tttctcactg 1440 tgttagatga tcaattactc gcttagctta 1500 agctctgcaa aatgtgcact catctattct 1560 ctcttgtatc tctgtacatt ttgttgtgct 1620 tgtaagtagg catatttttg tcagctgcat 1680 atgtgtttga aaacgtaaaa tcaattataa 1740 gttatttggt tcttgtttcc ttattttttc 1800 ttggttctaa taatgtgggt tttgttatct 1860 cattaaatga atatcactta ttgtacatgc 1920 ttacgtttt 1959 <213> Arabidopsis thaliana <400> 28
Met Gly Ser Arg Ser Arg Asn Asp Asn Phe Gln Ser Gly Asp Gly Ala 10 15
ser Pro Gly Lys Ile Phe Ile Gly Gly Leu His Lys Asp Thr Thr Asn 25 30
Thr vai Phe Asn Lys His Phe Gly Lys Tyr Gly Glu Ile Thr Asp Ser
40 45
Val Ile Met Arg Asp Arg His Thr Gly Gln Pro Arg Gly Phe Gly Phe 1O 50 55 60
Ile Thr Phe Ala Asp Pro ser vai Val Asp Lys Val Ile Glu Asp Thr 65 70 75 80
His vai lie Asn Gly Lys Gln Val Glu Ile Lys Arg Thr Ile Pro Lys 85 90 95
Gly Ala Gly Gly Asn Gln ser Lys Asp Ile Lys Thr Lys Lys Ile Phe
100 105 110
Val Gly Gly Ile Pro Ser Thr Val Thr Glu Asp Glu Leu Lys Asp Phe
115 120 125
Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Val Val Glu His Gln vai He Arg Asp His
130 135 140
Glu Thr Asn Arg ser Arg Gly Phe Gly Phe Val Ile Phe Asp ser Glu 145 150 155 160
Glu Val Val Asp Glu Leu Leu Ser Lys Gly Asn Met Ile Asp Met Ala
165 170 175
Asp Thr Gln Val Glu Ile Lys Lys Ala Glu Pro Lys Lys Ser Leu Asn
180 185 190
Arg ser Pro Pro Ser Tyr Gly Ser His Pro Arg Gly Arg Ser Ser Asn
195 200 205
Asp Ser Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Pro Tyr Gly Gly Phe Asp Gly Gly
210 215 220
Tyr Gly His Pro Pro Gly Pro Ile Arg ser His Gly Gly Pro Ala Ser 225 230 235 240 Arg Tyr Ala Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Arg Gly Ser Val
245 250
Phe Gly Gly Gly Tyr Asn Asn Tyr Gly Gly Gly Ser Leu 260 265 Arg Asn Glu Pro Pro Leu Gly Tyr Ser ser Arg Phe Gly 275 280 285
Ser Gly Phe Gly Gly Glu Gly Tyr Gly Arg Gly Gly Glu
290 295 300
Leu Gly Tyr Pro Arg Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Gly Gly 305 310 315
Pro Gly Tyr Gly Gly Ala Tyr Glu Ser Gly Gly Pro Gly
325 330
Glu Gly Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Arg Gly Tyr Ser Ser 340 345
Tyr His Pro Tyr Ala Arg 355
<210> 29 <211> 500 <212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana <400> 29
gaaggaaaaa gaaaaaacac aaatggaagg gaaagaggaa gaagcaaaga ggaggatgat 60 gatgaagatc aaacttaagg agacagaagc agacgtaagc caagacgaca ttaaaagaca 120 agaagcttac aacatgtctc cacgcgtacg tcgtggtggt ggtggtggcg gtggctcggt 180 aggtatgagc aagtcatcga gcgtgaggca aaactgttta tgcgcaccaa ctacacaccc 240 tggctccttc aggtgccgtt accaccgtcg taacgctgga ctcgggatgt ctcgtggcac 300 atccgttccc tctaaccttt ccatgttggc tggtggagac tctaattctc ccaagtgatg 360 attaatatat attatgtgtt tcttctcatc aatttaaaat tctcgtatgt gtctgtgtat 420 atacaaaaat gcataagtcg agaaatctct ggatattcac tttgctgttt gcacaaatga 480 aataaattca aatgatcgtg 500
<210> 30 <211> 111
Gly Pro Glu
255 Gly Gly Tyr 270
Pro Tyr Gly
Gly Ala Tyr
Tyr Gly Gly 320
Gly Ser Tyr 335
Ser Ser Arg 350 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 30
Met Glu Gly Lys Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Met Met Met Lys Ile 51 5 10 I5
Lys Leu Lys Glu Thr Glu Ala Asp Val Ser Gln Asp Asp Ile Lys Arg
25 30
Gln Glu Ala Tyr Asn Met Ser Pro Arg Val Arg Arg Gly Gly Gly Gly 40 45
Gly Gly Gly Ser Val Gly Met Ser Lys Ser Ser Ser Val Arg Gln Asn 50 55 60
Cys Leu Cys Ala Pro Thr Thr His Pro Gly Ser Phe Arg Cys Arg Tyr 65 70 75 80
His Arg Arg Asn Ala Gly Leu Gly Met Ser Arg Gly Thr Ser Val Pro 85 90 95
Ser Asn Leu Ser Met Leu Ala Gly Gly Asp Ser Asn Ser Pro Lys 100 105 110
<210> 31 <211> 2328 <212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana <400> 31
atgaagagtt gcagaacctt aatttttgtg gcaataattc tcaacgggct gagtactttc 60 gttgcacatg ccggtgctga gagcaaggtt cacatagttt atttgggtga gaagcagcac 120 gatgatcccg agtttgtcac ggaatctcat catcggatgt tgtggtcact tcttggaagt 180 aaagaggatg cccatagttc aatggtccat agttaccgac atggcttctc gggttttgca 240 gccaagctta ccaagtccca agccaagaag cttgcagatt tacctgaagt tgttcacgtc 300 acgccggata gcttctacca actagataca actcggactt gggactactt aggcctttcc 360 gtcgccaatc ctaaaaatct tctaaatgac actaatatgg gtgaagaagt tatcattggc 420 attgtagact caggagtttg gccagaatct gaagtcttta atgacaatgg gattggacca 480 gtgccaagcc actggaaagg aggctgtgta tcaggagaga atttcacttc ctctcagtgc 540 aacaaaaagc ttataggagc caaatacttc atcaatgggt ttcttgcgac gcacgaaagc 600 ttcaactcca cagaatcact tgactttatt tcccctagag accgtagcgg acatggcacg 660 catgtagcca ccatagcggg tggttcctac gtgcctagca taagctacaa ggggttagct 720 ggagggactg tgagaggtgg ggcaccacgt gctcgtatag cgatgtacaa agcttgttgg 780 tatctagatc gttttgacat aaatacatgt tcatctgctg atatcttgaa agctatggat 840 gaagctatgc atgatggtgt tgatgttttg tccttgtcta tcggctatcg ttttccttac 900 ttcccagaaa ctgatgttcg cgccgtgata gccacgggag cattccatgc tgttttaaag 960 ggtatcacag ttgtttgttc gggaggtaac tctggtcctg cggctcagac tgtgggaaac 1020 acggctccat ggattttgac agtggctgca actactttag accgatcttt tcccacacct 1080 atcacacttg ggaacaataa actgatattg ggtcaagcaa tgtacaccgg tccagaactt 1140 ggcttcacta gcttggttta cccagagaat ccagggaaca gcaacgagag tttttctggt 1200 gactgtgagc ttctattttt caactccaat catacaatgg cggggaaagt cgtgttatgc 1260 ttcacaacat caacacgtta catcactgta tcaagtgctg tgtcttatgt gaaggaagct 1320 ggtggtcttg gcgtaattgt agcaagaaac cccggcgaca atctttcacc atgtgaagat 1380 gattttcctt gtgttgctgt tgactacgag cttgggacag atatactttt atacatacgt 1440 tccacaggat tacctgttgt gaagatacaa ccttctaaaa cacttgttgg acaaccagtg 1500 ggcacaaagg ttgcagattt ctcatcaaga ggacctaatt caattgagcc tgccatcctc 1560 aaaccggata tagcagcacc aggagtgagc atattagcgg ctacaactac caataaaact 1620 ttcaacgacc gaggattcat tttcttgtca gggacatcaa tggcagctcc taccatttca 1680 ggagttgttg ctcttctcaa agctctgcac cgtgattggt ctcctgctgc cattagatca 1740 gccattgtca ccacagcttg gagaacagat ccatttggag agcagatatt tgcagaaggg 1800 tcacctcgga agctagctga tccgtttgac tatggtggag gccttgtgaa tccagagaaa 1860 gctgcaaaac ctggtcttgt atatgacttg ggacttgaag actatgttct ctacatgtgc 1920 tctgttggtt acaacgagac atcaatctct caacttgtcg gaaaaggaac agtttgttcg 1980 aatcccaaac catctgttct tgattttaac ttgccttcca tcacaatccc aaacctcaaa 2040 gatgaagtca ctctcaccag aaccctcact aacgttggac aacttgagtc ggtctataaa 2100 gttgtgatcg agccaccgat aggcattcaa gtgactgtga caccagagac gcttctgttt 2160 aactctacaa ccaaaagggt ctcttttaaa gtcaaagttt cgaccacaca caaaatcaac 2220 acaggttact tctttggaag cttgacttgg agtgactctc tacataatgt gaccattcct 2280 ctctctgtga gaactcaaat tttgcagaac tactacgatg aaaactga 2328
<210> 32 <211> 775 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 32
Met Lys ser Cys Arg Thr Leu Ile Phe Val Ala Ile Ile Leu Asn Gly 10 15
Leu ser Thr Phe Val Ala His Ala Gly Ala Glu Ser Lys vai His Ile
25 30
vai Tyr Leu Gly Glu Lys Gln His Asp Asp Pro Glu Phe Val Thr Glu
40 45
Ser His His Arg Met Leu Trp Ser Leu Leu Gly Ser Lys Glu Asp Ala
50 55 60
His Ser ser Met Val His Ser Tyr Arg His Gly Phe Ser Gly Phe Ala 65 70 75 80
Ala Lys Leu Thr Lys Ser Gln Ala Lys Lys Leu Ala Asp Leu Pro Glu
85 90 95
Val vai His Val Thr Pro Asp Ser Phe Tyr Gln Leu Asp Thr Thr Arg
100 105 110
Thr Trp Asp Tyr Leu Gly Leu Ser vai Ala Asn Pro Lys Asn Leu Leu
115 120 125
Asn Asp Thr Asn Met Gly Glu Glu vai Ile Ile Gly Ile Val Asp Ser
130 135 140
Gly Val Trp Pro Glu Ser Glu Val Phe Asn Asp Asn Gly Ile Gly Pro 145 150 155 160
Val Pro ser His Trp Lys Gly Gly Cys Val ser Gly Glu Asn Phe Thr
165 170 175
Ser ser Gln Cys Asn Lys Lys Leu Ile Gly Ala Lys Tyr Phe Ile Asn
180 185 190
Gly Phe Leu Ala Thr His Glu Ser Phe Asn ser Thr Glu Ser Leu Asp
195 200 205
Phe Ile Ser Pro Arg Asp Arg Ser Gly His Gly Thr His Val Ala Thr
210 215 220
Ile Ala Gly Gly ser Tyr vai Pro Ser Ile Ser Tyr Lys Gly Leu Ala 225 230 235 240 Gly Gly Thr Val Arg Gly Gly Ala Pro Arg Ala Arg Ile Ala Met Tyr
245 250 255
Lys Ala Cys Trp Tyr Leu Asp Arg Phe Asp Ile Asn Thr Cys Ser ser 260 265 270
Ala Asp Ile Leu Lys Ala Met Asp Glu Ala Met His Asp Gly vai Asp 275 280 285
Val Leu Ser Leu Ser Ile Gly Tyr Arg Phe Pro Tyr Phe Pro Glu Thr
290 295 300
Asp vai Arg Ala vai Ile Ala Thr Gly Ala Phe His Ala Val Leu Lys 305 310 315 320
Gly Ile Thr Val Val Cys Ser Gly Gly Asn ser Gly Pro Ala Ala Gln
325 330 335
Thr vai Gly Asn Thr Ala Pro Trp Ile Leu Thr vai Ala Ala Thr Thr 340 345 350
Leu Asp Arg ser Phe Pro Thr Pro Ile Thr Leu Gly Asn Asn Lys Leu 355 360 365
Ile Leu Gly Gln Ala Met Tyr Thr Gly Pro Glu Leu Gly Phe Thr ser
370 375 380
Leu vai Tyr Pro Glu Asn Pro Gly Asn Ser Asn Glu Ser Phe Ser Gly 385 390 395 400
Asp Cys Glu Leu Leu Phe Phe Asn Ser Asn His Thr Met Ala Gly Lys
405 410 415
Val vai Leu Cys Phe Thr Thr Ser Thr Arg Tyr Ile Thr vai Ser Ser
420 425 430
Ala Val Ser Tyr vai Lys Glu Ala Gly Gly Leu Gly vai Ile vai Ala
435 440 445
Arg Asn Pro Gly Asp Asn Leu Ser Pro Cys Glu Asp Asp Phe Pro Cys
450 455 460
Val Ala Val Asp Tyr Glu Leu Gly Thr Asp Ile Leu Leu Tyr Ile Arg 465 470 475 480
Ser Thr Gly Leu Pro Val Val Lys Ile Gln Pro Ser Lys Thr Leu Val 485 490 495 Gly Gln Pro Val Gly Thr Lys Val Ala Asp Phe ser Ser Arg Gly Pro
500 505 510
Asn ser Ile Glu Pro Ala Ile Leu Lys Pro Asp Ile Ala Ala Pro Gly
515 520 525
Val ser Ile Leu Ala Ala Thr Thr Thr Asn Lys Thr Phe Asn Asp Arg
530 535 540
Gly Phe Ile Phe Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro Thr Ile Ser 545 550 555 560
Gly vai vai Ala Leu Leu Lys Ala Leu His Arg Asp Trp Ser Pro Ala
565 570 575
Ala Ile Arg ser Ala Ile Val Thr Thr Ala Trp Arg Thr Asp Pro Phe
580 585 590
Gly Glu Gln Ile Phe Ala Glu Gly Ser Pro Arg Lys Leu Ala Asp Pro
595 600 605
Phe Asp Tyr Gly Gly Gly Leu Val Asn Pro Glu Lys Ala Ala Lys Pro
610 615 620
Gly Leu Val Tyr Asp Leu Gly Leu Glu Asp Tyr Val Leu Tyr Met Cys 625 630 635 640
Ser vai Gly Tyr Asn Glu Thr Ser Ile Ser Gln Leu Val Gly Lys Gly
645 650 655
Thr vai Cys Ser Asn Pro Lys Pro Ser vai Leu Asp Phe Asn Leu Pro
660 665 670
Ser lie Thr Ile Pro Asn Leu Lys Asp Glu Val Thr Leu Thr Arg Thr
675 680 685
Leu Thr Asn Val Gly Gln Leu Glu Ser vai Tyr Lys Val vai Ile Glu
690 695 700
Pro Pro Ile Gly Ile Gln Val Thr Val Thr Pro Glu Thr Leu Leu Phe 705 710 715 720
Asn Ser Thr Thr Lys Arg vai Ser Phe Lys Val Lys Val ser Thr Thr
725 730 735
His Lys Ile Asn Thr Gly Tyr Phe Phe Gly Ser Leu Thr Trp Ser Asp 740 745 750 10
ser Leu His Asn vai Thr Ile Pro Leu ser vai Arg Thr Gln Ile Leu
755 760 765
Gln Asn Tyr Tyr Asp Glu Asn 770 775
<210> 33 <211> 1140 <212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana <400> 33
atggaatatg gagaagaacc ctcgattaaa agatttctaa tgcttcctga tgatttggta 60 tttaactgct tagctcgcgt ctcaagatta cattatccaa ctctctcatt agtctccaaa 120 aaatttcgct ttcttcttgc ttcaaaggag ctttaccaaa cccgaatcct cttaggcgga 180 acggagagtt gtctttacgt gtgcgtacga ctccataccg attctgaaca actacattgg 240 ttcattatct accagggacc aaatagctcc aaaaaagttt tggtcccgat ttcatctccc 300 aattttactt ccgcagccct gccgggtttt gtagtggtcg gtcatgagat atatgccatt 360 ggcggtggat cagagaataa aaacgcttcg ataaatgcaa ctggatcaaa gacttataac 420 gctttgtcta gcgttatggt tatggactct cgttctcaca catggcgtga agctccaagc 480 atgcgggtgg cccgtgtgtt tccatctgct tgtaccctcg atgggagaat atatgttacg 540 ggaggctgcg aaaatctcaa ttcaatgaat tggatggaga tttttgatac gaagactcaa 600 acttgggagt ttttacagat ccctagcgag gaggtatgca aaggctctga gtacttaagc 660 ataagttatc aaagaaccgt ctatgtaggg tctagggaaa aagatgtcac ttacaagatg 720 cataaaggta aatggagagg ggcagacata tgcctgaatc atggatggag tctggatcca 780 tcatcttgtt gtgtgataga gaacgtgttc taccgttgca gtcttgggga tgtacgttgg 840 tatgacctca agaaaagaga atgggcagct ttgaagggtt tggaaggact gcctactttt 900 actaattatt atagaaattt taaatcggcg gatcattgtg gaaaattggc gatttcttgg 960 gaggagtatg tgttagttga tgacgaaaca aagatttggt gtgcggaaat tgcgattcaa 1020 aaacgccaaa atggagaaat ttggggaacg cttgagtggt ttgacaatgt gtttatatcc 1080 agtggaccaa accgtcatgt ggatttatta gtgaatgctc ttactgcaac agtttggtga 1140 <210> 34 <211> 379 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 34
Met Glu Tyr Gly Glu Glu Pro Ser Ile Lys Arg Phe Leu Met Leu Pro 1 5 10 15
Asp Asp Leu vai Phe Asn Cys Leu Ala Arg vai ser Arg Leu His Tyr
25 30
Pro Thr Leu ser Leu Val Ser Lys Lys Phe Arg Phe Leu Leu Ala Ser
40 45
Lys Glu Leu Tyr Gln Thr Arg Ile Leu Leu Gly Gly Thr Glu Ser Cys
50 55 60
Leu Tyr Val Cys Val Arg Leu His Thr Asp Ser Glu Gln Leu His Trp 65 70 75 80
Phe Ile Ile Tyr Gln Gly Pro Asn ser ser Lys Lys Val Leu Val Pro
85 90 95
Ile ser Ser Pro Asn Phe Thr Ser Ala Ala Leu Pro Gly Phe Val Val
100 105 110
vai Gly His Glu Ile Tyr Ala Ile Gly Gly Gly Ser Glu Asn Lys Asn
115 120 125
Ala ser Ile Asn Ala Thr Gly ser Lys Thr Tyr Asn Ala Leu Ser Ser
130 135 140
Val Met vai Met Asp ser Arg ser His Thr Trp Arg Glu Ala Pro Ser 145 150 155 160
Met Arg Val Ala Arg Val Phe Pro Ser Ala Cys Thr Leu Asp Gly Arg
165 170 175
Ile Tyr vai Thr Gly Gly Cys Glu Asn Leu Asn Ser Met Asn Trp Met
180 185 190
Glu Ile Phe Asp Thr Lys Thr Gln Thr Trp Glu Phe Leu Gln Ile Pro
195 200 205
ser Glu Glu vai Cys Lys Gly ser Glu Tyr Leu Ser Ile ser Tyr Gln
210 215 220
Arg Thr vai Tyr Val Gly Ser Arg Glu Lys Asp Val Thr Tyr Lys Met 225 230 235 240
His Lys Gly Lys Trp Arg Gly Ala Asp Ile Cys Leu Asn His Gly Trp 245 250 255
Ser Leu Asp Pro ser Ser Cys Cys vai Ile Glu Asn Val Phe Tyr Arg
260 265 270
Cys Ser Leu Gly Asp vai Arg Trp Tyr Asp Leu Lys Lys Arg Glu Trp
275 280 285
Ala Ala Leu Lys Gly Leu Glu Gly Leu Pro Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr
290 295 300
Arg Asn Phe Lys Ser Ala Asp His Cys Gly Lys Leu Ala Ile Ser Trp 305 BlO 315 320
Glu Glu Tyr Val Leu Val Asp Asp Glu Thr Lys Ile Trp Cys Ala Glu
325 330 335
Ile Ala Ile Gln Lys Arg Gln Asn Gly Glu He Trp Gly Thr Leu Glu
340 345 350
Trp Phe Asp Asn vai Phe Ile Ser ser Gly Pro Asn Arg His Val Asp
355 360 365
Leu Leu vai Asn Ala Leu Thr Ala Thr vai Trp 370 375

Claims (29)

1. Planta transgênica, que compreende um vetor de transforma- ção de plantas que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifi- ca ou é complementar a uma seqüência que codifica um polipeptídeo HIO que compreende a seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 ou um ortólogo ou um parálo- go da mesma, através do que a planta transgênica possui um fenótipo de maior conteúdo de óleo ou um fenótipo de maior qualidade de farinha, em relação às plantas de controle.
2. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, que é selecionada do grupo que consiste em plantas de espécies de Brassica, in- cluindo canola e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, açafroa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e ar- roz.
3. Parte da planta obtida da planta como definida na reivindica- ção 1.
4. Parte da planta de acordo com a reivindicação 3, que é uma semente.
5. Farinha, produto alimentício ou alimento produzido partindo da semente como definida na reivindicação 4.
6. Processo de produção de óleo que compreende o cultivo da planta transgênica como definida na reivindicação 1, e a recuperação do ó- Ieo da dita planta.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o óleo é recuperado de uma semente da planta.
8. Processo de produção de maior conteúdo de óleo em uma planta, o dito processo compreendendo: a) a introdução nas células progenitoras da planta de um vetor de trans- formação de plantas que compreende uma seqüência de nucleotídeos b) que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um poli- peptídeo HIO que compreende a seqüência de aminoácidos que é a- presentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma e c) o cultivo das células progenitoras transformadas para produzir uma planta transgênica, em que a dita seqüência de polinucleotídeo é ex- pressa e a dita planta transgênica exibe um fenótipo de maior conteúdo de óleo em relação às plantas de controle.
9. Planta obtida através de um processo como definido na rei- vindicação 8.
10. Planta de acordo com a reivindicação 9, que é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo cano- Ia e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, açafroa, dende- zeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e arroz.
11. Planta de acordo com a reivindicação 9, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em uma planta crescida partindo das di- tas células progenitoras, uma planta que é a progênie direta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras e uma planta que é a progê- nie indireta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras.
12. Processo de produção de uma planta que possui um maior conteúdo de óleo, que compreende a identificação de uma planta que possui um alelo em seu gene HIO que resulta no maior conteúdo de óleo compara- da a plantas que não possuem o alelo e a produção de progênie da dita planta identificada, em que a progênie gerada herda o alelo e possui o fenó- tipo de alto conteúdo de óleo.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12 que emprega metodologia de gene/QTL candidato.
14. Processo de acordo com a reivindicação 12 que emprega a metodologia de TILLING.
15. Produto alimentício, farinha, grão, alimento ou semente que compreende um polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico que é apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33.
16. Produto alimentício, farinha, grão, alimento ou semente que compreende um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoáci- dos que é apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma.
17. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, em que um fenótipo de maior qualidade de farinha compreende um aumento na e- nergia que pode ser metabolizada disponível na farinha produzida partindo das sementes da planta transgênica, em relação às plantas de controle.
18. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 17, em que um aumento na energia que pode ser metabolizada disponível compre- ende um conteúdo alterado de proteínas e/ou de fibras nas sementes da planta transgênica.
19. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 18, em que o conteúdo de proteínas é aumentado e/ou o conteúdo de fibras é dimi- nuído.
20. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 17, em que um aumento na energia que pode ser metabolizada disponível compre- ende um menor conteúdo de fibras nas sementes da planta transgênica.
21. Processo de produção de farinha, que compreende o cultivo da planta transgênica como definida na reivindicação 1, e a recuperação da farinha da planta, produzindo assim a farinha.
22. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que a fari- nha é produzida partindo de sementes da planta.
23. Processo de produção de um fenótipo de maior qualidade de farinha em uma planta, o dito processo compreendendo: a) a introdução nas células progenitoras da planta de um vetor de transformação de plantas que compreende uma seqüência de nucleotí- deos que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um poli- peptídeo HIO que compreende a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma e b) o cultivo das células progenitoras transformadas para produzir uma planta transgênica, em que a seqüência de nucleotídeos é expressa e a planta transgênica exibe um fenótipo de maior qualidade de farinha em rela- ção às plantas de controle, produzindo assim o fenótipo de maior qualidade de farinha na planta.
24. Planta obtida através de um processo como definido na rei- vindicação 23.
25. Planta de acordo com a reivindicação 24, que é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo cano- Ia e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, açafroa, dende- zeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e arroz.
26. Planta de acordo com a reivindicação 24, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em uma planta crescida partindo das di- tas células progenitoras, uma planta que é a progênie direta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras e uma planta que é a progê- nie indireta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras.
27. Processo de produção de uma planta que possui um fenótipo de maior qualidade de farinha que compreende a identificação de uma plan- ta que possui um alelo em seu gene HIO que resulta na melhor qualidade de farinha, comparada a plantas que não possuem o alelo e a produção da pro- gênie da dita planta identificada, em que a progênie gerada herda o alelo e possui a qualidade de farinha melhorada, gerando assim uma planta que possui um fenótipo de maior qua- Iidade de farinha.
28. Processo de acordo com a reivindicação 27 que emprega a metodologia de gene/QTL candidato.
29. Processo de acordo com a reivindicação 27 que emprega a metodologia de TILLING.
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