CN110684855B - 一种米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents

一种米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量rt-pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量PCR检测方法，步骤是：A、引物设计：上游引物：5'ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG 3'；下游引物：5'AGTTGTCTTCACCGTATGCC 3'；B、反应体系的优化：得到反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 2×SYBR Green Mix 10μL，10pmol/μL上下游引物各1μL，RNase Free ddH2O 7μL；C、阳性标准品的制备：提取米尔伊丽莎白菌样品DNA，为模板，上游引物和下游引物扩增片段长度，对目的片段使用胶回收试剂盒切胶回收后克隆到pMD‑19T载体上，转化导入DH5α，扩大培养后提取重组质粒，测定核酸浓度，转化为拷贝数，为阳性标准品；D、标准曲线的建立：将质粒稀释，以稀释液为模板，按照反应体系进行PCR扩增，建立标准曲线；E、待测样品的检测。解决了其中存在的费时费力、容易污染及检测结果波动性的问题。

Description

一种米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量RT-PCR检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，更具体涉及一种米尔伊丽莎白菌的Real-time PCR检测方法，它适用于米尔伊丽莎白菌的快速分子检测，还可以同时实现该病原菌引起的疾病的早期诊断和病菌的检测鉴定。
背景技术
米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)是一种有氧、非发酵、非运动型、非孢子形成的革兰氏阴性杆菌，可引起蛙类的一种高度接触性传染病，主要表现为歪头、白内障等。该病传播速度快、致死率高、接触传染性强。该病对我国蛙类养殖业造成重大的经济损失。同时，米尔伊丽莎白菌还被认为是一种人畜共患细菌，主要引起免疫力低下人群白内障、囊性纤维症及败血症等。
目前米尔伊丽莎白菌的检测方法相对匮乏，主要为常规PCR，但常规PCR检测技术灵敏度不高，容易受到环境的污染，且需体外培养，耗时较长。随着现代分子生物学的快速发展，实时荧光定量PCR检测技术填补了以上方法的缺陷，SYBR Green I实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入荧光染料，利用荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高及可定量的优点。当前国内外尚未有针对米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量PCR检测方法。本发明的建立可以填补该领域的空白。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是在于提供一种检测米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量PCR检测方法。本发明为一种定量检测米伊丽莎白菌的手段，在国内外未见相关资料报道。与传统PCR检测方法相比，解决了其中存在的费时费力、容易污染及检测结果波动性的问题，方法易行，操作简便。
为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：
一种用于检测米尔伊丽莎白菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测引物，引物的核苷酸序列为：上游引物：5'ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG 3'；下游引物：5'AGTTGTCTTCACCGTATGCC 3'。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立一套可用于检测伊丽莎白菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR。
一种检测米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量PCR检测方法，其步骤是：
1、引物设计：根据本实验室获得的米尔伊丽莎白菌全基因组中DNA错配修复蛋白mutT基因保守区域，利用DNAMAN 6.0软件进行引物设计，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。所述的上游引物：5'ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG 3'；下游引物：5'AGTTGTCTTCACCGTATGCC 3'。
mutT基因序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2、反应体系的优化：优化得到最佳反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 2×SYBRGreen Mix 10μL，10pmol/μL上下游引物各1μL，RNase Free ddH2O 7μL，模板1uL最佳反应条件为：95℃，30s，预变性；95℃，5s，58℃，15s，72℃，20s，共三十九个循环。
3、阳性标准品的制备：提取米尔伊丽莎白菌样品DNA，以其为模板，用特异性引物，上游引物：5'ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG 3'；下游引物：5'AGTTGTCTTCACCGTATGCC 3'。扩增片段长度约182bp。PCR扩增体系为20μL体系，配置如下：2×Es Taq MasterMix 10μL、上/下游引物各1μ、1μL样品DNA，补充灭菌去离子水至终体积为20μL。PCR反应条件为：95℃3min后，进行PCR循环(共进行39个循环)，条件为95℃10s、58℃30s、72℃10s；PCR循环结束后，于72℃延伸5min。对目的片段使用胶回收试剂盒切胶回收后克隆到pMD-19T载体(购自Takara公司)上，转化导入DH5α(购自上海维地生物技术有限公司)，扩大培养后提取重组质粒，测定核酸浓度，转化为拷贝数，将其作为阳性标准品备用。
4、标准曲线的建立：将步骤3制备的标准质粒作10倍梯度稀释，以稀释液为模板，按照优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标,以Ct值为纵坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线。所述的线性回归方程是：y＝-3.0908x+38.391.
5、待测样品的检测：提取待测样品DNA，扩增体系及程序同步骤2，若检测样品无特异性扩增曲线或Ct值大于31或Tm值不在81－82℃范围内，无Ct值并无扩增曲线，样品判定为阴性；若检测样品出现典型扩增曲线，且Ct值小于等于31且Tm值在81－82℃内，则将上步所得的Ct值带入本发明构建的标准曲线中，计算得到检测样品中米尔伊丽莎白菌的数量，Ct值≤31且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
最关键的步骤是：设计特异性引物以及建立标准曲线。
主要解决的技术问题是：1、解决了PCR检测灵敏度低的问题；2、能够对米尔伊丽莎白菌定量进行检测；3、检测速度快，无需测序。
达到的技术效果是：能够快速灵敏低成本的定量检测米尔伊丽莎白菌。
现在只有16s测序用于米尔伊丽莎白菌的检测，耗费时间长，费用较高灵敏度低，本发明的技术较现有技术比，经济快捷灵敏度高。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明根据根据已有的米尔伊丽莎白菌的DNA错配修复蛋白mutT基因序列，设计特异性引物，于国内外首先建立米尔伊丽莎白菌mutT基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法，有如下几点：
1、定量准确、诊断速度快；
2、检测灵敏度高、特异性好、重复性好；
3、步骤简单，无需细菌接种培养；
4、实用性好：本发明的米尔伊丽莎白菌实时荧光定量RT-PCR检测方法，定量准确，可实现米尔伊丽莎白菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，为疾病的早期预防奠定技术基础。
附图说明
图1为一种米尔伊丽莎白菌SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的敏感性扩增曲线示意图；质粒浓度为1.07×1010CFU/μL～1.07×102CFU/μL、RNase Free ddH2O。
图2为一种米尔伊丽莎白菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的标准曲线示意图；
绘制得到的标准曲线的斜率为-3.0908，截距为38.391，得到的回归方程为y＝-3.0908x+38.391,相关系数R2＝0.9972。
图3为一种米尔伊丽莎白菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的特异性检测结果图。
其中：1为Elizabethkingia miricola,，实验对照为：按蚊伊丽莎白菌、脑膜败血伊丽莎白菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、鮰氏爱德华氏菌、迟缓爱德华氏菌、金黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、约氏不动杆菌、鲁氏耶尔森菌。
具体实施方式
实施例1：(米尔伊丽莎白菌SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立)
1、菌株：
米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)、按蚊伊丽莎白菌(Elizabethkiaanophelis)、脑膜败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鮰氏爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella trade)、金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundi)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)。以上菌株由实验室保存(全部都是现有或购买，一般实验室都能接种)。
2、仪器与试剂：
荧光定量PCR仪购自Bio-rad公司；SYBR Green I Premix Ex Taq 2×、DL 2000Maker购自有CWBIO限公司；荧光定量96孔板、RNase Free ddH2O。
一种检测米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量PCR检测方法，其步骤是：
A、引物设计：
根据本实验室获得的米尔伊丽莎白菌全基因组中DNA错配修复蛋白mutT基因保守区域设计特异性引物：
上游引物：5'ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG 3'
下游引物：5'AGTTGTCTTCACCGTATGCC 3'。
mutT基因序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
B、阳性标准品的制备：
提取米尔伊丽莎白菌样品DNA，以其为模板，用特异性引物，上游引物：5'ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG 3'；下游引物：5'AGTTGTCTTCACCGTATGCC 3'。扩增片段长度约182bp。PCR扩增体系为20μL体系，配置如下：2×Es Taq MasterMix 10μL、上/下游引物各1μ、μL提取核酸DNA，补充灭菌去离子水至终体积为20μL。PCR反应条件为：95℃3min后，进行PCR循环(共进行39个循环)，条件为95℃10s、58℃30s、72℃10s；PCR循环结束后，于72℃延伸5min。对目的片段使用胶回收试剂盒切胶回收后克隆到pMD-19T载体(购自Takara公司)上，转化导入DH5α(购自上海维地生物技术有限公司)，扩大培养后提取重组质粒，测定核酸浓度，转化为拷贝数，将其作为阳性标准品备用。
C、反应条件的优化：
采用20μL反应体系SYBR Premix Ex Taq 2×SYBR Green Mix 10μL，PCR上游引物(10pmol/μL)1.0μL,PCR下游引物(10pmol/μL)1.0μL，倍比稀释后的阳性标准品1μL，RNaseFree ddH2O 7μL，以出现最小的Ct值以及在溶解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，分别对退火温度(50～60℃)和引物浓度(0.2～1.0pmol/L)进行优化。
D、标准曲线的建立：
所述步骤B中获得的质粒为模板，对质粒以梯度进行稀释，根据已优化的条件进行实时荧光定量PCR扩增实验。以Ct值为纵坐标，标准质粒拷贝数为横坐标，建立标准曲线(如图2)。标准曲线的相关系数为R2＝0.9972，所获的标准曲线的斜率为-3.0908，截距为38.391，得到的回归方程为y＝-3.0908x+38.391。根据测得的Ct值，可以计算样品中米尔伊丽莎白菌的拷贝数。
E、特异性检测：
根据荧光定量PCR优化的条件，分别检测米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingiamiricola)、按蚊伊丽莎白菌(Elizabethkia anophelis)、脑膜败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鮰氏爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella trade)、金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundi)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)，对该方法的特异性进行评价，结果显示，只有米尔伊丽莎白菌出现典型的S型扩增曲线，其他实验对照菌株均未出现扩增曲线，且只有表明所建立的检测方法具有良好的特异性(如图3)。
F、灵敏度检测：
将阳性标准品以10倍倍比稀释10个梯度，以各浓度梯度的重组质粒DNA为模板进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，评价其灵敏度。如图2该方法对米尔伊丽莎白菌的最低检测浓度为1.07×103CFU/μL。
G、重复性评估：
将阳性标准品A-B拷贝分别设置3个重复管，反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 2×SYBR Green Mix 10μL，10pmol/μL上下游引物各1μL，RNase Free ddH2O 7μL，模板1uL反应条件为：95℃，30s，预变性；95℃，5s，58℃，15s，72℃，20s，共三十九个循环。分别进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，计算组内及组件变异系数，评价其重复性。结果显示，组内和组间变异系数(CV)均小于1.5％(请见表1，荧光定量RT-PCR的重复性分析)。表示所建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法稳定，具有良好的重复性。
表1荧光定量RT-PCR的重复性分析
Figure BDA0002241206080000051
H、临床样品检测应用：
对临床样品20份进行荧光定量PCR检测与分析。利用试剂盒提取DNA后，按照优化后的条件进行荧光定量PCR检测。同时对20份样品扩大培养后用常规PCR检测方法(引物和条件如“4、阳性标准品的制备”所示)进行检测，计算两种检测方法之间的符合率。结果显示，符合率为100％(请见表2：20份临床样品的检测结果)。证明本发明实时荧光定量PCR检测方法，能准检测米尔伊丽莎白菌，可检测的最低模板浓度为1.07×103CFU/μL。
表2：20份临床样品的检测结果
Figure BDA0002241206080000061
通过上述技术措施：实现了对米尔伊丽莎白菌进行特异、快速、灵敏、高通量的检测，克服了传统鉴定方法培养鉴定时间长、灵敏度低的缺陷。
综上所述，本发明中中的荧光定量PCR检测方法特异性好，具有快速、准确、灵敏的特点，可以达到特异性检测米尔伊丽莎白菌的目的。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，依本发明申请专利范围所做的改进与变型，也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量RT-PCR检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaacaac ttcatactgc tggattaatt accttaaaag acaagaagct gttgctggct 60
ttcagcaaga ataaacaagc ctggtatctc cctggcggga aaatagatgc aggcgaaagt 120
ccggaagaag ctttgatccg tgaaatacat gaggaactta atctggtttt aaatgcagaa 180
gaattaaact ttttcaccca tatttcggct ccggcatacg gtgaagacaa cttactaatg 240
gaacaggact gctttttggt tcatttgaat aaaacaatac atccaagtgc tgaaatcgag 300
gctgttaaat attttagcct ggaagaatat aaaaaagaaa atattcaggt agccggtgtt 360
ttaatagcct ttgctgagct tgaaaaacaa gagcttattt aa 402
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accttaaaag acaagaagct g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agttgtcttc accgtatgcc 20

Claims (2)

1.用于检测米尔伊丽莎白菌的引物对，其特征在于，上游引物为5'-ACCTTAAAAGACAAG
AAGCTG-3'，下游引物为5'-AGTTGTCTTCACCGTATGCC-3'。
2.用于非疾病诊断目的的米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量PCR检测方法，其步骤是：
A、引物设计：米尔伊丽莎白菌全基因组中DNA错配修复蛋白mutT基因保守区域，利用DNAMAN 6.0 软件进行引物设计，上游引物：5'- ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG
-3'；下游引物：5'-AGTTGTCTTCACCGTATGCC-3'；mutT基因序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸；
B、反应体系的优化：得到反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 2×SYBR Green Mix 10µL，10 pmol/µL上下游引物各 1µL，RNase Free ddH2O 7µL，模板1µL；反应条件为：95oC，30s，预变性；95oC，5s ，58oC，15s，72oC，20s，共三十九个循环；
C、阳性标准品的制备：提取米尔伊丽莎白菌样品DNA，以其为模板，用特异性引物，上游引物：5'-ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG-3'；下游引物：5'-AGTTGTCTTCACCGTATGCC -3'，扩增片段长度182bp，PCR扩增体系为20µL体系，配置如下：2×Es Taq MasterMix 10µL、上/下游引物各1µL、1µL样品DNA，补充灭菌去离子水至终体积为20µL，PCR反应条件为：95 ℃ 3min后，进行PCR循环：共进行39个循环，条件为95 ℃ 10s、58 ℃ 30s、72℃ 10 s；PCR循环结束后，于72 ℃延伸5 min，对目的片段使用胶回收试剂盒切胶回收后克隆到pMD-19T载体上，转化导入DH5α，扩大培养后提取重组质粒，测定核酸浓度，转化为拷贝数，作为阳性标准品备用；
D、标准曲线的建立：将步骤C制备的标准质粒作10倍梯度稀释，以稀释液为模板，按照步骤B所述反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线：所述的线性回归方程是：y= -3.0908x+38.391；
E、待测样品的检测：提取待测样品DNA，扩增体系及程序同步骤B，检测样品无特异性扩增曲线或Ct值大于31或Tm值不在81－82 oC范围内，无Ct值并无扩增曲线，样品判定为阴性；检测样品出现典型扩增曲线，且Ct值小于或等于31且Tm值在81－82 oC内，所得的Ct值带入构建的标准曲线中，计算得到检测样品中米尔伊丽莎白菌的数量，Ct值⩽31且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
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