KR102675213B1 - 망막 색소 표피 세포의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 표피 세포를 보다 효율적으로 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 망막 색소 표피 세포의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다: (1) 다능성 줄기 세포를, FGF 수용체 저해제 및/또는 MEK 저해제를 포함하는 배지에서 30 일을 초과하지 않는 기간 동안 배양하는 제 1 단계; 및 (2) 제 1 단계에서 수득한 세포를, 노달 신호 전달 경로 저해제 및/또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제의 존재 하에 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 형성시키는 제 2 단계.

Description

망막 색소 표피 세포의 제조 방법
본 발명은, 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조 방법 등에 관한 것이다.
망막 색소 표피 세포는 망막의 최외층에 존재하는 색소 표피 세포이며, 광수용체 세포 외절의 식세포 작용 및 시각 물질의 재순환과 같은 광수용체 세포의 유지 등에 중요한 역할을 담당하고 있다. 노화 등으로 인한 망막 색소 표피 세포의 이상에 의해 초래된 노인성 황반 변성은, 중심 시력의 저하나 실명을 일으키는 안질환이며, 이의 유효한 치료법 개발이 요망되고 있다. 최근, 노인성 황반 변성의 새로운 치료법으로서 망막 색소 표피 세포를 보충 또는 대체하는 세포 이식 치료가 각광을 받고 있으며, 세포 치료용 이식 재료로서 망막 색소 표피 세포의 활용이 기대되고 있다. 지금까지 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 망막 색소 표피 세포를 분화 유도하는 방법에 대한 일부 보고 (비특허문헌 1 및 2, 특허문헌 1, 2, 3 및 4) 가 있지만, 재생 의료 산업에 있어서 고품질 망막 색소 표피 세포를 대량으로 안정적으로 제조하는 기술이 필요하므로, 보다 고효율이고 편리한 제조 방법이 요구되고 있다.
WO 2012/173207 WO 2015/053375 WO 2015/053376 US 2013/0224156
Stem Cell Reports, 2(2), 205-218 (2014) Cell Stem Cell, 10(6), 771-785 (2012)
다능성 줄기 세포 유래의 망막 색소 표피 세포를 재생 의료 등에 사용하는 경우, 상기 세포를 대량으로 안정적으로 제조하기 위해서는, 보다 고효율인 제조 방법의 개발이 긴급히 필요하다.
이와 같은 상황을 고려하여, 본 발명자들은 집중적으로 연구를 수행하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다.
[1] 하기 단계를 포함하는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법:
(1) 다능성 줄기 세포를, FGF 수용체 저해제 및/또는 MEK 저해제를 포함하는 배지에서 30 일 이하 기간 동안 배양하는 제 1 단계, 및
(2) 제 1 단계에서 수득한 세포를, 노달 (Nodal) 신호 전달 경로 저해제 및/또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제의 존재 하에 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 형성시키는 제 2 단계.
[2] 상술한 [1] 에 있어서, 제 1 단계가 무혈청 조건으로 실시되는 제조 방법.
[3] 상술한 [1] 또는 [2] 에 있어서, 제 1 단계가 피더 세포 부재 하에 실시되는 제조 방법.
[4] 상술한 [1] ~ [3] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계에서의 배지가 미분화 상태 유지 인자를 추가로 포함하는 제조 방법.
[5] 상술한 [4] 에 있어서, 미분화 상태 유지 인자가 FGF 신호 전달 경로 아고니스트인 제조 방법.
[6] 상술한 [5] 에 있어서, FGF 신호 전달 경로 아고니스트가 bFGF 인 제조 방법.
[7] 상술한 [1] ~ [6] 중 어느 하나에 있어서, FGF 수용체 저해제가 PD173074 및 SU5402 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 제조 방법.
[8] 상술한 [1] ~ [7] 중 어느 하나에 있어서, MEK 저해제가 PD0325901, PD184352, U0126, TAK-733 및 AZD-8330 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 제조 방법.
[9] 상술한 [1] ~ [8] 중 어느 하나에 있어서, 노달 신호 전달 경로 저해제가 ALK4, 5 또는 7 저해제인 제조 방법.
[10] 상술한 [9] 에 있어서, ALK4, 5 또는 7 저해제가 SB431542 인 제조 방법.
[11] 상술한 [1] ~ [10] 중 어느 하나에 있어서, Wnt 신호 전달 경로 저해제가 CKI-7 인 제조 방법.
[12] 상술한 [1] ~ [11] 중 어느 하나에 있어서, 다능성 줄기 세포가 영장류 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
[13] 상술한 [1] ~ [12] 중 어느 하나에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
[14] 상술한 [1] ~ [13] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계에서의 배지가 BMP 수용체 저해제를 추가로 포함하는 제조 방법.
[15] 상술한 [14] 에 있어서, BMP 수용체 저해제가 ALK2/3 저해제인 제조 방법.
[16] 상술한 [15] 에 있어서, ALK2/3 저해제가 LDN193189 인 제조 방법.
[17] 상술한 [1] ~ [16] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계에서의 배지가 소닉 헤지호그 (Sonic hedgehog) 신호 전달 경로 아고니스트를 추가로 포함하는 제조 방법.
[18] 상술한 [17] 에 있어서, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 아고니스트가 SAG 인 제조 방법.
[19] 상술한 [1] ~ [18] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계에서의 배지가 PKC 저해제를 추가로 포함하는 제조 방법.
[20] 상술한 [19] 에 있어서, PKC 저해제가 Go6983 인 제조 방법.
[21'] 상술한 [1] ~ [20] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계에서 배양 기간이, 안계 전사 인자 중 적어도 하나의 유전자 발현을 유도하는데 충분한 기간이며 30 일 이하의 기간인 제조 방법.
[22'] 상술한 [1] ~ [20] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계에서 배양 기간이, PAX6, LHX2 및 SIX3 중 적어도 하나의 유전자 발현을 유도하는데 충분한 기간이며 30 일 이하의 기간인 제조 방법.
[21] 상술한 [1] ~ [20], [21'] 및 [22'] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계에서 배양 기간이 2 일 ~ 13 일 동안인 제조 방법.
[22] 상술한 [1] ~ [21], [21'] 및 [22'] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계에서 배양 기간이 4 일 ~ 6 일 동안인 제조 방법.
[23] 상술한 [1] ~ [22], [21'] 및 [22'] 중 어느 하나에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포를 포함하는 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하기 위한 시약.
[24] 상술한 [1] ~ [22], [21'] 및 [22'] 중 어느 하나에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포와 시험 물질을 접촉시키고, 세포에 대한 시험 물질의 영향을 검정하는 것을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능의 평가 방법.
[25] 상술한 [1] ~ [22], [21'] 및 [22'] 중 어느 하나에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포를 포함하는, 망막 색소 표피 세포의 장애를 기반으로 하는 질환의 치료제.
[26] 상술한 [1] ~ [22], [21'] 및 [22'] 중 어느 하나에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 이식하는 것을 포함하는, 망막 색소 표피 세포의 장애를 기반으로 하는 질환의 치료 방법.
[27] 망막 색소 표피 세포의 장애를 기반으로 하는 질환의 치료에서 사용하기 위한, 상술한 [1] ~ [22], [21'] 및 [22'] 중 어느 하나에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포.
[28] 상술한 [1] ~ [22], [21'] 및 [22'] 중 어느 하나에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포를 유효 성분으로서 포함하는 약학 조성물.
본 발명으로, 현존 분화 유도 방법보다 고효율인 망막 색소 표피 세포 제조 방법을 제공할 수 있게 되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포 치료용 이식 재료, 또는 화학 물질 등의 독성 또는 효능 평가에 사용하는 시약 또는 재료일 수 있는 망막 색소 표피 세포의 효율적 제조에 있어서 유용하다.
도 1 은, "StemFit®" AK03 배지 또는 Essential 8 배지를 사용하여 MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (201B7 또는 1231A3) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 38~42 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다. MEKi: MEK 저해제 ("StemFit®" AK03 배지 사용시 1 μM, Essential 8 배지 사용시 0.03 μM PD0325901).
도 2 는, MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (201B7) 유래 RPE 세포를 함유하는 배양 55 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 (a) 사진, (b) 저배율 위상차 현미경 영상 및 (c) 고배율 명시야 현미경 영상을 나타낸다. MEKi: MEK 저해제 (1 μM PD0325901).
도 3 은, "StemFit®" AK03 배지 또는 Essential 8 배지를 사용하여 MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (201B7 또는 1231A3) 유래 분화 세포를 함유하는 배양 38~42 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다.
도 4 는, "StemFit®" AK03 배지, Essential 8 배지 또는 StemSure hPSC 배지 △ w/o bFGF 를 사용하여 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (201B7 또는 1231A3) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 38~42 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다. FGFRi: FGF 수용체 저해제 (100 nM PD173074).
도 5 는, FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (201B7) 유래 RPE 세포를 함유하는 배양 55 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 (a) 사진, (b) 저배율 위상차 현미경 영상 및 (c) 고배율 명시야 현미경 영상을 나타낸다. FGFRi: FGF 수용체 저해제 (100 nM PD173074).
도 6 은, "StemFit®" AK03 배지, Essential 8 배지 또는 StemSure hPSC 배지 △ w/o bFGF 를 사용하여 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (201B7 또는 1231A3) 유래 분화 세포를 함유하는 배양 38~42 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다.
도 7 은, MEK 저해제 및/또는 FGF 수용체 저해제와 각종 저해제, 신호 전달 경로 저해제 또는 신호 전달 경로 아고니스트와의 조합 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (201B7 또는 1231A3) 유래 RPE 세포를 함유하는 배양 38~47 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다. 비교를 위해, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법, 및 MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 RPE 세포를 함유하는 6-웰 배양 플레이트의 사진 (도면 상부의 "무처리" 및 "MEKi"), 그리고 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법, 및 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 RPE 세포를 함유하는 6-웰 배양 플레이트의 사진도 나타낸다 (도면 하부의 "무처리" 및 "FGFRi"). MEKi: MEK 저해제 (1 μM PD0325901), FGFRi: FGF 수용체 저해제 (100 nM PD173074), BMPRi: BMP 수용체 저해제 (100 nM LDN193189), Shh ag: Shh 신호 전달 경로 아고니스트 (30 nM SAG), PKCi: PKC 저해제 (2 μM Go6983).
도 8 은, (A) 결과를 전체 웰에서의 RPE 세포의 백분율에 따라 0 에서 5 의 6 개 등급으로 분류할 때 각 등급의 대표적인 6-웰 배양 플레이트의 사진, (B) MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법 (무처리), MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법 (MEKi), 및 MEK 저해제와 각종 저해제 또는 신호 전달 경로 저해제와의 조합 처리 단계를 포함하는 제조 방법 (MEKi+PKCi, MEKi+PKCi+BMPRi, MEKi+FGFRi, MEKi+FGFRi+BMPRi, MEKi+FGFRi+PKCi, MEKi+FGFRi+PKCi+BMPRi) 으로 제조한 결과의 요약, 그리고 (C) FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법 (무처리), FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법 (FGFRi), 및 FGF 수용체 저해제와 각종 저해제 또는 신호 전달 경로 저해제와의 조합 처리 단계를 포함하는 제조 방법 (FGFRi+PKCi, FGFRi+PKCi+BMPRi, FGFRi+MEKi, FGFRi+MEKi+BMPRi, FGFRi+MEKi+PKCi, FGFRi+MEKi+PKCi+BMPRi) 으로 제조한 결과의 요약을 나타낸다. 그래프 세로축은 전체 웰에서의 RPE 세포의 백분율을 6 개 등급으로 나타낸다. 값은 평균 ± 표준 편차로서 나타내고, n 은 실험 횟수를 나타낸다. MEKi: MEK 저해제 (1 μM PD0325901), FGFRi: FGF 수용체 저해제 (100 nM PD173074), BMPRi: BMP 수용체 저해제 (100 nM LDN193189), PKCi: PKC 저해제 (2 μM Go6983).
도 9 는, "StemFit®" AK03N 배지를 사용하여 MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (Ff-I01 또는 QHJI01) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 43 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다 (MEKi 또는 FGFRi). 비교를 위해, MEK 저해제 및/또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 분화 세포를 함유하는 배양 43 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진도 나타낸다 (무처리). MEKi: MEK 저해제 (1 μM PD0325901), FGFRi: FGF 수용체 저해제 (100 nM PD173074).
도 10 은, "StemFit®" AK03N 배지를 사용하여 MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (QHJI01) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 48 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진 (MEKi (PD0325901) 또는 FGFRi (PD173074)) 을 나타낸다. 1 일 내지 6 일 동안의 저해제 노출의 효과를 검사하였다. MEKi: MEK 저해제 (1 μM PD0325901), FGFRi: FGF 수용체 저해제 (100 nM PD173074).
도 11 은, "StemFit®" AK03 배지를 사용하여 MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (1231A3) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 37 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다 (MEKi (PD0325901)). 비교를 위해, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 분화 세포를 함유하는 배양 37 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진도 나타낸다 (무처리). 1 일, 3 일, 6 일 및 13 일 동안의 저해제 노출의 효과를 검사하였다. MEKi: MEK 저해제 (1 μM PD0325901).
도 12 는, "StemFit®" AK03N 배지를 사용하여 MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (Ff-I01 또는 QHJI01) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포의, 배양 43 일 후 전체 웰에서의 백분율 (백분율은 도 8A 에 따른 시각적 판단에 의한 결과임), 및 제 1 단계 종료시 PAX6, LHX2 및 SIX3 의 발현 값 (신호) 및 플래그 (검출) 를 나타낸다 (MEKi 또는 FGFRi). 비교를 위해, MEK 저해제 및/또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 분화 세포의 전체 웰에서의 RPE 세포의 백분율의 시각적 판단 결과, 및 제 1 단계 종료시에 상응하는 시간에서의 PAX6, LHX2 및 SIX3 의 발현 값 (신호) 및 플래그 (검출) 를 나타낸다 (무처리). MEKi: MEK 저해제 (1 μM PD0325901), FGFRi: FGF 수용체 저해제 (100 nM PD173074).
도 13 은, "StemFit®" AK03N 배지를 사용하여 MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (QHJI01) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 36 일 또는 49 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다 (MEKi (PD0325901) 또는 FGFRi (PD173074)). 비교를 위해, MEK 저해제 및/또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 분화 세포를 함유하는 배양 49 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진도 나타낸다 (무처리). MEK 저해제 농도 0.25 μM ~ 4 μM, 또는 FGF 수용체 저해제 농도 25 nM ~ 400 nM 의 효과를 검사하였다. MEKi: MEK 저해제 (PD0325901), FGFRi: FGF 수용체 저해제 (PD173074).
도 14 는, "StemFit®" AK03N 배지를 사용하여 MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (QHJI01) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 49 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다 (MEKi (PD0325901) 또는 FGFRi (PD173074)). 제 2 단계 개시시의 플레이팅된 세포수 (0.2 x 104 ~ 4.0 x 104 세포/㎠) 의 효과를 검사하였다. MEKi: MEK 저해제 (1 μM PD0325901), FGFRi: FGF 수용체 저해제 (100 nM PD173074).
도 15 는, "StemFit®" AK03N 배지를 사용하여 MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (QHJI01 또는 1231A3) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 49 일 또는 50 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다 (MEKi (PD0325901), MEKi(PD184352), MEKi(U0126), MEKi(TAK-733) 또는 MEKi(AZD-8330)). 비교를 위해, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 분화 세포를 함유하는 배양 49 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진도 나타낸다 (무처리). MEKi: MEK 저해제 (1 μM PD0325901, 1.5 μM, 3 μM 또는 6 μM PD184352, 5 μM 또는 10 μM U0126, 0.3 μM TAK-733, 0.3 μM AZD-8330).
도 16 은, "StemFit®" AK03N 배지를 사용하여 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (QHJI01 또는 1231A3) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 49 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다 (FGFRi (PD173074) 또는 FGFRi(SU5402)). 비교를 위해, FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 분화 세포를 함유하는 배양 49 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진도 나타낸다 (무처리). FGFRi: FGF 수용체 저해제 (100 nM PD173074, 5 μM, 10 μM 또는 20 μM SU5402).
도 17 은, MEK 저해제 함유 "StemFit®" AK03N 배지를 사용하는 제 1 단계 후의 제 2 단계에서, 노달 신호 전달 경로 저해제 및/또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제 존재 하 배양에 의해 제조된 iPS 세포 (QHJI01) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 43 일 후의 12-웰 배양 플레이트의 사진을 나타낸다 (NODALi+WNTi, NODALi 또는 WNTi). 제 2 단계에서 노달 신호 전달 경로 저해제 또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제 단독 노출의 분화 유도 효과를 검사하였다. NODALi: 노달 신호 전달 경로 저해제 (5 μM SB431542), WNTi: Wnt 신호 전달 경로 저해제 (3 μM CKI-7).
도 18 은, "StemFit®" AK03 배지를 사용하여 MEK 저해제 및 BMP 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (201B7) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포의, 배양 39 일 후 전체 웰에서의 백분율 (백분율은 도 8A 에 따른 시각적 판단에 의한 결과임) (도면 상부, 6 일 동안 MEKi + 1 일 동안 BMPRi 또는 6 일 동안 MEKi + 6 일 동안 BMPRi), 및 실시간 RT-PCR 법에 의한 배양 39 일 후의 망막 색소 표피 마커 BEST1 및 MITF, 및 눈 형성 초기 마커 RAX 의 발현 수준 비교 결과 (도면 하부, 전체 웰에서의 RPE 세포의 백분율 (6 개 등급의 "3" 및 "5")) 를 나타낸다. 비교를 위해, MEK 저해제 및/또는 BMP 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 분화 세포의, 배양 39 일 후 전체 웰에서의 RPE 세포의 백분율의 시각적 판단 결과 (도면 상부, "무처리"), 및 BEST1, MITF 및 RAX 의 발현 수준 (도면 하부, 전체 웰에서의 RPE 세포의 백분율 (6 개 등급의 "1")) 도 나타낸다. 각 샘플의 유전자 발현 수준을 GAPDH 의 발현 수준에 의해 정규화하고, BEST1, MITF 또는 RAX 발현 수준 비교를 위해 미분화 상태 유지용 조건 하 배양된 iPS 세포 ((도면 하부, "미분화") 에서의 발현 수준을 1 로 정의했을 때 상대량으로서 나타내었다.
도 19 는, "StemFit®" AK03N 배지를 사용하여 MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 (1231A3) 유래 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 함유하는 배양 43 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진 (도면의 우측, MEKi (PD0325901), FGFRi (PD173074)), 및 RT-PCR 법에 의한 배양 43 일 후의 망막 색소 표피 마커 RPE65, BEST1 와 CRALBP 및 내재성 비교군 GAPDH 의 발현 확인의 결과 (도면의 좌측, MEKi (PD0325901), FGFRi (PD173074)) 를 나타낸다. 비교를 위해, MEK 저해제 및/또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법으로 제조된 iPS 세포 유래 분화 세포를 함유하는 배양 43 일 후의 6-웰 배양 플레이트의 사진 (도면의 우측, 무처리), 및 RPE65, BEST1, CRALBP 및 GAPDH 의 RT-PCR 결과도 나타낸다 (도면의 좌측, 무처리). RT-PCR 법에 대해, 양성 대조군으로서 1 차 인간 RPE (도면의 좌측, hRPE), 및 음성 대조군으로서 미분화 상태 유지용 조건 하 배양된 iPS 세포 (도면의 좌측, 미분화 iPSC) 를 사용하였다.
1. 정의
본 발명에서 "다능성 줄기 세포" 란, 자기 재생력과 다능성을 갖는 세포, 생체내 배양될 수 있고 3 배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 에 속하는 세포 계열 모두로 분화하는 능력 (다능성 (pluripotency)) 을 가질 수 있는 줄기 세포를 의미한다.
다능성 줄기 세포의 예는, 배아 줄기 세포 (ES 세포), 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 등을 포함한다. 본 발명에 사용하는 다능성 줄기 세포는 포유 동물 다능성 줄기 세포이고, 바람직하게는 설치류 또는 영장류의 다능성 줄기 세포이고, 보다 바람직하게는 인간 다능성 줄기 세포이다. 여기서 포유 동물로서는, 인간, 원숭이 등과 같은 영장류, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등과 같은 설치류, 및 기타 개, 고양이, 돼지, 소, 염소, 말, 양, 토끼 등을 언급할 수 있다.
배아 줄기 세포는, 예를 들어 착상 이전의 배반포 단계 배아에 존재하는 내부 세포 덩어리를, 피더 세포 상에 또는 LIF 를 함유하는 배지 내에 배양함으로써 제조할 수 있다. 배아 줄기 세포의 구체적인 제조 방법은 예를 들어, WO 96/22362, WO 02/101057, US 5,843,780, US 6,200,806, US 6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아 줄기 세포는 소정의 기관으로부터 입수 가능하거나, 시판 제품을 구입할 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은, 쿄토 대학 재생 의과 학연 연구소 (Kyoto University's Institute for Frontier Medical Sciences) 로부터 입수 가능하다. 마우스 배아 줄기 세포인 EB5 세포는 국립 연구 개발 법인 이화학 연구소 (Incorporated Administrative Agency RIKEN) 로부터, 그리고 마우스 배아 줄기 세포인 D3 세포주는 ATCC 로부터 입수 가능하다.
ES 세포 중 하나인 핵 이식 ES세포 (ntES 세포) 는, 핵을 없앤 난자에 체세포의 핵을 이식해 제조한든 클론 배아부터 수립할 수 있다.
"유도 다능성 줄기 세포" 는, 체세포를 공지된 방법 등에 의해 초기화 (reprogramming) 함으로써 다능성을 유도한 세포이다. 구체적으로는, 예를 들어 섬유아세포, 피부 세포, 말초혈 단핵 세포 등과 같은 체세포를 Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb 등의 유전자에서 선택되는 복수의 초기화 인자의 임의의 조합을 도입함으로써 초기화하여 다능성을 갖도록 유도된 세포를 언급할 수 있다. 바람직한 초기화 인자의 조합의 예는 (1) Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Myc (c-Myc 또는 L-Myc), (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc (Stem Cells, 2013;31:458-466) 를 포함할 수 있다.
유도 다능성 줄기 세포는, 2006 년에 Yamanaka et al. 에 의해 마우스 세포에서 처음으로 수립되었고 (Cell, 2006, 126(4) pp.663-676), 2007 년에는 인간 섬유아세포에서도 수립되었다 (Cell, 2007, 131(5) pp.861-872; Science, 2007, 318(5858) pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp.101-106). 유도 다능성 줄기 세포의 유도 방법에 있어서 그 후에도 다양한 개선이 이루어지고 있으며, 이의 구체적인 제조 방법은 예를 들어 마우스 유도 다능성 줄기 세포에 대해서는 [Cell. 2006 Aug 25; 126(4):663-76] 에, 인간 유도 다능성 줄기 세포에 대해서는 [Cell. 2007 Nov 30; 131(5):861-72] 등에 기재되어 있다.
유전자 발현에 의한 직접 초기화 기반의 제조 방법 이외에, 화합물의 첨가 등에 의해 체세포로부터 유도 다능성 줄기 세포를 유도할 수도 있다 (Science, 2013, 341 pp. 651-654).
또한, 수립된 유도 다능성 줄기 세포를 입수할 수도 있고, 예를 들어 쿄토 대학에서 수립된 201B7 세포, 201B7-Ff 세포, 253G1 세포, 253G4 세포, 1201C1 세포, 1205D1 세포, 1210B2 세포 또는 1231A3 세포 등과 같은 인간 유도 다능성 세포주가, 쿄토 대학 및 iPS Academia Japan, Inc. 로부터 입수 가능하다. 확립된 유도 다능성 줄기 세포로서, 예를 들어 쿄토 대학에서 수립된 Ff-I01 세포 및 Ff-I14 세포 및 QHJI01 세포가 쿄토 대학에서 입수 가능하다.
유도 다능성 줄기 세포를 수득하기 위해 사용되는 체세포가 특별히 한정되지 않지만, 섬유아세포, 혈구계 세포 (예를 들어 말초혈 단핵 세포 또는 T 세포, 제대혈 유래 세포) 등을 구체적으로 언급할 수 있다. 섬유아세포로서, 진피 유래의 것들 등을 언급할 수 있다.
유도 다능성 줄기 세포를 여러 종류의 초기화 인자의 발현에 의해 초기화하여 제조하는 경우, 유전자 발현을 위한 수단은 특별히 한정되지 않는다. 당업자에게 널리 공지되어 있는 유전자 도입 방법 또는 단백질의 직접 주입법을 사용할 수 있다. 상기 유전자 도입법의 구체예는, 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터) 를 사용한 감염법, 플라스미드 벡터 (예를 들어, 플라스미드 벡터, 에피솜 벡터) 또는 RNA 벡터를 각각 사용하는 인산칼슘법, 리포펙틴법, 레트로넥틴법 (RetroNectin method), 전기천공법 등을 포함한다.
유도 다능성 줄기 세포는, 피더 세포 존재 하 또는 피더 세포 부재 하 (피더-프리 (feeder-free)) 에서 제조할 수 있다. 피더 세포 존재 하에서 유도 다능성 줄기 세포를 제조할 때에는, 미분화 상태 유지 인자 존재 하에서 공지된 방법에 의해 유도 다능성 줄기 세포를 제조할 수 있다. 피더 세포 부재 하에서 유도 다능성 줄기 세포를 제조할 때에 사용되는 배지는 특별히 한정되지 않으나, 배아 줄기 세포 및/또는 유도 다능성 줄기 세포용의 공지된 유지 배지, 및 피더-프리 하에 유도 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 배지를 사용할 수 있다. 피더-프리 하에 유도 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 배지의 예는, Essential 8 배지 (E8 배지), Essential 6 배지, TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지, Stabilized Essential 8 배지, StemFit® 등과 같은 피더-프리 배지를 포함할 수 있다. 유도 다능성 줄기 세포를 제조할 때, 예를 들어 피더 세포 부재 하에 센다이바이러스 벡터를 사용하여 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 Myc 의 4 개 인자를 체세포에 유전자 도입함으로써 유도 다능성 줄기 세포를 제조할 수 있다.
본 발명에 사용되는 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 설치류 또는 영장류의 유도 다능성 줄기 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유도 다능성 줄기 세포이다.
당업자가 널리 공지된 방법에 의해 다능성 줄기 세포를 유지 배양 또는 확대 배양할 수 있으나, 이식 세포 제조의 안전성 등의 관점에서, 다능성 줄기 세포는 무혈청 조건 하 및 피더 세포 부재 하에 유지 배양 또는 확대 배양하는 것이 바람직하다.
유전자 변형된 다능성 줄기 세포는 예를 들어 상동 재조합 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 변형되는 염색체 상의 유전자의 예는 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원 유전자, 망막 색소 표피 세포의 장애로 인한 질환 관련 유전자 등을 포함한다. 염색체 상의 표적 유전자는, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995) 등에 기재된 방법을 사용하여 변형될 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어 변형되는 표적 유전자 (예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원 유전자, 질환 관련 유전자 등) 를 포함하는 게놈 DNA 를 단리하고, 단리된 게놈 DNA 를 사용하여 표적 유전자의 상동 재조합에 사용되는 표적 벡터를 제작한다. 제작된 표적 벡터를 줄기 세포에 도입하고, 표적 유전자와 표적 벡터의 사이에 상동 재조합을 나타낸 세포를 선택함으로써, 염색체 상의 유전자가 변형된 줄기 세포를 제조할 수 있다.
표적 유전자를 포함하는 게놈 DNA 를 단리하는 방법의 예는, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) 등에 기재된 공지된 방법을 포함한다. 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems사제), Universal GenomeWalker Kits (CLONTECH사제) 등을 사용하여, 표적 유전자를 포함하는 게놈 DNA 를 단리할 수도 있다. 게놈 DNA 대신에, 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는, PCR 법에 의해 상응하는 폴리뉴클레오티드를 증폭함으로써 수득할 수 있다.
표적 유전자를 상동 재조합하기 위해 사용되는 표적 벡터의 제작, 및 상동 재조합체의 효율적인 선택은, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995) 등에 기재된 방법에 따라 실시될 수 있다. 표적 벡터로서, 대체형 또는 삽입형 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 선택 방법으로서, 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 폴리 A 선택 등과 같은 방법을 사용할 수 있다.
선택된 세포주로부터 원하는 상동 재조합체를 선택하는 방법의 예는, 게놈 DNA 에 대한 서던 하이브리드화법 (Southern hybridization method), PCR 법 등을 포함한다.
본 발명에서 "안계 전사 인자 (eye field transcription factor)" 란, 발생 초기에 있어서 안계 부위에서 발현되는 유전자이며, ET(Tbx3), Rx1(Rax), Pax6, Six3, Lhx2, Tlx(Nr2e1), Optx2 (Six6) 등이 확인되고 있다. 이들 안계 전사 인자는, 눈 형성 초기의 마커로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 "망막 색소 표피 세포" 란, 생체내 망막에서 신경 망막 조직의 외측에 존재하는 표피 세포를 의미한다. 세포가 망막 색소 표피 세포 인지의 여부는, 예를 들어 세포 마커 (RPE65, Mitf, CRALBP, MERTK, BEST1 등) 의 발현, 멜라닌 과립의 존재 (흑갈색), 세포간 치밀 이음새 (tight junction), 특징적인 다각형, 조약돌-유사 세포 형태 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 세포가 망막 색소 표피 세포의 기능을 갖는지의 여부는, VEGF 및 PEDF 등과 같은 사이토카인의 분비 능력 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명에서 "부유 배양" 이란, 세포 또는 세포 응집체가 배양 배지에 부유하는 상태를 유지하는 조건 하의 배양을 나타낸다. 즉, 배양이 세포 또는 세포 응집체와 배양 용기 등의 사이에 강한 세포-기층 접합 (cell-substratum junction) 이 형성되지 않는 조건 하에 실시된다.
"접착 배양" 이란, 세포 또는 세포 응집체를 배양 용기 등에 접착시키는 조건 하의 배양을 나타낸다. 이 경우, 세포의 접착은, 세포 또는 세포 응집체와 배양 용기 물질의 사이에 강한 세포-기층 접합이 형성되는 것을 의미한다. 즉, 접착 배양이란, 세포 또는 세포 응집체와 배양 용기 물질 등과의 사이에 강한 세포-기층 접합이 형성되는 조건 하의 배양을 나타낸다.
부유 배양 중의 세포 응집체에서는, 평면 세포-세포 접착이 형성된다. 부유 배양 중의 세포 응집체에서는, 세포-기층 접합이 배양 용기 등과는 거의 형성되지 않으며, 형성된다 해도 그 기여가 작다. 일부 구현예에서는, 부유 배양 중의 세포 응집체에서는, 내재성 세포-기층 접합이 응집물의 내부에 존재하지만, 세포-기층 접합이 배양 용기 등과는 거의 형성되지 않으며, 형성된다 해도 그 기여가 작다. 평면 세포-세포 접착 (평면 부착) 은, 세포가 평면을 통해 또 다른 세포에게 부착하는 것을 의미한다. 보다 상세하게는, 평면 세포-세포 접착은, 예를 들어 세포 표면적의 1% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상이 또 다른 세포의 표면에 부착되는 것을 의미한다. 세포의 표면은, 멤브레인을 염색하는 시약 (예를 들어 DiI) 에 의한 염색, 세포 접착 분자 (예를 들어, E-카드헤린 및 N-카드헤린) 의 면역염색에 의해 관찰할 수 있다.
접착 배양에 사용되는 배양 용기는, "접착 배양" 이 실시될 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 당업자는 배양 규모, 배양 조건 및 배양 기간에 따라 적합한 배양 용기를 적절히 선택할 수 있다. 이러한 배양 용기의 예는, 조직 배양 플라스크, 배양 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티-디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 멀티-플레이트, 멀티-웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 마이크로캐리어, 비즈, 스피너 플라스크 및 롤러 보틀을 포함한다. 이들 배양 용기는, 접착 배양을 가능하게 하기 위해, 세포 접착성인 것이 바람직하다. 세포 접착성 배양 용기는, 그 표면이 세포 접착성을 개선시키기 위해 인공적으로 처리된 배양 용기를 포함하며, 구체적으로는 그 내부가 코팅제로 코팅되는 배양 용기를 언급할 수 있다. 코팅제의 예는 세포외 매트릭스 예컨대 라미닌 [라미닌 α5β1γ1 (이하, 라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1 (이하, 라미닌 111) 등 및 라미닌 단편 (라미닌 511E8 등) 을 포함], 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴, Synthemax (Corning Incorporated), 마트리겔 등, 또는 중합체 예컨대 폴리리신, 폴리오르니틴 등, 등을 포함한다. 또한, 양전하 처리 등으로 표면 가공된 배양 용기를 사용할 수도 있다. 망막 색소 표피 세포의 안정하고 효율적인 유도가 실시 가능하므로, 보다 바람직하게는 라미닌 511E8 로 코팅한 배양 용기를 사용한다 (WO 2015/053375). 라미닌 511E8 로서는 시판 제품을 사용할 수 있다 (예를 들어, iMatrix-511, Nippi).
부유 배양을 실시할 때에 사용되는 배양 용기는, "부유 배양" 이 가능한 한 특별히 한정되지 않고, 당업자는 이를 적절히 결정할 수 있다. 이러한 배양 용기의 예는, 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 스피너 플라스크, 롤러 보틀 등을 포함한다. 이들 배양 용기는, 부유 배양을 가능하게 하기 위해, 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 세포 비접착성 배양 용기는 배양 용기의 표면이 세포 접착성을 개선시키기 위해 인공적으로 처리 (예를 들어, 라미닌, 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴 등과 같은 세포외 매트릭스 등, 또는 폴리리신, 폴리오르니틴 등과 같은 중합체 등에 의한 코팅 처리, 또는 양전하 처리 등과 같은 표면 가공) 되지 않은 배양 용기를 포함한다. 세포 비접착성 배양 용기로서, 배양 용기의 표면이 세포 접착성을 감소시키기 위해 인공적으로 처리 (예를 들어, MPC 중합체 등으로의 초친수성 처리, 단백질 저흡착 처리 등) 되어 있는 배양 용기를 사용할 수 있다.
본 발명에서 세포의 배양에 사용되는 배지는, 기초 배지로서 동물 세포의 배양에 일반적으로 사용되는 배지로부터 제조할 수 있다. 시판 기초 배지의 예는, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM (GMEM) 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, Ham 배지, RPMI 1640 배지, Fischer 배지 등을 포함한다. 단일 배지 또는 이의 2 종 이상의 조합을 사용할 수 있으나, 배지는 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명에서 "혈청 배지" 란, 무조정 또는 미정제 혈청을 함유하는 배지를 의미한다. 임의의 동물 유래의 혈청을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 소, 인간 등과 같은 포유 동물 유래의 혈청을 사용할 수 있다. 자가 이식을 목적으로 하여 배양을 실시하는 경우에는, 환자 자체의 혈청을 또한 사용할 수 있다.
혈청의 농도는, 망막 색소 표피 세포를 효율적으로 분화 유도할 수 있는 농도인 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 이를 약 0.5% ~ 30% (v/v) 의 범위로부터 적절히 설정할 수 있다. 농도는 일정할 수 있거나, 단계적으로 변화할 수 있다.
"무혈청 배지" 란, 무조정 또는 미정제 혈청을 함유하지 않는 배지를 의미한다. 본 발명에서는, 정제된 혈액 유래 성분 및 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 성장 인자) 을 함유하는 배지도 무조정 또는 미정제 혈청이 함유되어 있지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.
"무혈청 조건" 이란, 무조정 또는 미정제 혈청을 함유하지 않는 조건, 구체적으로는, 무혈청 배지를 사용하는 조건을 의미한다.
무혈청 배지는, 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물의 예는, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3' 티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것 등을 포함한다. 이러한 혈청 대체물은 예를 들어, WO 98/30679 에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 혈청 대체물은 시판 제품일 수 있다. 이러한 시판되는 혈청 대체물의 예는 KnockoutTM Serum Replacement (Life Technologies사제, 이하, 때때로 KSR 로 나타냄), Chemically Defined Lipid Concentrate (Life Technologies사제) 및 GlutamaxTM (Life Technologies사제), B27 (Life Technologies사제), N2 (Life Technologies사제) 를 포함한다.
제조의 번잡함을 피하기 위해서, 시판 KSR (Life Technologies사제) 을 적당량 (예를 들어, 약 0.5% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 5% 내지 약 20%) 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, 상기 농도 범위의 KSR 을 첨가한 Glasgow MEM 배지) 를 무혈청 배지로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 배지는, 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 적절히 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 배지는, 상기 언급된 것들 외에, 다능성 줄기 세포의 세포사 (세포자멸사 (apoptosis)) 를 억제하기 위해 ROCK (Rho-결합 꼬인 코일 형성 키나아제 (Rho-associated coiled-coil forming kinase)/Rho 결합 키나아제) 저해제를 임의로 함유한다. ROCK 저해제로서, Y-27632, 파수딜 (Fasudil) 또는 H-1152 를 언급할 수 있다. ROCK 저해제의 농도는, 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있다. 예를 들어, 이는 약 50 nM ~ 200 μM 의 Y-27632 에 상응하는 ROCK 저해 활성을 나타내는 농도 범위 내로 설정될 수 있다.
화학적으로 미결정된 성분으로의 오염을 피하기 위해, 본 발명에서 사용하는 배지는 바람직하게는 그의 성분이 화학적으로 결정된 배지 (Chemically defined medium; CDM) 이다.
본 발명에서, 배양은 바람직하게는 제노-프리 조건 하에 실시된다. "제노-프리 (xeno-free)" 란, 배양되는 세포의 종과 상이한 종 유래의 성분 (단백질 등) 이 배제된 조건을 의미한다.
본 발명에서, "물질 X 를 함유하는 배지" 및 "물질 X 의 존재 하" 란, 외래성 물질 X 가 보충된 배지 또는 외래성 물질 X 를 함유하는 배지, 또는 외래성 물질 X 의 존재 하를 나타낸다. 즉, 배지 내에 존재하는 세포가 물질 X 를 내재적으로 발현하고, 분비하거나 생성하는 경우, 내재성 물질 X 는 외래성 물질 X 와는 구별되고, 외래성 물질 X 를 포함하지 않는 배지는 내재성 물질 X 를 함유하는 경우에도 "물질 X 를 함유하는 배지" 의 범주의 밖에 해당되는 것으로 이해된다.
예를 들어, "FGF 신호 전달 경로 아고니스트를 함유하는 배지" 란, 외래성 FGF 신호 전달 경로 아고니스트가 보충된 배지 또는 외래성 FGF 신호 전달 경로 아고니스트를 함유하는 배지이다.
본 발명에서, "피더 세포" 란, 줄기 세포 배양시 공존하는 다능성 줄기 세포 이외의 세포를 나타낸다. 미분화 상태를 유지하면서 다능성 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 피더 세포의 예는, 마우스 섬유아세포 (MEF), 인간 섬유아세포, SNL 세포 등을 포함한다. 피더 세포로서, 성장 억제 처리를 거친 피더 세포가 바람직하다. 성장 억제 처리의 예는, 성장 저해제 (예를 들어, 미토마이신 C) 처리, 감마선 조사 등을 포함한다. 미분화 상태를 유지하면서 다능성 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 피더 세포는, 액성 인자 (바람직하게는 미분화 상태 유지 인자) 의 분비, 또는 세포 접착용의 스캐폴드 (세포외 기질) 의 생성에 의해, 다능성 줄기 세포의 미분화 상태 유지에 기여한다.
본 발명에서, 피더 세포 부재 하 (피더-프리) 란, 피더 세포 부재 하에 배양하는 것을 의미한다. 피더 세포 부재 하로서, 예를 들어 피더 세포를 첨가하지 않는 조건 또는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는 조건 (예를 들어, 전체 세포수에 대한 피더 세포수의 비율이 3% 이하) 을 언급할 수 있다.
2. 망막 색소 표피 세포의 제조 방법
본 발명의 제조 방법은, 하기 단계 (1) ~ (2) 를 포함하는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포를, FGF 수용체 저해제 및/또는 MEK 저해제를 함유하는 배지에서, 30 일을 초과하지 않는 기간 동안 배양하는 제 1 단계, 및
(2) 제 1 단계에서 수득한 세포를, 노달 신호 전달 경로 저해제 및/또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제의 존재 하에 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 형성시키는 제 2 단계.
(1) 제 1 단계
제 1 단계에서의 바람직한 다능성 줄기 세포로서, 유도 다능성 줄기 세포, 더욱 바람직하게는 인간 유도 다능성 줄기 세포를 언급할 수 있다. 유도 다능성 줄기 세포의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 상술한 바와 같은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 유도 다능성 줄기 세포의 제조 단계 (즉, 체세포를 초기화하여 다능성 줄기 세포를 수립하는 단계) 도 피더-프리 조건 하에 실시하는 것이 바람직하다.
다능성 줄기 세포는, 일반적으로 유지 배양 또는 확대 배양 후, 제 1 단계를 거친다. 다능성 줄기 세포의 유지 또는 확대 배양은, 당업자에게 널리 공지된 방법으로, 바람직하게는 피더 세포 부재 하에 실시될 수 있다. 다능성 줄기 세포의 유지 및 확대 배양을 접착 배양 또는 부유 배양에 의해 실시할 수 있으나, 바람직하게는 접착 배양으로 실시된다.
피더 세포 부재 하에서의 다능성 줄기 세포의 유지 배양 또는 확대 배양은, 미분화 상태 유지 인자를 함유하는 배지에서 실시할 수 있다. 미분화 상태 유지 인자는, 다능성 줄기 세포의 분화를 억제하는 작용을 갖는 물질인 한 특별히 한정되지 않는다. 이는 일반적으로, 포유 동물 유래의 미분화 상태 유지 인자이다. 미분화 상태 유지 인자가 포유 동물 종 간에 교차 반응성을 가질 수 있으므로, 배양하는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지할 수 있는 한, 임의의 포유 동물의 미분화 상태 유지 인자를 또한 사용할 수 있다. 바람직하게는, 배양하는 세포와 동일 종의 포유 동물의 미분화 상태 유지 인자를 사용한다.
당업자에게 범용되고 있는 미분화 상태 유지 인자의 예는, 준만능성 줄기 세포 (primed pluripotent stem cell) (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 의 경우, FGF 신호 전달 경로 아고니스트, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 아고니스트 등을 포함한다. FGF 신호 전달 경로 아고니스트로서, 구체적으로는 섬유아세포 성장 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4, FGF8) 를 언급할 수 있다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 아고니스트로서, TGFβ 신호 전달 경로 아고니스트 (예를 들어 TGFβ1, TGFβ2), 노달 (Nodal)/액티빈 (Activin) 신호 전달 경로 아고니스트 (예를 들어 노달, 액티빈 A, 액티빈 B) 를 언급할 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 (인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 를 배양하는 경우, 미분화 상태 유지 인자는 바람직하게는 bFGF 이다.
다능성 줄기 세포의 유지 배양 또는 확대 배양에서 사용되는 배지 내의 미분화 상태 유지 인자 농도는, 배양되는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지 가능한 농도이며, 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어 구체적으로는, 미분화 상태 유지 인자로서 bFGF 를 사용하는 경우, 그 농도는 일반적으로 약 4 ~ 500 ng/㎖, 바람직하게는 10 ~ 200 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 30 ~ 150 ng/㎖ 이다.
미분화 상태 유지 인자를 함유하는 배지 (이하, 때때로 피더-프리 배지로 나타냄) 로서, 줄기 세포용의 배지로서 시판되는 배지를 또한 적절히 사용할 수 있다. 예를 들어, Essential 8 (Life Technologies사제), hESF9 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9;105(36):13409-14), S-medium (DS Pharma Biomedical사제), StemPro (Life Technologies사제), mTeSR1 (STEMCELL Technologies사제), mTeSR2 (STEMCELL Technologies사제), TeSR-E8 (STEMCELL Technologies사제) 등이 시판되고 있다. 이에 추가로, 개발 중인 피더-프리 배지로서 StemFit® (Ajinomoto Co., Inc.사제) 를 언급할 수 있다. 이들 배지를 사용하여, 다능성 줄기 세포의 유지 배양 또는 확대 배양을 실시할 수 있다.
유지 배양 또는 확대 배양을 거친 다능성 줄기 세포를 회수하는 경우, 분산 조작에 의해 분산된 다능성 줄기 세포를 제조한다. 다능성 줄기 세포의 분산 조작은, 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리 및 세포 보호제 첨가 처리를 포함할 수 있다. 이들 처리는 조합하여 실시될 수 있다. 바람직하게는, 세포 보호제 첨가 처리와 동시에 세포 분산액 처리를 실시한 다음, 기계적 분산 처리를 실시한다.
세포 보호제 첨가 처리에 사용되는 세포 보호제로서, 헤파린, 혈청 또는 혈청 대체물을 언급할 수 있다. 또한, 분산에 의해 유도되는 세포사 (특히, 인간 다능성 줄기 세포의 세포사) 를 억제하기 위해, 분산 동안 ROCK 저해제를 첨가할 수 있다. ROCK 저해제로서, Y-27632, 파수딜 (HA1077), H-1152 등을 언급할 수 있다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로서, 트립신, 콜라게나아제, 히알루로니다아제, 엘라스타아제, 프로나아제, DNase, 파파인 등과 같은 효소, 및 에틸렌디아민테트라아세트산 등과 같은 킬레이트제 중 임의의 것을 함유하는 용액을 언급할 수 있다. 시판되는 세포 분산액, 예를 들어 TrypLE Select (Life Technologies사제) 및 TrypLE Express (Life Technologies사제) 를 사용할 수도 있다.
기계적 분산 처리 방법으로서, 피펫팅 처리 또는 스크레이퍼로 긁기를 언급할 수 있다.
분산된 다능성 줄기 세포를, 새로운 배양 용기에 시딩하고 제 1 단계를 거치게 할 수 있다.
분산에 의해 유도되는 세포사 (특히, 인간 다능성 줄기 세포의 세포사) 를 억제하기 위해, 다능성 줄기 세포를 새로운 배양 용기에 시딩할 수 있고, ROCK 저해제의 존재 하에 유지 배양을 연속하여 실시할 수 있고, 그 후 제 1 단계를 개시할 수 있다. ROCK 저해제 처리의 기간은 분산에 의해 유도되는 세포사를 억제할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않으나 일반적으로 약 12 ~ 24 시간이다.
제 1 단계 개시시 다능성 줄기 세포의 농도는, 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있다. 접착 배양에서, 이는 예를 들어 1.0 x 102 세포/㎠ 내지 1 x 106 세포/㎠, 바람직하게는 2.0 x 102 세포/㎠ 내지 2 x 105 세포/㎠, 보다 바람직하게는 5 x 102 세포/㎠ 내지 1 x 105 세포/㎠, 또는 1 x 103 세포/㎠ 내지 1 x 104 세포/㎠ 이다.
화학적 미결정 성분으로의 오염을 피하기 위해, 제 1 단계에서 사용되는 배지는 바람직하게는 그의 성분이 화학적으로 결정된 배지이다.
제 1 단계에서 사용되는 배지는, 혈청 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적 미결정 성분으로의 오염을 피하기 위해, 이는 바람직하게는 무혈청 배지이다.
제 1 단계에서 사용되는 배지는, 세포사 (세포자멸사) 를 억제하기 위해 ROCK (Rho-결합 꼬인 코일 형성 키나아제/Rho 결합 키나아제) 저해제를 임의로 함유한다. ROCK 저해제로서, Y-27632, 파수딜 또는 H-1152 를 언급할 수 있다. ROCK 저해제 중 1 종만을 사용할 수 있거나, 이의 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. ROCK 저해제의 농도는 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있으나, 예를 들어 약 50 nM ~ 200 μM 의 Y-27632 에 상응하는 ROCK 저해 활성을 나타내는 농도 범위 내로 설정될 수 있다.
제 1 단계에서의 배양은, 피더 세포 존재 하에서 실시할 수 있다. 화학적 미결정 성분의 혼입을 피하기 위해, 바람직하게는 피더 세포를 포함하지 않는 조건 하에 배양을 실시한다.
제 1 단계에서 사용되는 배지는, 피더 세포 부재 하에서의 배양 또는 피더 세포 존재 하에서의 배양과 관계 없이 외래의 미분화 상태 유지 인자를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 본 발명의 제 1 단계는, 보다 바람직하게는 피더 세포 부재 하에 미분화 상태 유지 인자를 함유하는 배지 내에서 실시된다. 미분화 상태 유지 인자는, 다능성 줄기 세포의 분화를 억제하는 작용을 갖는 물질인 한 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 이는 FGF 신호 전달 경로 아고니스트, 보다 바람직하게는 bFGF 를 함유한다.
제 1 단계에서 사용되는 배지 내의 미분화 상태 유지 인자 농도는, 다능성 줄기 세포의 유지 배양 또는 확대 배양에 사용되는 미분화 상태 유지 인자의 농도 범위 내일 수 있다. 예를 들어, 미분화 상태 유지 인자로서 피더 세포 부재 하에 bFGF 를 사용하는 경우, 그 농도는 일반적으로 약 4 ~ 500 ng/㎖, 바람직하게는 10 ~ 200 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 30 ~ 150 ng/㎖ 이다.
제 1 단계에서 사용되는 배지는, FGF 수용체 저해제 및/또는 MEK 저해제를 또한 함유한다. 배지는 본 발명의 제조 방법에 의한 망막 색소 표피 세포의 제조 효율을 현저하게 감소시키지 않는 한 (예를 들어, 제 1 단계가 없는 효율의 수준과 동일한 수준 또는 그 수준 이하), 추가 성분 (예를 들어, 임의의 신호 전달 경로의 아고니스트 또는 저해제) 을 함유할 수 있다. 예를 들어 배지는, BMP 수용체 저해제, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 아고니스트 또는 PKC 저해제를, 단독으로 또는 하기 (1) ~ (4) 중 임의의 것의 조합으로 추가 함유할 수 있다: (1) BMP 수용체 저해제 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 아고니스트, (2) BMP 수용체 저해제 및 PKC 저해제, (3) 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 아고니스트 및 PKC 저해제, (4) BMP 수용체 저해제, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 아고니스트 및 PKC 저해제.
본 발명에서, FGF 수용체 저해제란, FGF 에 의해 매개되는 신호 전달을 억제 할 수 있는 물질인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산 및 저분자량 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 여기서 FGF 는 적어도 22 종류를 함유하는 패밀리를 형성한다. 대표적인 FGF 수용체로서, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 등을 언급할 수 있으며, FGF 수용체 저해제는 이들 중 1 개, 복수 또는 전부를 저해하는 물질이다. 상기 물질의 예는, FGF 또는 FGF 수용체에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 항체, 압타머 등), FGF 또는 FGF 수용체를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), FGF 수용체와 FGF 의 결합을 저해하는 물질 (예를 들어, 가용성 FGF 수용체, FGF 안타고니스트 등), FGF 수용체에 의한 신호 전달에 의해 초래된 생리 활성을 저해하는 물질 [예를 들어, ATP 경합에 의해 FGF 수용체의 티로신 키나아제 활성을 저해하는 PD173074 (N-[2-[[4-(디에틸아미노)부틸]아미노]-6-(3,5-디메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N'-(1,1-디메틸에틸)우레아), SU5402 (2-[(1,2-디히드로-2-옥소-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-4-메틸-1H-피롤-3-프로판산) 등과 같은 저분자량 화합물] 을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 물질 중 1 종만을 사용할 수 있거나, 이의 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. PD173074 및 SU5402 는 공지된 FGF 수용체 저해제이며, 시판 제품 등을 적절히 수득 가능하다. FGF 수용체 저해제로서 바람직한 것은 예를 들어 PD173074 또는 SU5402 이다.
본 발명에서, 배지 내에 함유되는 FGF 수용체 저해제의 농도는 본 발명의 방법에 의해 망막 색소 표피 세포를 제조할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, FGF 수용체 저해제의 종류에 따라 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, FGF 수용체 저해제의 농도는 1 ~ 1000 nM, 바람직하게는 10 ~ 500 nM, 더욱 바람직하게는 25 ~ 400 nM, 특히 바람직하게는 30 ~ 300 nM 의 PD173074 에 상응하는 FGF 수용체 저해 활성을 나타내는 농도 범위 내이다. 예를 들어, 0.1 ~ 500 μM, 바람직하게는 1 ~ 100 μM, 보다 바람직하게는 5 ~ 20 μM 의 SU5402 의 농도 범위를 언급할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 망막 색소 표피 세포를 제조할 수 있는 한, 농도는 제 1 단계를 통해 일정할 수 있거나, 단계적으로 변화할 수 있다.
본 발명에서, MEK 저해제란, MEK 패밀리의 발현 또는 활성을 저해하는 물질인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산 및 저분자량 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 대표적인 MEK 패밀리로서 MEK1, MEK2, MEK3 등을 언급할 수 있으며, MEK 저해제는 이들 MEK 패밀리 중 하나, 복수 또는 전부의 발현 또는 활성을 저해하는 물질이다. 상기 물질의 예는, 각종 MEK 를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), 각종 MEK의 효소 활성을 저해하는 물질 [PD0325901 (N-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드), PD184352 ((2-[(2-클로로-4-요오도페닐)아미노]-N-시클로프로필메톡시)-3,4-디플루오로벤즈아미드), PD98059 (2'-아미노-3'-메톡시플라본), U0126 (1,4-디아미노-2,3-디시아노-1,4-비스[2-아미노페닐티오]부타디엔), MEK162 (5-[(4-브로모-2-플루오로페닐)아미노]-4-플루오로-N-(2-히드록시에톡시)-1-메틸-1H-벤지미다졸-6-카르복사미드), SL327 (α-[아미노[(4-아미노페닐)티오]메틸렌]-2-(트리플루오로메틸)벤젠아세토니트릴), TAK-733 ((R)-3-(2,3-디히드록시프로필)-6-플루오로-5-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)-8-메틸피리도 [2,3-d] 피리미딘-4,7(3H, 8H)-디온) 또는 AZD-8330 (2-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)-N-(2-히드록시에톡시)-1,5-디메틸-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-3-카르복사미드) 등과 같은 저분자량 화합물] 등을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 이들의 물질 중 1 종만을 사용할 수 있거나, 이의 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. PD0325901, PD184352, PD98059, U0126, MEK162, SL327, TAK-733 및 AZD-8330 은 공지된 MEK 저해제이며, 시판 제품 등을 적절히 수득할 수 있다. MEK 저해제로서 바람직한 것은 예를 들어 PD0325901, PD184352, U0126, TAK-733 또는 AZD-8330 이다.
본 발명에서, 배지 내에 함유되는 MEK 저해제의 농도는, 본 발명의 방법에 의해 포유 동물의 망막 색소 표피 세포를 제조할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, MEK 저해제의 종류에 따라 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, MEK 저해제의 농도는 0.001 ~ 10 μM, 바람직하게는 0.005 ~ 5 μM, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 4 μM, 더욱 바람직하게는 0.25 ~ 4 μM, 특히 바람직하게는 0.25 ~ 2 μM 의 PD0325901 에 상응하는 MEK 저해 활성을 나타내는 농도 범위 내이다. 예를 들어, 0.01 ~ 20 μM, 바람직하게는 0.1 ~ 10 μM, 더욱 바람직하게는 1.5 ~ 6 μM 의 PD184352 의 농도 범위를 언급할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 망막 색소 표피 세포를 제조할 수 있는 한, 상기 농도는 제 1 단계를 통해 일정할 수 있거나 단계적으로 변화할 수 있다.
본 발명에서 BMP 수용체 저해제란, BMP 에 의해 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있는 물질인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산 및 저분자량 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 대표적인 BMP 로서, BMP2, BMP4, BMP7, GDF7 등을 언급할 수 있다. 여기서, BMP 수용체 (BMPR) 는, I 형 수용체 (ALK (액티빈 수용체-유사 키나아제 (activin receptor-like kinase))-1, ALK-2, ALK-3, ALK-6) 및 II 형 수용체 (ActRII, BMPRII) 의 이종이량체로서 존재한다. BMP 수용체 저해제의 예는 BMP 또는 BMP 수용체에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 항체, 압타머 등), BMP 또는 BMP 수용체를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), BMP 수용체와 BMP 의 결합을 저해하는 물질 (예를 들어 가용성 BMP 수용체, BMP 안타고니스트 등), BMP 수용체에 의한 신호 전달에 의해 초래된 생리 활성을 저해하는 물질 [LDN193189 (4-[6-(4-피페라진-1-일페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린) 또는 도르소모르핀 (6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)-피라졸로[1,5-a]피리미딘) 등과 같은 저분자량 화합물 등] 등을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 이들 물질 중 1 종만을 사용할 수 있거나, 이의 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. LDN193189 및 도르소모르핀은 공지된 BMPI 형 수용체의 저해제이며, 시판 제품 등을 적절히 수득할 수 있다. BMP 수용체 저해제로서 바람직한 것은 예를 들어 LDN193189 이다.
본 발명에서, 소닉 헤지호그 (이하, 때때로 Shh 로 나타냄) 신호 전달 경로 아고니스트란, Shh 에 의해 매개되는 신호 전달을 증강할 수 있는 물질인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산 및 저분자량 화합물 중 임의의 것일 수 있다. Shh 신호 전달 경로 아고니스트의 예는, 헤지호그 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Shh 및 Ihh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트 [푸르모르프아민 (9-시클로헥실-N-[4-(4-모르폴리닐)페닐]-2-(1-나프탈레닐옥시)-9H-퓨린-6-아민), 또는 SAG (평활화된 아고니스트 (Smoothened Agonist); N-메틸-N'-(3-피리디닐벤질)-N'-(3-클로로벤조[b]티오펜-2-카르보닐)-1,4-디아미노시클로헥산) 등과 같은 저분자량 화합물 등] 등을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 이들 물질 중 1 종만을 사용할 수 있거나, 이의 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 푸르모르프아민 및 SAG 는 공지된 Shh 신호 전달 경로 아고니스트이며, 시판 제품 등을 적절히 수득할 수 있다. Shh 신호 전달 경로 아고니스트로서 바람직한 것은 예를 들어 SAG 이다.
본 발명에서, PKC 저해제란, 단백질 키나아제 C (PKC) 의 발현 또는 활성을 저해할 수 있는 물질인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산 및 저분자량 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 여기서 PKC 란, 적어도 10 종류의 아이소자임으로 구성되는 단백질 패밀리이며, PKC 저해제는 이들 PKC 패밀리 중 1 개, 복수 또는 전부의 발현 또는 활성을 저해하는 물질이다. 상기 물질의 예는, PKC 를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), PKC 의 효소 활성을 저해하는 물질 [예를 들어, Go6983 (3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온) 등과 같은 저분자량 화합물 등] 등을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 이들 물질 중 1 종만을 사용할 수 있거나, 이의 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. Go6983 는 공지된 PKC 저해제이며, 시판 제품 등을 적절히 수득할 수 있다. PKC 저해제로서 바람직한 것은 예를 들어 Go6983 이다.
본 발명에서, 배지 내에 함유되는 BMP 수용체 저해제, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 아고니스트 및 PKC 저해제의 농도는, 본 발명의 방법에 의해 망막 색소 표피 세포를 제조할 수 있는 범위 내에 포함되도록 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, BMP 수용체 저해제의 농도는 1 ~ 1000 nM, 바람직하게는 10 ~ 500 nM, 보다 바람직하게는 30 ~ 300 nM 의 LDN193189 에 상응하는 BMP 수용체 저해 활성을 나타내는 농도 범위 내이다. Shh 신호 전달 경로 아고니스트의 농도는 1 ~ 2000 nM, 바람직하게는 3 ~ 1000 nM, 보다 바람직하게는 10 ~ 500 nM 의 SAG 에 상응하는 Shh 신호 전달 작용을 나타내는 농도 범위 내이다. PKC 저해제의 농도는 0.05 ~ 20 μM, 바람직하게는 0.2 ~ 10 μM, 보다 바람직하게는 0.5 ~ 5 μM 의 Go6983 에 상응하는 PKC 저해 활성을 나타내는 농도 범위 내이다.
본 발명의 방법에 의해 망막 색소 표피 세포를 제조할 수 있는 한, 농도는 제 1 단계를 통해 일정할 수 있거나, 단계적으로 변화할 수 있다.
제 1 단계에서, 다능성 줄기 세포는 부유 배양 및 접착 배양 중 임의의 조건 하에, 바람직하게는 접착 배양 하에 배양될 수 있다.
다능성 줄기 세포의 접착 배양에 사용하는 배양 용기는, 세포의 접착 배양이 가능한 한 특별히 한정되지 않는다. 이는 바람직하게는 세포 접착성 배양 용기이다. 세포 접착성의 배양 용기로서, 세포 접착성을 향상시키기 위해 인공적으로 처리된 배양 용기를 사용할 수 있고, 구체적으로는, 내부를 코팅제로 코팅한 상술한 배양 용기를 언급할 수 있다. 코팅제의 바람직한 예는, 라미닌 [라미닌 α5β1γ1 (라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1 (라미닌 111) 등 및 라미닌 단편 (라미닌 511E8 등) 을 포함], 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴), Synthemax (Corning Incorporated), 마트리겔 등과 같은 세포외 매트릭스 등 또는 폴리리신, 폴리오르니틴 등과 같은 중합체 등을 포함하며, 라미닌 511E8 이 보다 바람직하다 (WO 2015/053375). 라미닌 511E8 은 시판 제품일 수 있다 (예를 들어, iMatrix-511, Nippi).
다능성 줄기 세포의 부유 배양에 사용하는 배양 용기는 세포의 부유 배양이 가능한 한 특별히 한정되지 않는다. 이는 바람직하게는 세포 비접착성이다.
제 1 단계에서의 배양 온도 및 CO2 농도와 같은 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1 ~ 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
제 1 단계 도중에서, 배지를 교환할 수 있다. 배지 교환 방법은 특별히 한정되지 않고, 원래 배지의 전체량을 새로운 배지로 교환할 수 있거나, 원래 배지의 일부만을 새로운 배지로 교환할 수 있다. 원래 배지의 일부를 새로운 배지로 교환하는 경우, 제 1 단계에 포함되는 물질 (MEK 저해제, FGF 수용체 저해제 등) 의 최종 농도를 먼저 계산한 다음, 교환하는 배지의 비에 상응하는 농도에서의 물질을 함유하는 새로운 배지를 준비하고, 배지와 교환한다. 제 1 단계에 포함되는 물질의 최종 농도는 배양 도중에 변화할 수 있다.
배지 교환 조작에 사용하는 도구는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 피펫터, 마이크로피펫, 다중채널 마이크로피펫, 연속 분주기 등을 언급할 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로서 96 웰 플레이트를 사용하는 경우, 다중채널 Pipetman 을 사용할 수 있다.
제 1 단계의 일수는 다능성 줄기 세포를 상기 언급한 FGF 수용체 저해제 및/또는 MEK 저해제 등에 노출시켜 제조된 세포가 망막 색소 표피 세포로의 분화 능력을 유지하는 한, 특별히 제한되지는 않는다. 제 1 단계에서의 다능성 줄기 세포는 30 일을 초과하지 않는 기간 동안 배양된다. 그 기간은 사용하는 다능성 줄기 세포의 세포주 등에 따라 가변적일 수 있다. 이는 일반적으로 2 일 이상, 바람직하게는 3 일 이상, 보다 바람직하게는 4 일 이상이다. 제 1 단계에서, 다능성 줄기 세포는 보다 바람직하게는 2 일 ~ 13 일 또는 2 일 ~ 6 일, 더욱 바람직하게는 4 일 ~ 6 일 동안 배양된다.
제 1 단계의 일수는 상기 언급한 FGF 수용체 저해제 및/또는 MEK 저해제로 처리한 다능성 줄기 세포에서 발현되는 특정 마커를 지표로 사용하여 결정할 수도 있다. 구체적으로는 예를 들어, PAX6 (페어드 박스 단백질 6 (Paired box protein 6)), LHX2 (LIM 호메오박스 2 (homeobox 2)) 및 SIX3 (SIX 호메오박스 3) 등의 눈 형성 초기의 마커, 구체적으로는 안계 전사 인자의 적어도 1 개 유전자의 발현을 유도하는데 충분한 기간 동안 제 1 단계의 배양을 실시한 다음, 제 2 단계를 실시할 수 있다. 즉, 제 1 단계에서의 "30 일을 초과하지 않는 기간" 의 예는 "눈 형성 초기의 적어도 1 개의 마커, 구체적으로는 안계 전사 인자의 발현을 유도하는데 충분하고 30 일 이하인 기간" 및 "PAX6, LHX2 및 SIX3 중 적어도 1 개의 유전자 발현을 유도하는데 충분하고 30 일 이하인 기간" 을 포함한다. 이들 구현예에서, 배양 기간의 상한은 예를 들어 30 일을 초과하지 않는 기간, 13 일을 초과하지 않는 기간, 또는 6 일을 초과하지 않는 기간 등이다.
주어진 배양 조건 하에 주어진 배양 기간이 "눈 형성 초기의 적어도 1 개의 마커, 구체적으로는 안계 전사 인자의 발현을 유도하는데 충분한 기간" 또는 "PAX6, LHX2 및 SIX3 중 적어도 1 개의 유전자 발현을 유도하는데 충분한 기간" 인지의 여부는, 해당 조건 하 해당 기간 동안 배양 후 세포 집단에서, 무처리 대조군과 비교하여 이들 유전자 중 적어도 1 개의 발현이 유의하게 검출될 수 있는지를 확인함으로써 결정할 수 있다. 당업자는, 예를 들어 노던 블롯, RT-PCR, 마이크로어레이 등과 같은 방법에 의해 이들 유전자의 발현을 검출할 수 있다.
PAX6, LHX2 및 SIX3 은 발생 초기에서 눈 형성 부위에서 발현되는 안계 전사 인자를 인코딩하는 유전자이며, 인간의 유전자로서 각각 Genbank 등록 번호: NM_001127612, Genbank 등록 번호: NM_004789, Genbank 등록 번호: NM_005413 으로서 명시된다. 마우스 등과 같은 다른 동물 종에서의 이들 유전자는, 당업자에 의해 용이하게 명시될 수 있고, 예를 들어 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 에 인용된 유전자의 염기 서열로부터 명시될 수 있다.
즉, 본 발명의 하나의 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법을 제공한다.
(1) 적어도 1 개의 안계 전사 인자의 유전자 발현을 유도하는데 충분한 기간 동안 다능성 줄기 세포를 FGF 수용체 저해제 및/또는 MEK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 제 1 단계, 및
(2) 제 1 단계에서 수득한 세포를, 노달 신호 전달 경로 저해제 및/또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제의 존재 하에 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 형성시키는 제 2 단계.
즉, 본 발명의 다른 하나의 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법을 제공한다.
(1) PAX6, LHX2 및 SIX3 중 적어도 1 개의 유전자 발현을 유도하는데 충분한 기간 동안 다능성 줄기 세포를 FGF 수용체 저해제 및/또는 MEK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 제 1 단계, 및
(2) 제 1 단계에서 수득한 세포를, 노달 신호 전달 경로 저해제 및/또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제의 존재 하에 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 형성시키는 제 2 단계.
제 1 단계를 접착 배양에 의해 실시하는 경우, 세포를 배양 용기로부터 박리하여 세포를 회수할 수도 있다.
세포를 배양 용기로부터 박리하는 방법은 일반적으로 세포를 박리하는 방법으로서 공지된 방법인 한 특별히 한정되지 않는다. 트립신 등과 같은 효소를 함유하는 세포 박리액을 사용할 수 있다. 또한, 시판 세포 박리액 [TrypLE select (Life Technologies) 등] 을 사용할 수 있다. 박리하고 회수한 세포는 일반적으로, PBS (인산 완충 식염수 (Phosphate Buffered Saline)) 및/또는 제 2 단계에서 사용하는 배지로 세정한 다음, 제 2 단계에서 사용한다.
제 1 단계에서 수득한 세포는, 그의 분화 상태 및 생존 상태가 유지되는 한, 계대 (유지 배양) 하고, 망막 색소 표피 세포 제조용 중간체로서 보관하거나, 기타 처리를 실시할 수 있다. 제 1 단계에서 수득한 세포를 동결보존하는 방법은, 일반적으로 세포를 동결보존하는 방법으로서 공지된 방법인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 제 1 단계에서 수득한 세포를 DMSO 또는 글리세린 등과 같은동결방지제를 함유하는 배지에 현탁하고 동결보존할 수 있다. 또, 시판 세포 동결보존액 [StemCellBanker (Zenoaq)] 을 사용할 수도 있다.
(2) 제 2 단계
제 1 단계에서 수득한 세포를 노달 신호 전달 경로 저해제 및/또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제의 존재 하에 배양하여 망막 색소 표피 세포를 형성시키는 제 2 단계를 하기에서 설명한다.
제 2 단계 개시시 세포 농도는, 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있다. 접착 배양의 경우, 예를 들어 이는 1.0 x 102 세포/㎠ 내지 2 x 106 세포/㎠, 바람직하게는 3 x 102 세포/㎠ 내지 1 x 106 세포/㎠, 보다 바람직하게는 1 x 103 세포/㎠ 내지 2 x 105 세포/㎠, 더욱 바람직하게는 2 x 103 세포/㎠ 내지 4 x 104 세포/㎠ 이다.
제 2 단계에서 사용되는 배지는, 상기 언급한 정의 부분에서 기재한 바와 같은 것인 한 특별히 한정되지는 않는다. 제 2 단계에서 사용되는 배지는 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적 미결정 성분의 오염을 피하기 위해, 본 발명에서는 무혈청 배지가 바람직하게 사용된다. 제조의 번잡함을 피하기 위해, 예를 들어 KSR 등과 같은 시판 혈청 대체물을 적당량 보충한 무혈청 배지 (예를 들어, 0.5% 내지 30% 의 농도 범위에서의 KSR 을 보충한 Glasgow MEM 배지) 를 사용할 수 있다.
제 2 단계에서 사용되는 배지는, 세포사 (세포자멸사) 를 억제하기 위해 ROCK (Rho-결합 꼬인 코일 형성 키나아제/Rho 결합 키나아제) 저해제를 임의로 함유할 수 있다. ROCK 저해제로서, Y-27632, 파수딜 또는 H-1152 를 언급할 수 있다. ROCK 저해제의 농도는 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있다. 예를 들어 이는 약 50 nM ~ 200 μM 의 Y-27632 에 상응하는 ROCK 저해 활성을 나타내는 농도 범위 내로 설정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 노달 신호 전달 경로 저해제는 노달에 의해 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산 및 저분자량 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 노달에 의해 매개되는 신호는 노달 수용체를 통해 도입된다. 노달 수용체는 I 형 수용체 (ALK (액티빈 수용체-유사 키나아제)-4, ALK-5, ALK-7) 및 II 형 수용체 (ActRII) 의 이종이량체로서 존재한다. 노달 신호 전달 경로 저해제의 예는, 노달 또는 노달 수용체에 직접 작용하는 물질 (항-노달 항체, 항-노달 수용체 항체 등), 노달 또는 노달 수용체를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), 노달 수용체와 노달의 결합을 저해하는 물질 (Lefty-A, Lefty-B, Lefty-1, Lefty-2, 가용성 노달 수용체 등), 노달 수용체에 의한 신호 전달에 의해 초래된 생리 활성을 저해하는 물질 [ATP 경합에 의해 I 형 수용체의 키나아제 활성을 저해하는 SB-431542 (SB431542) (4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(피리딘-2-일)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드) 등과 같은 저분자량 화합물 등] 등을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. SB-431542 는 공지된 Nodal 신호 저해제이며, 시판 제품 등으로서 적절히 입수 가능하다. 노달 신호 저해제로서 바람직한 것은 예를 들어 SB-431542 이다.
본 발명의 방법에서, Wnt 신호 전달 경로 저해제는 Wnt 에 의해 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산 및 저분자량 화합물 등 중 임의의 것일 수 있다. Wnt 에 의해 매개되는 신호는 프리즐드 (Frizzled) (Fz) 및 LRP5/6 (저밀도 리포단백질 수용체-관련 단백질 (low-density lipoprotein receptor-related protein) 5/6) 의 이종이량체로서 존재하는 Wnt 수용체를 통해 전달된다. Wnt 신호 전달 경로 저해제의 예는, Wnt 또는 Wnt 수용체에 직접 작용하는 물질 (항-Wnt 항체, 항-Wnt 수용체 항체 등), Wnt 또는 Wnt 수용체를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), Wnt 수용체와 Wnt 의 결합을 저해하는 물질 (가용성 Wnt 수용체, 우성 음성 Wnt 수용체 등, Wnt 안타고니스트, Dkk1, 케르베로스 (Cerberus) 단백질 등), Wnt 수용체에 의한 신호 전달에 의해 초래된 생리 활성을 저해하는 물질 [카세인 키나아제 I 저해제 CKI-7 (N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-술폰아미드) 및 D4476 (4-[4-(2,3-디히드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드), 엑신 (Axin) 의 대사 회전을 저해하여 β-카테닌 파괴 복합체를 안정화시키는 IWR-1-엔도 (IWR1e) (4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사히드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드), 및 막 결합 O-아실트랜스퍼라아제 (MBOAT) 로서 폴큐파인 (Porcupine) (Porcn) 을 불활성화시키고 Wnt 단백질의 팔미토일화를 억제하는 IWP-2 (N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]아세트아미드) 등과 같은 저분자량 화합물 등] 등을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2 등은 공지된 Wnt 신호 저해제이며, 시판 제품 등이 적절히 입수 가능하다. 바람직한 Wnt 신호 저해제는 CKI-7 이다.
제 2 단계에서, 노달 신호 전달 경로 저해제 또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제를 단독으로 사용할 수 있으나, 바람직하게는 이들을 조합하여 사용한다.
본 발명의 방법에서, 배지 내에 포함되는 노달 신호 전달 경로 저해제 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제의 농도는, 본 발명의 방법에 의해 망막 색소 표피 세포를 제조할 수 있는 범위 내에 포함되도록 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 를 사용하는 경우, 이의 농도는 일반적으로 0.01 ~ 50 μM, 바람직하게는 0.1 ~ 10 μM, 보다 바람직하게는 5 μM 이며; Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 을 사용하는 경우, 이의 농도는 일반적으로 0.01 ~ 30 μM, 바람직하게는 0.1 ~ 30 μM, 보다 바람직하게는 3 μM 이다.
본 발명의 방법에 의해 망막 색소 표피 세포를 제조할 수 있는 한, 농도는 제 2 단계를 통해 일정할 수 있거나, 단계적으로 변화할 수 있다.
제 2 단계에서의 배양은, 부유 배양 또는 접착 배양 중 임의의 조건 하에, 바람직하게는 접착 배양 하에 실시될 수 있다.
제 2 단계에서의 접착 배양에 사용하는 배양 용기는 세포의 접착 배양이 실시될 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 세포 접착성 배양 용기가 바람직하다. 세포 접착성 배양 용기로서, 세포 접착성을 향상시키기 위해 인공적으로 처리된 배양 용기를 사용할 수 있고, 구체적으로는 그의 내부를 코팅제로 코팅한 상술한 배양 용기를 언급할 수 있다. 코팅제의 바람직한 예는 라미닌 [라미닌 α5β1γ1 (라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1 (라미닌 111) 등 및 라미닌 단편 (라미닌 511E8 등) 을 포함], 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴, Synthemax (Corning Incorporated), 마트리겔 등과 같은 세포외 매트릭스 등, 또는 폴리리신, 폴리오르니틴 등과 같은 중합체 등을 포함한다. 보다 바람직한 것은 라미닌 511E8 이다 (WO 2015/053375). 라미닌 511E8 로서, 시판 제품 (예를 들어, iMatrix-511, Nippi) 을 사용할 수 있다.
제 2 단계에서의 부유 배양에 사용하는 배양 용기는 세포의 부유 배양이 가능한 한 특별히 한정되지 않는다. 이는 바람직하게는 세포 비접착성이다.
제 2 단계에서의 배양 온도, CO2 농도 등과 같은 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
제 2 단계 도중에, 적절히 배지를 교환할 수 있다. 배지 교환 방법은 특별히 한정되지 않고, 원래 배지의 전체량을 새로운 배지로 교환할 수 있거나, 원래 배지의 일부만을 새로운 배지로 교환할 수 있다. 원래 배지의 일부를 새로운 배지로 교환하는 경우, 제 2 단계에 포함되는 물질 (노달 신호 전달 경로 저해제, Wnt 신호 전달 경로 저해제, KSR 등) 의 최종 농도를 먼저 계산한 다음, 교환하는 배지의 비에 상응하는 농도에서 물질을 함유하는 새로운 배지를 준비하고 배지와 교환할 수 있다. 제 2 단계에서 포함되는 물질의 최종 농도는 배양 도중에 변화할 수 있다.
배지 교환 조작에 사용하는 도구는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 피펫터, 마이크로피펫, 다중채널 마이크로피펫, 연속 분주기 등을 언급할 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로서 96 웰 플레이트를 사용하는 경우, 다중채널 피펫을 사용할 수 있다.
제 2 단계의 배양 기간은, 관심 대상인 망막 색소 표피 세포를 유도할 수 있는 기간인 한 특별히 한정되지 않는다. 이러한 배양 기간의 예로서, 제 2 단계 개시로부터 계산하여, 일반적으로 제 14 ~ 40 일에 망막 색소 표피 세포를 생성할 수 있다.
당업자는, 세포 마커 (RPE65 (망막 색소 표피 세포), Mitf (망막 색소 표피 세포), BEST1 (망막 색소 표피 세포), CRALBP (망막 색소 표피 세포) 등) 의 발현, 멜라닌 과립의 존재 (흑갈색), 세포간 치밀 이음새, 특징적인 다각형 또는 조약돌-유사 세포 형태 등을 기반으로, 망막 색소 표피 세포의 생성을 확인할 수 있으며, 이들을 확인함으로써 배양 기간을 결정할 수도 있다.
제 2 단계 종료 후, 배지를 망막 색소 표피 세포용 유지 배지 (이하, 때때로 RPE 유지 배지로 나타냄) 로 교환하고 이를 추가 배양하는 것이 바람직하다. 그 결과, 기저판에 접착된 다각형 편평 세포 집단 및 멜라닌 색소 침착 세포 집단이 보다 명백하게 관찰될 수 있다. RPE 유지 배지에서의 배양은, 망막 색소 표피 세포의 콜로니가 형성될 수 있는 한 한정되지 않는다. 예를 들어 3 일에 1 회 이상의 빈도로 배지 전체량을 교환하면서 약 5 ~ 20 일 동안 세포를 추가 배양한다.
망막 색소 표피 세포용 유지 배지로서, 예를 들어 IOVS, March 2004, Vol. 45, No. 3, Masatoshi Haruta, et. al., IOVS, November 2011, Vol. 52, No. 12, Okamoto and Takahashi, J. Cell Science 122 (17), Fumitaka Osakada, et. al., IOVS, February 2008, Vol. 49, No. 2, Gamm, et. al. 에 기재된 것들을 사용할 수 있는데, 이는 기초 배지, 혈청 및/또는 혈청 대체물, 및 기타 성분으로 구성된다.
기초 배지는, 상술한 정의 부분에서 기재한 바와 같은 것인 한 특별히 한정되지는 않는다. 혈청으로서, 소, 인간 등과 같은 포유 동물에서 유래하는 혈청을 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 관심 대상인 세포의 품질 관리 측면에서 혈청 대체물을 사용하는 것이 바람직하고, 신경 세포에 대한 혈청 대체물인 B27 이 특히 바람직하다. 기타 성분의 예는 L-글루타민, 페니실린 나트륨, 스트렙토마이신 술페이트 등을 포함한다.
제 2 단계 종료 후, 농축 또는 정제 조작에 의해 고순도 망막 색소 표피 세포를 수득할 수 있다. 농축 또는 정제 방법은, 일반적으로 세포를 농축/정제 하는 방법으로서 공지되는 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 여과 (예를 들어, WO 2015/053376), 원심분리, 관류 분리, 유세포 분석 분리, 항체 고정 운반체에 의한 트랩 분리 등과 같은 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 제 2 단계 종료 후 망막 색소 표피 세포를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, WO 2015/053375 에 기재된 방법에 의해 망막 색소 표피 세포를 확장시킬 수 있다. WO 2015/053375 에 기재된 확장 방법에 따르면, 배양된 세포 중 함유되는 분화 유도가 불충분한 세포 등이 선택에 의해 제거될 수 있고, 망막 색소 표피 세포 이외의 부생성물을 상대적으로 감소시킬 수 있다. 따라서, 확장 단계는 또한 망막 색소 표피 세포의 정제 단계일 수 있다.
제 2 단계에서 망막 색소 표피 세포를 부유 배양에 의해 제조하는 경우, 망막 색소 표피 세포를 단독의 세포로서 회수할 수 있고, 현탁액으로서 제조한 후 이용할 수 있다.
제 2 단계에서 망막 색소 표피 세포를 접착 배양에 의해 제조하는 경우, 망막 색소 표피 세포는 서로 접착하여 시트-유사 구조를 형성할 수 있다. 따라서, 환자에게 이식가능한 망막 색소 표피 세포의 시트를 제조할 수 있다. 망막 색소 표피 세포의 시트는, 망막 질환 치료용 세포 이식 치료 약물로서 사용하는 세포 집단으로서 특히 유용하다. 또한, 접착 배양에 의해 제조된 망막 색소 표피 세포를 상술한 방법으로 박리시키고, 망막 색소 표피 세포를 독립적인 단독의 세포로서 회수하고, 이들을 생리적인 수성 용매 (생리식염수, 완충액, 무혈청 배지 등) 에 현탁시켜, 현탁액을 제공할 수 있다.
3. 독성, 효능 평가 방법
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 색소 표피 세포는, 정상 및 질환 모델 세포로서, 망막 질환용 치료 약물 및 당뇨병 등과 같은 다른 합병증 질환용 치료 약물, 또는 이의 예방 약물의 스크리닝 및 효능 평가, 화학 물질 등의 안전성 시험, 스트레스 시험, 독성 시험, 부작용 시험, 감염/오염 시험에 대해 활용 가능하다. 한편, 망막 세포 고유의 광독성, 망막 흥분독성 등의 독성 연구, 독성 시험 등에 활용할 수도 있다. 이의 평가 방법은 세포자멸사 평가 등과 같은 자극 및 독성 시험 뿐 아니라, 선구 세포로부터 망막 색소 표피 세포 및 광수용체로의 정상 분화에 대한 영향을 평가하기 위한 시험 (각종 유전자 마커의 RT-PCR, 사이토카인의 ELISA 에 의한 단백질 발현 분석, 식세포 능력 시험 등), 광독성 등의 독성 시험, 시각 기능에 대한 망막 전위 및 경표피 임피던스, 자기면역 반응에 의해 초래된 세포독성 시험 등을 포함한다. 이들 시험을 위한 세포 재료로서, 망막 색소 표피 세포 뿐 아니라 이의 선구 세포도 사용할 수 있으며, 예를 들어 세포가 시딩에 의해 접착되는 플레이트, 세포 현탁액, 이의 시트 또는 압축물 (compact) 을 제공할 수 있다. 이들은 인간 및 동물 시험의 외삽법 시험으로서 사용할 수 있다.
4. 약학 조성물
본 발명은, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포의 유효량을 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
약학 조성물은, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포의 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다.
약학적으로 허용가능한 담체로서, 생리적인 수성 용매 (생리식염수, 완충액, 무혈청 배지 등) 를 사용할 수 있다. 필요에 따라, 이식 치료에 있어서, 이식하는 조직이나 세포를 함유하는 의약은, 일반적으로 사용되는 보존제, 안정화제, 환원제, 등장화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포를 적절한 생리적인 수성 용매에 현탁함으로써, 현탁액으로서 제조할 수 있다. 필요시, 조성물에 동결보존제를 첨가하고, 액체 질소 등으로 동결보존하고, 사용시에 해동하고, 완충액으로 세정하고, 이식 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 의해 수득되는 망막 색소 표피 세포는 또한, 핀셋 등을 사용하여 적절한 크기로 절단되어, 시트 제제가 제공될 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 의해 수득되는 세포는 또한, 분화 유도를 위한 제 2 단계에서 접착 배양되어, 시트 형태로 세포를 제공함으로써 시트 제제를 제공할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 망막 색소 표피 세포의 장애를 기반으로 하는 (그에 의해 초래되는) 질환용 치료 약물로서 유용하다.
5. 망막 질환 치료 약물 및 치료 방법
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 색소 표피 세포 (상술한 농축 및 증폭 조작 등을 거친 망막 색소 표피 세포를 포함함) 는, 망막 질환 치료를 위해 현탁액이나 시트 형태로 생체에 이식되는 세포 이식 치료 약물로서 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 치료 약물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 여기서 망막 질환이란, 망막에 관련되는 안과 질환이며, 당뇨병 등과 같은 다른 질환과의 합병증도 포함된다. 본 발명에서의 망막 질환은 예를 들어, 망막 색소 표피 세포의 장애를 기반으로 하는 질환, 예컨대 노인성 황반 변성, 망막 색소 변성증, 당뇨병성 망막증 또는 망막 박리 등을 포함한다. 즉, 환자에서의 망막 색소 표피 세포의 손상 위치를 보충하는데 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 색소 표피 세포를 사용할 수 있다.
이식 치료에서, 조직적합성 항원의 차이로 인한 거부가 자주 문제가 된다. 상기 문제는 수령인과 면역적으로 양립가능한 (예를 들어, HLA 형 및 MHC 형 중 일부 또는 전부와 양립가능한) 다른 인간의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포), 또는 이식 수령인의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포) 를 사용함으로써 해결될 수 있다.
즉, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서의 다능성 줄기 세포로서, 수령인과 면역이 양립가능한 다른 인간의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포로부터, 동종이계 망막 색소 표피 세포 또는 이를 함유하는 조직을 제조하고, 이를 수령인에게 이식한다. 대안적으로, 수령인의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포) 를 사용하여 수령인에 대해 면역학적 자기인 망막 색소 표피 세포 또는 이를 함유하는 조직을 제조하여, 이를 수령인에게 이식한다.
간행물, 특허 문헌, 특허 출원 명세서 등을 포함하는 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은, 본원에 개시되는 정도로, 그 전체가 참조로 포함된다.
[실시예]
본 발명을, 이에 제한되는 것으로 이해되지 않는 실시예를 나타냄으로써 하기에서 상세하게 설명한다.
하기 실시예 및 비교예에서, 인간 진피 섬유아세포 유래 iPS 세포 (201B7, 쿄토 대학), 및 Cellular Technology Limited 의 ePBMC® 로부터 쿄토 대학에 의해 수립된 인간 말초 혈액 유래 단핵 세포에서 유래한 iPS 세포 (1231A3, Ff-I01, QHJI01) 를 사용하였다.
실시예 1: MEK 저해제 처리 단계를 포함하고 인간 iPS 세포를 사용하는 망막 색소 표피 세포의 고효율 제조
인간 iPS 세포 (201B7 세포주 및 1231A3 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03 배지) 또는 Essential 8 배지 (Life Technologies) 였다.
MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에 1 개 웰 당 1.2 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03 배지 또는 Essential 8 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) 을 AK03 배지에 최종 농도 1 μM 로 또는 Essential 8 배지에 최종 농도 0.03 μM 로 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에 1 개 웰 당, AK03 배지 사용시에는 2.0 x 105 세포로, Essential 8 배지 사용시에는 5.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일에는, Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 AK03 배지 또는 Essential 8 배지를 사용하였고; 배양 2 일 내지 5 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고, 배양 6 일 내지 9 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 10 일 내지 13 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 14 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다.
배양 38 일 내지 42 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, AK03 배지 및 Essential 8 배지의 두 배지 모두를 사용시, 201B7 세포주, 1231A3 세포주 모두에서, 흑갈색 세포 집단의 출현을 광범위하게 확인할 수 있었다 (도 1). 현미경 관찰에 의해, 세포는 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내었다 (도 2).
비교예 1: MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않고 인간 iPS 세포를 사용하는 망막 색소 표피 세포의 제조
인간 iPS 세포 (201B7 세포주 및 1231A3 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03 배지) 또는 Essential 8 배지 (Life Technologies) 였다.
MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당, AK03 배지 사용시에는 2.0 x 105 세포로, Essential 8 배지 사용시에는 5.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 배양 1 일에는, ROCK 저해제로서 Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 AK03 배지 또는 Essential 8 배지를 사용하였고; 배양 2 일 내지 5 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 6 일 내지 9 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 10 일 내지 13 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 14 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다.
배양 38 일 내지 42 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 몇 안되는 세포만이 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다 (도 3).
실시예 2: FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하고 인간 iPS 세포를 사용하는 망막 색소 표피 세포의 고효율 제조
인간 iPS 세포 (201B7 세포주 및 1231A3 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03 배지) 또는 Essential 8 배지 (Life Technologies) 였다.
FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조는 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 1.2 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03 배지 또는 Essential 8 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) 를 최종 농도 100 nM 에서 AK03 배지 또는 Essential 8 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 한 구현예에서, 미분화 상태 유지 인자 (bFGF) 를 포함하지 않는 배지에서의 FGF 수용체 저해제의 효과를 연구하기 위해, bFGF 를 첨가하지 않은 StemSure hPSC Medium △ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (이하, StemSure hPSC Medium △ w/o bFGF) 를 사용하였다. 즉, StemSure hPSC Medium △ w/o bFGF 에 FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) 를 최종 농도 100 nM 에서 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에 1 개 웰 당, AK03 배지 또는 StemSure hPSC Medium △ w/o bFGF 사용시에는 2.0 x 105 세포로, Essential 8 배지 사용시에는 5.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일에는, ROCK 저해제로서 Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 AK03 배지, Essential8 배지 또는 StemSure hPSC Medium △ w/o bFGF 를 사용하였고; 배양 2 일 내지 5 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 6 일 내지 9 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 10 일 내지 13 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 14 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다.
배양 38 일 내지 42 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, AK03 배지, Essential 8 배지 또는 StemSure hPSC Medium △ w/o bFGF 사용시, 201B7 세포주 및/또는 1231A3 세포주에서, 흑갈색 세포 집단의 출현을 광범위하게 확인할 수 있었다 (도 4). 현미경 관찰에 의해, 세포는 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내었다 (도 5).
비교예 2: FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않고 인간 iPS 세포를 사용하는 망막 색소 표피 세포의 제조
인간 iPS 세포 (201B7 세포주 및 1231A3 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. "StemFit®" AK03 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03 배지) 또는 Essential 8 배지 (Life Technologies) 를 사용하였다.
FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포 또는 StemSure hPSC Medium △ w/o bFGF (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 에서 6 일 동안 배양한 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당, AK03 배지 또는 StemSure hPSC Medium △ w/o bFGF 사용시에는 2.0 x 105 세포로, Essential 8 배지 사용시에는 5.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 배양 1 일에는, ROCK 저해제로서 Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 AK03 배지, Essential 8 배지 또는 StemSure hPSC Medium △w/o bFGF 를 사용하였고; 배양 2 일 내지 5 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 6 일 내지 9 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 10 일 내지 13 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 14 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다.
배양 38 일 내지 42 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 몇 안되는 세포만이 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다 (도 6).
실시예 3: MEK 저해제 및/또는 FGF 수용체 저해제와 각종 저해제, 신호 전달 경로 저해제 또는 신호 전달 경로 아고니스트의 조합 처리 단계를 포함하고 인간 iPS 세포를 사용하는 망막 색소 표피 세포의 고효율 제조
인간 iPS 세포 (201B7 세포주 및 1231A3 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03 배지) 였다.
MEK 저해제 및/또는 FGF 수용체 저해제와 각종 저해제, 신호 전달 경로 저해제 또는 신호 전달 경로 아고니스트의 조합 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에 1 개 웰 당 1.2 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포 시딩 다음날, 도 7 에서 나타낸 조합으로의, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM), FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) (최종 농도 100 nM), BMP 수용체 저해제로서 LDN193189 (STEMGENT) (최종 농도 100 nM), Shh 신호 전달 경로 아고니스트로서 SAG (Enzo Life Sciences) (최종 농도 30 nM), 및 PKC 저해제로서 Go6983 (SIGMA) (최종 농도 2 μM) 를 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일에는, ROCK 저해제로서 Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 AK03 배지를 사용하였고; 배양 2 일 내지 5 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 6 일 내지 9 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 10 일 내지 13 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 14 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다. 동시에, MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 실시예 1, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 1, FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 실시예 2, 및 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 2 의 조건 하에서도 실험을 실시하였다.
배양 38 일 내지 47 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 비교예 1 및 비교예 2 의 조건 하에서는, 몇 안되는 세포만이 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 것으로 발견되었다 (도 7, 무처리). 반대로, MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 실시예 1 의 제조 조건, FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 실시예 2 의 제조 조건, 및 MEK 저해제 및/또는 FGF 수용체 저해제와 각종 저해제, 신호 전달 경로 저해제 또는 신호 전달 경로 아고니스트의 조합 처리 단계를 포함하는 제조 조건 하에서, 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 RPE 세포의 출현을 확인할 수 있었다 (도 7). 전체 웰에서의 RPE 세포의 비율을 시각 관찰에 의해 판단하고, 비율에 따라 0 에서 5 의 6 개 등급으로 분류하였다 (도 8A). 도 8B 및 8C 에 나타내는 모든 화합물 조합 처리 조건 하에서, 무처리 조건보다 높은 비율의 RPE 세포의 출현을 확인할 수 있었다 (도 8B 및 8C).
실시예 4: MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하고 인간 iPS 세포 Ff-I01, QHJI01 을 사용하는 망막 색소 표피 세포의 고효율 제조
인간 iPS 세포 (Ff-I01 세포주 및 QHJI01 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03N 배지) 였다.
MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03N 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM) 또는 FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) (최종 농도 100 nM) 를 AK03N 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일 내지 4 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 5 일 내지 8 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 9 일 내지 12 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 13 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다. 동시에, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 1 (단, AK03 배지는 AK03N 배지로 변경) 및 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 2 의 조건 (단, AK03 배지는 AK03N 배지로 변경) 하에서도 실험을 실시하였다.
배양 43 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 비교예 1 및 비교예 2 의 조건 하에서는, 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 세포는 거의 발견되지 않았다 (도 9, 무처리). 한편, MEK 저해제 및 FGF 수용체 저해제에 노출시켰을 때, Ff-I01 세포주 및 QHJI01 세포주 모두에서 흑갈색 세포 집단의 출현을 광범위하게 확인할 수 있었다 (도 9, MEKi, FGFRi).
실시예 5: MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계에서의 각 저해제의 노출 일수의 숙고
인간 iPS 세포 (QHJI01 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03N 배지) 였다.
MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03N 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, 2 일 후, 3 일 후, 4 일 후, 5 일 후 또는 6 일 후에, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM) 또는 FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) (최종 농도 100 nM) 를 AK03N 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안, 5 일 동안, 4 일 동안, 3 일 동안, 2 일 동안 또는 1 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일 내지 4 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 5 일 내지 8 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 9 일 내지 12 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 13 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다.
배양 48 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, MEK 저해제 및 FGF 수용체 저해제로의 치료 모두에서, 노출 2 일 이상 동안 흑갈색 세포 집단이 증가하였고, 노출 6 일까지 노출 일수가 증가함에 따라 전체 웰에서의 발색 세포의 비율이 증가하였다 (도 10). 특히, 노출 4 일 ~ 6 일에서 흑갈색 세포 집단의 현저한 증가를 볼 수 있었다.
실시예 6: MEK 저해제 처리 단계에서의 MEK 저해제 노출 기간의 숙고
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03 배지) 였다.
MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 1.2 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, 4 일 후 또는 6 일 후에, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM) 을 AK03 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안, 3 일 동안 또는 1 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 또한, 6 일 동안 MEK 저해제에 노출시킨 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 0.8 x 104 세포로 시딩하고, Y-27632 (최종 농도 10 μM) 및 PD0325901 (최종 농도 1 μM) 함유 AK03 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 7 일 동안 추가 배양함으로써, 세포를 13 일 동안 MEK 저해제에 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 1.2 x 106 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일에는, Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 AK03 배지를 사용하였고; 배양 2 일 내지 5 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 6 일 내지 9 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 10 일 내지 13 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 14 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다. 동시에, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 1 의 조건 하에서도 RPE 세포의 제조를 실시하였다.
배양 37 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 비교예 1 의 조건 및 1 일 동안 MEK 저해제에 대한 노출 하에서는, 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 세포는 거의 발견되지 않았다 (도 11, 무처리, MEKi 1 일). 한편, MEK 저해제 노출 3 일 및 6 일 동안, 흑갈색 세포 집단의 출현을 광범위하게 확인할 수 있었고 (도 11, MEKi 3 일, 6 일), 13 일 동안 노출에 의해서도 유사하게, 충분한 발색 세포 집단 출현이 확인되었다 (도 11, MEKi 13 일).
실시예 7: MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계 종료시의 유전자 발현
인간 iPS 세포 (Ff-I01 세포주 및 QHJI01 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03N 배지) 였다.
MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03N 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날 또는 4 일 후에 MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM) 또는 FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) (최종 농도 100 nM) 를 AK03N 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 또는 3 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, 제 2 단계로 옮겨지는 것들 외의 세포를 마이크로어레이용 샘플로서 RNA 추출에 사용하고, 제 2 단계로 옮겨지는 세포를 iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일에는, Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 AK03 배지, 또는 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였다. 배양 1 일에 AK03 배지 (Y-27632, SB-431542 및 CKI-7 함유) 를 사용한 경우, 배양 2 일 내지 5 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 6 일 내지 9 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 10 일 내지 13 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 14 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배양 1 일에 기초 배지 (20% KSR, Y-27632, SB-431542 및 CKI-7 함유) 를 사용한 경우, 배양 2 일 내지 4 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 5 일 내지 8 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 9 일 내지 12 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 13 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다. 동시에, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 1 의 조건 (AK03 배지는 AK03N 배지로 변경) 하에서도 마이크로어레이용 샘플의 회수 및 RPE 세포의 제조를 실시하였다.
RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 를 RNA 추출에 사용하고, GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix) 를 사용하여 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 마이크로어레이 분석을 위해서는, KURABO INDUSTRIES LTD. 에 의한 수탁 분석을 이용하였다.
배양 43 일에서의 배양 플레이트의 관찰상을 기반으로 하고 도 8A 에 따라, 시각 관찰에 의한 전체 웰에서의 RPE 세포의 결정된 비율 결과 (RPE 세포의 비율 에 따라 0 에서 5 의 6 개 등급으로 점수화), 및 마이크로어레이 분석 결과인 제 1 단계 종료시 눈 형성 초기 마커 PAX6, LHX2, SIX3 의 발현 값 (신호) 및 플래그 (검출) 를 표에 요약하였다 (도 12). 플래그는 발현 값의 신뢰성을 나타내며, P 는 높은 신뢰성을 의미하고, A 는 낮은 신뢰성을 의미한다. 이들 결과로부터, 전체 웰에서의 RPE 세포의 비율과 제 1 단계 종료시 PAX6, LHX2 및 SIX3 의 발현 값 사이에 상관관계가 발견되었다. 따라서, 제 2 단계로의 이행 시기를 이들 유전자의 발현을 기반으로 하여 결정할 수 있다는 것이 발견되었다.
실시예 8: MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계에서의 각종 저해제 농도의 숙고
인간 iPS 세포 (QHJI01 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03N 배지) 였다.
MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03N 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) 를 최종 농도 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM 또는 4 μM 로, 및 FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) 를 최종 농도 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 또는 400 nM 로 AK03N 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일 내지 4 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 5 일 내지 8 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 9 일 내지 12 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 13 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다. 동시에, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 1 (AK03 배지는 AK03N 배지로 변경) 및 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 2 의 조건 (AK03 배지는 AK03N 배지로 변경) 하에서도 RPE 세포의 제조를 실시하였다.
배양 36 일 및 49 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 비교예 1 및 비교예 2 의 조건 하에서는, 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 세포는 거의 발견되지 않았다 (도 13, 무처리). 한편, 연구한 모든 MEK 저해제 농도 (0.25 ~ 4 μM) 및 FGF 수용체 저해제 농도 (25 ~ 400 nM) 에서, 흑갈색 세포 집단의 출현을 광범위하게 확인할 수 있었다 (도 13, MEKi: 0.25 ~ 4 μM, FGFRi: 25 ~ 400 nM).
실시예 9: 제 1 단계에서 제 2 단계로의 이행시 시딩 세포수의 숙고
인간 iPS 세포 (QHJI01 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03N 배지) 였다.
MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03N 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM) 또는 FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) (최종 농도 100 nM) 를 AK03N 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 0.2, 0.4, 0.6, 1.0, 2.0 또는 4.0 x 105 세포 (0.2, 0.4, 0.6, 1.0, 2.0 또는 4.0 x 104 세포/㎠) 로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일 내지 4 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 5 일 내지 8 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 9 일 내지 12 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 13 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다.
배양 49 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 연구한 모든 시딩 세포수 (0.2, 0.4, 0.6, 1.0, 2.0 또는 4.0 x 104 세포/㎠) 에서, 흑갈색 세포 집단의 출현을 광범위하게 확인할 수 있었다 (도 14).
실시예 10: 제 1 단계에서의 MEK 저해제 PD184352, U0126, TAK-733, AZD-8330 의 숙고
인간 iPS 세포 (QHJI01 세포주 및 1231A3 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03N 배지) 였다.
MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03N 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM), PD184352 (SIGMA) (최종 농도 1.5 μM, 3 μM, 6 μM), U0126 (SIGMA) (최종 농도 5 μM, 10 μM), TAK-733 (Selleck) (최종 농도 0.3 μM) 또는 AZD-8330 (Selleck) (최종 농도 0.3 μM) 을 AK03N 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일 내지 4 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 5 일 내지 8 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 9 일 내지 12 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 13 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다. 동시에, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 1 의 조건 (AK03 배지는 AK03N 배지로 변경) 하에서도 RPE 세포의 제조를 실시하였다.
배양 49 일 및 50 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 비교예 1의 조건 하에서는, 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 세포는 거의 발견되지 않았다 (도 15, 무처리). 한편, 연구한 모든 MEK 저해제 (PD0325901, PD184352, U0126, TAK-733, AZD-8330) 에서, 흑갈색 세포 집단의 출현을 광범위하게 확인할 수 있었다 (도 15, PD0325901, PD184352, U0126, TAK-733, AZD-8330).
실시예 11: 제 1 단계에서의 FGF 수용체 저해제 SU5402 의 숙고
인간 iPS 세포 (QHJI01 세포주 및 1231A3 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03N 배지) 였다.
FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03N 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) (최종 농도 100 nM) 또는 SU5402 (SIGMA) (최종 농도 5 μM, 10 μM, 20 μM) 를 AK03N 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일 내지 4 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 5 일 내지 8 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 9 일 내지 12 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 13 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다. 동시에, FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 2 의 조건 (AK03 배지는 AK03N 배지로 변경) 에서도 RPE 세포의 제조를 실시하였다.
배양 49 일에 배양 플레이트를 관찰하였고, 그 결과, 비교예 2 의 조건 하에서는, 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 세포는 거의 발견되지 않았다 (도 16, 무처리). 한편, 연구한 모든 FGF 수용체 저해제 (PD173074, SU5402) 에서, 흑갈색 세포 집단의 출현을 광범위하게 확인할 수 있었다 (도 16, PD173074, SU5402).
실시예 12: 제 2 단계에서의 노달 신호 전달 경로 저해제 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제 단독의 노출의 분화 유도 효과의 숙고
인간 iPS 세포 (QHJI01 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03N 배지) 였다.
MEK 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03N 배지에서, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM) 을 AK03N 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 12-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 0.8 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 제 2 단계에서는 하기 3 종류의 배지를 사용하였다. 배양 1 일 내지 12 일에는, 10% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] (도 17, NODALi+WNTi), 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM) , SB-431542 (최종 농도 5 μM) 를 첨가한 기초 배지 (도 17, NODALi), 또는 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 (도 17, WNTi) 를 사용하였다. 배양 13 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다.
배양 43 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 노달 신호 전달 경로 저해제와 Wnt 신호 전달 경로 저해제의 양 처리 조건 (NODALi+WNTi), 및 노달 신호 전달 경로 저해제의 단일제 처리 조건 (NODALi) 하에서, 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징과 동일한 수준을 나타내는 세포의 출현이 확인되었다 (도 17, NODALi+WNTi, NODALi). Wnt 신호 전달 경로 저해제의 단일제 처리 (WNTi) 에 의해, 전체 웰에서의 흑갈색 면적이 감소하였으나; RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 충분한 수의 세포의 출현을 확인할 수 있었다 (도 17, WNTi). 상기 결과로부터, 제 2 단계에서는 노달 신호 전달 경로 저해제 또는 Wnt 신호 전달 경로 저해제 중 어느 하나가 존재하면 충분하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 13: 전체 웰에서의 흑갈색 세포의 면적비와 망막 색소 표피 세포 마커 유전자의 발현 사이의 관계
인간 iPS 세포 (201B7 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03 배지) 였다.
MEK 저해제 및 BMP 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 1.2 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. MEK 저해제에 6 일 동안, BMP 수용체 저해제에 1 일 동안 노출시킨 경우, 시딩 다음날 MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM) 을 AK03 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 시딩 6 일 후에 BMP 수용체 저해제로서 LDN193189 (STEMGENT) (최종 농도 100 nM) 를 AK03 배지에 첨가함으로써, 세포를 MEK 저해제 및 BMP 수용체 저해제에 각각 6 일 동안 및 1 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). MEK 저해제 및 BMP 수용체 저해제 둘 모두에 6 일 동안 노출시키는 경우, 시딩 다음날 PD0325901 (최종 농도 1 μM) 과 LDN193189 (최종 농도 100 nM) 를 AK03 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일에는, Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 AK03 배지를 사용하였고; 배양 2 일 내지 5 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 6 일 내지 9 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 10 일 내지 13 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM), CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 14 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다. 동시에, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 1 의 조건 하에서도 RPE 세포의 제조를 실시하였다.
배양 39 일에 관찰한 후, 세포를 회수하고, RNA 를 추출하고, 실시간 RT-PCR를 실시하였다. RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 를 RNA 추출에 사용하고, QuantiTect Probe RT-PCR Kit (QIAGEN) 를 실시간 RT-PCR 에 사용하였다. BEST1 (Hs00188249_m1), MITF (Hs01117294_m1), RAX (Hs00429459_m1), GAPDH (Hs02758991_g1) 에 대한 프라이머 및 프로브는 Applied Biosystems사로부터 구입하였다. 각 샘플의 BEST1, MITF 및 RAX 의 발현 수준을 GAPDH 의 발현 수준에 의해 정규화하고, 미분화 상태 유지 조건 하 배양된 iPS 세포 (미분화) 의 발현 수준을 1 로 했을 때의 상대치로 나타내었다.
배양 39 일 후의 배양 플레이트의 관찰상을 기반으로 하고 도 8A 에 따라, 전체 웰에서의 RPE 세포의 비율을 시각 관찰에 의해 결정하였다. 그 결과, 무처리는 "1", MEK 저해제 6 일 ＋ BMP 수용체 저해제 1 일 노출은 "3", MEK 저해제 6 일 ＋ BMP 수용체 저해제 6 일 노출은 "5" 였다 (도 18, 상측, 세포 사진). 이들 샘플과 지속적 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포 (미분화) 의 샘플 사이에서, 망막 색소 표피 세포 마커로서 BEST1, MITF, 및 눈 형성 초기 마커로서 RAX 의 발현 수준을 실시간 RT-PCR 법에 의해 비교하였다. 그 결과, 흑갈색 세포의 면적과 상기 기재한 마커 유전자의 발현 수준 사이에 상관관계가 발견되었다 (도 18, 하측, 그래프). 상기 결과로부터, 흑갈색 세포가 망막 색소 표피 세포 마커 유전자 및 눈 형성 초기 마커 유전자를 발현한다는 것이 제시되었다. 추가로, 본 제조 방법에 의한 RPE 세포 제조가 이들 유전자 발현 수준을 확인함으로써 또한 검증되었다.
실시예 14: MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조된 RPE 세포의 마커 유전자의 발현 확인
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주) 의 피더-프리 조건 하에서의 미분화 상태 유지 배양은, "Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594" 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 사용한 배지는 "StemFit®" AK03N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) (이하, AK03N 배지) 였다.
MEK 저해제 또는 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 제조를 하기와 같이 실시하였다. 미분화 상태 유지 배양 하의 iPS 세포를 0.5 x TrypLE select (TrypLE select (Life Technologies) 와 0.5 mM EDTA/PBS(-) 의 등량 혼합물) 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (Nippi) (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 104 세포로 시딩하고, ROCK 저해제 [10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] 함유 AK03N 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 시딩 다음날, MEK 저해제로서 PD0325901 (SIGMA) (최종 농도 1 μM) 또는 FGF 수용체 저해제로서 PD173074 (SIGMA) (최종 농도 100 nM) 를 AK03N 배지에 첨가하고 (제 1 단계 개시), 세포를 이에 6 일 동안 노출시켰다 (제 1 단계 종료). 그 후, 세포를 0.5 x TrypLE select 로 처리하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 박리하고, 피펫팅으로 단일 세포로 분산시키고, iMatrix-511 (0.5 ㎍/㎠) 로 코팅한 6-웰 배양 플레이트에, 1 개 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다 (제 2 단계 개시). 배양 1 일 내지 4 일에는, 20% KSR (Life Technologies), Y-27632 (최종 농도 10 μM), 노달 신호 전달 경로 저해제로서 SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (최종 농도 5 μM), 및 Wnt 신호 전달 경로 저해제로서 CKI-7 (SIGMA) (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지 [GMEM 배지 (SIGMA), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Life Technologies), 1 mM 나트륨 피루베이트 (SIGMA), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 mM L-글루타민 (SIGMA), 100 U/㎖ 페니실린-100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)] 를 사용하였고; 배양 5 일 내지 8 일에는, 15% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 9 일 내지 12 일에는, 10% KSR, Y-27632 (최종 농도 10 μM), SB-431542 (최종 농도 5 μM) 및 CKI-7 (최종 농도 3 μM) 을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 13 일 내지 30 일에는, 10% KSR 만을 첨가한 기초 배지를 사용하였고; 배양 31 일부터 및 그 이후에는, RPE 유지 배지 [67% DMEM 저 글루코오스 (SIGMA), 29% F12 (SIGMA), 1.9% B-27 보충물 (Life Technologies), 1.9 mM L-글루타민, 96 U/㎖ 페니실린-96 ㎍/㎖ 스트렙토마이신] 를 사용하였다. 배지 전체량을 매일 교환하였다. 동시에, MEK 저해제 처리 단계를 포함하지 않는 비교예 1 의 조건 (AK03 배지는 AK03N 배지로 변경) 하에서도 실험을 실시하였다.
배양 43 일에 관찰한 후, 세포를 회수하고, RNA 를 추출하고, RT-PCR 을 실시하였다. RNeasy Micro Kit (QIAGEN) 를 RNA 추출에 사용하고, Oligo(dT)12-18 Primer (Invitrogen) 및 SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) 를 역전사 반응에 사용하고, Blend Taq-Plus- (TOYOBO) 를 PCR 에 사용하였다. RPE65, BEST1, CRLBP, GAPDH 의 프라이머 서열은 하기와 같다.
RPE65-F: TCCCCAATACAACTGCCACT (SEQ ID NO: 1), RPE65-R: CCTTGGCATTCAGAATCAGG (SEQ ID NO: 2), BEST1-F: TAGAACCATCAGCGCCGTC (SEQ ID NO: 3), BEST1-R: TGAGTGTAGTGTGTATGTTGG (SEQ ID NO: 4), CRALBP-F: GAGGGTGCAAGAGAAGGACA (SEQ ID NO: 5), CRALBP-R: TGCAGAAGCCATTGATTTGA (SEQ ID NO: 6), GAPDH-F: ACCACAGTCCATGCCATCAC (SEQ ID NO: 7), GAPDH-R: TCCACCACCCTGTTGCTGTA (SEQ ID NO: 8). PCR 반응의 사이클 수는, RPE65, BEST1, GAPDH 에 대해 30 사이클이고, CRALBP 에 대해 35 사이클이었다. PCR 산물은 아가로오스 겔 전기영동에 의해, RPE65 는 369 bp 부근, BEST1 은 261 bp 부근, CRALBP 는 341 bp 부근, 그리고 GAPDH 는 452 bp 부근에 단일 밴드로서 검출되었다. 양성 대조군으로서 1 차 인간 RPE (hRPE) 를 사용하였고, 음성 대조군으로서 미분화 상태 유지 조건 하 배양된 iPS 세포 (미분화 iPSC) 를 사용하였다.
배양 43 일에 배양 플레이트를 관찰하였다. 그 결과, 비교예 1 의 조건 하에서는, 몇 안되는 세포만이 흑갈색, 다각형, 조약돌-유사 형태와 같은 RPE 세포의 전형적인 특징을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다 (도 19, 우측, 세포 사진, 무처리). 한편, MEK 저해제 및 FGF 수용체 저해제에 노출된 경우, 흑갈색 세포 집단의 출현을 광범위하게 확인할 수 있었다 (도 19, 우측, 세포 사진, MEKi, FGFRi). RT-PCR 의 결과로서, 비교예 1 의 조건 하에서는, 망막 색소 표피 세포 마커인 RPE65, BEST1, CRALBP 의 밴드가 매우 얇았다 (도 19, 좌측, 전기 영동 패턴, 무처리). 한편, MEK 저해제 및 FGF 수용체 저해제에 노출된 샘플에서는 명료한 밴드를 확인할 수 있었다 (도 19, 좌측, 전기 영동 패턴, MEKi, FGFRi). 상기 결과로부터, MEK 저해제 및 FGF 수용체 저해제 처리 단계를 포함하는 제조 방법에 의한 RPE 세포의 고효율 제조가 또한 이들 유전자 발현 수준을 확인함으로써 검증되었다.
본 발명의 제조 방법으로, 다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 표피 세포를 고효율로 제조할 수 있다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 번호 2015-176896 (출원일: 2015 년 9 월 8 일) 을 기반으로 하며, 이의 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.
<110> Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. HEALIOS K.K. <120> Method of producing retinal pigment epithelial cells <130> 092513 <150> JP 2015-176896 <151> 2015-09-08 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RPE65 <400> 1 tccccaatac aactgccact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RPE65 <400> 2 ccttggcatt cagaatcagg 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BEST1 <400> 3 tagaaccatc agcgccgtc 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BEST1 <400> 4 tgagtgtagt gtgtatgttg g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CRALBP <400> 5 gagggtgcaa gagaaggaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CRALBP <400> 6 tgcagaagcc attgatttga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 7 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 8 tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (28)

  1. 하기 단계를 포함하는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법:
    (1) 다능성 줄기 세포를, FGF 수용체 저해제, MEK 저해제, 또는 이들 모두를 포함하는 배지에서 30 일 이하 기간 동안 배양하는 제 1 단계, 및
    (2) 제 1 단계에서 수득한 세포를, 노달 (Nodal) 신호 전달 경로 저해제, Wnt 신호 전달 경로 저해제, 또는 이들 모두의 존재 하에 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 형성시키는 제 2 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계가 무혈청 조건으로 실시되는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계가 피더 세포 부재 하에 실시되는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계에서의 배지가 미분화 상태 유지 인자를 추가로 포함하는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 미분화 상태 유지 인자가 FGF 신호 전달 경로 아고니스트인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, FGF 신호 전달 경로 아고니스트가 bFGF 인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, FGF 수용체 저해제가 PD173074 및 SU5402 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, MEK 저해제가 PD0325901, PD184352, U0126, TAK-733 및 AZD-8330 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 노달 신호 전달 경로 저해제가 ALK4, 5 또는 7 저해제인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, ALK4, 5 또는 7 저해제가 SB431542 인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, Wnt 신호 전달 경로 저해제가 CKI-7 인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 영장류 다능성 줄기 세포인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계에서의 배지가 BMP 수용체 저해제를 추가로 포함하는 배지인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, BMP 수용체 저해제가 ALK2/3 저해제인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, ALK2/3 저해제가 LDN193189 인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계에서의 배지가 소닉 헤지호그 (Sonic hedgehog) 신호 전달 경로 아고니스트를 추가로 포함하는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 아고니스트가 SAG 인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계에서의 배지가 PKC 저해제를 추가로 포함하는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, PKC 저해제가 Go6983 인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계에서 배양 기간이 2 일 ~ 13 일 동안인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계에서 배양 기간이 4 일 ~ 6 일 동안인, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계에서 PAX6, LHX2 및 SIX3 중 적어도 하나의 유전자 발현이 유도되는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계의 배지는 노달 신호 전달 경로 저해제를 함유하지 않고 Wnt 신호 전달 경로 저해제를 함유하지 않으며, 제 2 단계는 FGF 수용체 저해제 및 MEK 저해제의 부재 하에서 이루어지는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
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