CN108138136A - 制造肾前体细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供通过对肾前体细胞特异性的细胞表面抗原标志进行鉴定而从由多能干细胞分化诱导成肾前体细胞的细胞群中获取、制造纯度高的肾前体细胞的方法。一种制造由多能干细胞分化诱导而成的肾前体细胞的方法，其包括：(i)将多能干细胞在诱导向肾前体细胞的分化的条件下进行培养的步骤；和(ii)使用选自由CD9(‑)、CD55(‑)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(‑)组成的组中的至少一种细胞表面标志从步骤(i)中得到的细胞中筛选细胞群的步骤。

Description

制造肾前体细胞的方法
技术领域
本发明涉及使用用于从由多能干细胞分化而成的包含肾前体细胞的细胞群中获取、制造高纯度的肾前体细胞群的细胞表面标志的、制造肾前体细胞的方法。
背景技术
肾脏是为了将生物体内的因代谢活动产生的有害物质和废物通过过滤从血中除去、实现身体健康的维持而发挥功能的重要器官之一。作为肾脏功能受损的严重疾病，有肾衰竭，但尚未建立有效的药物疗法，现状是通过肾移植、人工透析来进行治疗。但是，肾移植存在严重的供体器官不足的问题，另一方面，人工透析存在不仅发生并发症、而且医疗费负担庞大的问题，期望开发出新的治疗方法。
另一方面，迄今为止报道了胚胎干细胞(Embryonic stem cell；ES细胞)、通过向体细胞中导入重编程因子而得到的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPS细胞)等具有多能性的细胞(专利文献1和2)。目前，正在研究对由这些多能干细胞分化诱导而成的肾细胞进行移植的、肾衰竭的治疗方法的开发。此外，使用来源于这些多能干细胞的均一的肾细胞来进行治疗药的开发也进入了视野。
已知哺乳类的肾脏是经过前肾、中肾、后肾这三个阶段而形成的，其中后肾产生于中段中胚层的后方区域。在迄今为止的研究中，对从小鼠多能干细胞向中段中胚层分化诱导的方法进行了研究(非专利文献1)，确认了奇跳相关转录因子1(Odd-Skipped RelatedTranscription Factor 1，OSR1)作为中段中胚层的特征性标志。另外，作为肾前体细胞的特征性因子之一，已知有SIX同源异形盒2(SIX Homeobox 2，SIX2)(非专利文献2和3)。使用细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome；BAC)载体，通过与内源性的OSR1等位基因的同源重组，导入绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein；GFP)基因而制作人iPS细胞(OSR1-GFP报告基因人iPS细胞)，使用该细胞进行研究，由此成功地使用激活素A(Activin A)、Wnt蛋白、骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein(BMP))和各种低分子化合物进行了由人多能干细胞向中段中胚层的分化诱导(非专利文献3、专利文献3)。接着，使用与Mae等人(非专利文献3)同样的同源重组方法，制作在OSR1-GFP报告基因人iPS细胞株的SIX2基因位点导入有红色荧光蛋白tdTomato的OSR1-GFP&SIX2-tdTomato报告基因人iPS细胞株，使用该细胞进行研究，由此成功地构建了由人多能干细胞向肾前体细胞的分化诱导系统，并确认了由该方法得到的肾前体细胞在急性肾损伤模型中的药效(非专利文献4、专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：US5,843,780
专利文献2：WO2007/069666
专利文献3：WO2012/011610
专利文献4：WO2014/200115
非专利文献
非专利文献1：Mae S，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(2010)，393：877-882
非专利文献2：Kobayashi A，et al.，Cell Stem Cell，(2008)，3：169-181
非专利文献3：Mae S，et al.，Nat.Commun.，(2013)，4：1367
非专利文献4：Toyohara T，et al.，Stem Cells Transl.Med.，(2015)，4：980-992
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供通过对肾前体细胞特异性的细胞表面标志进行鉴定而从由多能干细胞分化诱导成肾前体细胞的细胞群中获取、制造纯度高的肾前体细胞群的方法。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果首次发现，通过使用选自CD9阴性(CD9(-))、CD55阴性(CD55(-))、CD106阳性(CD106(+))、CD140a阳性(CD140a(+))、CD140b阳性(CD140b(+))、CD165阳性(CD165(+))、CD271阳性(CD271(+))和CD326阴性(CD326(-))中的细胞表面标志，能够从包含肾前体细胞的细胞群中获取、制造纯度高的肾前体细胞群。本发明是基于这样的见解而完成的。
即，本发明具有以下特征。
[1]一种制造由多能干细胞分化诱导而成的肾前体细胞的方法，其包括：
(i)将多能干细胞在诱导向肾前体细胞的分化的条件下进行培养的步骤；和
(ii)使用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志，从步骤(i)中得到的细胞中筛选细胞群的步骤。
[2]如[1]所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用至少两种细胞表面标志来筛选细胞群。
[3]如[1]所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用至少三种细胞表面标志来筛选细胞群。
[4]如[1]所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用至少四种细胞表面标志来筛选细胞群。
[5]如[1]所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用选自由CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)组成的组中的至少两种细胞表面标志。
[6]如[5]所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用至少三种细胞表面标志来筛选细胞群。
[7]如[4]所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)作为细胞表面标志。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为诱导多能干(iPS)细胞。
[9]如[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为人iPS细胞。
[10]一种肾前体细胞群，其是使用[1]～[9]中任一项所述的方法制造的。
[11]一种筛选细胞群的方法，使用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志，从包含肾前体细胞的细胞群中筛选细胞群。
[12]如[11]所述的方法，其中，使用至少两种细胞表面标志来筛选细胞群。
[13]如[11]所述的方法，其中，使用至少三种细胞表面标志来筛选细胞群。
[14]如[11]所述的方法，其中，使用至少四种细胞表面标志来筛选细胞群。
[15]如[11]所述的方法，其中，使用选自由CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)组成的组中的至少两种细胞表面标志。
[16]如[15]所述的方法，其中，使用至少三种细胞表面标志来筛选细胞群。
[17]如[11]所述的方法，其中，使用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)作为细胞表面标志。
[18]如[11]～[17]中任一项所述的方法，其中，肾前体细胞为由多能干细胞分化诱导而成的肾前体细胞。
[19]如[11]～[17]中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为诱导多能干(iPS)细胞。
[20]如[11]～[17]中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为人iPS细胞。
[21]一种细胞群，其是利用[11]～[20]中任一项所述的方法得到的。
发明效果
根据本发明，首次能够通过使用细胞表面标志从由多能干细胞(例如iPS细胞)分化诱导成肾前体细胞的细胞群中获取、制造高纯度的肾前体细胞群。另外，利用本发明的方法获取的肾前体细胞群能够用于肾衰竭等肾疾病的再生医疗用途。
附图说明
图1示出实施例1中的利用流式细胞仪测定CD9、CD55、CD106、CD140a、CD140b、CD165、CD271和CD326与OSR1和SIX2的表达而得到的结果的二维展开图。纵轴代表针对各细胞表面标志的抗体的荧光强度，横轴代表代替OSR1或SIX2蛋白的表达的荧光报告蛋白的荧光强度。
图2示出实施例2中的从人iPS细胞来源分化细胞群中分选CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞的结果。图2A是用CD9、CD140a、CD140b、CD271对人iPS细胞来源分化细胞群进行染色时的散点图(サイトグラム図)，纵轴和横轴代表针对各细胞表面标志的抗体的荧光强度。P6表示CD9(-)且CD140a(+)的细胞群，P4表示CD9(-)且CD140b(+)的细胞群，P3表示CD9(-)且CD271(+)的细胞群。分取出图2A中所示的P3且P4且P6的细胞群。图2B的二维展开图左起是利用流式细胞仪对于分化诱导前的人iPS细胞、人iPS细胞来源分化细胞群、从人iPS细胞来源分化细胞群中分选后的P3且P4且P6的细胞群测定OSR1和SIX2的表达而得到的图，纵轴和横轴代表代替OSR1或SIX2蛋白的表达的荧光报告蛋白的荧光强度。以百分率表示的数值表示OSR1、SIX2双阳性细胞(OSR1(+)SIX2(+)细胞；右上分区)、OSR1阳性且SIX2阴性细胞(OSR1(+)SIX2(-)细胞；左上分区)、OSR1阴性且SIX2阳性细胞(OSR1(-)SIX2(+)细胞；右下分区)以及OSR1、SIX2双阴性细胞(OSR1(-)SIX2(-)细胞；左下分区)的比例。
图3示出实施例3中的由从人iPS细胞来源分化细胞群中分取的CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞制作近端肾小管样结构的一例。图3A示出利用与非专利文献4同样的方法进行的、在细胞团形成后与Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞共培养的向近端肾小管的分化方法。使用添加有BMP7和Rho激酶抑制剂Y-27632(和光，253-00513)的小鼠输尿管芽细胞(ureteric bud cells(UBC))驯化培养基，形成1×105个细胞的细胞团。次日，置换成添加有BMP7、Y-27632和GSK3β抑制剂BIO(和光，029-16241)的小鼠输尿管芽细胞驯化培养基，再进行一天的培养后，载置于丝裂霉素C处理完毕的Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞上进行共培养，进行向近端肾小管的分化诱导。图3B示出将CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞的细胞团与Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞共培养后的显微镜图像(左上)、免疫染色图像(右上、左下)和它们的重叠图像(右下)。另外，用箭头的放大图示出翅荚百脉根凝集素(LotusTetragonolobus Lectin，LTL)表达细胞。图中，LTL表示近端肾小管的标志，Hoechst33342表示细胞核染色剂，另外比例尺表示100μm。
图4以百分率示出实施例4中的由阴性选择标志CD9和三种阳性选择标志的网罗性组合得到的OSR1(+)SIX2(+)细胞、OSR1(+)SIX2(-)细胞、OSR1(-)SIX2(+)细胞和OSR1(-)SIX2(-)细胞的比例。另外，还一并示出了使用CD55或CD326代替阴性选择标志CD9时的OSR1(+)SIX2(+)细胞、OSR1(+)SIX2(-)细胞、OSR1(-)SIX2(+)细胞和OSR1(-)SIX2(-)细胞的比例。
图5以百分率示出实施例5中的利用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)的任意的细胞表面标志的组合从原细胞群中回收的细胞群中的OSR1(+)SIX2(+)细胞的比例、利用该细胞表面标志的组合规定的细胞在原细胞群中的比例、以及利用该细胞表面标志的组合回收的OSR1(+)SIX2(+)细胞数/原细胞数。
图6示出将实施例6中的以CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)为指标从人iPS细胞201B7株来源分化细胞群中分选出的细胞群分化诱导成近端肾小管样结构的结果。图6A示出相对于OSR1(利用GFP进行检测)、SIX2(利用tdTomato进行检测)和各细胞表面标志的荧光强度的细胞数的直方图。图6B是利用流式细胞仪测定iPS细胞201B7株来源分化细胞群的CD9、CD140a、CD140b或CD271的表达而得到的结果的二维展开图。纵轴和横轴代表针对各细胞表面标志的抗体的荧光强度。关于CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞，通过对设门(P4且P2且P3)划分进行分选而分取出细胞。图6C示出将分选后的CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞的细胞团与Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞共培养后的显微镜图像和免疫染色图像的重叠图像。图中，LTL表示近端肾小管的标志(框内)，比例尺表示100μm。
图7示出实施例7中的iPS细胞201B7株来源分化细胞群的利用抗SIX2抗体得到的免疫染色的结果。图7A示出分选前的细胞群的免疫染色图像，图7B示出以CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)为指标分选出的细胞群的免疫染色图像。图中，白色箭头表示SIX2阳性细胞，透明箭头表示SIX2阴性细胞。比例尺表示100μm。A、B均是左侧照片表示明视野图像、中央照片表示利用抗SIX2抗体得到的染色图像、右侧照片表示利用Hoechst33342得到的核染色图像。
具体实施方式
以下详细地对本发明进行说明。
本发明中，提供使用细胞表面标志从由多能干细胞分化诱导而成的肾前体细胞群中获取、制造高纯度的肾前体细胞群的方法。具体而言，本发明包含以下的方法(以下也称为“本发明的制造方法”)。
一种制造由多能干细胞分化诱导而成的肾前体细胞群的方法，其包括：
(i)将多能干细胞在诱导向肾前体细胞的分化的条件下进行培养的步骤；和
(ii)使用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志，从步骤(i)中得到的细胞中筛选细胞群的步骤。
另外，本发明中，还提供使用细胞表面标志从包含肾前体细胞的细胞群中筛选细胞群的方法。具体而言，本发明中包含以下的方法(以下也称为“本发明的筛选方法”)。
一种筛选细胞群的方法，使用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志，从包含肾前体细胞的细胞群中筛选细胞群。
本发明包含利用本发明的制造方法制造的肾前体细胞群。
另外，本发明包含利用本发明的筛选方法得到的细胞群。
以下，对本发明进行说明。
1.步骤(i)：将多能干细胞在诱导向肾前体细胞群的分化的条件下进行培养的步骤
作为本步骤中可使用的、诱导从多能干细胞向肾前体细胞群的分化的方法，可以列举非专利文献4和专利文献4中记载的方法，但可以使用不限定于此的任意方法。由于通过步骤(ii)中的筛选能够将肾前体细胞富集，因此在步骤(i)中，只要得到包含肾前体细胞的细胞群即可，该步骤(i)中得到的细胞群所含的肾前体细胞的含有率并不特别地视为问题，可以例示5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上或30％以上。
由本发明制造的肾前体细胞以肾前体细胞得到富集的细胞群的形式制造，所得到的细胞群中含有的肾前体细胞的含有率没有特别限定，可以例示50％以上、60％以上、65％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上或75％以上。因此，本发明中，“筛选”是指得到含有50％以上、60％以上、65％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上或75％以上的所期望的细胞的细胞群。
本发明中，肾前体细胞是指其一部分变化为肾小管的细胞，是OSR1和SIX2双阳性(OSR1(+)SIX2(+))的细胞。OSR1可以例示由人OSR1基因(NCBI登录号：NM_145260.2)编码的蛋白质，SIX2可以例示由人SIX2基因(NCBI登录号：NM_016932.4)编码的蛋白质。OSR1阳性是指OSR1基因的转录活性高，可以例示：能够利用公知的方法检测出OSR1的mRNA；能够利用公知的方法检测出OSR1的蛋白质(实施例1、2和4～6)；或者能够确认到与OSR1基因的启动子功能性连接的标志基因的表达；等等。同样地，SIX2阳性是指SIX2基因的转录活性高，可以例示：能够利用公知的方法检测出SIX2的mRNA；能够利用公知的方法检测出SIX2的蛋白质(实施例1、2和4～6)；或者能够确认到与SIX2基因的启动子功能性连接的标志基因的表达；等等。本发明中，标志基因可以例示编码荧光蛋白的基因，但不限定于此。
本发明中，多能干细胞是指具有能够分化为生物体内存在的多种性质、形态各异的细胞的多能性且还兼具增殖能力的干细胞，包含能够诱导成肾前体细胞的任意的细胞。对于多能干细胞没有特别限定，包括例如胚胎干细胞(ES细胞)、使用核移植技术制作的胚胎干细胞(Nuclear transfer embryonic stem cell；ntES细胞)、种系干细胞(Germlinestem cell；GS细胞)、胚胎生殖细胞(Embryonic germ cell；EG细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、培养成纤维细胞或骨髓干细胞来源的多能细胞(Multi-lineage differentiatingstress enduring cell(多系分化持续应激细胞)；Muse细胞)等。从在制造步骤中能够不破坏胚胎、卵子等而获取的观点出发，优选的多能干细胞为iPS细胞，更优选为人iPS细胞。
iPS细胞的制造方法是本领域中公知的，可以通过向任意的体细胞中导入重编程因子而制造。在此，重编程因子可以例示例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-联蛋白(beta-catenin)、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等的基因或基因产物，这些重编程因子可以单独使用，也可以组合使用。作为重编程因子的组合，可以例示WO2007/069666；WO2008/118820；WO2009/007852；WO2009/032194；WO2009/058413；WO2009/057831；WO2009/075119；WO2009/079007；WO2009/091659；WO2009/101084；WO2009/101407；WO2009/102983；WO2009/114949；WO2009/117439；WO2009/126250；WO2009/126251；WO2009/126655；WO2009/157593；WO2010/009015；WO2010/033906；WO2010/033920；WO2010/042800；WO2010/050626；WO 2010/056831；WO2010/068955；WO2010/098419；WO2010/102267；WO 2010/111409；WO 2010/111422；WO2010/115050；WO2010/124290；WO2010/147395；WO2010/147612；Huangfu D，et al.，Nat.Biotechnol.，(2008)，26：795-797；Shi Y，et al.，CellStem Cell，(2008)，2：525-528；Eminli S，et al.，Stem Cells，(2008)，26：2467-2474；Huangfu D，et al.，Nat.Biotechnol.，(2008)，26：1269-1275；Shi Y，et al.，Cell StemCell，(2008)，3：568-574；Zhao Y，et al.，Cell Stem Cell，(2008)，3：475-479；Marson A，Cell Stem Cell，(2008)，3：132-135；Feng B，et al.，Nat.Cell Biol.，(2009)，11：197-203；R.L.Judson et al.，Nat.Biotechnol.，(2009)，27：459-461；Lyssiotis CA，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(2009)，106：8912-8917；Kim JB，et al.，Nature，(2009)，461：649-643；Ichida JK，et al.，Cell Stem Cell.，(2009)，5：491-503；Heng JC，et al.，CellStem Cell，(2010)，6：167-174；Han J，et al.，Nature，(2010)，463：1096-1100；Mali P，etal.，Stem Cells，(2010)，28：713-720；Maekawa M，et al.，Nature，(2011)，474：225-229.中记载的组合。
体细胞中非限定性地包含新生儿(仔)的体细胞和健康人或患者的体细胞中的任意一种，另外，还包含这些体细胞来源的原代培养细胞、传代细胞和细胞系中的任意一种。具体而言，体细胞可以例示例如(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(成体干细胞)、(2)组织前体细胞、(3)血液细胞(外周血细胞、脐带血细胞等)、肌肉细胞、皮肤细胞、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰细胞、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞等存在于器官、组织中的分化细胞等。
另外，从在将iPS细胞作为移植用细胞的材料使用的情况下不引起排斥反应的观点出发，期望使用作为移植对象的个体的人白细胞抗原(HLA)基因型相同或实质上相同的体细胞。在此，“实质上相同”是指，HLA基因型一致的程度达到能够对移植的细胞利用免疫抑制剂抑制免疫反应的程度，例如为具有HLA-A、HLA-B和HLA-DR这三个基因座一致的HLA型或者除这些之外再加上HLA-C这四个基因座一致的HLA型的体细胞。
在一个实施方式中，作为步骤(i)，使用非专利文献4和专利文献4中记载的诱导由多能干细胞向肾前体细胞群的分化的方法，具体而言，包括以下的步骤(i-1)～(i-3)。
(i-1)将多能干细胞在包含选自激活素A、GSK-3β抑制剂和维甲酸衍生物中的一种以上的物质的培养基中进行培养的步骤；
(i-2)将步骤(i-1)中得到的细胞群在包含选自BMP7、GSK-3β抑制剂和维甲酸衍生物中的一种以上的物质的培养基中进行培养的步骤；和
(i-3)将步骤(i-2)中得到的细胞群在包含TGFβ信号刺激剂和BMP抑制剂的培养基中进行培养的步骤。
以下，对各步骤(i-1)～(i-3)进行说明。
(i-1)将多能干细胞在包含选自激活素A、GSK-3β抑制剂和维甲酸衍生物中的一种以上的物质的培养基中进行培养的步骤
在本步骤中，可以利用该领域中公知的任意方法分离多能干细胞，通过悬浮培养或贴壁培养进行培养。作为多能干细胞的分离方法，可以列举例如机械性分离、使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液(例如，Accutase(注册商标)和Accumax(InnovativeCell Technologies，Inc))或仅具有胶原酶活性的分离溶液的分离。优选为使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液进行解离、再利用机械方法细细地分散为单一细胞的方法。作为本步骤中使用的人多能干细胞，优选使用相对于所使用的培养皿培养至达到80％汇合为止的集落。
本发明的方法中使用的悬浮培养是指将细胞在不粘附于培养皿的状态下进行培养，没有特别限定，可以使用没有出于提高与细胞的粘附性的目的人为地进行处理(例如，利用细胞外基质等进行的包被处理)的培养皿或者人为地进行了抑制粘附的处理(例如，利用聚甲基丙烯酸羟基乙酯(poly-HEMA)进行的包被处理)的培养皿来进行培养。
本发明的方法中使用的贴壁培养是指将细胞在粘附于培养皿上的状态下进行培养，没有特别限定，也可以使用进行了包被处理的培养皿进行培养。作为包被剂，可以列举例如Matrigel(BD Biosciences)、Synthemax(注册商标)(Corning)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或巢蛋白以及它们的组合，优选为Matrigel、Synthemax(注册商标)或明胶。
步骤(i-1)中使用的培养基可以通过向动物细胞的培养所使用的基础培养基中添加选自激活素A、GSK-3β抑制剂和维甲酸衍生物中的一种以上的物质来制备。在一个实施方式中，本步骤中使用的物质为激活素A和GSK-3β抑制剂的组合或者GSK-3β抑制剂和维甲酸衍生物的组合。作为基础培养基，包括例如伊思柯夫改良杜氏培养基(Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium，IMDM)培养基、Medium 199培养基、伊格尔最低必需培养基(Eagle’sMinimum Essential Medium，EMEM)培养基、α改良伊格尔最低必需培养基(alpha ModifiedEagle Minimum Essential Medium，αMEM)培养基、杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’smodified Eagle’s Medium，DMEM)培养基、Ham’s F12(F12)培养基、RPMI 1640培养基、费歇尔(Fischer’s)培养基和它们的混合培养基等。培养基中可以含有血清(例如胎牛血清(Fetal Bovine Serum；FBS))或者也可以无血清。根据需要，可以含有例如白蛋白、KnockOut血清替代品(KSR)(Invitrogen)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)等一种以上的血清替代物，还可以含有转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需氨基酸(Non-essential amino acids；NEAA)、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等中的一种以上的物质。在本步骤的一个实施方式中，基础培养基为包含GlutaMAX、血清和抗生素的、DMEM与F12为1∶1的混合培养基(DMEM/F12)。
在步骤(i-1)中，作为激活素A，包括人和其他动物来源的激活素A以及它们的功能性变体，可以使用例如R&D systems公司等的市售品。本步骤中使用的激活素A的浓度为1ng/ml至1000ng/ml，优选为10ng/ml至500ng/ml，更优选为50ng/ml至200ng/ml。
在步骤(i-1)中，作为GSK-3β抑制剂，只要能够抑制GSK-3β的功能、例如激酶活性则没有特别限定，可以列举例如作为靛玉红衍生物的BIO(别名、GSK-3β抑制剂IX；6-溴靛玉红3’-肟)、作为马来酰亚胺衍生物的SB216763(3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)、作为苯基-α-溴甲基酮化合物的GSK-3β抑制剂VII(2，4’-二溴二苯乙酮)、作为细胞膜透过型的磷酸化肽的L803-mts(别名、GSK-3β肽抑制剂；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2(序列号15))和具有高选择性的CHIR99021(6-[[2-[[4-(2，4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈)(Nature，(2008)，453：519-523)。这些化合物例如可以从Stemgent公司、Calbiochem公司、Biomol公司等获得，另外也可以自行制作。作为本步骤中使用的优选的GSK-3β抑制剂，可以列举CHIR99021。本步骤中使用的GSK-3β抑制剂的浓度可以由本领域技术人员根据所使用的GSK-3β抑制剂来适当选择，例如，在使用CHIR99021作为GSK-3β抑制剂的情况下，为0.01μM至100μM，优选为0.1μM至10μM，进一步优选为1μM至3μM。
在步骤(i-1)中，维甲酸衍生物是保持天然维甲酸所具有的功能的可经人工修饰的维甲酸，包括例如类视色素化合物和维生素A化合物。作为类视色素化合物的例子，可以列举维甲酸、3-脱氢维甲酸、4-[[(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)羰基]氨基]-苯甲酸(AM580)(Tamura K，et al.，Cell Differ.Dev.，(1990)，32：17-26)、4-[(1E)-2-(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯-1-基]-苯甲酸(TTNPB)(Strickland S，etal.，Cancer Res.，(1983)，43：5268-5272)、Takenaga，K.et al.，Cancer Res.，(1980)，40：914-919中记载的化合物、棕榈酸视黄醇、视黄醇、视黄醛、3-脱氢视黄醇、3-脱氢视黄醛等。维甲酸化合物是指类视色素化合物中具有羧基的化合物，可以列举例如维甲酸、3-脱氢维甲酸、AM580、TTNPB等。在本步骤的一个实施方式中，维甲酸衍生物为类视色素化合物或维生素A化合物。在本步骤的另一个实施方式中，维甲酸衍生物为维甲酸化合物，在又一个实施方式中，维甲酸衍生物为维生素A化合物。作为在本步骤中使用的优选的维甲酸衍生物，可以列举AM580或TTNPB。本步骤中使用的维甲酸衍生物的浓度可以由本领域技术人员根据所使用的维甲酸衍生物进行适当选择，例如，在使用AM580或TTNPB作为维甲酸衍生物的情况下，为0.01μM至100μM，优选为0.1μM至10μM，进一步优选为0.5μM至2μM。
步骤(i-1)中使用的培养基可以进一步含有ROCK抑制剂。特别是在本步骤包括使多能干细胞分散成单一细胞的步骤的情况下，优选在培养基中含有ROCK抑制剂。
ROCK抑制剂只要能够抑制Rho激酶(ROCK)的功能则没有特别限定，可以列举例如Y-27632(例如，Ishizaki et al.，Mol.Pharmacol.，(2000)，57，976-983；Narumiya etal.，Methods Enzymol.，(2000)，325，273-284)、Fasudil/HA1077(例如，Uehata et al.，Nature，(1997)，389：990-994)、H-1152(例如，Sasaki et al.，Pharmacol.Ther.，(2002)，93：225-232)、Wf-536(例如，Nakajima et al.，Cancer Chemother.Pharmacol.，(2003)，52(4)：319-324)和它们的衍生物、以及针对ROCK的反义核酸、RNA干扰诱导性核酸(例如，siRNA)、显性失活突变体和它们的表达载体。另外，作为ROCK抑制剂，也可以使用其他公知的低分子化合物(例如，参考美国专利申请公开第2005/0209261号、美国专利申请公开第2005/0192304号、美国专利申请公开第2004/0014755号、美国专利申请公开第2004/0002508号、美国专利申请公开第2004/0002507号、美国专利申请公开第2003/0125344号、美国专利申请公开第2003/0087919号和国际公开第2003/062227号、国际公开第2003/059913号、国际公开第2003/062225号、国际公开第2002/076976号、国际公开第2004/039796号)。在本发明中，可以使用一种或两种以上的ROCK抑制剂。作为本步骤中使用的优选的ROCK抑制剂，可以列举Y-27632。本步骤中使用的ROCK抑制剂的浓度可以由本领域技术人员根据所使用的ROCK抑制剂进行适当选择，例如，在使用Y-27632作为ROCK抑制剂的情况下，为0.1μM至100μM，优选为1μM至50μM，进一步优选为5μM至20μM。
在步骤(i-1)中，培养温度不限定于以下，为约30℃～约40℃、优选为约37℃，在含有CO2的空气的气氛下进行培养。CO2浓度为约2％～约5％，优选为约5％。本步骤的培养时间为例如2天以下的培养，优选为2天。
(i-2)将步骤(i-1)中得到的细胞群在包含选自BMP7、GSK-3β抑制剂和维甲酸衍生物中的一种以上的物质的培养基中进行培养的步骤
在本步骤中，可以将上述步骤(i-1)中得到的悬浮培养后的细胞群直接在进行了包被处理的培养皿中在任意的培养基中进行贴壁培养，或者也可以将上述步骤(i-1)中通过贴壁培养得到的细胞群通过更换培养基而继续进行培养。
在步骤(i-2)中使用的培养基可以通过向动物细胞的培养所使用的基础培养基中添加选自由BMP7、GSK-3β抑制剂和维甲酸衍生物组成的组中的一种以上的物质来制备。在一个实施方式中，在本步骤中使用的物质为BMP7和GSK-3β抑制剂的组合或者维甲酸衍生物。作为基础培养基，包括例如IMDM培养基、Medium 199培养基、EMEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基和它们的混合培养基等。培养基中可以含有血清(例如，FBS)，或者也可以无血清。根据需要，可以含有例如白蛋白、KSR(Invitrogen)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)等一种以上的血清替代物，还可以含有转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需氨基酸(NEAA)、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类和它们的等同物等中的一种以上的物质。在本步骤的一个实施方式中，基础培养基为包含GlutaMAX、KSR、非必需氨基酸、2-巯基乙醇和抗生素的DMEM/F12。
在步骤(i-2)中，例如，可以将步骤(i-1)中得到的细胞群在包含选自BMP7和GSK-3β抑制剂中的一种以上的物质的培养基中进行培养，然后，在包含维甲酸衍生物的培养基中进一步进行培养。优选在步骤(i-2)中，将步骤(i-1)中得到的细胞群在包含选自BMP7和GSK-3β抑制剂中的一种以上的物质的培养基中进行培养，然后在包含维甲酸衍生物和TGFβ信号刺激剂的培养基中进一步进行培养。即，步骤(i-2)可以分离成下述的步骤(i-2-a)和(i-2-b)这两个步骤来进行：(i-2-a)在包含选自BMP7和GSK-3β抑制剂中的一种以上的物质的培养基中进行培养的步骤以及(i-2-b)在包含维甲酸衍生物和TGFβ信号刺激剂的培养基中进行培养的步骤。更优选的是，在步骤(i-2)中，步骤(i-2-a)为在包含BMP7和GSK-3β抑制剂的培养基中进行培养的步骤，步骤(i-2-b)为在包含维甲酸衍生物和TGFβ信号刺激剂的培养基中进行培养的步骤。
在步骤(i-2)中，作为BMP7，包括人BMP7(NCBI登录号：NM_001719.2)和其他动物来源的BMP7以及它们的功能性变体(保持了分化诱导能力的变体)，可以使用例如Invitrogen公司、R&D公司等的市售品。本步骤中使用的BMP7的浓度为1ng/ml至1000ng/ml，优选为10ng/ml至500ng/ml，更优选为50ng/ml至200ng/ml。
在步骤(i-2)中，GSK-3β抑制剂可以使用在上述的步骤(i-1)中例示的GSK-3β抑制剂，作为优选的GSK-3β抑制剂，可以列举CHIR99021。本步骤中使用的GSK-3β抑制剂的浓度可以由本领域技术人员根据所使用的GSK-3β抑制剂进行适当选择，例如，在使用CHIR99021作为GSK-3β抑制剂的情况下，为0.01μM至100μM，优选为0.1μM至10μM，进一步优选为1μM至3μM。
在步骤(i-2)中，维甲酸衍生物可以使用在上述的步骤(i-1)中例示的维甲酸衍生物，作为优选的维甲酸衍生物，可以列举AM580或TTNPB。本步骤中使用的维甲酸衍生物的浓度可以由本领域技术人员根据所使用的维甲酸衍生物进行适当选择，例如，在使用AM580或TTNPB作为维甲酸衍生物的情况下，为0.01μM至100μM，优选为0.1μM至10μM，进一步优选为0.5μM至2μM。
在步骤(i-2)中，TGFβ信号刺激剂只要使TGFβ信号途径活化则没有特别限定，作为TGFβ信号刺激剂，可以例示TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3等蛋白质(可以从Peprotech、R&D公司等获得)、IDE1(1-[2-[(2-羧基苯基)亚甲基]酰肼]庚酸)和IDE2(庚二酸1-(2-亚环戊基酰肼))(Borowiak M，et al.，Cell Stem Cell，(2009)，4：348-358)等化合物。IDE1和IDE2可以从Stemgent公司、Tocris公司等获得。作为优选的TGFβ信号刺激剂，可以列举TGFβ1。本步骤中使用的TGFβ信号刺激剂的浓度可以由本领域技术人员根据所使用的TGFβ信号刺激剂进行适当选择，例如，在使用TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3等蛋白质作为TGFβ信号刺激剂的情况下的浓度为0.1ng/ml至100ng/ml，优选为1ng/ml至10ng/ml，进一步优选为5ng/ml至10ng/ml。另外，在使用IDE1和IDE2的情况下的浓度为1μM至100μM，优选为25μM至75μM，进一步优选为40μM至60μM。
在步骤(i-2)中，培养温度不限定于以下，为约30℃～约40℃、优选为约37℃，在含有CO2的空气的气氛下进行培养。CO2浓度为约2％～约5％，优选为约5％。作为培养时间，为例如3天以上的培养，优选列举3天以上且12天以下，更优选列举3天以上且9天以下。此时，培养基优选每3天进行更换。在步骤(i-2)包括步骤(i-2-a)和(i-2-b)的情况下，步骤(i-2)的培养时间如上所述，但作为步骤(i-2-a)的培养时间，例如为1天以上的培养，优选列举2天以上且11天以下，更优选列举2天以上且6天以下，作为步骤(i-2-b)的培养时间，例如为1天以上的培养，优选列举2天以上且11天以下，更优选列举3天以上且6天以下。此时，培养基优选每3天进行更换。
通过上述的步骤(i-1)和(i-2)，可从多能干细胞诱导中段中胚层细胞。作为中段中胚层细胞的特征性标志，已知有OSR1，在一个实施方式中，在通过步骤(i-1)和(i-2)诱导的细胞群中含有大量OSR1阳性SIX2阴性(OSR1(+)SIX2(-))的中段中胚层细胞，但也可以含有OSR1和SIX2双阳性(OSR1(+)SIX2(+))的肾前体细胞。因此，作为步骤(i)，可以在上述的步骤(i-1)和(i-2)结束该步骤，但从提高肾前体细胞的含有率的观点出发，优选进一步进行步骤(i-3)。
(i-3)将步骤(i-2)中得到的细胞群在包含TGFβ信号刺激剂和BMP抑制剂的培养基中进行培养的步骤
在本步骤中，可以利用该领域中公知的任意方法将上述的步骤(i-1)和(i-2)中得到的细胞(中段中胚层细胞)群分离或者将该细胞直接通过悬浮培养或贴壁培养进行培养。作为细胞的分离方法，可以列举例如机械性分离、使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液(例如，Accutase(注册商标)和Accumax(Innovative Cell Technologies，Inc))或仅具有胶原酶活性的分离溶液的分离。
在步骤(i-3)中使用的培养基可以通过向动物细胞的培养所使用的基础培养基中添加TGFβ信号刺激剂和BMP抑制剂来制备。作为基础培养基，包括例如IMDM培养基、Medium199培养基、EMEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基和它们的混合培养基等。在培养基中可以含有血清(例如，FBS)，也可以无血清。根据需要，可以含有例如白蛋白、KSR(Invitrogen)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)等中的一种以上的血清替代物，还可以含有转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需氨基酸(NEAA)、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类和它们的等同物等中的一种以上的物质。在本步骤的一个实施方式中，基础培养基为包含GlutaMAX、KSR、非必需氨基酸、2-巯基乙醇和抗生素的DMEM/F12。
在步骤(i-3)中，TGFβ信号刺激剂只要使TGFβ信号途径活化则没有特别限定，作为TGFβ信号刺激剂，可以例示TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3等蛋白质、IDE1和IDE2等化合物。作为优选的TGFβ信号刺激剂，可以列举TGFβ1。本步骤中使用的TGFβ信号刺激剂的浓度可以由本领域技术人员根据所使用的TGFβ信号刺激剂进行适当选择，例如，在使用TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3等蛋白质作为TGFβ信号刺激剂的情况下的浓度为0.1ng/ml至100ng/ml，优选为1ng/ml至10ng/ml，进一步优选为5ng/ml至10ng/ml。另外，在使用IDE1和IDE2的情况下的浓度为1μM至100μM，优选为25μM至75μM，进一步优选为40μM至60μM。
在步骤(i-3)中，BMP抑制剂只要使BMP信号途径活化则没有特别限定，作为BMP抑制剂，可以例示脊索蛋白、头蛋白、卵泡抑素等蛋白质性抑制剂、Dorsomorphin(6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑并[1，5-a]嘧啶)及其衍生物(Yu et al.，Circulation，(2007)，116：II_60；Yu et al.，Nat.Chem.Biol.，(2008)，4：33-41；J.Hao etal.，PLoS ONE，(2008)，3：e2904)、DMH1(4-[6-(4-异丙氧基苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉、4-[6-[4-(1-甲基乙氧基)苯基]吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]-喹啉)以及LDN193189(4-(6-(4-(哌啶-1-基)苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)喹啉)。这些化合物例如可以从Stemgent、Tocris Bioscience、MERCK LIFE SCIENCE、和光公司等获得，另外也可以自行制作。作为优选的BMP抑制剂，可以列举DMH1、LDN193189、头蛋白和Dorsomorphin，更优选的BMP抑制剂为DMH1。本步骤中使用的BMP抑制剂的浓度可以由本领域技术人员根据所使用的BMP抑制剂进行适当选择，例如，在使用脊索蛋白、头蛋白、卵泡抑素等蛋白质性抑制剂作为BMP抑制剂的情况下的浓度为0.1ng/ml至1000ng/ml，优选为1ng/ml至500ng/ml，更优选为10ng/ml至100ng/ml。在使用Dorsomorphin、LDN193189、DMH1的情况下，为0.01μM至100μM，优选为0.1μM至10μM，进一步优选为0.5μM至1μM。
在一个实施方式中，在步骤(i-3)中使用的TGFβ信号刺激剂和BMP抑制剂的组合为TGFβ1和DMH1。
在步骤(i-3)的培养步骤中，可以在基础培养基中进一步添加成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor；FGF)9、FGF20、BMP7、维甲酸衍生物和GSK-3β抑制剂中的任意一者或任意的组合。
关于步骤(i-3)的培养步骤的天数，通过长期培养对肾前体细胞群的制造效率没有特别影响，因此没有上限，可以列举例如2天以上、4天以上、6天以上、8天以上、10天以上、11天以上、12天以上、13天以上、14天以上、15天以上、16天以上、17天以上、18天以上、19天以上、20天以上。
在步骤(i-3)中，培养温度不限定于以下，为约30℃～约40℃、优选为约37℃，在含有CO2的空气的气氛下进行培养，CO2浓度为约2％～约5％，优选为约5％。
2.步骤(ii)：使用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志，从步骤(i)中得到的细胞中筛选细胞群的步骤以及本发明的筛选方法
在步骤(ii)和本发明的筛选方法(以下在本章中统称为“步骤(ii)”)中，以选自由CD9、CD55、CD106、CD140a、CD140b、CD165、CD271、CD326组成的组中的至少一种细胞表面标志的表达的有无为指标，从步骤(i)中得到的细胞群中筛选进一步纯化的细胞群。更具体而言，以CD106、CD140a、CD140b、CD165和CD271为阳性、CD9、CD55和CD326为阴性作为指标。在本说明书中，针对细胞表面标志的(+)的标记是指细胞在其抗原方面为阳性，将CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)和CD271(+)称为阳性选择标志。在本说明书中，针对细胞表面标志的(-)的标记是指细胞在其抗原方面为阴性，将CD9(-)、CD55(-)和CD326(-)称为阴性选择标志。在本说明书中，也将阳性和阴性的选择标志统称为细胞表面标志。
在优选的方式中，步骤(ii)中使用的细胞表面标志的组合可以为选自由CD9、CD55、CD106、CD140a、CD140b、CD165、CD271、CD326组成的组中的至少两种、三种或四种细胞表面标志的组合。例如，至少两种细胞表面标志的组合可以优选包含选自由CD9(-)、CD55(-)和CD326(-)组成的组中的一种阴性选择标志(优选CD9(-))以及选自由CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)和CD271(+)组成的组(优选由CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)组成的组)中的一种阳性选择标志的组合。至少三种细胞表面标志的组合可以优选包含选自由CD9(-)、CD55(-)和CD326(-)组成的组中的一种阴性选择标志(优选(CD9(-))以及选自由CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)和CD271(+)组成的组(优选由CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)组成的组)中的两种阳性选择标志的组合；或者选自由CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)和CD271(+)组成的组中的三种阳性选择标志的组合。至少四种细胞表面标志的组合可以优选包含选自由CD9(-)、CD55(-)和CD326(-)组成的组中的一种阴性选择标志(优选CD9(-))以及选自由CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)和CD271(+)组成的组中的三种阳性选择标志的组合。在一个实施方式中，步骤(ii)中使用的细胞表面标志为选自由CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)组成的组中的至少两种或三种细胞表面标志，优选为CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)的组合。
在步骤(ii)中使用的细胞表面标志可以用于筛选包括人在内但不限定于人的哺乳动物来源的肾前体细胞的细胞群。在筛选人肾前体细胞的细胞群的情况下，八种各人细胞表面标志的NCBI登录号对应如下。
CD9：NM_001769.3(序列号1)
CD55：NM_000574.4(序列号3)
CD106：NM_001078.3(序列号5)
CD140a：NM_006206.4(序列号7)
CD140b：NM_002609.3(序列号9)
CD165：geneID_23449
CD271：NM_002507.3(序列号11)
CD326：NM_002354.2(序列号13)
人的各细胞表面标志中包括具有与上述登录号对应的核苷酸序列的基因和由该基因编码的蛋白质以及天然存在的突变体。
人CD9由具有序列号1的碱基序列(碱基号185～871)的基因编码，具有序列号2的氨基酸序列。人CD55由具有序列号3的碱基序列(碱基号295～1440)的基因编码，具有序列号4的氨基酸序列。人CD106由具有序列号5的碱基序列(碱基号222～2441)的基因编码，具有序列号6的氨基酸序列。人CD140a由具有序列号7的碱基序列(碱基号332～3601)的基因编码，具有序列号8的氨基酸序列。人CD140b由具有序列号9的碱基序列(碱基号470～3790)的基因编码，具有序列号10的氨基酸序列。人CD271由具有序列号11的碱基序列(碱基号126～1409)的基因编码，具有序列号12的氨基酸序列。人CD326由具有序列号13的碱基序列(碱基号359～1303)的基因编码，具有序列号14的氨基酸序列。人CD165是作为AD2或gp37而为人所知的37-42kDa的膜表面蛋白质。作为与CD165特异性结合的抗体，鉴定出单克隆抗体SN2(Seon，BK，et al.，J.Immunol.，(1984)，132：2089-2095)，该抗体已有市售。
关于上述细胞表面标志的天然存在的突变体，对于CD9、CD55、CD106、CD140a、CD140b、CD271和CD326，是指由相对于上述碱基序列具有至少80％以上、优选85％以上、90％以上、95％以上、98％以上的一致性的基因编码的、或者包含相对于上述氨基酸序列具有至少80％以上、优选85％以上、90％以上、95％以上、98％以上的一致性的氨基酸序列的细胞表面标志。
关于核酸序列或氨基酸序列，本说明书中的“一致性”是指通过NEEDLE程序(Needleman SB，et al.，J.Mol.Biol.，(1970)，48：443-453)检索使用默认的参数得到的值Identity。上述的参数如下所示。
Gap penalty(空位罚分)＝10
Extend penalty(延伸罚分)＝0.5
Matrix(矩阵)＝EBLOSUM62
另外，与上述的人的细胞表面抗原结合的特异性抗体已有市售。作为这样的抗体的一例，包含在后述的实施例中记载的抗体。另外，保持了与上述细胞表面标志各自特异性结合的市售的抗体进行结合的这种特征的细胞表面标志也包含在本发明中可用于细胞群的筛选的细胞表面标志中。
在步骤(ii)中，使用细胞表面标志来筛选细胞群可以利用该领域中公知的各种方法来进行。可以列举例如使用与细胞表面标志特异性结合的抗体，基于该抗体在细胞上的结合来筛选细胞的方法。作为这样的方法，可以列举使用荧光标记的抗体利用细胞分选仪的方法(例如，FACS(注册商标)(BD Biosciences))、使用标记了抗体的磁珠利用磁性对细胞进行筛选的方法(例如，MACS(注册商标)(Miltenyi Biotec))、使用固定有抗体的载体(例如，细胞富集柱)的方法等。
3.肾疾病治疗剂、肾疾病治疗方法和制造肾疾病治疗用细胞的方法
通过本发明的方法获取的肾前体细胞群能够用作肾疾病治疗剂。因此，本发明提供以下的肾疾病治疗用细胞的制造方法和肾疾病治疗用细胞群的筛选方法。
一种制造肾疾病治疗用细胞的方法，其包括：
(i)将多能干细胞在诱导向肾前体细胞的分化的条件下进行培养的步骤；和
(ii)使用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志，从步骤(i)中得到的细胞中筛选细胞群的步骤。
一种筛选肾疾病治疗用细胞群的方法，其中，使用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志，从包含肾前体细胞的细胞群中筛选肾疾病治疗用细胞群。
本发明中的肾疾病治疗用细胞是指利用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志赋予特征的细胞，优选为利用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)赋予特征的细胞。
在本发明中，提供包含通过本发明的制造方法制造的肾前体细胞群或通过本发明的筛选方法筛选出的肾前体细胞群的肾疾病治疗剂、以及包括向患者给药通过本发明的制造方法制造的肾前体细胞群或通过本发明的筛选方法筛选出的肾前体细胞群的步骤的肾疾病治疗方法。作为向患者给药肾前体细胞群或治疗剂的方法，可以列举例如将所获取的肾前体细胞群制成片，贴附于患者的肾脏上的方法；使所获取的肾前体细胞群悬浮于生理盐水等中，直接或者通过经血管给药移植于患者的肾脏中的方法；在由基质胶等构成的支架上进行三维培养，将所得到的肾前体细胞团进行移植的方法；将肾前体细胞群填充至透析柱中的方法；将肾前体细胞群包埋至微胶囊中进行给药的方法等。作为肾疾病，可以例示包括未达到慢性肾衰竭的状态在内的慢性肾脏病。
在本发明中，肾疾病治疗剂中含有的肾前体细胞的细胞数可以根据疾病的严重程度、患部、躯体的大小而适当增减来制备。
实施例
通过以下的实施例进一步具体地对本发明进行说明，但本发明的范围不受这些实施例的限制。
[实施例1]
<利用OSR1和SIX2与各种细胞表面标志的流式细胞术进行的肾前体细胞群的二维展开>
iPS细胞使用利用非专利文献3中记载的方法制作的、与内源性的OSR1的基因表达联合表达GFP且与内源性的SIX2的基因表达联合表达tdTomato的OSR1-GFP&SIX2-tdTomato报告蛋白人iPS细胞株。按照非专利文献4中记载的方法，由该人iPS细胞株进行向包含肾前体细胞的细胞群的分化诱导。使用人细胞表面标志筛选面板(BD Biosciences：560747)，进行了在肾前体细胞上特异性表达的细胞表面标志的探索，结果，作为能够明确划分包含目标肾前体细胞的细胞群的细胞表面标志，鉴定出CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)(图1)。
[实施例2]
<CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)的细胞群中包含70％以上的肾前体细胞>
对于是否能够通过将实施例1中得到的细胞表面标志多种组合使用来提高从人iPS细胞来源分化细胞群中区分出的细胞中所含的肾前体细胞的比例进行了研究。
首先，对于是否能够通过使用一种阴性选择标志、使用三种阳性选择标志来提高人iPS细胞来源分化细胞群中所含的肾前体细胞的比例进行了研究。作为细胞表面标志，选择在实施例1中与OSR1和SIX2的二维展开图中得到了细胞群的明确分离图像的CD9、CD140a、CD140b和CD271，作为针对各细胞表面标志的抗体，分别使用APC-H7小鼠抗人CD9(BD Biosciences，655409)、Alexa Fluor(注册商标)647小鼠抗人CD140a(BDBiosciences，562798)、BV421小鼠抗人CD140b(BD Biosciences，564124)和BV510小鼠抗人CD271(BD Biosciences，563451)。各抗体稀释20倍后使用，在室温下反应15分钟。反应后，用含有2％FBS的PBS清洗2次，使用FACSAria III(注册商标)(BD Biosciences)进行分析。然后，基于其二维展开图，设定CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)的细胞划分，分取出该细胞。对于分取出的细胞群，再次使用FACSAria III(注册商标)进行分析，结果，细胞群整体中含有的OSR1(+)SIX2(+)细胞的比例超过了70％(图2B)。图2A是利用CD9、CD140a、CD140b、CD271对人iPS细胞来源分化细胞群进行染色时的散点图，图2B的二维展开图左起是利用流式细胞仪对于分化诱导前的人iPS细胞、人iPS细胞来源分化细胞群、以及P3且P4且P6的分选后的细胞群测定OSR1和SIX2的表达而得到的图。
[实施例3]
<由利用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)筛选出的细胞群进行的LTL(近端肾小管的标志)阳性的肾小管样结构的形成>
作为肾前体细胞的特征，除了肾前体细胞标志的表达以外，还可以列举向肾小管细胞分化的能力的保持。因此，为了确认实施例2中得到的CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞是否为肾前体细胞，将其供试于肾小管分化诱导系统。向肾小管细胞的分化和肾小管样结构的形成的判定通过作为近端肾小管标志的LTL的表达和形态的特征来进行。
将按照非专利文献4中记载的方法从人iPS细胞株分化诱导而成的包含肾前体细胞的细胞群使用APC-H7小鼠抗人CD9、Alexa Fluor(注册商标)647小鼠抗人CD140a、BV421小鼠抗人CD140b和BV510小鼠抗人CD271进行免疫染色，利用FACSAria III(注册商标)分取CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞。将分取出的细胞以1.0×105个细胞/孔接种至含有添加了50ng/ml BMP7(R&D，354-BP-010)和10μM Y-27632(和光，253-00513)的UBC驯化培养基(参考以下)的纺锤底低粘附96孔板(住友电木，MS-9096M)中，在37℃、含有5％CO2的空气气氛下培养24小时。接着，将培养基置换成添加有50ng/ml BMP7、0.5μM BIO(Calbiochem，361552)和10μM Y-27632的UBC驯化培养基，进一步培养24小时。然后，按照非专利文献4中记载的方法，与Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞进行共培养。Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞以4.0×105个细胞/孔播种至24孔板中，在丝裂霉素C处理后使用。共培养使用UBC驯化培养基，培养2周后，进行染色。染色的一次反应使用LTL-生物素偶联物(Vector Labs，B-1325)，二次反应使用链霉亲和素-Alexa Fluor(注册商标)546偶联物(LifeTechnologies，S-11225)，核染色使用Hoechst 33342(Life Technologies，H3570)。LTL稀释200倍后使用，在4℃下进行一晚反应。另外，链霉亲和素-Alexa Fluor(注册商标)546偶联物稀释200倍后使用，在室温下进行1小时反应。其结果，确认到由CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)的细胞群形成了LTL阳性的管腔结构(图3B)。图3A示出利用与非专利文献4同样的方法进行的、在细胞团形成后与Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞共培养的向近端肾小管的分化方法。图3B示出将CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞的细胞团与Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞共培养时的状况。
<UBC驯化培养基>
利用将文献(Barasch et al.，Am.J.Physiol.，(1997)，273，F757-767)记载的方法改良后的方法制作输尿管芽细胞(UBC)驯化培养基。将UBC(由哥伦比亚大学Barasch博士馈赠，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1997)，94，6279-6284)在含有10％FBS的最低必需培养基(MEM；Invitrogen)中进行培养。在达到80％融合时将细胞用PBS清洗，将培养基置换成在DMEM与F12的1∶1的混合培养基中含有GlutaMAX、10％KSR、0.1mM非必需氨基酸、0.55mM 2-巯基乙醇和500U/ml青霉素/链霉素的培养基。接着，将细胞培养3天，生成培养上清。培养上清在使用前利用0.22μm过滤器进行过滤。
[实施例4]
<利用CD9(-)和三种阳性选择标志的组合筛选出的肾前体细胞(OSR1(+)SIX2(+)细胞)的比例>
在使用CD9(-)和三种实施例1中提取的阳性选择标志时的网罗性组合(10种)中，使用FACSAria Fusion(注册商标)(BD Biosciences)考察OSR1(+)SIX2(+)细胞的比例。另外，对于在实施例3中能够确认到可分取包含肾前体细胞的细胞群的组合即CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD271(+)中，CD55(-)和CD326(-)能否成为替代CD9(-)的阴性选择标志一并进行了考察。
抗体使用APC-H7小鼠抗人CD9(BD Biosciences，655409)、Alexa Fluor(注册商标)647小鼠抗人CD140a(BD Biosciences，562798)、BV421小鼠抗人CD140a(BDBiosciences，562799)、BV421小鼠抗人CD140b(BD Biosciences，564124)、BV510小鼠抗人CD271(BD Biosciences，563451)、APC小鼠抗人CD106(BD Biosciences，551147)、BV605小鼠抗人CD106(BD Biosciences，563307)、人CD165-生物素(Miltenyi Biotec，130-098-536)、人CD165-APC(Miltenyi Biotec，130-098-542)、抗人CD55生物素(eBioscience，13-0559)和BV605小鼠抗人CD326(BD Biosciences，563182)。各抗体稀释20倍后使用，在室温下反应15分钟后，用PBS清洗3次并进行分析。另外，对于生物素化抗体，使用BV605链霉亲和素(BD Biosciences，563260)，稀释500倍后进行二次染色。二次染色在室温下反应15分钟后，用PBS清洗3次并进行分析。使用FACSAria Fusion(注册商标)对人iPS细胞来源分化细胞群进行分析，基于其二维展开图设定12种组合的划分，分取各划分的细胞。对于分取出的细胞群，再次使用FACSAria Fusion(注册商标)进行分析，算出细胞群整体中含有的OSR1(+)SIX2(+)细胞、OSR1(+)SIX2(-)细胞、OSR1(-)SIX2(+)细胞和OSR1(-)SIX2(-)细胞的比例(图4)。其结果，在任何一种标志的组合的情况下，均相对于分取出的细胞群整体以高比例含有OSR1(+)SIX2(+)细胞。
[实施例5]
<能够分取肾前体细胞的细胞表面标志的组合的研究>
在CD9、CD140a、CD140b、CD271的细胞表面标志的组合中，使用在实施例4中使用的抗体，利用FACSAria Fusion(注册商标)进行分析，在作为阴性选择标志的CD9(-)以及选自CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)中的任意的阳性选择标志的组合中，算出利用各种细胞表面标志分取出的细胞群中含有的OSR1(+)SIX2(+)细胞的比例。另外，考察以各细胞表面标志组合规定的细胞在原细胞群中的比例，算出利用所期望的各表面标志回收的OSR1(+)SIX2(+)细胞数/原细胞数(图5)。其结果，在任何一种细胞表面标志的组合的情况下，均能够将OSR1(+)SIX2(+)细胞富集，利用两种或三种细胞表面标志的组合，也能够以与四种细胞表面标志的组合同等程度的比例进行OSR1(+)SIX2(+)细胞的富集。
[实施例6]
<能够分取肾前体细胞的细胞表面标志的组合的研究>
为了确认使用该细胞表面标志从未导入报告基因的人iPS细胞株也能够分取高纯度的肾前体细胞群，将人iPS细胞(201B7株、由京都大学馈赠)供试于分化诱导系统。人iPS细胞(201B7)利用以往的方法(Takahashi K，et al.，(2007)，Cell.131：861-72)进行维持培养，按照非专利文献4中记载的方法，进行向包含肾前体细胞的细胞群的分化诱导。与实施例3同样地使用FACSAria Fusion(注册商标)分取CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞而形成细胞团后，与Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞共培养，由此确认能否分取保持了向肾小管分化的能力的细胞群。向肾小管分化的判定通过作为近端肾小管标志的LTL的表达和形态的特征来进行。其结果，确认到能够由CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)的细胞群形成LTL阳性的管腔结构。即，确认了：对于来自人iPS细胞(201B7)的分化细胞，使用CD9、CD140a、CD140b和CD271也能够以高纯度分取包含肾前体细胞的细胞群(图6C)。图6A示出相对于OSR1(GFP)、SIX2(tdTomato)和各细胞表面标志的荧光强度的细胞数的直方图。图6B是利用流式细胞仪测定iPS细胞201B7株来源分化细胞群的CD9、CD140a、CD140b或CD271的表达而得到的结果的二维展开图。图6C示出分选出P4且P2且P3的细胞群后形成细胞团、与Wnt4表达NIH3T3成纤维细胞共培养的图像。
[实施例7]
<能够分取肾前体细胞的细胞表面抗原标志的组合的研究(2)>
对于与实施例6同样地对人iPS细胞(201B7)进行分化诱导而得到的包含肾前体细胞的细胞群，使用APC-H7小鼠抗人CD9、Alexa Fluor(注册商标)647小鼠抗人CD140a、BV421小鼠抗人CD140b和BV510小鼠抗人CD271进行表面抗原的免疫染色，使用FACSAria Fusion(注册商标)分取CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)细胞。分取细胞后，使用Smear Gell(注册商标)(GenoStaff，SG-01)涂抹至载玻片上，进行核内转录因子的免疫染色。一次抗体使用抗SIX2兔多克隆抗体(Proteintech，11562-1-AP)，二次抗体使用驴抗兔IgG(H+L)二次抗体Alexa Fluor(注册商标)488偶联物(Life Technologies，A21206)，核染色使用Hoechst 33342(Life Technologies，H3570)。使用显微镜(KEYENCE，BZ-9000)进行观察，结果观察到：CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)的细胞群中，作为肾前体细胞的特征之一的SIX2阳性细胞的比例比分选前的分化细胞群高(图7)。
产业上的可利用性
如以上详细说明的那样，本发明提供使用细胞表面标志从由多能干细胞分化诱导成肾前体细胞的细胞群中获取、制造高纯度的肾前体细胞的方法。通过本方法获取的肾前体细胞能够用于肾衰竭等肾疾病的再生医疗。
序列表自由文本
序列号15：L803-mts/GSK-3β肽抑制剂；作为第1位氨基酸的甘氨酸残基在N末端经由酰胺键接受了肉豆蔻酸的键合；作为第11位氨基酸的丝氨酸残基进行了磷酸化；作为第12位氨基酸的脯氨酸的C末端进行了酰胺化。

Claims (21)

1.一种制造由多能干细胞分化诱导而成的肾前体细胞的方法，其包括：
(i)将多能干细胞在诱导向肾前体细胞的分化的条件下进行培养的步骤；和
(ii)使用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志，从步骤(i)中得到的细胞中筛选细胞群的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用至少两种细胞表面标志来筛选细胞群。
3.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用至少三种细胞表面标志来筛选细胞群。
4.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用至少四种细胞表面标志来筛选细胞群。
5.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用选自由CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)组成的组中的至少两种细胞表面标志。
6.如权利要求5所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用至少三种细胞表面标志来筛选细胞群。
7.如权利要求4所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)作为细胞表面标志。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为诱导多能干(iPS)细胞。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为人iPS细胞。
10.一种肾前体细胞群，其是使用权利要求1至9中任一项所述的方法制造的。
11.一种筛选细胞群的方法，其中，使用选自由CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)和CD326(-)组成的组中的至少一种细胞表面标志，从包含肾前体细胞的细胞群中筛选细胞群。
12.如权利要求11所述的方法，其中，使用至少两种细胞表面标志来筛选细胞群。
13.如权利要求11所述的方法，其中，使用至少三种细胞表面标志来筛选细胞群。
14.如权利要求11所述的方法，其中，使用至少四种细胞表面标志来筛选细胞群。
15.如权利要求11所述的方法，其中，使用选自由CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)组成的组中的至少两种细胞表面标志。
16.如权利要求15所述的方法，其中，使用至少三种细胞表面标志来筛选细胞群。
17.如权利要求11所述的方法，其中，使用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)和CD271(+)作为细胞表面标志。
18.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中，肾前体细胞为由多能干细胞分化诱导而成的肾前体细胞。
19.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为诱导多能干(iPS)细胞。
20.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为人iPS细胞。
21.一种细胞群，其是利用权利要求11至20中任一项所述的方法得到的。
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