KR20180042391A - 신장 전구 세포를 제조하는 방법 - Google Patents

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유키코 야마기시
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아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
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Abstract

본 발명의 과제는, 신장 전구 세포 특이적인 세포 표면 항원 마커를 동정함으로써, 다능성 줄기 세포로부터 신장 전구 세포로 분화 유도된 세포 집단으로부터, 순도가 높은 신장 전구 세포를 취득하고 제조하는 방법을 제공하는 데 있다. 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 신장 전구 세포를 제조하는 방법이며, (i) 다능성 줄기 세포를 신장 전구 세포로의 분화를 유도하는 조건 하에서 배양하는 공정; 및 (ⅱ) 공정 (i)에서 얻어진 세포로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는 공정을 포함하는 방법.

Description

신장 전구 세포를 제조하는 방법
본 발명은, 다능성 줄기 세포로부터 분화된 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단으로부터, 고순도의 신장 전구 세포 집단을 취득하고 제조하기 위한 세포 표면 마커를 사용하는, 신장 전구 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
신장은, 생체 내에서의 대사 활동에 의하여 발생하는 유해 물질이나 노폐물을 혈중으로부터 여과함으로써 제거하여, 신체의 건강 유지를 도모하기 위해 기능하는 중요한 장기의 하나이다. 신장의 기능이 손상되는 위독한 질환으로서 신부전이 있는데 유효한 약물 요법이 확립되어 있지 않으며, 현상에서는 신장 이식, 인공 투석으로 치료되고 있다. 그러나, 신장 이식에는 심각한 도너 장기 부족의 문제가 있는 한편, 인공 투석에는 합병증의 발현에 더하여 큰 의료비 부담의 문제가 있어, 새로운 치료법의 개발이 요망되고 있다.
한편, 배성 줄기 세포(Embryonic stem cell; ES 세포)나, 체세포에 초기화 인자를 도입함으로써 얻어지는 인공 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPS 세포) 등 다능성을 갖는 세포가 지금까지 보고되어 있다(특허문헌 1 및 2). 현재, 이들 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 신장 세포를 이식하는 신부전의 치료법 개발이 검토되고 있다. 또한, 이들 다능성 줄기 세포 유래의 균일한 신장 세포를 사용하여 치료약의 개발을 행하는 것도 시야에 들어 있다.
포유류의 신장은 전신, 중신, 후신의 3단계를 거쳐 형성되어 있으며, 그 중 후신은 중간 중배엽의 후방 영역에 발생하는 것이 알려져 있다. 지금까지의 연구에서 마우스 다능성 줄기 세포로부터 중간 중배엽으로의 분화 유도 방법이 검토되고 있으며(비특허문헌 1), 중간 중배엽의 특징적인 마커로서 Odd-Skipped Related Transcription Factor 1(OSR1)이 확인되어 있다. 또한 신장 전구 세포를 특징짓는 인자의 하나로서 SIX Homeobox 2(SIX2)가 알려져 있다(비특허문헌 2 및 3). 세균 인공 염색체(Bacterial artificial chromosome; BAC) 벡터를 사용하여 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP) 유전자를 내재성의 OSR1 대립 유전자와의 상동 재조합으로 도입한 인간 iPS 세포(OSR1-GFP 리포터 인간 iPS 세포)를 제작하고, 이 세포를 사용한 검토에 의하여, 액티빈 A(Activin A), Wnt 단백질, 뼈 형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein(BMP)) 및 각종 저분자 화합물을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 중간 중배엽으로의 분화 유도에 성공하고 있다(비특허문헌 3, 특허문헌 3). 이어서, Mae 등(비특허문헌 3)과 동일한 상동 재조합 방법을 이용하여, OSR1-GFP 리포터 인간 iPS 세포주의 SIX2 유전자 자리에 적색 형광 단백질인 tdTomato를 도입한 OSR1-GFP & SIX2-tdTomato 리포터 iPS 인간 세포주를 제작하고, 이 세포를 사용한 검토에 의해, 인간 다능성 줄기 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도계의 구축에 성공하여, 이 방법으로 얻어진 신장 전구 세포의 급성 신장 장애 모델에서의 약효를 확인하고 있다(비특허문헌 4, 특허문헌 4).
US5,843,780 WO2007/069666 WO2012/011610 WO2014/200115
Mae S, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (2010), 393:877-882 Kobayashi A, et al., Cell Stem Cell, (2008), 3:169-181 Mae S, et al., Nat. Commun., (2013), 4:1367 Toyohara T, et al., Stem Cells Transl. Med., (2015), 4:980-992
본 발명의 과제는, 신장 전구 세포 특이적인 세포 표면 마커를 동정함으로써, 다능성 줄기 세포로부터 신장 전구 세포로 분화 유도된 세포 집단으로부터, 순도가 높은 신장 전구 세포 집단을 취득하고 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하고자 예의 검토를 행한 결과, CD9 음성(CD9(-)), CD55 음성(CD55(-)), CD106 양성(CD106(+)), CD140a 양성(CD140a(+)), CD140b 양성(CD140b(+)), CD165 양성(CD165(+)), CD271 양성(CD271(+)) 및 CD326 음성(CD326(-))으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 사용함으로써, 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단으로부터, 순도가 높은 신장 전구 세포 집단을 취득하고 제조할 수 있음을 처음으로 알아내었다. 본 발명은 그와 같은 지견을 기초로 하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 이하의 특징을 갖는다:
[1] 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 신장 전구 세포를 제조하는 방법이며,
(i) 다능성 줄기 세포를 신장 전구 세포로의 분화를 유도하는 조건 하에서 배양하는 공정; 및
(ⅱ) 공정 (i)에서 얻어진 세포로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는 공정
을 포함하는 방법.
[2] 공정 (ⅱ)에 있어서, 적어도 2개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, [1]에 기재된 방법.
[3] 공정 (ⅱ)에 있어서, 적어도 3개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, [1]에 기재된 방법.
[4] 공정 (ⅱ)에 있어서, 적어도 4개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, [1]에 기재된 방법.
[5] 공정 (ⅱ)에 있어서, CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개의 세포 표면 마커를 사용하는, [1]에 기재된 방법.
[6] 공정 (ⅱ)에 있어서, 적어도 3개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, [5]에 기재된 방법.
[7] 공정 (ⅱ)에 있어서, 세포 표면 마커로서 CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)를 사용하는, [4]에 기재된 방법.
[8] 다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기(iPS) 세포인, [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[9] 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된, 신장 전구 세포 집단.
[11] 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단으로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
[12] 적어도 2개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, [11]에 기재된 방법.
[13] 적어도 3개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, [11]에 기재된 방법.
[14] 적어도 4개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, [11]에 기재된 방법.
[15] CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개의 세포 표면 마커를 사용하는, [11]에 기재된 방법.
[16] 적어도 3개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, [15]에 기재된 방법.
[17] 세포 표면 마커로서 CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)를 사용하는, [11]에 기재된 방법.
[18] 신장 전구 세포가 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 신장 전구 세포인, [11] 내지 [17] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[19] 다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기(iPS) 세포인, [11] 내지 [17] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[20] 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, [11] 내지 [17] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[21] [11] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의하여 얻어진 세포 집단.
본 발명에 의하여, 다능성 줄기 세포(예를 들어 iPS 세포)로부터 신장 전구 세포로 분화 유도된 세포 집단으로부터 세포 표면 마커를 사용함으로써, 고순도의 신장 전구 세포 집단을 취득하고 제조하는 것이 처음으로 가능해졌다. 또한, 본 발명의 방법으로 취득된 신장 전구 세포 집단은 신부전 등의 신장 질환의 재생 의료 용도에 사용될 수 있다.
도 1은, 실시예 1에 있어서의 CD9, CD55, CD106, CD140a, CD140b, CD165, CD271 및 CD326과 OSR1 및 SIX2의 발현을 유세포 분석기로 측정한 결과의 2차원 전개도를 나타낸다. 종축에 각 세포 표면 마커에 대한 항체의 형광 강도를 취하고, 횡축에 OSR1 또는 SIX2 단백질의 발현을 대체하는 형광 리포터의 형광 강도를 취한다.
도 2는, 실시예 2에 있어서의 인간 iPS 세포 유래 분화 세포군으로부터의 CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포의 소팅 결과를 나타낸다. 도 2의 A는, 인간 iPS 세포 유래 분화 세포군을 CD9, CD140a, CD140b, CD271로 염색했을 때의 사이토그램도이며, 종축 및 횡축에 각 세포 표면 마커에 대한 항체의 형광 강도를 취한다. P6은 CD9(-) 및 CD140a(+)의 세포 집단을, P4는 CD9(-) 및 CD140b(+)의 세포 집단을, P3은 CD9(-) 및 CD271(+)의 세포 집단을 나타낸다. 도 2의 A에 나타나는 P3 및 P4 및 P6의 세포 집단을 분취하였다. 도 2의 B의 2차원 전개도는, 좌측으로부터 분화 유도 전의 인간 iPS 세포, 인간 iPS 세포 유래 분화 세포군, 인간 iPS 세포 유래 분화 세포군으로부터 소팅 후의 P3 및 P4 및 P6의 세포 집단에 대한 OSR1과 SIX2의 발현을 유세포 분석기로 측정한 도면이며, 종축 및 횡축에 OSR1 또는 SIX2 단백질의 발현을 대체하는 형광 리포터의 형광 강도를 취한다. 백분율로 나타낸 수치는 OSR1, SIX2 모두 양성 세포(OSR1(+)SIX2(+) 세포; 우측 상방 분획), OSR1 양성 및 SIX2 음성 세포(OSR1(+)SIX2(-) 세포; 좌측 상방 분획), OSR1 음성 및 SIX2 양성 세포(OSR1(-)SIX2(+) 세포; 우측 하방 분획), 및 OSR1, SIX2 모두 음성 세포(OSR1(-)SIX2(-) 세포; 좌측 하방 분획)의 비율을 나타낸다.
도 3은, 실시예 3에 있어서의 인간 iPS 세포 유래 분화 세포군으로부터 분취한 CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포로부터 근위요세관유사 구조를 제작한 일례를 나타낸다. 도 3의 A는, 비특허문헌 4와 동일한 방법으로의, 세포 덩어리 형성 후 Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포와 공배양하는, 근위요세관으로의 분화 방법을 나타낸다. BMP7 및 Rho 키나아제 저해제인 Y-27632(Wako, 253-00513)를 첨가한 마우스 요관아세포(ureteric bud cells(UBC)) 순화 배지를 사용하여, 1×105 세포의 세포 덩어리를 형성시켰다. 익일, BMP7, Y-27632 및 GSK3β 저해제인 BIO(Wako, 029-16241)를 첨가한 마우스 요관아세포 순화 배지로 치환하고, 1일 더 배양한 후, 마이토마이신 C 처리가 완료된 Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포 상에서 공배양을 행하여, 근위요세관으로의 분화 유도를 행하였다. 도 3의 B는, CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포의 세포 덩어리를 Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포와 공배양한 후의 현미경 상(좌측 상방), 면역 염색 상(우측 상방, 좌측 하방), 및 그들의 중첩 화상(우측 하방)을 나타낸다. 또한 로터스 테트라고놀로부스 렉틴(Lotus Tetragonolobus Lectin(LTL)) 발현 세포를 화살표의 확대도로 나타낸다. 도면 중, LTL은 근위요세관의 마커를, Hoechst33342는 세포핵 염색제를 나타내고, 또한 스케일 바는 100㎛를 나타낸다.
도 4는, 실시예 4에 있어서의 음성 선택 마커 CD9와 양성 선택 마커 3종류의 망라적 조합에 의한 OSR1(+)SIX2(+) 세포, OSR1(+)SIX2(-) 세포, OSR1(-)SIX2(+) 세포, 및 OSR1(-)SIX2(-) 세포의 비율을 백분율로 나타낸다. 또한 음성 선택 마커 CD9의 대체로서, CD55 또는 CD326을 사용했을 때의 OSR1(+)SIX2(+) 세포, OSR1(+)SIX2(-) 세포, OSR1(-)SIX2(+) 세포, 및 OSR1(-)SIX2(-) 세포의 비율도 아울러 나타낸다.
도 5는, 실시예 5에 있어서의 CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)의 임의의 세포 표면 마커의 조합에 의해 본래 세포 집단으로부터 회수되는 세포 집단에서의 OSR1(+)SIX2(+) 세포의 비율, 동 세포 표면 마커의 조합으로 규정되는 세포의 본래 세포 집단 중의 비율, 그리고 동 세포 표면 마커의 조합에 의해 회수되는 OSR1(+)SIX2(+) 세포 수/본래 세포 수를 백분율로 나타낸다.
도 6은, 실시예 6에 있어서의 인간 iPS 세포(201B7)주 유래 분화 세포 집단으로부터 CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)를 지표로 소팅한 세포 집단을 근위요세관유사 구조로 분화 유도한 결과를 나타낸다. 도 6의 A는, OSR1(GFP에 의한 검출), SIX2(tdTomato에 의한 검출) 및 각 세포 표면 마커의 형광 강도에 대한 세포 수의 히스토그램을 나타낸다. 도 6의 B는, iPS 세포(201B7)주 유래 분화 세포 집단의 CD9, CD140a, CD140b 또는 CD271의 발현을 유세포 분석기로 측정한 결과의 2차원 전개도이다. 종축 및 횡축에 각 세포 표면 마커에 대한 항체의 형광 강도를 취한다. CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포는, 게이팅(P4 및 P2 및 P3) 분획을 소팅함으로써 세포를 분취하였다. 도 6의 C는, 소팅 후의 CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포의 세포 덩어리를 Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포와 공배양한 후의 현미경 상과 면역 염색 상의 중첩 화상을 나타낸다. 도면 중, LTL은 근위요세관의 마커(프레임 내)를 나타내고, 스케일 바는 100㎛를 나타낸다.
도 7은, 실시예 7에 있어서의 iPS 세포(201B7)주 유래 분화 세포 집단의 항SIX2 항체에 의한 면역 염색의 결과를 나타낸다. 도 7의 A는, 소팅 전의 세포 집단의 면역 염색 상을 나타내고, 도 7의 B는, CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)를 지표로 소팅한 세포 집단의 면역 염색 상을 나타낸다. 도면 중, 백색 화살촉은 SIX2 양성 세포를 나타내고, 투명 화살촉은 SIX2 음성 세포를 나타낸다. 스케일 바는 100㎛를 나타낸다. A, B 모두 사진 좌측은 명시야 상을, 사진 중앙은 항SIX2 항체에 의한 염색 상을, 사진 우측은 Hoechst33342에 의한 핵 염색 상을 나타낸다.
본 발명을 이하에 상세히 설명한다.
본 발명에서는, 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 신장 전구 세포 집단으로부터, 세포 표면 마커를 사용하여, 고순도의 신장 전구 세포 집단을 취득하고 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명에는 이하의 방법(이하, 「본 발명의 제조 방법」이라고도 칭함)이 포함된다:
다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 신장 전구 세포 집단을 제조하는 방법이며,
(i) 다능성 줄기 세포를 신장 전구 세포로의 분화를 유도하는 조건 하에서 배양하는 공정; 및
(ⅱ) 공정 (i)에서 얻어진 세포로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는 공정
을 포함하는 방법.
본 발명에서는 또한, 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는 방법도 제공한다. 구체적으로는, 본 발명에는 이하의 방법(이하, 「본 발명의 선별 방법」이라고도 칭함)이 포함된다:
신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단으로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
본 발명은, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 신장 전구 세포 집단을 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 선별 방법에 의하여 얻어진 세포 집단을 포함한다.
이하에 본 발명에 대하여 설명한다.
1. 공정 (i) 다능성 줄기 세포를 신장 전구 세포 집단으로의 분화를 유도하는 조건 하에서 배양하는 공정:
본 공정에서 사용될 수 있는, 다능성 줄기 세포로부터 신장 전구 세포 집단으로의 분화를 유도하는 방법으로서는, 비특허문헌 4 및 특허문헌 4에 기재되는 방법을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 공정 (ⅱ)에서의 선별에 의해 신장 전구 세포를 농축할 수 있는 점에서, 공정 (i)에서는 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단이 얻어지면 되며, 당해 공정 (i)에서 얻어지는 세포 집단에 포함되는 신장 전구 세포의 함유율은 특별히 문제가 되지 않지만 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상 또는 30% 이상이 예시된다.
본 발명에 의하여 제조되는 신장 전구 세포는, 신장 전구 세포가 농축된 세포 집단으로서 제조되며, 얻어지는 세포 집단에 포함되는 신장 전구 세포의 함유율은 특별히 한정되지 않지만 50% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상 또는 75% 이상이 예시된다. 따라서, 본 발명에서 「선별한다」는 것은, 원하는 세포가 50% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상 또는 75% 이상을 함유하는 세포 집단을 얻는 것이다.
본 발명에서 신장 전구 세포란, 그의 일부가 요세관으로 변화되는 세포를 의미하며, OSR1 및 SIX2 이중 양성(OSR1(+)SIX2(+))인 세포이다. OSR1은, 인간 OSR1 유전자(NCBI의 액세션 번호: NM_145260.2)에 의해 코딩되는 단백질이 예시되고, SIX2는, 인간 SIX2 유전자(NCBI의 액세션 번호: NM_016932.4)에 의해 코딩되는 단백질이 예시된다. OSR1 양성이란, OSR1 유전자의 전사 활성이 높은 것을 의미하며, OSR1의 mRNA를 공지된 방법으로 검출할 수 있는 것, OSR1의 단백질을 공지된 방법으로 검출할 수 있는 것(실시예 1, 2 및 4 내지 6), 또는 OSR1 유전자의 프로모터에 기능적으로 연결한 마커 유전자의 발현을 확인할 수 있는 것 등이 예시된다. SIX2가 양성이라는 것은, 마찬가지로 SIX2 유전자의 전사 활성이 높은 것을 의미하며, SIX2의 mRNA를 공지된 방법으로 검출할 수 있는 것, SIX2의 단백질을 공지된 방법으로 검출할 수 있는 것(실시예 1, 2 및 4 내지 6), 또는 SIX2 유전자의 프로모터에 기능적으로 연결한 마커 유전자의 발현을 확인할 수 있는 것 등이 예시된다. 본 발명에서, 마커 유전자란, 형광 단백질을 코딩하는 유전자가 예시되지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 다능성 줄기 세포란, 생체에 존재하는 많은, 성질·형태가 상이한 세포로 분화 가능한 다능성을 갖고, 또한 증식능도 아울러 갖는 줄기 세포이며, 신장 전구 세포로 유도되는 임의의 세포가 포함된다. 다능성 줄기 세포에는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 배성 줄기 세포(ES 세포), 핵 이식 기술을 이용하여 제작된 배성 줄기 세포(Nuclear transfer embryonic stem cell; ntES 세포), 정자 줄기 세포(Germline stem cell; GS 세포), 배성 생식 세포(Embryonic germ cell; EG 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배양 섬유아세포나 골수 줄기 세포 유래의 다능성 세포(Multi-lineage differentiating stress enduring cell; Muse 세포) 등이 포함된다. 바람직한 다능성 줄기 세포는, 제조 공정에서 배, 난자 등의 파괴를 하지 않고 취득 가능하다는 관점에서 iPS 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 iPS 세포이다.
iPS 세포의 제조 방법은 당해 분야에서 공지이며, 임의의 체세포에 초기화 인자를 도입함으로써 제조될 수 있다. 여기서 초기화 인자란, 예를 들어 Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 또는 Glis1 등의 유전자 또는 유전자 산물이 예시되며, 이들 초기화 인자는 단독으로 사용해도 되고 조합하여 사용해도 된다. 초기화 인자의 조합으로서는, WO2007/069666; WO2008/118820; WO2009/007852; WO2009/032194; WO2009/058413; WO2009/057831; WO2009/075119; WO2009/079007; WO2009/091659; WO2009/101084; WO2009/101407; WO2009/102983; WO2009/114949; WO2009/117439; WO2009/126250; WO2009/126251; WO2009/126655; WO2009/157593; WO2010/009015; WO2010/033906; WO2010/033920; WO2010/042800; WO2010/ 050626; WO2010/056831; WO2010/068955; WO2010/098419; WO2010/102267; WO2010/111409; WO2010/111422; WO2010/115050; WO2010/124290; WO2010/147395; WO2010/147612; Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol., (2008), 26:795-797; Shi Y, et al., Cell Stem Cell, (2008), 2:525-528; Eminli S, et al., Stem Cells, (2008), 26:2467-2474; Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol., (2008), 26:1269-1275; Shi Y, et al., Cell Stem Cell, (2008), 3:568-574; Zhao Y, et al., Cell Stem Cell, (2008), 3:475-479; Marson A, Cell Stem Cell, (2008), 3:132-135; Feng B, et al., Nat. Cell Biol., (2009), 11:197-203; R. L. Judson et al., Nat. Biotechnol., (2009), 27:459-461; Lyssiotis CA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2009), 106:8912-8917; Kim JB, et al., Nature, (2009), 461:649-643; Ichida JK, et al., Cell Stem Cell., (2009), 5:491-503; Heng JC, et al., Cell Stem Cell, (2010), 6:167-174; Han J, et al., Nature, (2010), 463:1096-1100; Mali P, et al., Stem Cells, (2010), 28:713-720; Maekawa M, et al., Nature, (2011), 474:225-229.에 기재된 조합이 예시된다.
체세포에는 비한정적으로 신생아(동물의 태아)의 체세포, 및 건강한 사람 또는 환자의 체세포 모두가 포함되고, 또한 그들 유래의 초대 배양 세포, 계대 세포 및 주화 세포 모두가 포함된다. 구체적으로는 체세포는, 예를 들어 (1) 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 치수 줄기 세포 등의 조직 줄기 세포(체성 줄기 세포), (2) 조직 전구 세포, (3) 혈액 세포(말초혈 세포, 제대혈 세포 등), 근육 세포, 피부 세포, 털 세포, 간장 세포, 위점막 세포, 장 세포, 비장 세포, 췌장 세포, 뇌 세포, 폐 세포, 신장 세포 및 지방 세포 등의 장기, 조직에 존재하는 분화 세포 등이 예시된다.
또한, iPS 세포를 이식용 세포가 재료로서 사용하는 경우, 거부 반응이 일어나지 않는다는 관점에서 이식처인 개체의 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자형이 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 체세포를 사용하는 것이 바람직하다. 여기서 「실질적으로 동일하다」는 것은, 이식한 세포에 대하여 면역 제어제에 의해 면역 반응을 억제할 수 있을 정도로 HLA 유전자형이 일치하고 있는 것이며, 예를 들어 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3유전자 자리, 또는 그들에 HLA-C를 더한 4유전자 자리가 일치하는 HLA형을 갖는 체세포이다.
일 실시 형태에 있어서, 공정 (i)로서는, 비특허문헌 4 및 특허문헌 4에 기재되는 다능성 줄기 세포로부터 신장 전구 세포 집단으로의 분화를 유도하는 방법이 이용되며, 구체적으로는 이하의 공정 (i-1) 내지 (i-3)을 포함한다:
(i-1) 다능성 줄기 세포를, 액티빈 A, GSK-3β 저해제 및 레티노산 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 공정,
(i-2) 공정 (i-1)에서 얻어진 세포 집단을, BMP7, GSK-3β 저해제 및 레티노산 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 공정, 및
(i-3) 공정 (i-2)에서 얻어진 세포 집단을, TGFβ 시그널 자극제 및 BMP 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정.
이하에 각 공정 (i-1) 내지 (i-3)에 대하여 설명한다.
(i-1) 다능성 줄기 세포를, 액티빈 A, GSK-3β 저해제 및 레티노산 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 공정:
본 공정에서는, 다능성 줄기 세포를 당해 분야에서 공지된 임의의 방법으로 분리하여 부유 배양 또는 접착 배양에 의해 배양해도 된다. 다능성 줄기 세포의 분리 방법으로서는, 예를 들어 기계적 분리나, 프로테아제 활성과 콜라게나아제 활성을 갖는 분리 용액(예를 들어 Accutase(등록 상표) 및 Accumax(Innovative Cell Technologies, Inc)) 또는 콜라게나아제 활성만을 갖는 분리 용액을 사용한 분리를 들 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제 활성과 콜라게나아제 활성을 갖는 분리 용액을 사용하여 해리하고 기계적으로 미세하게 단일 세포로 분산하는 방법이다. 본 공정에서 사용하는 인간 다능성 줄기 세포로서는, 사용한 배양 접시에 대하여 80% 전면(confluent)이 되기까지 배양된 콜로니를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서 사용되는 부유 배양이란, 세포를 배양 접시와 비접착 상태에서 배양하는 것이며, 특별히 제한은 되지 않지만 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리(예를 들어 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 것, 또는 인공적으로 접착을 억제하는 처리(예를 들어 폴리히드록시에틸메타크릴산(poly-HEMA)에 의한 코팅 처리)한 것을 사용하여 배양할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 접착 배양이란, 세포를 배양 접시에 접착시킨 상태에서 배양하는 것이며, 특별히 제한은 되지 않지만 코팅 처리된 배양 접시에서 배양하는 것도 가능하다. 코팅제로서는, 예를 들어 마트리겔(BD Biosciences), Synthemax(등록 상표)(Corning), 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 헤파란황산프로테오글리칸 또는 엔탁틴 및 이들의 조합을 들 수 있으며, 바람직하게는 마트리겔, Synthemax(등록 상표), 또는 젤라틴이다.
공정 (i-1)에서 사용되는 배지는, 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지에, 액티빈 A, GSK-3β 저해제 및 레티노산 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 첨가하여 조제할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 본 공정에서 사용되는 물질은 액티빈 A 및 GSK-3β 저해제의 조합, 또는 GSK-3β 저해제 및 레티노산 유도체의 조합이다. 기초 배지로서는, 예를 들어 Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium(αMEM) 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12(F12) 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 배지에는 혈청(예를 들어 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum; FBS))이 함유되어 있어도 되고, 또는 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들어 알부민, KnockOut Serum Replacement(KSR)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen) 등 중 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 트란스페린, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(Non-essential amino acids; NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등 중 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 일 실시 형태에 있어서, 기초 배지는, GlutaMAX, 혈청 및 항생 물질을 포함하는, DMEM과 F12의 1:1의 혼합 배지(DMEM/F12)이다.
공정 (i-1)에 있어서, 액티빈 A로서는, 인간 및 다른 동물 유래의 액티빈 A, 그리고 이들의 기능적 개변체가 포함되며, 예를 들어 R&D systems사 등의 시판품을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 액티빈 A의 농도는 1ng/ml 내지 1000ng/ml, 바람직하게는 10ng/ml 내지 500ng/ml, 보다 바람직하게는 50ng/ml 내지 200ng/ml이다.
공정 (i-1)에 있어서, GSK-3β 저해제로서는, GSK-3β의 기능, 예를 들어 키나아제 활성을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 인디루빈 유도체인 BIO(별명, GSK-3β 저해제 Ⅸ; 6-브로모인디루빈3'-옥심), 말레이미드 유도체인 SB216763(3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), 페닐α브로모메틸케톤 화합물인 GSK-3β 저해제 Ⅶ(2,4'-디브로모아세토페논), 세포막 투과형의 인산화펩티드인 L803-mts(별명, GSK-3β펩티드 저해제; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2(서열 번호 15)), 및 높은 선택성을 갖는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴)(Nature, (2008), 453:519-523)을 들 수 있다. 이들 화합물은, 예를 들어 Stemgent사, Calbiochem사, Biomol사 등으로부터 입수 가능하며, 또한 스스로 제작해도 된다. 본 공정에서 사용하는 바람직한 GSK-3β 저해제로서는 CHIR99021을 들 수 있다. 본 공정에서 사용하는 GSK-3β 저해제의 농도는, 사용하는 GSK-3β 저해제에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 GSK-3β 저해제로서 CHIR99021을 사용하는 경우, 0.01μM 내지 100μM, 바람직하게는 0.1μM 내지 10μM, 더욱 바람직하게는 1μM 내지 3μM이다.
공정 (i-1)에 있어서, 레티노산 유도체는, 천연 레티노산이 갖는 기능을 유지하는 인공적으로 수식되어 있어도 되는 레티노산이며, 예를 들어 레티노이드 화합물 및 비타민 A 화합물을 포함한다. 레티노이드 화합물의 예로서는, 레티노산, 3-디히드로레티노산, 4-[[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르보닐]아미노]-벤조산(AM580)(Tamura K, et al., Cell Differ. Dev., (1990), 32:17-26), 4-[(1E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로펜-1-일]-벤조산(TTNPB)(Strickland S, et al., Cancer Res., (1983), 43:5268-5272), Takenaga, K.et al., Cancer Res., (1980), 40:914-919에 기재되어 있는 화합물, 팔미트산 레티놀, 레티놀, 레티날, 3-디히드로레티놀, 3-디히드로레티날 등을 들 수 있다. 레티노산 화합물이란, 레티노이드 화합물 중, 카르복실기를 갖는 화합물이며, 예를 들어 레티노산, 3-디히드로레티노산, AM580, TTNPB 등을 들 수 있다. 본 공정의 일 실시 형태에 있어서, 레티노산 유도체는 레티노이드 화합물 또는 비타민 A 화합물이다. 본 공정의 다른 실시 형태에 있어서, 레티노산 유도체는 레티노산 화합물이며, 또 다른 실시 형태에 있어서, 레티노산 유도체는 비타민 A 화합물이다. 본 공정에서 사용하는 바람직한 레티노산 유도체로서는 AM580 또는 TTNPB를 들 수 있다. 본 공정에서 사용하는 레티노산 유도체의 농도는, 사용하는 레티노산 유도체에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 레티노산 유도체로서 AM580 또는 TTNPB를 사용하는 경우, 0.01μM 내지 100μM, 바람직하게는 0.1μM 내지 10μM, 더욱 바람직하게는 0.5μM 내지 2μM이다.
공정 (i-1)에서 사용되는 배지는 ROCK 저해제를 더 포함하고 있어도 된다. 특히, 본 공정이 다능성 줄기 세포를 단일 세포에 분산시키는 공정을 포함하는 경우에는, 배지에 ROCK 저해제가 포함되어 있는 것이 바람직하다.
ROCK 저해제는, Rho-키나아제(ROCK)의 기능을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 Y-27632(예를 들어 Ishizaki et al., Mol. Pharmacol., (2000), 57, 976-983; Narumiya et al., Methods Enzymol., (2000), 325, 273-284), Fasudil/HA1077(예를 들어 Uehata et al., Nature, (1997), 389:990-994), H-1152(예를 들어 Sasaki et al., Pharmacol.Ther., (2002), 93:225-232), Wf-536(예를 들어 Nakajima et al., Cancer Chemother. Pharmacol., (2003), 52(4):319-324) 및 그들의 유도체, 그리고 ROCK에 대한 안티센스 핵산, RNA 간섭 유도성 핵산(예를 들어 siRNA), 우성 음성 변이체 및 그들의 발현 벡터를 들 수 있다. 또한 ROCK 저해제로서는 다른 공지된 저분자 화합물도 사용할 수 있다(예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2005/0209261호, 동 제2005/0192304호, 동 제2004/0014755호, 동 제2004/0002508호, 동 제2004/0002507호, 동 제2003/0125344호, 동 제2003/0087919호 및 국제 공개 제2003/062227호, 동 제2003/059913호, 동 제2003/062225호, 동 제2002/076976호, 동 제2004/039796호 참조). 본 발명에서는 1종 또는 2종 이상의 ROCK 저해제가 사용될 수 있다. 본 공정에서 사용하는 바람직한 ROCK 저해제로서는 Y-27632를 들 수 있다. 본 공정에서 사용하는 ROCK 저해제의 농도는, 사용하는 ROCK 저해제에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 ROCK 저해제로서 Y-27632를 사용하는 경우, 0.1μM 내지 100μM, 바람직하게는 1μM 내지 50μM, 더욱 바람직하게는 5μM 내지 20μM이다.
공정 (i-1)에 있어서, 배양 온도는 이하에 한정되지 않지만 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는 약 2 내지 5%, 바람직하게는 약 5%이다. 본 공정의 배양 시간은, 예를 들어 2일간 이하의 배양이며, 바람직하게는 2일간이다.
(i-2) 공정 (i-1)에서 얻어진 세포 집단을, BMP7, GSK-3β 저해제 및 레티노산 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 공정:
본 공정에서는, 상술한 공정 (i-1)에서 얻어진 부유 배양 후의 세포 집단을, 그대로 코팅 처리된 배양 접시에서 임의의 배지 중에서 접착 배양해도 되고, 또는 상술한 공정 (i-1)에서 접착 배양에 의하여 얻어진 세포 집단을, 배지의 교환에 의해 배양을 계속해도 된다.
공정 (i-2)에서 사용되는 배지는, 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지에, BMP7, GSK-3β 저해제 및 레티노산 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 첨가하여 조제할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 본 공정에서 사용되는 물질은 BMP7 및 GSK-3β 저해제의 조합, 또는 레티노산 유도체이다. 기초 배지로서는, 예를 들어 IMDM 배지, Medium 199 배지, EMEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 배지에는 혈청(예를 들어 FBS)이 함유되어 있어도 되고, 또는 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들어 알부민, KSR(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen) 등 중 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 트란스페린, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류, 및 이들의 동등물 등 중 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 일 실시 형태에 있어서, 기초 배지는, GlutaMAX, KSR, 비필수 아미노산, 2-머캅토에탄올 및 항생 물질을 포함하는 DMEM/F12이다.
공정 (i-2)에 있어서, 예를 들어 공정 (i-1)에서 얻어진 세포 집단을, BMP7 및 GSK-3β 저해제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하고, 그 후에 레티노산 유도체를 포함하는 배지에서 더 배양해도 된다. 바람직하게는 공정 (i-2)에 있어서, 공정 (i-1)에서 얻어진 세포 집단을, BMP7 및 GSK-3β 저해제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하고, 그 후에 레티노산 유도체 및 TGFβ 시그널 자극제를 포함하는 배지에서 더 배양한다. 즉, 공정 (i-2)는 다음의 공정 (i-2-a) 및 (i-2-b)의 2공정으로 분리하여 행해도 된다: (i-2-a) BMP7 및 GSK-3β 저해제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 공정, 및 (i-2-b) 레티노산 유도체 및 TGFβ 시그널 자극제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정. 보다 바람직하게는 공정 (i-2)에 있어서, 공정 (i-2-a)는 BMP7 및 GSK-3β 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정이고, 공정 (i-2-b)는 레티노산 유도체 및 TGFβ 시그널 자극제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정이다.
공정 (i-2)에 있어서, BMP7로서는, 인간 BMP7(NCBI의 액세션 번호: NM_001719.2) 및 다른 동물 유래의 BMP7, 그리고 이들의 기능적 개변체(분화 유도능을 유지한 개변체)가 포함되며, 예를 들어 Invitrogen사, R&D사 등의 시판품을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 BMP7의 농도는 1ng/ml 내지 1000ng/ml, 바람직하게는 10ng/ml 내지 500ng/ml, 보다 바람직하게는 50ng/ml 내지 200ng/ml이다.
공정 (i-2)에 있어서, GSK-3β 저해제는, 상술한 공정 (i-1)에 대하여 예시한 GSK-3β 저해제를 사용할 수 있으며, 바람직한 GSK-3β 저해제로서는 CHIR99021을 들 수 있다. 본 공정에서 사용하는 GSK-3β 저해제의 농도는, 사용하는 GSK-3β 저해제에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 GSK-3β 저해제로서 CHIR99021을 사용하는 경우, 0.01μM 내지 100μM, 바람직하게는 0.1μM 내지 10μM, 더욱 바람직하게는 1μM 내지 3μM이다.
공정 (i-2)에 있어서, 레티노산 유도체는, 상술한 공정 (i-1)에 대하여 예시한 레티노산 유도체를 사용할 수 있으며, 바람직한 레티노산 유도체로서는 AM580 또는 TTNPB를 들 수 있다. 본 공정에서 사용하는 레티노산 유도체의 농도는, 사용하는 레티노산 유도체에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 레티노산 유도체로서 AM580 또는 TTNPB를 사용하는 경우, 0.01μM 내지 100μM, 바람직하게는 0.1μM 내지 10μM, 더욱 바람직하게는 0.5μM 내지 2μM이다.
공정 (i-2)에 있어서, TGFβ 시그널 자극제는, TGFβ 시그널 경로를 활성화하는 것인 한 특별히 한정되지 않으며, TGFβ 시그널 자극제로서는, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 등의 단백질(Peprotech, R&D사 등으로부터 입수 가능), IDE1(1-[2-[(2-카르복시페닐)메틸렌]히드라지드]헵탄산) 및 IDE2(헵탄이산1-(2-시클로펜틸리덴히드라지드))(Borowiak M, et al., Cell Stem Cell, (2009), 4:348-358) 등의 화합물이 예시된다. IDE1 및 IDE2는 Stemgent사, Tocris사 등으로부터 입수 가능하다. 바람직한 TGFβ 시그널 자극제로서는 TGFβ1을 들 수 있다. 본 공정에서 사용하는 TGFβ 시그널 자극제의 농도는, 사용하는 TGFβ 시그널 자극제에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 TGFβ 시그널 자극제로서 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 등의 단백질을 사용하는 경우의 농도는 0.1ng/ml 내지 100ng/ml, 바람직하게는 1ng/ml 내지 10ng/ml, 더욱 바람직하게는 5ng/ml 내지 10ng/ml이다. 또한 IDE1 및 IDE2를 사용하는 경우의 농도는 1μM 내지 100μM, 바람직하게는 25μM 내지 75μM, 더욱 바람직하게는 40μM 내지 60μM이다.
공정 (i-2)에 있어서, 배양 온도는 이하에 한정되지 않지만 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는 약 2 내지 5%, 바람직하게는 약 5%이다. 배양 시간으로서는, 예를 들어 3일 이상의 배양이며, 바람직하게는 3일 이상 12일 이하, 보다 바람직하게는 3일 이상 9일 이하를 들 수 있다. 이때, 배지는 3일마다 교환하는 것이 바람직하다. 공정 (i-2)가 공정 (i-2-a) 및 (i-2-b)를 포함하는 경우, 공정 (i-2)의 배양 시간으로서는 상술한 바와 같은데, 공정 (i-2-a)의 배양 시간으로서는, 예를 들어 1일 이상의 배양이며, 바람직하게는 2일 이상 11일 이하, 보다 바람직하게는 2일 이상 6일 이하를 들 수 있고, 공정 (i-2-b)의 배양 시간으로서는, 예를 들어 1일 이상의 배양이며, 바람직하게는 2일 이상 11일 이하, 보다 바람직하게는 3일 이상 6일 이하를 들 수 있다. 이때, 배지는 3일마다 교환하는 것이 바람직하다.
상술한 공정 (i-1) 및 (i-2)에 의하여 다능성 줄기 세포로부터 중간 중배엽 세포가 유도될 수 있다. 중간 중배엽 세포를 특징짓는 마커로서 OSR1이 알려져 있으며, 일 실시 형태에 있어서, 공정 (i-1) 및 (i-2)에 의하여 유도되는 세포 집단에는 OSR1 양성 SIX2 음성(OSR1(+)SIX2(-))의 중간 중배엽 세포가 많이 함유되지만, OSR1 및 SIX 2 이중 양성(OSR1(+)SIX2(+))의 신장 전구 세포가 포함되어도 된다. 따라서, 공정 (i)로서 상술한 공정 (i-1) 및 (i-2)에서 당해 공정을 종료해도 되지만, 신장 전구 세포의 함유율을 높인다는 관점에서 공정 (i-3)을 더 행하는 것이 바람직하다.
(i-3) 공정 (i-2)에서 얻어진 세포 집단을, TGFβ 시그널 자극제 및 BMP 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정:
본 공정에서는, 상술한 공정 (i-1) 및 (i-2)에서 얻어진 세포(중간 중배엽 세포) 집단을 당해 분야에서 공지된 임의의 방법으로 분리하거나 또는 해당 세포를 그대로, 부유 배양 또는 접착 배양에 의해 배양해도 된다. 세포의 분리 방법으로서는, 예를 들어 기계적 분리나, 프로테아제 활성과 콜라게나아제 활성을 갖는 분리 용액(예를 들어 Accutase(등록 상표) 및 Accumax(Innovative Cell Technologies, Inc)) 또는 콜라게나아제 활성만을 갖는 분리 용액을 사용한 분리를 들 수 있다.
공정 (i-3)에서 사용되는 배지는, 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지에 TGFβ 시그널 자극제 및 BMP 저해제를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어 IMDM 배지, Medium 199 배지, EMEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 배지에는 혈청(예를 들어 FBS)이 함유되어 있어도 되고, 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들어 알부민, KSR(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen) 등 중 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 트란스페린, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류, 및 이들의 동등물 등 중 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 일 실시 형태에 있어서, 기초 배지는, GlutaMAX, KSR, 비필수 아미노산, 2-머캅토에탄올 및 항생 물질을 포함하는 DMEM/F12이다.
공정 (i-3)에 있어서, TGFβ 시그널 자극제는, TGFβ 시그널 경로를 활성화하는 것인 한 특별히 한정되지 않으며, TGFβ 시그널 자극제로서는, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 등의 단백질, IDE1 및 IDE2 등의 화합물이 예시된다. 바람직한 TGFβ 시그널 자극제로서는 TGFβ1을 들 수 있다. 본 공정에서 사용하는 TGFβ 시그널 자극제의 농도는, 사용하는 TGFβ 시그널 자극제에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 TGFβ 시그널 자극제로서 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 등의 단백질을 사용하는 경우의 농도는 0.1ng/ml 내지 100ng/ml, 바람직하게는 1ng/ml 내지 10ng/ml, 더욱 바람직하게는 5ng/ml 내지 10ng/ml이다. 또한 IDE1 및 IDE2를 사용하는 경우의 농도는 1μM 내지 100μM, 바람직하게는 25μM 내지 75μM, 더욱 바람직하게는 40μM 내지 60μM이다.
공정 (i-3)에 있어서, BMP 저해제는, BMP 시그널 경로를 활성화하는 것인 한 특별히 한정되지 않으며, BMP 저해제로서는, 코르딘, 노긴, 폴리스타틴 등의 단백질성 저해제, 도르소모르핀(6-[4-(2-피페리딘-1-일-에톡시)페닐]-3-피리딘-4-일-피라졸로[1,5-a]피리미딘) 및 그의 유도체(Yu et al., Circulation, (2007), 116:Ⅱ_60; Yu et al., Nat. Chem. Biol., (2008), 4:33-41; J. Hao et al., PLoS ONE, (2008), 3:e2904), DMH1(4-[6-(4-이소프로폭시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린, 4-[6-[4-(1-메틸에톡시)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]-퀴놀린), 그리고 LDN193189(4-(6-(4-(피페리딘-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린)이 예시된다. 이들 화합물은, 예를 들어 Stemgent, Tocris Bioscience, MERCK LIFE SCIENCE나 Wako사 등으로부터 입수 가능하며, 또한 스스로 제작해도 된다. 바람직한 BMP 저해제로서는 DMH1, LDN193189, 노긴 및 도르소모르핀을 들 수 있으며, 보다 바람직한 BMP 저해제는 DMH1이다. 본 공정에서 사용하는 BMP 저해제의 농도는, 사용하는 BMP 저해제에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 BMP 저해제로서 코르딘, 노긴, 폴리스타틴 등의 단백질성 저해제를 사용하는 경우의 농도는 0.1ng/ml 내지 1000ng/ml, 바람직하게는 1ng/ml 내지 500ng/ml, 보다 바람직하게는 10ng/ml 내지 100ng/ml이다. 도르소모르핀, LDN193189, DMH1을 사용하는 경우, 0.01μM 내지 100μM, 바람직하게는 0.1μM 내지 10μM, 더욱 바람직하게는 0.5μM 내지 1μM이다.
일 실시 형태에 있어서, 공정 (i-3)에서 사용되는 TGFβ 시그널 자극제 및 BMP 저해제의 조합은 TGFβ1 및 DMH1이다.
공정 (i-3)의 배양 공정에 있어서, 기초 배지에, 섬유아세포 증식 인자(Fibroblast Growth Factor; FGF) 9, FGF20, BMP7, 레티노산 유도체 및 GSK-3β 저해제 중 어느 것 또는 임의의 조합을 더 첨가해도 된다.
공정 (i-3)의 배양 공정의 일수는, 장기간 배양함으로써 신장 전구 세포 집단의 제조 효율에 특별히 영향이 없기 때문에 상한은 없지만, 예를 들어 2일 이상, 4일 이상, 6일 이상, 8일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상, 16일 이상, 17일 이상, 18일 이상, 19일 이상, 20일 이상을 들 수 있다.
공정 (i-3)에 있어서, 배양 온도는 이하에 한정되지 않지만 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이고, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해지며, CO2 농도는 약 2 내지 5%, 바람직하게는 약 5%이다.
2. 공정 (ⅱ) 공정 (i)에서 얻어진 세포로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는 공정, 그리고 본 발명의 선별 방법:
공정 (ⅱ) 및 본 발명의 선별 방법(이하, 본 장에 있어서 통틀어 「공정 (ⅱ)」라 칭함)에 있어서, CD9, CD55, CD106, CD140a, CD140b, CD165, CD271, CD326으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커의 발현의 유무를 지표로, 공정 (i)에서 얻어진 세포 집단으로부터 보다 순화된 세포 집단을 선별한다. 보다 구체적으로는, CD106, CD140a, CD140b, CD165 및 CD271에 대해서는 양성인 것, CD9, CD55 및 CD326에 대해서는 음성인 것을 지표로 한다. 본 명세서 중에서 세포 표면 마커에 대한 (+)의 표기는, 세포가 그의 항원에 대하여 양성인 것을 의미하며, CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) 및 CD271(+)를 양성 선택 마커라 칭한다. 본 명세서 중에서 세포 표면 마커에 대한 (-)의 표기는, 세포가 그의 항원에 대하여 음성인 것을 의미하며, CD9(-), CD55(-) 및 CD326(-)를 음성 선택 마커라 칭한다. 본 명세서 중에서 양성 및 음성인 선택 마커를 통틀어 세포 표면 마커라고도 칭한다.
바람직한 양태에 있어서, 공정 (ⅱ)에서 사용하는 세포 표면 마커의 조합은, CD9, CD55, CD106, CD140a, CD140b, CD165, CD271, CD326으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개, 3개 또는 4개의 세포 표면 마커의 조합이어도 된다. 예를 들어 적어도 2개의 세포 표면 마커의 조합은, 바람직하게는 CD9(-), CD55(-) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 1개의 음성 선택 마커(바람직하게는 CD9(-)), 그리고 CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군(바람직하게는 CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군)으로부터 선택되는 1개의 양성 선택 마커의 조합을 포함하고 있어도 된다. 적어도 3개의 세포 표면 마커의 조합은, 바람직하게는 CD9(-), CD55(-) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 1개의 음성 선택 마커(바람직하게는 CD9(-)), 그리고 CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군(바람직하게는 CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군)으로부터 선택되는 2개의 양성 선택 마커의 조합; 또는 CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군에서 선택되는 3개의 양성 선택 마커의 조합을 포함하고 있어도 된다. 적어도 4개의 세포 표면 마커의 조합은, 바람직하게는 CD9(-), CD55(-) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 1개의 음성 선택 마커(바람직하게는 CD9(-)), 그리고 CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군에서 선택되는 3개의 양성 선택 마커의 조합을 포함하고 있어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 공정 (ⅱ)에서 사용하는 세포 표면 마커는, CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개 또는 3개의 세포 표면 마커이며, 바람직하게는 CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)의 조합이다.
공정 (ⅱ)에서 사용하는 세포 표면 마커는, 인간을 포함하지만 인간에 한정되지 않는 포유 동물 유래의 신장 전구 세포의 세포 집단을 선별하기 위하여 사용될 수 있다. 인간 신장 전구 세포의 세포 집단을 선별하는 경우, 8개의 각 인간 세포 표면 마커의 NCBI 액세션 번호는 이하와 같이 대응한다.
CD9: NM_001769.3(서열 번호 1)
CD55: NM_000574.4(서열 번호 3)
CD106: NM_001078.3(서열 번호 5)
CD140a: NM_006206.4(서열 번호 7)
CD140b: NM_002609.3(서열 번호 9)
CD165: geneID_23449
CD271: NM_002507.3(서열 번호 11)
CD326: NM_002354.2(서열 번호 13)
인간의 각 세포 표면 마커에는, 상기 액세션 번호에 대응한 뉴클레오티드 배열을 갖는 유전자 및 당해 유전자에 코딩되는 단백질, 그리고 천연에 존재하는 변이체가 포함된다.
인간 CD9는, 서열 번호 1의 염기 서열(염기 번호 185 내지 871)을 갖는 유전자에 의해 코딩되며, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 CD55는, 서열 번호 3의 염기 서열(염기 번호 295 내지 1440)을 갖는 유전자에 의해 코딩되며, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 CD106은, 서열 번호 5의 염기 서열(염기 번호 222 내지 2441)을 갖는 유전자에 의해 코딩되며, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 CD140a는, 서열 번호 7의 염기 서열(염기 번호 332 내지 3601)을 갖는 유전자에 의해 코딩되며, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 CD140b는, 서열 번호 9의 염기 서열(염기 번호 470 내지 3790)을 갖는 유전자에 의해 코딩되며, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 CD271은, 서열 번호 11의 염기 서열(염기 번호 126 내지 1409)을 갖는 유전자에 의해 코딩되며, 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 CD326은, 서열 번호 13의 염기 서열(염기 번호 359 내지 1303)을 갖는 유전자에 의해 코딩되며, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 CD165는, AD2 또는 gp37로서도 알려지는 37-42kDa의 막 표면 단백질이다. CD165에 특이적으로 결합하는 항체로서 모노클로날 항체 SN2가 동정되어 있으며(Seon, BK, et al., J. Immunol., (1984, 132:2089-2095), 당해 항체는 시판되고 있다.
상기 세포 표면 마커의 천연에 존재하는 변이체는, CD9, CD55, CD106, CD140a, CD140b, CD271 및 CD326에 대해서는, 상기 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상의 동일성을 갖는 유전자에 의해 코딩되거나, 상기 아미노산 서열에 대하여 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 세포 표면 마커를 의미한다.
핵산 배열 또는 아미노산 서열에 대하여, 본 명세서에 있어서의 「동일성」이란, NEEDLE program(Needleman SB, et al., J. Mol. Biol., (1970), 48:443-453) 검색에 의해 디폴트로 준비되어 있는 파라미터를 이용하여 얻어진 값 Identity를 의미한다. 상기 파라미터는 이하와 같다.
Gap penalty=10
Extend penalty=0.5
Matrix=EBLOSUM62
또한, 상기 인간의 세포 표면 항원에 결합하는 특이적인 항체는 시판되고 있다. 그와 같은 항체의 일례로서, 후술하는 실시예에서 기재되는 것이 포함된다. 상기 세포 표면 마커의 각각에 특이적으로 결합하는 시판 항체가 결합한다는 특징을 유지하는 세포 표면 마커도 또한, 본 발명에서 세포 집단의 선별에 이용 가능한 세포 표면 마커에 포함된다.
공정 (ⅱ)에 있어서, 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는 것은, 당해 분야에서 공지된 다양한 방법에 의하여 행할 수 있다. 예를 들어 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여, 세포에의 해당 항체의 결합에 기초하여 세포를 선별하는 방법을 들 수 있다. 이와 같은 방법으로서, 형광 표지된 항체를 사용하여 셀 소터를 사용하는 방법(예를 들어 FACS(등록 상표)(BD Biosciences)), 항체를 표지한 자기 비즈를 사용하여 자성에 의하여 세포를 선별하는 방법(예를 들어 MACS(등록 상표)(밀테니 바이오텍)), 항체가 고정화된 담체(예를 들어 세포 농축 칼럼)를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
3. 신장 질환 치료제, 신장 질환 치료 방법 및 신장 질환 치료용 세포를 제조하는 방법:
본 발명의 방법에 의하여 취득된 신장 전구 세포 집단은 신장 질환 치료제로서 이용 가능하다. 따라서, 본 발명은 이하의 신장 질환 치료용 세포의 제조 방법 및 신장 질환 치료용의 세포 집단의 선별 방법을 제공한다:
신장 질환 치료용 세포를 제조하는 방법이며,
(i) 다능성 줄기 세포를 신장 전구 세포로의 분화를 유도하는 조건 하에서 배양하는 공정; 및
(ⅱ) 공정 (i)에서 얻어진 세포로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는 공정
을 포함하는 방법.
신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단으로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 신장 질환 치료용의 세포 집단을 선별하는, 방법.
본 발명에서의 신장 질환 치료용 세포란, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커로 특징지어지는 세포이며, 바람직하게는 CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)로 특징지어지는 세포이다.
본 발명에서는, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 신장 전구 세포 집단 또는 본 발명의 선별 방법으로 선별된 신장 전구 세포 집단을 포함하는 신장 질환 치료제, 및 본 발명의 제조 방법으로 제조된 신장 전구 세포 집단 또는 본 발명의 선별 방법으로 선별된 신장 전구 세포 집단을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는 신장 질환 치료 방법을 제공한다. 환자로의 신장 전구 세포 집단 또는 치료제의 투여 방법으로서는, 예를 들어 취득된 신장 전구 세포 집단을 시트화하여 환자의 신장에 첩부하는 방법, 취득된 신장 전구 세포 집단을 생리 식염수 등에 현탁시키고 환자의 신장에 직접 또는 경혈관 투여에 의해 이식하는 방법, 마트리겔 등으로 구성된 스캐폴드 상에서 3차원 배양하여 얻어진 신장 전구 세포 덩어리를 이식하는 방법, 투석 칼럼에 신장 전구 세포 집단을 충전하는 방법, 마이크로캡슐에 신장 전구 세포 집단을 포매하고 투여하는 방법 등을 들 수 있다. 신장 질환으로서는, 만성 신부전에까지는 이르지 않은 상태를 포함하는 만성 신장병이 예시된다.
본 발명에 있어서, 신장 질환 치료제에 포함되는 신장 전구 세포의 세포 수는, 질환의 중증도, 환부나 체구의 크기에 맞추어 적절히 증감하여 조제되어도 된다.
실시예
이하의 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 그들 실시예에 의하여 제한되지는 않는다.
[실시예 1]
<OSR1 및 SIX2와 각종 세포 표면 마커의 유세포 분석법에 의한 신장 전구 세포 집단의 2차원 전개>
iPS 세포는, 비특허문헌 3에 기재된 방법으로 제작된, 내재성의 OSR1의 유전자 발현과 연동하여 GFP를 발현시키고, 내재성의 SIX2의 유전자 발현과 연동하여 tdTomato를 발현시키는 OSR1-GFP & SIX2-tdTomato 리포터 인간 iPS 세포주를 사용하였다. 이 인간 iPS 세포주로부터, 비특허문헌 4에 기재된 방법에 따라, 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단으로의 분화 유도를 행하였다. Human Cell Surface Marker Screening Panel(BD Biosciences: 560747)을 사용하여, 신장 전구 세포에 특이적인 발현을 하는 세포 표면 마커의 탐색을 행한 결과, 목적으로 하는 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단을 명확히 분획할 수 있는 세포 표면 마커로서 CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)를 동정하였다(도 1).
[실시예 2]
<CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)의 세포 집단에는 70% 이상의 신장 전구 세포가 포함된다>
실시예 1에서 얻어진 세포 표면 마커를 복수 조합하여 사용함으로써, 인간 iPS 세포 유래 분화 세포 집단으로부터 분획한 세포에 포함되는 신장 전구 세포의 비율을 높일 수 있는지의 여부를 검토하였다.
먼저, 음성 선택 마커로서 1개, 양성 선택 마커로서 3개 사용함으로써, 인간 iPS 세포 유래 분화 세포 집단에 포함되는 신장 전구 세포의 비율을 높일 수 있는지의 여부를 검토하였다. 세포 표면 마커로서는, 실시예 1에서 OSR1 및 SIX2의 2차원 전개도에서 세포 집단의 명확한 분리 상이 얻어진 CD9, CD140a, CD140b 및 CD271을 선정하고, 각 세포 표면 마커에 대한 항체로서는 각각 APC-H7 Mouse Anti Human CD9(BD Biosciences, 655409), Alexa Fluor(등록 상표) 647 Mouse Anti-Human CD140a(BD Biosciences, 562798), BV421 Mouse Anti-Human CD140b(BD Biosciences, 564124) 및 BV510 Mouse Anti-Human CD271(BD Biosciences, 563451)을 사용하였다. 각 항체는 20배 희석으로 사용하여, 실온에서 15분간 반응시켰다. 반응 후, 2% FBS 함유 PBS로 2회 세정하고, FACSAria Ⅲ(등록 상표)(BD Biosciences)을 사용하여 해석하였다. 그리고, 그의 2차원 전개도로부터 CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)의 세포 분획을 설정하여, 당해 세포를 분취하였다. 분취한 세포 집단을 다시 FACSAria Ⅲ(등록 상표)을 사용하여 해석한 바, 세포 집단 전체에 포함되는 OSR1(+)SIX2(+) 세포의 비율은 70%를 초과하고 있었다(도 2의 B). 도 2의 A는, 인간 iPS 세포 유래 분화 세포군을 CD9, CD140a, CD140b, CD271로 염색했을 때의 사이토그램도이고, 도 2의 B의 2차원 전개도는, 좌측으로부터 분화 유도 전의 인간 iPS 세포, 인간 iPS 세포 유래 분화 세포군, 그리고 P3 및 P4 및 P6의 소팅 후의 세포 집단에 대한 OSR1과 SIX2의 발현을 유세포 분석기로 측정한 도면이다.
[실시예 3]
<CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)에 의해 선별한 세포 집단으로부터 LTL(근위요세관의 마커) 양성의 요세관유사 구조의 형성>
신장 전구 세포의 특징으로서, 신장 전구 세포 마커의 발현 이외에 요세관 세포로의 분화능의 유지를 들 수 있다. 따라서, 실시예 2에서 얻어진 CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포가 신장 전구 세포인 것인지의 여부를 확인하기 위하여 요세관 분화 유도계에 공시하였다. 요세관 세포로의 분화와 요세관유사 구조의 형성의 판정은, 근위요세관의 마커인 LTL의 발현과 형태적 특징으로부터 행하였다.
비특허문헌 4에 기재된 방법에 따라 인간 iPS 세포주로부터 분화 유도된 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단을, APC-H7 Mouse Anti Human CD9, Alexa Fluor(등록 상표) 647 Mouse Anti-Human CD140a, BV421 Mouse Anti-Human CD140b 및 BV510 Mouse Anti-Human CD271을 사용하여 면역 염색을 행하고, FACSAria Ⅲ(등록 상표)으로 CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포를 분취하였다. 분취한 세포를, 50ng/ml BMP7(R&D, 354-BP-010) 및 10μM Y-27632(Wako, 253-00513)를 첨가한 UBC 순화 배지(이하 참조)를 포함하는 방추 바닥 저접착 96 웰 플레이트(스미토모 베이크라이트, MS-9096M)에 1.0×105 세포/웰로 파종하고, 37℃, 5% CO2 함유 공기 분위기 하에서 24시간 배양하였다. 이어서, 배지를 50ng/ml BMP7, 0.5μM BIO(칼비오켐, 361552) 및 10μM Y-27632를 첨가한 UBC 순화 배지로 치환하고 24시간 더 배양하였다. 그 후, 비특허문헌 4에 기재된 방법에 따라, Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포와 공배양하였다. Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포는, 24 웰 플레이트에 4.0×105 세포/웰로 파종하고 마이토마이신 C 처리 후에 사용하였다. 공배양에는 UBC 순화 배지를 사용하여, 2주간 배양한 후 염색을 행하였다. 염색의 1차 반응에는 LTL, Biotin Conjugate(Vector Labs, B-1325)를 사용하고, 2차 반응에는 streptavidin, Alexa Fluor(등록 상표) 546 conjugate(Life Technologies, S-11225)를 사용하고, 핵 염색에는 Hoechst 33342(Life Technologies, H3570)를 사용하였다. LTL은 200배 희석으로 사용하여, 4℃에서 밤새 반응을 행하였다. 또한, streptavidin, Alexa Fluor(등록 상표) 546 conjugate는 200배 희석으로 사용하여, 실온에서 1시간 반응을 행하였다. 그 결과, CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)의 세포 집단으로부터 LTL 양성의 관강 구조가 형성되어 있음을 확인하였다(도 3의 B). 도 3의 A는, 비특허문헌 4와 동일한 방법으로의 세포 덩어리 형성 후, Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포와 공배양하는 근위요세관으로의 분화 방법을 나타낸다. 도 3의 B는, CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포의 세포 덩어리를 Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포와 공배양했을 때의 모습을 나타낸다.
<UBC 순화 배지>
요관아세포(UBC) 순화 배지를, 문헌(Barasch et al., Am. J. Physiol., (1997), 273, F757-767)에 기재된 방법을 개량한 방법으로 제작하였다. UBC(컬럼비아 대학 Dr. Barasch로부터 양수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1997), 94, 6279-6284)를, 10% FBS를 함유하는 최소 필수 배지(MEM; Invitrogen)에서 배양하였다. 80% 전면이 된 시점에서 세포를 PBS로 세정하고, 배지를 DMEM과 F12의 1:1의 혼합 배지에, GlutaMAX, 10% KSR, 0.1mM 비필수 아미노산, 0.55mM 2-머캅토에탄올 및 500U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배지로 치환하였다. 이어서, 세포를 3일간 배양하여 배양 상청을 생성하였다. 배양 상청은 사용 전에 0.22㎛ 필터로 여과하였다.
[실시예 4]
<CD9(-)와 양성 선택 마커 3종류의 조합에 의해 선별한 신장 전구 세포(OSR1(+)SIX2(+) 세포)의 비율>
CD9(-)와 실시예 1에서 추출된 양성 선택 마커를 3종류 사용했을 때의 망라적 조합(10종류)에서, OSR1(+)SIX2(+) 세포의 비율을 FACSAria Fusion(등록 상표)(BD Biosciences)을 사용하여 조사하였다. 또한 실시예 3에서 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단을 분취하는 것이 가능하다고 확인된 조합인 CD9(-), CD140a(+), CD140b(+), CD271(+)에서, CD55(-) 및 CD326(-)가 CD9(-) 대체의 음성 선택 마커가 될 수 있는지를 아울러 조사하였다.
항체에는 APC-H7 Mouse Anti Human CD9(BD Biosciences, 655409), Alexa Fluor(등록 상표) 647 Mouse Anti-Human CD140a(BD Biosciences, 562798), BV421 Mouse Anti-Human CD140a(BD Biosciences, 562799), BV421 Mouse Anti-Human CD140b(BD Biosciences, 564124), BV510 Mouse Anti-Human CD271(BD Biosciences, 563451), APC Mouse Anti-Human CD106(BD Biosciences, 551147), BV605 Mouse Anti-Human CD106(BD Biosciences, 563307), CD165-Biotin, 인간(밀테니 바이오텍, 130-098-536), CD165-APC, 인간(밀테니 바이오텍, 130-098-542), Anti-Human CD55 Biotin(eBioscience, 13-0559) 및 BV605 Mouse Anti-Human CD326(BD Biosciences, 563182)을 사용하였다. 각 항체는 20배 희석으로 사용하여, 실온에서 15분간 반응시킨 후, PBS로 3회 세정하여 해석을 행하였다. 또한, biotin화 항체는 BV605 Streptavidin(BD Biosciences, 563260)을 사용하여, 500배 희석으로 2차 염색을 행하였다. 2차 염색은 실온에서 15분간 반응시킨 후, PBS로 3회 세정하여 해석을 행하였다. 인간 iPS 세포 유래 분화 세포 집단을 FACSAria Fusion(등록 상표)을 사용하여 해석하고, 그의 2차원 전개도로부터 12가지의 조합의 분획을 설정하고, 각각의 분획 세포를 분취하였다. 분취한 세포 집단을 다시 FACSAria Fusion(등록 상표)을 사용하여 해석하고, 세포 집단 전체에 포함되는 OSR1(+)SIX2(+) 세포, OSR1(+)SIX2(-) 세포, OSR1(-)SIX2(+) 세포, 및 OSR1(-)SIX2(-) 세포의 비율을 산출하였다(도 4). 그 결과, 어느 마커의 조합에서도, 분취한 세포 집단 전체에 대하여 OSR1(+)SIX2(+) 세포가 높은 비율로 포함되어 있었다.
[실시예 5]
<신장 전구 세포를 분취할 수 있는 세포 표면 마커의 조합 검토>
CD9, CD140a, CD140b, CD271의 세포 표면 마커의 조합에서, 실시예 4에서 사용한 항체를 사용하여 FACSAria Fusion(등록 상표)에 의한 해석을 행하고, 음성 선택 마커인 CD9(-), 그리고 CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)로부터 선택되는 임의의 양성 선택 마커의 조합에 있어서, 각종 세포 표면 마커로 분취한 세포 집단에 포함되는 OSR1(+)SIX2(+) 세포의 비율을 산출하였다. 또한, 각 세포 표면 마커 조합으로 규정되는 세포의 본래 세포 집단 중의 비율을 조사하고, 원하는 각 표면 마커로 회수되는 OSR1(+)SIX2(+) 세포 수/본래 세포 수를 산출하였다(도 5). 그 결과, 어느 세포 표면 마커의 조합에서도 OSR1(+)SIX2(+) 세포를 농축할 수 있고, 2개 또는 3개의 세포 표면 마커의 조합에서도 4개의 세포 표면 마커의 조합과 같은 정도의 비율로의 OSR1(+)SIX2(+) 세포의 농축이 가능하였다.
[실시예 6]
<신장 전구 세포를 분취할 수 있는 세포 표면 마커의 조합 검토>
리포터 유전자가 들어 있지 않은 인간 iPS 세포주로부터도 이 세포 표면 마커를 사용하여 고순도의 신장 전구 세포 집단을 분취할 수 있음을 확인할 목적으로 인간 iPS 세포(201B7주, 교토 대학으로부터 양수)를 분화 유도계에 공시하였다. 인간 iPS 세포(201B7)는 종래의 방법(Takahashi K, et al., (2007), Cell. 131:861-72)으로 유지 배양하여, 비특허문헌 4에 기재된 방법에 따라, 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단으로의 분화 유도를 행하였다. 실시예 3과 마찬가지로, CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포를 FACSAria Fusion(등록 상표)을 사용하여 분취하여 세포 덩어리 형성 후, Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포와 공배양함으로써, 요세관으로의 분화능을 유지하고 있는 세포 집단을 분취할 수 있는지의 여부를 확인하였다. 요세관으로의 분화의 판정은, 근위요세관의 마커인 LTL의 발현과 형태적 특징으로부터 행하였다. 그 결과, CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)의 세포 집단으로부터 LTL 양성의 관강 구조를 형성할 수 있음을 확인하였다. 즉, 인간 iPS 세포(201B7)로부터의 분화 세포에서도, CD9, CD140a, CD140b 및 CD271을 사용하여, 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단을 고순도로 분취할 수 있음이 확인되었다(도 6의 C). 도 6의 A는, OSR1(GFP), SIX2(tdTomato) 및 각 세포 표면 마커의 형광 강도에 대한 세포 수의 히스토그램을 나타낸다. 도 6의 B는, iPS 세포(201B7)주 유래 분화 세포 집단의 CD9, CD140a, CD140b, 또는 CD271의 발현을 유세포 분석기로 측정한 결과의 2차원 전개도이다. 도 6의 C는, P4 및 P2 및 P3의 세포 집단을 소팅한 후, 세포 덩어리를 형성하고, Wnt4 발현 NIH3T3 섬유아세포와 공배양한 상을 나타낸다.
[실시예 7]
<신장 전구 세포를 분취할 수 있는 세포 표면 항원 마커의 조합 검토 (2)>
실시예 6과 마찬가지로, 인간 iPS 세포(201B7)를 분화 유도한 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단을, APC-H7 Mouse Anti Human CD9, Alexa Fluor(등록 상표) 647 Mouse Anti-Human CD140a, BV421 Mouse Anti-Human CD140b 및 BV510 Mouse Anti-Human CD271을 사용하여 표면 항원의 면역 염색을 행하고, FACSAria Fusion(등록 상표)을 사용하여 CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) 세포를 분취하였다. 세포를 분취 후, Smear Gell(등록 상표)(GenoStaff, SG-01)을 사용하여 슬라이드 글래스 상에 도말하고, 핵내 전사 인자의 면역 염색을 행하였다. 1차 항체에는 anti-SIX2, rabbit poly(Proteintech, 11562-1-AP)를 사용하고, 2차 항체에는 Donkey anti-Rabbit IgG(H+L) Secondary Antibody Alexa Fluor(등록 상표) 488 conjugate(Life Technologies, A21206)를 사용하고, 핵 염색에는 Hoechst 33342(Life Technologies, H3570)를 사용하였다. 현미경(KEYENCE, BZ-9000)을 사용하여 관찰한 결과, CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)의 세포 집단은, 신장 전구 세포의 특징의 하나인 SIX2 양성 세포의 비율이 소팅 전의 분화 세포 집단에 비하여 높은 것이 관찰되었다(도 7).
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은, 다능성 줄기 세포로부터 신장 전구 세포로 분화 유도된 세포 집단으로부터, 세포 표면 마커를 사용하여 고순도의 신장 전구 세포를 취득하고 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법으로 취득된 신장 전구 세포는 신부전 등의 신장 질환의 재생 의료에 사용될 수 있다.
서열 번호 15: L803-mts/GSK-3β펩티드 저해제; 1번째의 아미노산인 글리신 잔기는 N 말단에서 아미드 결합을 통해 미리스트산에 결합하고 있다; 11번째의 아미노산인 세린 잔기는 인산화되어 있다; 12번째의 아미노산인 프롤린은 C 말단이 아미드화되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. KYOTO UNIVERSITY <120> A method for producing renal progenitor cells <130> FA1535-16136 <150> JP 2015-179104 <151> 2015-09-11 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (185)..(871) <300> <308> NM_001769.3 <309> 2015-03-15 <313> (1)..(1321) <400> 1 cttttcccgg cacatgcgca ccgcagcggg tcgcgcgccc taaggagtgg cactttttaa 60 aagtgcagcc ggagaccagc ctacagccgc ctgcatctgt atccagcgcc aggtcccgcc 120 agtcccagct gcgcgcgccc cccagtcccg cacccgttcg gcccaggcta agttagccct 180 cacc atg ccg gtc aaa gga ggc acc aag tgc atc aaa tac ctg ctg ttc 229 Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe 1 5 10 15 gga ttt aac ttc atc ttc tgg ctt gcc ggg att gct gtc ctt gcc att 277 Gly Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile 20 25 30 gga cta tgg ctc cga ttc gac tct cag acc aag agc atc ttc gag caa 325 Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln 35 40 45 gaa act aat aat aat aat tcc agc ttc tac aca gga gtc tat att ctg 373 Glu Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu 50 55 60 atc gga gcc ggc gcc ctc atg atg ctg gtg ggc ttc ctg ggc tgc tgc 421 Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys 65 70 75 ggg gct gtg cag gag tcc cag tgc atg ctg gga ctg ttc ttc ggc ttc 469 Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe 80 85 90 95 ctc ttg gtg ata ttc gcc att gaa ata gct gcg gcc atc tgg gga tat 517 Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr 100 105 110 tcc cac aag gat gag gtg att aag gaa gtc cag gag ttt tac aag gac 565 Ser His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp 115 120 125 acc tac aac aag ctg aaa acc aag gat gag ccc cag cgg gaa acg ctg 613 Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu 130 135 140 aaa gcc atc cac tat gcg ttg aac tgc tgt ggt ttg gct ggg ggc gtg 661 Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val 145 150 155 gaa cag ttt atc tca gac atc tgc ccc aag aag gac gta ctc gaa acc 709 Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr 160 165 170 175 ttc acc gtg aag tcc tgt cct gat gcc atc aaa gag gtc ttc gac aat 757 Phe Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn 180 185 190 aaa ttc cac atc atc ggc gca gtg ggc atc ggc att gcc gtg gtc atg 805 Lys Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met 195 200 205 ata ttt ggc atg atc ttc agt atg atc ttg tgc tgt gct atc cgc agg 853 Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg 210 215 220 aac cgc gag atg gtc tag agtcagctta catccctgag caggaaagtt 901 Asn Arg Glu Met Val 225 tacccatgaa gattggtggg attttttgtt tgtttgtttt gttttgtttg ttgtttgttg 961 tttgtttttt tgccactaat tttagtattc attctgcatt gctagataaa agctgaagtt 1021 actttatgtt tgtcttttaa tgcttcattc aatattgaca tttgtagttg agcggggggt 1081 ttggtttgct ttggtttata ttttttcagt tgtttgtttt tgcttgttat attaagcaga 1141 aatcctgcaa tgaaaggtac tatatttgct agactctaga caagatattg tacataaaag 1201 aatttttttg tctttaaata gatacaaatg tctatcaact ttaatcaagt tgtaacttat 1261 attgaagaca atttgataca taataaaaaa ttatgacaat gtcctggact ggtaaaaaaa 1321 <210> 2 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly 1 5 10 15 Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly 20 25 30 Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu 35 40 45 Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile 50 55 60 Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly 65 70 75 80 Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu 85 90 95 Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser 100 105 110 His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr 115 120 125 Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys 130 135 140 Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu 145 150 155 160 Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe 165 170 175 Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys 180 185 190 Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile 195 200 205 Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn 210 215 220 Arg Glu Met Val 225 <210> 3 <211> 2796 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (295)..(1140) <300> <308> NM_000574.4 <309> 2015-03-15 <313> (1)..(2796) <400> 3 agcgagctcc tcctccttcc cctccccact ctccccgagt ctagggcccc cggggcgtat 60 gacgccggag ccctctgacc gcacctctga ccacaacaaa cccctactcc acccgtcttg 120 tttgtcccac ccttggtgac gcagagcccc agcccagacc ccgcccaaag cactcattta 180 actggtattg cggagccacg aggcttctgc ttactgcaac tcgctccggc cgctgggcgt 240 agctgcgact cggcggagtc ccggcggcgc gtccttgttc taacccggcg cgcc atg 297 Met 1 acc gtc gcg cgg ccg agc gtg ccc gcg gcg ctg ccc ctc ctc ggg gag 345 Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly Glu 5 10 15 ctg ccc cgg ctg ctg ctg ctg gtg ctg ttg tgc ctg ccg gcc gtg tgg 393 Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val Trp 20 25 30 ggt gac tgt ggc ctt ccc cca gat gta cct aat gcc cag cca gct ttg 441 Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu 35 40 45 gaa ggc cgt aca agt ttt ccc gag gat act gta ata acg tac aaa tgt 489 Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys 50 55 60 65 gaa gaa agc ttt gtg aaa att cct ggc gag aag gac tca gtg atc tgc 537 Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys 70 75 80 ctt aag ggc agt caa tgg tca gat att gaa gag ttc tgc aat cgt agc 585 Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser 85 90 95 tgc gag gtg cca aca agg cta aat tct gca tcc ctc aaa cag cct tat 633 Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr 100 105 110 atc act cag aat tat ttt cca gtc ggt act gtt gtg gaa tat gag tgc 681 Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys 115 120 125 cgt cca ggt tac aga aga gaa cct tct cta tca cca aaa cta act tgc 729 Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys 130 135 140 145 ctt cag aat tta aaa tgg tcc aca gca gtc gaa ttt tgt aaa aag aaa 777 Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys 150 155 160 tca tgc cct aat ccg gga gaa ata cga aat ggt cag att gat gta cca 825 Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro 165 170 175 ggt ggc ata tta ttt ggt gca acc atc tcc ttc tca tgt aac aca ggg 873 Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly 180 185 190 tac aaa tta ttt ggc tcg act tct agt ttt tgt ctt att tca ggc agc 921 Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser 195 200 205 tct gtc cag tgg agt gac ccg ttg cca gag tgc aga gaa att tat tgt 969 Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys 210 215 220 225 cca gca cca cca caa att gac aat gga ata att caa ggg gaa cgt gac 1017 Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp 230 235 240 cat tat gga tat aga cag tct gta acg tat gca tgt aat aaa gga ttc 1065 His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe 245 250 255 acc atg att gga gag cac tct att tat tgt act gtg aat aat gat gaa 1113 Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu 260 265 270 gga gag tgg agt ggc cca cca cct gaa tgcagaggaa aatctctaac 1160 Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu 275 280 ttccaaggtc ccaccaacag ttcagaaacc taccacagta aatgttccaa ctacagaagt 1220 ctcaccaact tctcagaaaa ccaccacaaa aaccaccaca ccaaatgctc aagcaacacg 1280 gagtacacct gtttccagga caaccaagca ttttcatgaa acaaccccaa ataaaggaag 1340 tggaaccact tcaggtacta cccgtcttct atctgggcac acgtgtttca cgttgacagg 1400 tttgcttggg acgctagtaa ccatgggctt gctgacttag ccaaagaaga gttaagaaga 1460 aaatacacac aagtatacag actgttccta gtttcttaga cttatctgca tattggataa 1520 aataaatgca attgtgctct tcatttagga tgctttcatt gtctttaaga tgtgttagga 1580 atgtcaacag agcaaggaga aaaaaggcag tcctggaatc acattcttag cacacctaca 1640 cctcttgaaa atagaacaac ttgcagaatt gagagtgatt cctttcctaa aagtgtaaga 1700 aagcatagag atttgttcgt atttagaatg ggatcacgag gaaaagagaa ggaaagtgat 1760 ttttttccac aagatctgta atgttatttc cacttataaa ggaaataaaa aatgaaaaac 1820 attatttgga tatcaaaagc aaataaaaac ccaattcagt ctcttctaag caaaattgct 1880 aaagagagat gaaccacatt ataaagtaat ctttggctgt aaggcatttt catctttcct 1940 tcgggttggc aaaatatttt aaaggtaaaa catgctggtg aaccaggggt gttgatggtg 2000 ataagggagg aatatagaat gaaagactga atcttccttt gttgcacaaa tagagtttgg 2060 aaaaagcctg tgaaaggtgt cttctttgac ttaatgtctt taaaagtatc cagagatact 2120 acaatattaa cataagaaaa gattatatat tatttctgaa tcgagatgtc catagtcaaa 2180 tttgtaaatc ttattctttt gtaatattta tttatattta tttatgacag tgaacattct 2240 gattttacat gtaaaacaag aaaagttgaa gaagatatgt gaagaaaaat gtatttttcc 2300 taaatagaaa taaatgatcc cattttttgg tatcatgtag tatgtgaaat ttattcttaa 2360 acgtgactac tttatttcta aataagaaat tccctacctg cttcctacaa gcagttcaga 2420 atgccatgcc ttggttgtcc tagtgtgaat aattttcagc tactttaaaa ttatattgta 2480 ctttctcaag catgtcatat cctttcctat tagagtatct atattacttg ttactgattt 2540 acctgaaggc aatctgatta atttctaggt ttttaccata ttcttgtcat cttgccaatt 2600 acattttaag tgttagacta gactaagatg tactagttgt atagaatata actagattta 2660 ttatggcaat gtttattttg tcattttgct tcatctgttt tgttgttgaa gtactttaaa 2720 tttcatacgt tcatggcatt tcactgtaaa gactttaatg tgtatttctt aaaataaaac 2780 tttttttcct ccttaa 2796 <210> 4 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 15 Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val 20 25 30 Trp Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala 35 40 45 Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys 50 55 60 Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile 65 70 75 80 Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg 85 90 95 Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro 100 105 110 Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys 145 150 155 160 Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val 165 170 175 Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr 180 185 190 Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly 195 200 205 Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg 225 230 235 240 Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly 245 250 255 Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp 260 265 270 Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu 275 280 <210> 5 <211> 3220 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (222)..(2441) <300> <308> NM_001078.3 <309> 2015-03-15 <313> (1)..(3220) <400> 5 aaactttttt ccctggctct gccctgggtt tccccttgaa gggatttccc tccgcctctg 60 caacaagacc ctttataaag cacagacttt ctatttcact ccgcggtatc tgcatcgggc 120 ctcactggct tcaggagctg aataccctcc caggcacaca caggtgggac acaaataagg 180 gttttggaac cactattttc tcatcacgac agcaacttaa a atg cct ggg aag atg 236 Met Pro Gly Lys Met 1 5 gtc gtg atc ctt gga gcc tca aat ata ctt tgg ata atg ttt gca gct 284 Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp Ile Met Phe Ala Ala 10 15 20 tct caa gct ttt aaa atc gag acc acc cca gaa tct aga tat ctt gct 332 Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu Ser Arg Tyr Leu Ala 25 30 35 cag att ggt gac tcc gtc tca ttg act tgc agc acc aca ggc tgt gag 380 Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser Thr Thr Gly Cys Glu 40 45 50 tcc cca ttt ttc tct tgg aga acc cag ata gat agt cca ctg aat ggg 428 Ser Pro Phe Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp Ser Pro Leu Asn Gly 55 60 65 aag gtg acg aat gag ggg acc aca tct acg ctg aca atg aat cct gtt 476 Lys Val Thr Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu Thr Met Asn Pro Val 70 75 80 85 agt ttt ggg aac gaa cac tct tac ctg tgc aca gca act tgt gaa tct 524 Ser Phe Gly Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr Ala Thr Cys Glu Ser 90 95 100 agg aaa ttg gaa aaa gga atc cag gtg gag atc tac tct ttt cct aag 572 Arg Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile Tyr Ser Phe Pro Lys 105 110 115 gat cca gag att cat ttg agt ggc cct ctg gag gct ggg aag ccg atc 620 Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro Leu Glu Ala Gly Lys Pro Ile 120 125 130 aca gtc aag tgt tca gtt gct gat gta tac cca ttt gac agg ctg gag 668 Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro Phe Asp Arg Leu Glu 135 140 145 ata gac tta ctg aaa gga gat cat ctc atg aag agt cag gaa ttt ctg 716 Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys Ser Gln Glu Phe Leu 150 155 160 165 gag gat gca gac agg aag tcc ctg gaa acc aag agt ttg gaa gta acc 764 Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys Ser Leu Glu Val Thr 170 175 180 ttt act cct gtc att gag gat att gga aaa gtt ctt gtt tgc cga gct 812 Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val Leu Val Cys Arg Ala 185 190 195 aaa tta cac att gat gaa atg gat tct gtg ccc aca gta agg cag gct 860 Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro Thr Val Arg Gln Ala 200 205 210 gta aaa gaa ttg caa gtc tac ata tca ccc aag aat aca gtt att tct 908 Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys Asn Thr Val Ile Ser 215 220 225 gtg aat cca tcc aca aag ctg caa gaa ggt ggc tct gtg acc atg acc 956 Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly Ser Val Thr Met Thr 230 235 240 245 tgt tcc agc gag ggt cta cca gct cca gag att ttc tgg agt aag aaa 1004 Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile Phe Trp Ser Lys Lys 250 255 260 tta gat aat ggg aat cta cag cac ctt tct gga aat gca act ctc acc 1052 Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly Asn Ala Thr Leu Thr 265 270 275 tta att gct atg agg atg gaa gat tct gga att tat gtg tgt gaa gga 1100 Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Val Cys Glu Gly 280 285 290 gtt aat ttg att ggg aaa aac aga aaa gag gtg gaa tta att gtt caa 1148 Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys Glu Val Glu Leu Ile Val Gln 295 300 305 gag aaa cca ttt act gtt gag atc tcc cct gga ccc cgg att gct gct 1196 Glu Lys Pro Phe Thr Val Glu Ile Ser Pro Gly Pro Arg Ile Ala Ala 310 315 320 325 cag att gga gac tca gtc atg ttg aca tgt agt gtc atg ggc tgt gaa 1244 Gln Ile Gly Asp Ser Val Met Leu Thr Cys Ser Val Met Gly Cys Glu 330 335 340 tcc cca tct ttc tcc tgg aga acc cag ata gac agc cct ctg agc ggg 1292 Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gly 345 350 355 aag gtg agg agt gag ggg acc aat tcc acg ctg acc ctg agc cct gtg 1340 Lys Val Arg Ser Glu Gly Thr Asn Ser Thr Leu Thr Leu Ser Pro Val 360 365 370 agt ttt gag aac gaa cac tct tat ctg tgc aca gtg act tgt gga cat 1388 Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr Val Thr Cys Gly His 375 380 385 aag aaa ctg gaa aag gga atc cag gtg gag ctc tac tca ttc cct aga 1436 Lys Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Leu Tyr Ser Phe Pro Arg 390 395 400 405 gat cca gaa atc gag atg agt ggt ggc ctc gtg aat ggg agc tct gtc 1484 Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser Gly Gly Leu Val Asn Gly Ser Ser Val 410 415 420 act gta agc tgc aag gtt cct agc gtg tac ccc ctt gac cgg ctg gag 1532 Thr Val Ser Cys Lys Val Pro Ser Val Tyr Pro Leu Asp Arg Leu Glu 425 430 435 att gaa tta ctt aag ggg gag act att ctg gag aat ata gag ttt ttg 1580 Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Ile Leu Glu Asn Ile Glu Phe Leu 440 445 450 gag gat acg gat atg aaa tct cta gag aac aaa agt ttg gaa atg acc 1628 Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser Leu Glu Asn Lys Ser Leu Glu Met Thr 455 460 465 ttc atc cct acc att gaa gat act gga aaa gct ctt gtt tgt cag gct 1676 Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly Lys Ala Leu Val Cys Gln Ala 470 475 480 485 aag tta cat att gat gac atg gaa ttc gaa ccc aaa caa agg cag agt 1724 Lys Leu His Ile Asp Asp Met Glu Phe Glu Pro Lys Gln Arg Gln Ser 490 495 500 acg caa aca ctt tat gtc aat gtt gcc ccc aga gat aca acc gtc ttg 1772 Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn Val Ala Pro Arg Asp Thr Thr Val Leu 505 510 515 gtc agc cct tcc tcc atc ctg gag gaa ggc agt tct gtg aat atg aca 1820 Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu Gly Ser Ser Val Asn Met Thr 520 525 530 tgc ttg agc cag ggc ttt cct gct ccg aaa atc ctg tgg agc agg cag 1868 Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln 535 540 545 ctc cct aac ggg gag cta cag cct ctt tct gag aat gca act ctc acc 1916 Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu Ser Glu Asn Ala Thr Leu Thr 550 555 560 565 tta att tct aca aaa atg gaa gat tct ggg gtt tat tta tgt gaa gga 1964 Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser Gly Val Tyr Leu Cys Glu Gly 570 575 580 att aac cag gct gga aga agc aga aag gaa gtg gaa tta att atc caa 2012 Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys Glu Val Glu Leu Ile Ile Gln 585 590 595 gtt act cca aaa gac ata aaa ctt aca gct ttt cct tct gag agt gtc 2060 Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys Leu Thr Ala Phe Pro Ser Glu Ser Val 600 605 610 aaa gaa gga gac act gtc atc atc tct tgt aca tgt gga aat gtt cca 2108 Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr Cys Gly Asn Val Pro 615 620 625 gaa aca tgg ata atc ctg aag aaa aaa gcg gag aca gga gac aca gta 2156 Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys Ala Glu Thr Gly Asp Thr Val 630 635 640 645 cta aaa tct ata gat ggc gcc tat acc atc cga aag gcc cag ttg aag 2204 Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Lys Ala Gln Leu Lys 650 655 660 gat gcg gga gta tat gaa tgt gaa tct aaa aac aaa gtt ggc tca caa 2252 Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys Glu Ser Lys Asn Lys Val Gly Ser Gln 665 670 675 tta aga agt tta aca ctt gat gtt caa gga aga gaa aac aac aaa gac 2300 Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Gln Gly Arg Glu Asn Asn Lys Asp 680 685 690 tat ttt tct cct gag ctt ctc gtg ctc tat ttt gca tcc tcc tta ata 2348 Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu Val Leu Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Ile 695 700 705 ata cct gcc att gga atg ata att tac ttt gca aga aaa gcc aac atg 2396 Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile Ile Tyr Phe Ala Arg Lys Ala Asn Met 710 715 720 725 aag ggg tca tat agt ctt gta gaa gca cag aag tca aaa gtg tag 2441 Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val Glu Ala Gln Lys Ser Lys Val 730 735 ctaatgcttg atatgttcaa ctggagacac tatttatctg tgcaaatcct tgatactgct 2501 catcattcct tgagaaaaac aatgagctga gaggcagact tccctgaatg tattgaactt 2561 ggaaagaaat gcccatctat gtcccttgct gtgagcaaga agtcaaagta aaacttgctg 2621 cctgaagaac agtaactgcc atcaagatga gagaactgga ggagttcctt gatctgtata 2681 tacaataaca taatttgtac atatgtaaaa taaaattatg ccatagcaag attgcttaaa 2741 atagcaacac tctatattta gattgttaaa ataactagtg ttgcttggac tattataatt 2801 taatgcatgt taggaaaatt tcacattaat atttgctgac agctgacctt tgtcatcttt 2861 cttctatttt attccctttc acaaaatttt attcctatat agtttattga caataatttc 2921 aggttttgta aagatgccgg gttttatatt tttatagaca aataataagc aaagggagca 2981 ctgggttgac tttcaggtac taaatacctc aacctatggt ataatggttg actgggtttc 3041 tctgtatagt actggcatgg tacggagatg tttcacgaag tttgttcatc agactcctgt 3101 gcaactttcc caatgtggcc taaaaatgca acttcttttt attttctttt gtaaatgttt 3161 aggttttttt gtatagtaaa gtgataattt ctggaattag aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3220 <210> 6 <211> 739 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp 1 5 10 15 Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu 20 25 30 Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser 35 40 45 Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Phe Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp 50 55 60 Ser Pro Leu Asn Gly Lys Val Thr Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu 65 70 75 80 Thr Met Asn Pro Val Ser Phe Gly Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr 85 90 95 Ala Thr Cys Glu Ser Arg Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile 100 105 110 Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro Leu Glu 115 120 125 Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro 130 135 140 Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys 145 150 155 160 Ser Gln Glu Phe Leu Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys 165 170 175 Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val 180 185 190 Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro 195 200 205 Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys 210 215 220 Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly 225 230 235 240 Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile 245 250 255 Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly 260 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tta ccc tct atc ctt cca aat gaa aat gaa aag gtt gtg 448 Gln Leu Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro Asn Glu Asn Glu Lys Val Val 25 30 35 cag ctg aat tca tcc ttt tct ctg aga tgc ttt ggg gag agt gaa gtg 496 Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val 40 45 50 55 agc tgg cag tac ccc atg tct gaa gaa gag agc tcc gat gtg gaa atc 544 Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile 60 65 70 aga aat gaa gaa aac aac agc ggc ctt ttt gtg acg gtc ttg gaa gtg 592 Arg Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu Phe Val Thr Val Leu Glu Val 75 80 85 agc agt gcc tcg gcg gcc cac aca ggg ttg tac act tgc tat tac aac 640 Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn 90 95 100 cac act cag aca gaa gag aat gag ctt gaa ggc agg cac att tac atc 688 His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile 105 110 115 tat gtg cca gac cca gat gta gcc ttt gta cct cta gga atg acg gat 736 Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe Val Pro Leu Gly Met Thr Asp 120 125 130 135 tat tta gtc atc gtg gag gat gat gat tct gcc att ata cct tgt cgc 784 Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg 140 145 150 aca act gat ccc gag act cct gta acc tta cac aac agt gag ggg gtg 832 Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr Leu His Asn Ser Glu Gly Val 155 160 165 gta cct gcc tcc tac gac agc aga cag ggc ttt aat ggg acc ttc act 880 Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr 170 175 180 gta ggg ccc tat atc tgt gag gcc acc gtc aaa gga aag aag ttc cag 928 Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln 185 190 195 acc atc cca ttt aat gtt tat gct tta aaa gca aca tca gag ctg gat 976 Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp 200 205 210 215 cta gaa atg gaa gct ctt aaa acc gtg tat aag tca ggg gaa acg att 1024 Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile 220 225 230 gtg gtc acc tgt gct gtt ttt aac aat gag gtg gtt gac ctt caa tgg 1072 Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn Glu Val Val Asp Leu Gln Trp 235 240 245 act tac cct gga gaa gtg aaa ggc aaa ggc atc aca atg ctg gaa gaa 1120 Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu 250 255 260 atc aaa gtc cca tcc atc aaa ttg gtg tac act ttg acg gtc ccc gag 1168 Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu 265 270 275 gcc acg gtg aaa gac agt gga gat tac gaa tgt gct gcc cgc cag gct 1216 Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala 280 285 290 295 acc agg gag gtc aaa gaa atg aag aaa gtc act att tct gtc cat gag 1264 Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys Val Thr Ile Ser Val His Glu 300 305 310 aaa ggt ttc att gaa atc aaa ccc acc ttc agc cag ttg gaa gct gtc 1312 Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val 315 320 325 aac ctg cat gaa gtc aaa cat ttt gtt gta gag gtg cgg gcc tac cca 1360 Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro 330 335 340 cct ccc agg ata tcc tgg ctg aaa aac aat ctg act ctg att gaa aat 1408 Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn 345 350 355 ctc act gag atc acc act gat gtg gaa aag att cag gaa ata agg tat 1456 Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr 360 365 370 375 cga agc aaa tta aag ctg atc cgt gct aag gaa gaa gac agt ggc cat 1504 Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala Lys Glu Glu Asp Ser Gly His 380 385 390 tat act att gta gct caa aat gaa gat gct gtg aag agc tat act ttt 1552 Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe 395 400 405 gaa ctg tta act caa gtt cct tca tcc att ctg gac ttg gtc gat gat 1600 Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp 410 415 420 cac cat ggc tca act ggg gga cag acg gtg agg tgc aca gct gaa ggc 1648 His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly 425 430 435 acg ccg ctt cct gat att gag tgg atg ata tgc aaa gat att aag aaa 1696 Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys 440 445 450 455 tgt aat aat gaa act tcc tgg act att ttg gcc aac aat gtc tca aac 1744 Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn 460 465 470 atc atc acg gag atc cac tcc cga gac agg agt acc gtg gag ggc cgt 1792 Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg 475 480 485 gtg act ttc gcc aaa gtg gag gag acc atc gcc gtg cga tgc ctg gct 1840 Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala 490 495 500 aag aat ctc ctt gga gct gag aac cga gag ctg aag ctg gtg gct ccc 1888 Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro 505 510 515 acc ctg cgt tct gaa ctc acg gtg gct gct gca gtc ctg gtg ctg ttg 1936 Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala Ala Ala Val Leu Val Leu Leu 520 525 530 535 gtg att gtg atc atc tca ctt att gtc ctg gtt gtc att tgg aaa cag 1984 Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val Leu Val Val Ile Trp Lys Gln 540 545 550 aaa ccg agg tat gaa att cgc tgg agg gtc att gaa tca atc agc cca 2032 Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro 555 560 565 gat gga cat gaa tat att tat gtg gac ccg atg cag ctg cct tat gac 2080 Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp 570 575 580 tca aga tgg gag ttt cca aga gat gga cta gtg ctt ggt cgg gtc ttg 2128 Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly Leu Val Leu Gly Arg Val Leu 585 590 595 ggg tct gga gcg ttt ggg aag gtg gtt gaa gga aca gcc tat gga tta 2176 Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu 600 605 610 615 agc cgg tcc caa cct gtc atg aaa gtt gca gtg aag atg cta aaa ccc 2224 Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Pro 620 625 630 acg gcc aga tcc agt gaa aaa caa gct ctc atg tct gaa ctg aag ata 2272 Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile 635 640 645 atg act cac ctg ggg cca cat ttg aac att gta aac ttg ctg gga gcc 2320 Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala 650 655 660 tgc acc aag tca ggc ccc att tac atc atc aca gag tat tgc ttc tat 2368 Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr 665 670 675 gga gat ttg gtc aac tat ttg cat aag aat agg gat agc ttc ctg agc 2416 Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser 680 685 690 695 cac cac cca gag aag cca aag aaa gag ctg gat atc ttt gga ttg aac 2464 His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn 700 705 710 cct gct gat gaa agc aca cgg agc tat gtt att tta tct ttt gaa aac 2512 Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn 715 720 725 aat ggt gac tac atg gac atg aag cag gct gat act aca cag tat gtc 2560 Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val 730 735 740 ccc atg cta gaa agg aaa gag gtt tct aaa tat tcc gac atc cag aga 2608 Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg 745 750 755 tca ctc tat gat cgt cca gcc tca tat aag aag aaa tct atg tta gac 2656 Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp 760 765 770 775 tca gaa gtc aaa aac ctc ctt tca gat gat aac tca gaa ggc ctt act 2704 Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr 780 785 790 tta ttg gat ttg ttg agc ttc acc tat caa gtt gcc cga gga atg gag 2752 Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr Gln Val Ala Arg Gly Met Glu 795 800 805 ttt ttg gct tca aaa aat tgt gtc cac cgt gat ctg gct gct cgc aac 2800 Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn 810 815 820 gtc ctc ctg gca caa gga aaa att gtg aag atc tgt gac ttt ggc ctg 2848 Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu 825 830 835 gcc aga gac atc atg cat gat tcg aac tat gtg tcg aaa ggc agt acc 2896 Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr 840 845 850 855 ttt ctg ccc gtg aag tgg atg gct cct gag agc atc ttt gac aac ctc 2944 Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu 860 865 870 tac acc aca ctg agt gat gtc tgg tct tat ggc att ctg ctc tgg gag 2992 Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu 875 880 885 atc ttt tcc ctt ggt ggc acc cct tac ccc ggc atg atg gtg gat tct 3040 Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Pro Gly Met Met Val Asp Ser 890 895 900 act ttc tac aat aag atc aag agt ggg tac cgg atg gcc aag cct gac 3088 Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp 905 910 915 cac gct acc agt gaa gtc tac gag atc atg gtg aaa tgc tgg aac agt 3136 His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile Met Val Lys Cys Trp Asn Ser 920 925 930 935 gag ccg gag aag aga ccc tcc ttt tac cac ctg agt gag att gtg gag 3184 Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr His Leu Ser Glu Ile Val Glu 940 945 950 aat ctg ctg cct gga caa tat aaa aag agt tat gaa aaa att cac ctg 3232 Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu 955 960 965 gac ttc ctg aag agt gac cat cct gct gtg gca cgc atg cgt gtg gac 3280 Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala Val Ala Arg Met Arg Val Asp 970 975 980 tca gac aat gca tac att ggt gtc acc tac aaa aac gag gaa gac aag 3328 Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys 985 990 995 ctg aag gac tgg gag ggt ggt ctg gat gag cag aga ctg agc gct 3373 Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp Glu Gln Arg Leu Ser Ala 1000 1005 1010 gac agt ggc tac atc att cct ctg cct gac att gac cct gtc cct 3418 Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro Asp Ile Asp Pro Val Pro 1015 1020 1025 gag gag gag gac ctg ggc aag agg aac aga cac agc tcg cag acc 3463 Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn Arg His Ser Ser Gln Thr 1030 1035 1040 tct gaa gag agt gcc att gag acg ggt tcc agc agt tcc acc ttc 3508 Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly Ser Ser Ser Ser Thr Phe 1045 1050 1055 atc aag aga gag gac gag acc att gaa gac atc gac atg atg gat 3553 Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu Asp Ile Asp Met Met Asp 1060 1065 1070 gac atc ggc ata gac tct tca gac ctg gtg gaa gac agc ttc ctg 3598 Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu Val Glu Asp Ser Phe Leu 1075 1080 1085 taa ctggcggatt cgaggggttc cttccacttc tggggccacc tctggatccc 3651 gttcagaaaa ccactttatt gcaatgcaga ggttgagagg aggacttggt tgatgtttaa 3711 agagaagttc ccagccaagg gcctcgggga gcgttctaaa tatgaatgaa tgggatattt 3771 tgaaatgaac tttgtcagtg ttgcctcttg caatgcctca gtagcatctc agtggtgtgt 3831 gaagtttgga gatagatgga taagggaata ataggccaca gaaggtgaac tttgtgcttc 3891 aaggacattg gtgagagtcc aacagacaca atttatactg cgacagaact tcagcattgt 3951 aattatgtaa ataactctaa ccaaggctgt gtttagattg tattaactat cttctttgga 4011 cttctgaaga gaccactcaa tccatccatg tacttccctc ttgaaacctg atgtcagctg 4071 ctgttgaact ttttaaagaa gtgcatgaaa aaccattttt gaaccttaaa aggtactggt 4131 actatagcat tttgctatct tttttagtgt taaagagata aagaataata attaaccaac 4191 cttgtttaat agatttgggt catttagaag cctgacaact cattttcata ttgtaatcta 4251 tgtttataat actactactg ttatcagtaa tgctaaatgt gtaataatgt aacatgattt 4311 ccctccagag aaagcacaat ttaaaacaat ccttactaag taggtgatga gtttgacagt 4371 ttttgacatt tatattaaat aacatgtttc tctataaagt atggtaatag ctttagtgaa 4431 ttaaatttag ttgagcatag agaacaaagt aaaagtagtg ttgtccagga agtcagaatt 4491 tttaactgta ctgaataggt tccccaatcc atcgtattaa aaaacaatta actgccctct 4551 gaaataatgg gattagaaac aaacaaaact cttaagtcct aaaagttctc aatgtagagg 4611 cataaacctg tgctgaacat aacttctcat gtatattacc caatggaaaa tataatgatc 4671 agcaaaaaga ctggatttgc agaagttttt tttttttttt tcttcatgcc tgatgaaagc 4731 tttggcgacc ccaatatatg tattttttga atctatgaac ctgaaaaggg tcagaaggat 4791 gcccagacat cagcctcctt ctttcacccc ttaccccaaa gagaaagagt ttgaaactcg 4851 agaccataaa gatattcttt agtggaggct ggatgtgcat tagcctggat cctcagttct 4911 caaatgtgtg tggcagccag gatgactaga tcctgggttt ccatccttga gattctgaag 4971 tatgaagtct gagggaaacc agagtctgta tttttctaaa ctccctggct gttctgatcg 5031 gccagttttc ggaaacactg acttaggttt caggaagttg ccatgggaaa caaataattt 5091 gaactttgga acagggttgg cattcaacca cgcaggaagc ctactattta aatccttggc 5151 ttcaggttag tgacatttaa tgccatctag ctagcaattg cgaccttaat ttaactttcc 5211 agtcttagct gaggctgaga aagctaaagt ttggttttga caggttttcc aaaagtaaag 5271 atgctacttc ccactgtatg ggggagattg aactttcccc gtctcccgtc ttctgcctcc 5331 cactccatac cccgccaagg aaaggcatgt acaaaaatta tgcaattcag tgttccaagt 5391 ctctgtgtaa ccagctcagt gttttggtgg aaaaaacatt ttaagtttta ctgataattt 5451 gaggttagat gggaggatga attgtcacat ctatccacac tgtcaaacag gttggtgtgg 5511 gttcattggc attctttgca atactgctta attgctgata ccatatgaat gaaacatggg 5571 ctgtgattac tgcaatcact gtgctatcgg cagatgatgc tttggaagat gcagaagcaa 5631 taataaagta cttgactacc tactggtgta atctcaatgc aagccccaac tttcttatcc 5691 aactttttca tagtaagtgc gaagactgag ccagattggc caattaaaaa cgaaaacctg 5751 actaggttct gtagagccaa ttagacttga aatacgtttg tgtttctaga atcacagctc 5811 aagcattctg tttatcgctc actctccctt gtacagcctt attttgttgg tgctttgcat 5871 tttgatattg ctgtgagcct tgcatgacat catgaggccg gatgaaactt ctcagtccag 5931 cagtttccag tcctaacaaa tgctcccacc tgaatttgta tatgactgca tttgtgtgtg 5991 tgtgtgtgtt ttcagcaaat tccagatttg tttccttttg gcctcctgca aagtctccag 6051 aagaaaattt gccaatcttt cctactttct atttttatga tgacaatcaa agccggcctg 6111 agaaacacta tttgtgactt tttaaacgat tagtgatgtc cttaaaatgt ggtctgccaa 6171 tctgtacaaa atggtcctat ttttgtgaag agggacataa gataaaatga tgttatacat 6231 caatatgtat atatgtattt ctatatagac ttggagaata ctgccaaaac atttatgaca 6291 agctgtatca ctgccttcgt ttatattttt ttaactgtga taatccccac aggcacatta 6351 actgttgcac ttttgaatgt ccaaaattta tattttagaa ataataaaaa gaaagatact 6411 tacatgttcc caaaacaatg gtgtggtgaa tgtgtgagaa aaactaactt gatagggtct 6471 accaatacaa aatgtattac gaatgcccct gttcatgttt ttgttttaaa acgtgtaaat 6531 gaagatcttt atatttcaat aaatgatata taatttaaag tta 6574 <210> 8 <211> 1089 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Gly Thr Ser His Pro Ala Phe Leu Val Leu Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys Gln Leu Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro 20 25 30 Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg 35 40 45 Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu 50 55 60 Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile Arg Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu 65 70 75 80 Phe Val Thr Val Leu Glu Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly 85 90 95 Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu 100 105 110 Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe 115 120 125 Val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp 130 135 140 Ser Ala Ile Ile Pro 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gat tct gat gcc tac tat gtc tac aga ctc cag gtg 1102 Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg Leu Gln Val 200 205 210 tca tcc atc aac gtc tct gtg aac gca gtg cag act gtg gtc cgc cag 1150 Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val Val Arg Gln 215 220 225 ggt gag aac atc acc ctc atg tgc att gtg atc ggg aat gag gtg gtc 1198 Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn Glu Val Val 230 235 240 aac ttc gag tgg aca tac ccc cgc aaa gaa agt ggg cgg ctg gtg gag 1246 Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu Ser Gly Arg Leu Val Glu 245 250 255 ccg gtg act gac ttc ctc ttg gat atg cct tac cac atc cgc tcc atc 1294 Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu Asp Met Pro Tyr His Ile Arg Ser Ile 260 265 270 275 ctg cac atc ccc agt gcc gag tta gaa gac tcg ggg acc tac acc tgc 1342 Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Thr Cys 280 285 290 aat gtg acg gag agt gtg aat gac cat cag gat gaa aag gcc atc aac 1390 Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp His Gln Asp Glu Lys Ala Ile Asn 295 300 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aaa aag aag tac cag cag gtg gat gag gag ttt ctg agg 3406 Glu Gly Tyr Lys Lys Lys Tyr Gln Gln Val Asp Glu Glu Phe Leu Arg 965 970 975 agt gac cac cca gcc atc ctt cgg tcc cag gcc cgc ttg cct ggg ttc 3454 Ser Asp His Pro Ala Ile Leu Arg Ser Gln Ala Arg Leu Pro Gly Phe 980 985 990 995 cat ggc ctc cga tct ccc ctg gac acc agc tcc gtc ctc tat act 3499 His Gly Leu Arg Ser Pro Leu Asp Thr Ser Ser Val Leu Tyr Thr 1000 1005 1010 gcc gtg cag ccc aat gag ggt gac aac gac tat atc atc ccc ctg 3544 Ala Val Gln Pro Asn Glu Gly Asp Asn Asp Tyr Ile Ile Pro Leu 1015 1020 1025 cct gac ccc aaa ccc gag gtt gct gac gag ggc cca ctg gag ggt 3589 Pro Asp Pro Lys Pro Glu Val Ala Asp Glu Gly Pro Leu Glu Gly 1030 1035 1040 tcc ccc agc cta gcc agc tcc acc ctg aat gaa gtc aac acc tcc 3634 Ser Pro Ser Leu Ala Ser Ser Thr Leu Asn Glu Val Asn Thr Ser 1045 1050 1055 tca acc atc tcc tgt gac agc ccc ctg gag ccc cag gac gaa cca 3679 Ser Thr Ile Ser Cys Asp Ser Pro Leu Glu Pro Gln Asp Glu Pro 1060 1065 1070 gag cca gag ccc cag ctt gag ctc cag gtg gag ccg gag cca gag 3724 Glu Pro Glu Pro Gln Leu Glu Leu Gln Val Glu Pro Glu Pro Glu 1075 1080 1085 ctg gaa cag ttg ccg gat tcg ggg tgc cct gcg cct cgg gcg gaa 3769 Leu Glu Gln Leu Pro Asp Ser Gly Cys Pro Ala Pro Arg Ala Glu 1090 1095 1100 gca gag gat agc ttc ctg tag ggggctggcc cctaccctgc cctgcctgaa 3820 Ala Glu Asp Ser Phe Leu 1105 gctccccccc tgccagcacc cagcatctcc tggcctggcc tgaccgggct tcctgtcagc 3880 caggctgccc ttatcagctg tccccttctg gaagctttct gctcctgacg tgttgtgccc 3940 caaaccctgg ggctggctta ggaggcaaga aaactgcagg ggccgtgacc agccctctgc 4000 ctccagggag gccaactgac tctgagccag ggttccccca gggaactcag ttttcccata 4060 tgtaagatgg gaaagttagg cttgatgacc cagaatctag gattctctcc ctggctgaca 4120 ggtggggaga ccgaatccct ccctgggaag attcttggag ttactgaggt ggtaaattaa 4180 cttttttctg ttcagccagc tacccctcaa ggaatcatag ctctctcctc gcacttttat 4240 ccacccagga gctagggaag agaccctagc ctccctggct gctggctgag ctagggccta 4300 gccttgagca gtgttgcctc atccagaaga aagccagtct cctccctatg atgccagtcc 4360 ctgcgttccc tggcccgagc tggtctgggg ccattaggca gcctaattaa tgctggaggc 4420 tgagccaagt acaggacacc cccagcctgc agcccttgcc cagggcactt ggagcacacg 4480 cagccatagc aagtgcctgt gtccctgtcc ttcaggccca tcagtcctgg ggctttttct 4540 ttatcaccct cagtcttaat ccatccacca gagtctagaa ggccagacgg gccccgcatc 4600 tgtgatgaga atgtaaatgt gccagtgtgg agtggccacg tgtgtgtgcc agtatatggc 4660 cctggctctg cattggacct gctatgaggc tttggaggaa tccctcaccc tctctgggcc 4720 tcagtttccc cttcaaaaaa tgaataagtc ggacttatta actctgagtg ccttgccagc 4780 actaacattc tagagtattc caggtggttg cacatttgtc cagatgaagc aaggccatat 4840 accctaaact tccatcctgg gggtcagctg ggctcctggg agattccaga tcacacatca 4900 cactctgggg actcaggaac catgcccctt ccccaggccc ccagcaagtc tcaagaacac 4960 agctgcacag gccttgactt agagtgacag ccggtgtcct ggaaagcccc cagcagctgc 5020 cccagggaca tgggaagacc acgggacctc tttcactacc cacgatgacc tccgggggta 5080 tcctgggcaa aagggacaaa gagggcaaat gagatcacct cctgcagccc accactccag 5140 cacctgtgcc gaggtctgcg tcgaagacag aatggacagt gaggacagtt atgtcttgta 5200 aaagacaaga agcttcagat gggtacccca agaaggatgt gagaggtggg cgctttggag 5260 gtttgcccct cacccaccag ctgccccatc cctgaggcag cgctccatgg gggtatggtt 5320 ttgtcactgc ccagacctag cagtgacatc tcattgtccc cagcccagtg ggcattggag 5380 gtgccagggg agtcagggtt gtagccaaga cgcccccgca cggggagggt tgggaagggg 5440 gtgcaggaag ctcaacccct ctgggcacca accctgcatt gcaggttggc accttacttc 5500 cctgggatcc ccagagttgg tccaaggagg gagagtgggt tctcaatacg gtaccaaaga 5560 tataatcacc taggtttaca aatattttta ggactcacgt taactcacat ttatacagca 5620 gaaatgctat tttgtatgct gttaagtttt tctatctgtg tacttttttt taagggaaag 5680 attttaatat taaacctggt gcttctcact cacaaaaa 5718 <210> 10 <211> 1106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Arg Leu Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Glu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gln Ile Ser Gln Gly 20 25 30 Leu Val Val Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser 35 40 45 Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg 50 55 60 Met Ser Gln Glu Pro Pro Gln Glu 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2139 ggaaatggct tgaagccaag tcagctttgc cttccacgct gtctccagac ccccacccct 2199 tccccactgc ctgcccaccc gtggagatgg gatgcttgcc tagggcctgg tccatgatgg 2259 agtcaggttt ggggttcgtg gaaagggtgc tgcttccctc tgcctgtccc tctcaggcat 2319 gcctgtgtga catcagtggc atggctccag tctgctgccc tccatcccga catggacccg 2379 gagctaacac tggcccctag aatcagccta ggggtcaggg accaaggacc cctcaccttg 2439 caacacacag acacacgcac acacacacac aggaggagaa atctcacttt tctccatgag 2499 ttttttctct tgggctgaga ctggatactg cccggggcag ctgccagaga agcatcggag 2559 ggaattgagg tctgctcggc cgtcttcact cgcccccggg tttggcgggc caaggactgc 2619 cgaccgaggc tggagctggc gtctgtcttc aagggcttac acgtggagga atgctccccc 2679 atcctcccct tccctgcaaa catggggttg gctgggccca gaaggttgtg atgaagaaaa 2739 gtgggccagt gtgggaatgc ggcaagaagg aattgacttc gactgtgacc tgtggggatt 2799 tctcccagct ctagacaacc ctgcaaagga ctgttttttc ctgagcttgg ccagaagggg 2859 gccatgaggc ctcagtggac tttccacccc ctccctggcc tgttctgttt tgcctgaagt 2919 tggagtgagt gtggctcccc tctatttagc atgacaagcc ccaggcaggc tgtgcgctga 2979 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cgcggtccgg ggaccccctc gtcgctgtcc tcccgacgcg 240 gacccgcgtg ccccaggcct cgcgctgccc ggccggctcc tcgtgtccca ctcccggcgc 300 acgccctccc gcgagtcccg ggcccctccc gcgcccctct tctcggcgcg cgcgcagc 358 atg gcg ccc ccg cag gtc ctc gcg ttc ggg ctt ctg ctt gcc gcg gcg 406 Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 acg gcg act ttt gcc gca gct cag gaa gaa tgt gtc tgt gaa aac tac 454 Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr 20 25 30 aag ctg gcc gta aac tgc ttt gtg aat aat aat cgt caa tgc cag tgt 502 Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys 35 40 45 act tca gtt ggt gca caa aat act gtc att tgc tca aag ctg gct gcc 550 Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala 50 55 60 aaa tgt ttg gtg atg aag gca gaa atg aat ggc tca aaa ctt ggg aga 598 Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg 65 70 75 80 aga gca aaa cct gaa ggg gcc ctc cag aac aat gat ggg ctt tat gat 646 Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp 85 90 95 cct gac tgc gat gag agc ggg ctc ttt aag gcc aag cag tgc aac ggc 694 Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly 100 105 110 acc tcc atg tgc tgg tgt gtg aac act gct ggg gtc aga aga aca gac 742 Thr Ser Met Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp 115 120 125 aag gac act gaa ata acc tgc tct gag cga gtg aga acc tac tgg atc 790 Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile 130 135 140 atc att gaa cta aaa cac aaa gca aga gaa aaa cct tat gat agt aaa 838 Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys 145 150 155 160 agt ttg cgg act gca ctt cag aag gag atc aca acg cgt tat caa ctg 886 Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu 165 170 175 gat cca aaa ttt atc acg agt att ttg tat gag aat aat gtt atc act 934 Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr 180 185 190 att gat ctg gtt caa aat tct tct caa aaa act cag aat gat gtg gac 982 Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp 195 200 205 ata gct gat gtg gct tat tat ttt gaa aaa gat gtt aaa ggt gaa tcc 1030 Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser 210 215 220 ttg ttt cat tct aag aaa atg gac ctg aca gta aat ggg gaa caa ctg 1078 Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu 225 230 235 240 gat ctg gat cct ggt caa act tta att tat tat gtt gat gaa aaa gca 1126 Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala 245 250 255 cct gaa ttc tca atg cag ggt cta aaa gct ggt gtt att gct gtt att 1174 Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile 260 265 270 gtg gtt gtg gtg ata gca gtt gtt gct gga att gtt gtg ctg gtt att 1222 Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile 275 280 285 tcc aga aag aag aga atg gca aag tat gag aag gct gag ata aag gag 1270 Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu 290 295 300 atg ggt gag atg cat agg gaa ctc aat gca taa ctatataatt tgaagattat 1323 Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala 305 310 agaagaaggg aaatagcaaa tggacacaaa ttacaaatgt gtgtgcgtgg gacgaagaca 1383 tctttgaagg tcatgagttt gttagtttaa catcatatat ttgtaatagt gaaacctgta 1443 ctcaaaatat aagcagcttg aaactggctt taccaatctt gaaatttgac cacaagtgtc 1503 ttatatatgc agatctaatg taaaatccag aacttggact ccatcgttaa aattatttat 1563 gtgtaacatt caaatgtgtg cattaaatat gcttccacag taaaatctga aaaactgatt 1623 tgtgattgaa agctgccttt ctatttactt gagtcttgta catacatact tttttatgag 1683 ctatgaaata aaacatttta aactgaattt cttaaaaaaa aaaaaaaa 1731 <210> 14 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr 20 25 30 Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys 35 40 45 Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala 50 55 60 Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg 65 70 75 80 Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp 85 90 95 Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly 100 105 110 Thr Ser Met Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp 115 120 125 Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile 130 135 140 Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys 145 150 155 160 Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu 165 170 175 Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr 180 185 190 Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp 195 200 205 Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser 210 215 220 Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu 225 230 235 240 Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala 245 250 255 Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile 260 265 270 Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile 275 280 285 Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu 290 295 300 Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala 305 310 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L803-mts / GSK-3beta peptidic inhibitor <220> <221> LIPID <222> (1)..(1) <223> MYRISTATE <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> AMIDATION <400> 15 Gly Lys Glu Ala Pro Pro Ala Pro Pro Gln Ser Pro 1 5 10

Claims (21)

  1. 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 신장 전구 세포를 제조하는 방법이며,
    (i) 다능성 줄기 세포를 신장 전구 세포로의 분화를 유도하는 조건 하에서 배양하는 공정; 및
    (ⅱ) 공정 (i)에서 얻어진 세포로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는 공정
    을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 공정 (ⅱ)에 있어서 적어도 2개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 공정 (ⅱ)에 있어서 적어도 3개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 공정 (ⅱ)에 있어서 적어도 4개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 공정 (ⅱ)에 있어서, CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개의 세포 표면 마커를 사용하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 공정 (ⅱ)에 있어서, 적어도 3개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 공정 (ⅱ)에 있어서, 세포 표면 마커로서 CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)를 사용하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기(iPS) 세포인, 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된, 신장 전구 세포 집단.
  11. 신장 전구 세포를 포함하는 세포 집단으로부터, CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) 및 CD326(-)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 적어도 2개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 적어도 3개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 적어도 4개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
  15. 제11항에 있어서, CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개의 세포 표면 마커를 사용하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 적어도 3개의 세포 표면 마커를 사용하여 세포 집단을 선별하는, 방법.
  17. 제11항에 있어서, 세포 표면 마커로서 CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) 및 CD271(+)를 사용하는, 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 전구 세포가 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 신장 전구 세포인, 방법.
  19. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기(iPS) 세포인, 방법.
  20. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, 방법.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의하여 얻어진 세포 집단.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019524098A (ja) 2016-07-15 2019-09-05 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 非分裂細胞のゲノム編集のための方法と組成物
CN117802033A (zh) * 2017-05-25 2024-04-02 国立大学法人京都大学 由多能干细胞制造中胚层谱系原条细胞的方法
EP3828262A4 (en) * 2018-07-23 2022-03-30 Kyoto University NOVEL RENAL PROGENITOR CELL MARKER AND METHOD OF RENAL PROGENITOR CELL CONCENTRATION USING THE SAME
CN110684855B (zh) * 2019-10-21 2021-08-03 华中农业大学 一种米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN116802276A (zh) 2021-01-08 2023-09-22 国立大学法人京都大学 用于扩增培养肾元祖细胞的培养基、扩增培养肾元祖细胞的方法以及肾脏类器官的制造方法
CN113201560B (zh) * 2021-05-06 2023-05-30 北京起源爱心生物科技有限公司 一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
ES2537951T3 (es) * 2002-08-08 2015-06-16 Baylor College Of Medicine Aislamiento e identificación de células T
CN101864392B (zh) 2005-12-13 2016-03-23 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
CN104651301A (zh) * 2008-10-24 2015-05-27 洛杉矶儿童医院 羊水细胞及其用途
EP2401362B1 (en) * 2009-02-26 2017-04-12 Tel HaShomer Medical Research Infrastructure and Services Ltd. Isolated populations of renal stem cells and methods of isolating and using same
JP5896360B2 (ja) 2010-07-21 2016-04-13 国立大学法人京都大学 ヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導方法
AU2012279995C1 (en) 2011-07-06 2019-10-24 Cell Therapy Limited Progenitor cells of mesodermal lineage
AU2014279065B2 (en) 2013-06-11 2020-04-09 Astellas Pharma Inc. Method for producing renal precursor cells, and drug containing renal precursor cells
MX2015017330A (es) * 2013-07-29 2016-04-06 Hoffmann La Roche Metodo para la diferenciacion de celulas madre pluripotenciales en precursores renales multi-competentes.
ITFI20130303A1 (it) * 2013-12-24 2015-06-25 Azienda Ospedaliero Universitaria M Eyer Metodica per l¿isolamento, purificazione ed amplificazione di progenitori renali cd133+cd24+ dalle urine di pazienti affetti da malattie renali.

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