CN108291206B - 干细胞来源的视网膜色素上皮的基于macs的纯化 - Google Patents

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Abstract

提供了富集源自干细胞的视网膜色素上皮(RPE)细胞群体的方法。这样的方法可以包括通过从RPE细胞的起始群体中耗竭CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞来除去污染细胞。

Description

干细胞来源的视网膜色素上皮的基于MACS的纯化
本申请要求2015年9月8日提交的美国临时申请号62/215,272的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明一般而言涉及干细胞生物学领域。更具体地，涉及富集干细胞来源的视网膜色素上皮细胞群体的方法。
2.相关技术的描述
视网膜是组织的光敏层，其布置在眼睛的内表面。视网膜中的感光器细胞(杆或锥细胞)对光直接敏感，并将化学光信号转化为触发神经冲动的电活动。视网膜色素上皮细胞(RPE)是一层形成血-视网膜屏障的色素细胞。RPE细胞在维持视觉功能以及从视网膜下腔至血液的离子、水和代谢终产物的转运中发挥重要作用(Strauss等人，2005)。此外，RPE细胞通过分泌免疫抑制因子来建立眼的免疫赦免(immune privilege)。RPE细胞的紊乱或损伤可导致视网膜变性、失去视觉功能和失明。视网膜的几种疾病(包括急性和年龄相关性黄斑变性和贝斯特病)涉及RPE的退化；因此，细胞替代治疗是保持视力的一种可能的治疗选择(Buchholz等人，2009)。
通常，干细胞是未分化的细胞，其可以产生一系列成熟的功能细胞。例如，造血干细胞可产生任何不同类型的终末分化血细胞。胚胎干(ES)细胞来自胚胎并且是多能的，因此具有发育成任何器官或组织类型(包括RPE细胞)的能力。
在2006年诱导多能干细胞(iPS细胞)从成年小鼠体细胞的产生提供了干细胞研究、药物研发、疾病模型和细胞治疗的重大突破(Takahashi等人，2006)。人iPSC可以分化为特定的细胞类型，并且具有用于再生医学的患者特异性、免疫匹配的细胞的潜力(Yu等人，2007)。
已显示iPSC产生眼细胞，包括RPE细胞(Hirami等人，2009)。然而，将iPSC来源的RPE细胞用于治疗、筛选测定、视网膜疾病模型和RPE生物学研究需要从分化的RPE细胞群体中除去污染细胞和/或富集目的群体。
发明概述
本发明的实施方案通过提供用于通过除去CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞获得来自起始RPE细胞群体的视网膜色素上皮(RPE)细胞富集群体的方法克服了本领域的主要缺陷。在某些实施方案中，起始RPE细胞群体可以获自多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
在一个实施方案中，提供了用于提供富集的视网膜色素上皮(RPE)细胞群体的方法，其包括(a)获得包含RPE细胞的起始细胞群体和(b)通过从其中除去CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞，来富集所述细胞群体的RPE细胞，由此提供与起始细胞群体相比富含RPE细胞的RPE富集细胞群体。在一些方面，起始细胞群体是未经遗传改造或遗传修饰的。在一些方面，富集细胞群体不包括遗传改造细胞。因此，在某些方面，RPE富集细胞群体未经遗传改造或遗传修饰。
在一些方面，所述方法可以进一步包括测定RPE富集群体中RPE细胞的富集水平。在某些方面，通过使用视网膜上皮特异性标记来测定富集水平。例如，视网膜上皮特异性标记可以是BEST1、CRALBP、TYRP1、PMEL17或MITF。在具体的方面，如通过BEST1分选测定的，与起始细胞群体相比，RPE富集细胞群体富含RPE细胞。
在某些方面，RPE富集群体是至少95％，96％，97％，98％或99％的RPE细胞。在其他方面，RPE富集群体是基本上纯的RPE细胞。
在实施方案的某些方面，起始细胞群体由多能干细胞制备。在其他方面，多能干细胞是诱导多能干细胞。例如，RPE细胞可以是人RPE细胞。
在某些方面，除去CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞。例如，CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞可通过基于磁珠的分选或基于荧光的分选来除去。在某些方面，使用识别CD24、CD56和/或CD90的抗体或适体除去CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞。
在某些方面，通过从其中除去CD24阳性的细胞来富集细胞群体的RPE细胞。在其他方面，通过从其中除去CD56阳性的细胞来富集细胞群体的RPE细胞。在又一方面，通过从其中除去CD90阳性的细胞来富集细胞群体的RPE细胞。在另一方面，通过从其中除去CD90阳性的细胞、CD56阳性的细胞和CD24阳性的细胞来富集细胞群体的RPE细胞。
本文提供的细胞群体可以基本上不含污染性非RPE细胞，例如成纤维细胞或未分化的多能干细胞。另一方面，RPE细胞是小鼠或人RPE细胞。在特定的方面，RPE细胞可以是冷冻保存的RPE细胞。
通过本文的方法产生的RPE细胞可用于本领域目前已知的RPE细胞的任何方法和应用。例如，可以提供评估化合物的方法，包括测定化合物在RPE细胞上的药理学或毒理学性质。还可以提供评估化合物对RPE细胞的作用的方法，其包括：a)使本文提供的RPE细胞与化合物接触；和b)测定化合物对RPE细胞的作用。
根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应该理解的是，尽管指出了本发明的优选实施方案，但是详细描述和特定实施例仅仅是以示例的方式给出的，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改根据详细描述对于本领域技术人员将变得明显。
附图的简要说明
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图并结合在本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A-1D：A)汇合前iPSC的图像。B)RPE分化的第25天的示例图像。C)RPE分化的第40天的示例图像。D)在第40天用RPE-MM中的培养物重新铺板后的第60天的100x亮视野示例图像。
图2A-2B：在iPSC来源的RPE细胞群体的细胞分选之前，相关标记(包括MAP2，NES，PAX6，MITF，PMEL17，TYRP1，CRALBP和BEST1)的流式细胞术分析。
图3A-3C：在细胞分选iPSC来源的RPE细胞群体以除去CD24阳性的细胞、CD24阳性和CD56阳性的细胞、CD24阳性和CD90阳性的细胞、以及CD24阳性、CD56阳性和CD90阳性的细胞后，相关标记(包括MAP2，NES，PAX6，MITF，PMEL17，TYRP1，CRALBP和BEST1)的流式细胞术分析。
图4A-4D：A)未处理的iPSC-RPE细胞和用PGE2处理的iPSC-RPE细胞的β-连环蛋白和F-肌动蛋白染色。在未处理的细胞的细胞质中和处理的细胞的膜上可见β-连环蛋白染色。B)未处理的iPSC-RPE细胞和用PGE2处理的iPSC-RPE细胞的pERM(Ezrin)和ZO1染色。在未处理的细胞的细胞质中ERM染色浅，在处理的细胞的细胞质中ERM染色深，而在未处理和处理的细胞的质膜的紧密连接处可见ZO1染色。C)未处理的iPSC-RPE细胞和用PGE2处理的iPSC-RPE细胞的RPE65和ZO1染色。在未处理细胞的细胞质中RPE65染色浅，在处理细胞的细胞质中RPE65染色深。D)未处理的iPSC-RPE细胞和用PGE2处理的iPSC-RPE细胞的透射电子显微照片。用PGE2处理的细胞具有更广阔的顶突。
图5A-5D：A)用IWP2+endo-IWR1、IWP2或LiCl处理的细胞的β-连环蛋白染色。用IWP2或IWP2+endo-IWR1处理的细胞在细胞膜上具有β-连环蛋白。用LiCl处理的细胞在细胞核中具有β-连环蛋白，而未处理的细胞在细胞质中具有β-连环蛋白。B)用IWP2+endo-IWR1、IWP2或LiCl处理的细胞的p27染色。用IWP2或IWP2+endo-IWR1处理的细胞在细胞核中具有较高的p27表达，表明细胞已经退出细胞周期。用LiCl处理的细胞或未处理的细胞在细胞核中具有弱的p27表达。C)用IWP2+IWR1、IWP2或LiCl处理的细胞的RPE65和ZO1紧密连接。RPE65在IWP2+IWR1处理的细胞和IWP2细胞的细胞质中高，在未处理的细胞中低，并且在LiCl处理的细胞中没有看到染色。D)用IWP2+IWR1、IWP2或LiCl处理的细胞的功能性紧密连接的电子显微镜图像。
图6A-6D：A)多操作者RPE分化。所示数据代表使用跨三个细胞系的具有多操作者的优化方案的RPE分化设置，如通过RPE标记视黄醛结合蛋白1(Cralbp)的流式细胞术测量的。B)在包括3D1，AMD1B，BEST1L，BEST3A，BEST8A，AMD Donor3D，AMD Donor3C和HLA系A的不同起始细胞系群体中显示了RPE分化方案的再现性。C-D)RPE分化方案的再现性在不同起始细胞系群体中显示。数据表示由来自13个捐献者的28个iPSC细胞系上的5个操作者进行的109个分化。与纯化前细胞群体的不同纯度相比，Cralbp阳性的细胞的百分比增加至90-100％。
图7A-7G：A)使用RPE分化方案产生的RPE细胞的屏障功能的功能性通过跨单层的离子梯度的跨上皮电位(TEP)测量显示。B)用IWP2或IWP2+endo-IWR2处理的RPE细胞的功能性。C-E)未经处理的细胞、PGE2处理的细胞和IWP2+endo-IWR1处理的细胞的跨上皮电阻(TER)和TEP(较浅的线)。F)iPSC来源的分化方案的第54天至第75天的使用RPE-MM+PGE2培养基中的50μM相对100μM PGE2成熟的细胞的功能响应(TER)。与分化方案的第54天至第75天的使用RPE-MM+PGE2培养基中的50μM PGE2培养的iPSC来源的RPE相比，在其以100μM分化的过程中，TER的量度逐渐增加。这表明PGE2浓度的增加促进了iPSC来源的RPE培养物的成熟和功能效率。G)iPSC来源的RPE纯度，通过开始于iPSC来源的RPE分化方案的第54天至第75天的在具有50μM相对100μM PGE2的培养物中的第75天的成熟RPE标记的百分比表达表示。Pmel17、Tryp1和Cralbp(RPE特异性标记)的表达与使用50μM PGE2培养的iPSC来源的RPE是相当的。这表明PGE2在一定浓度范围内促进iPSC来源的RPE分化。与用50μM PGE2处理的细胞相比，用100μM PGE2处理的细胞中Best 1标记(晚期成熟RPE标记)的表达高得多，这表明增加PGE2的浓度增强了iPSC来源的RPE的纯度和成熟度。
示例性实施方案的描述
本公开内容通过提供用于富集干细胞来源的视网膜色素上皮(RPE)细胞群体的方法克服了当前技术的几个主要问题。RPE细胞可以来源于多能干细胞，如ES细胞和iPS细胞；然而，即使在使用现有技术的干细胞来源的RPE群体内，也发现存在一定量的污染细胞(例如未分化的干细胞)。本发明提供了从起始RPE细胞群体中分离和除去污染细胞的方法。污染RPE细胞群体的细胞具有特异性细胞表面抗原，其可用于从群体中耗竭污染性非RPE细胞，如CD24、CD56和/或CD90。因此，除去对于这些特定细胞表面标记中的一种或多种呈阳性的细胞可以产生RPE富集细胞群体，其具有比起始群体更高百分比的RPE细胞。本领域已知某些方法学，例如磁激活细胞分选
Figure BDA0001631938340000061
荧光激活细胞分选(FACS)或单细胞分选等，用于根据它们的表面抗原分离各种细胞群体。在优选的实施方案中，本公开内容包括使用这些分选方法，优选MACS以从起始RPE细胞群体耗竭CD24、CD56和/或CD90阳性的细胞以获得RPE富集细胞群体的方法。因此，本发明的方法可更具时间和成本效益，并且可以使得能够从可再生来源如干细胞制造RPE富集细胞群体用于治疗剂。下面描述本公开内容的其他实施方案和优点。
I.定义
术语“纯化”不需要绝对纯度；相反，它只是一个相对术语。因此，纯化的细胞群体大于约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％纯的，或最优选地，基本上不含其他细胞类型。
如本文所用，就特定组分而言，“基本上”或“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。
如在本说明书中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”一起使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
贯穿本申请，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。
术语“细胞”在本文中用于指可以独立复制，被膜包围并包含生物分子和遗传物质的生物体的结构和功能单位。本文使用的细胞可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如融合细胞，遗传修饰的细胞等)。
术语“细胞群体”在本文中用于指代一组通常为常见类型的细胞。细胞群体可以来自共同的祖细胞或可以包含多于一种的细胞类型。“富集的”细胞群体是指源自起始细胞群体(例如，未分级的，异质性细胞群体)的细胞群体，其含有比起始群体中特定细胞类型的百分比更大百分比的该特定细胞类型。细胞群体可以就一种或多种细胞类型被富集并耗竭一种或多种细胞类型。
术语“干细胞”在本文中指在合适的条件下能够分化成多种范围的特化细胞类型而在其他合适的条件下能够自我更新并保持基本上未分化的多能状态的细胞。术语“干细胞”还包括多能细胞，多潜能细胞，前体细胞和祖细胞。示例性的人干细胞可以从获自骨髓组织的造血或间充质干细胞、获自胚胎组织的胚胎干细胞或获自胎儿的生殖组织的胚胎生殖细胞获得。示例性多能干细胞还可以通过与多能性相关的某些转录因子的表达将其重编程为多能状态而由体细胞产生；这些细胞被称为“诱导性多能干细胞”或“iPSC”。
术语“多能”是指细胞在生物体内分化成所有其他细胞类型(除了胚外或胎盘细胞)的性质。即使在延长培养之后，多能干细胞也能够分化成所有三种胚层(例如，外胚层，中胚层和内胚层细胞类型)的细胞类型。多能干细胞是源自胚泡的内细胞团的胚胎干细胞。在其他实施方案中，多能干细胞是通过重编程体细胞衍生的诱导性多能干细胞。
术语“分化”是指未特化的细胞变成具有结构和/或功能特性变化的更特化类型的过程。成熟细胞通常具有改变的细胞结构和组织特异性蛋白。更具体地说，在本发明方法的背景下，分化指示人干细胞获得具有指示视网膜色素上皮(RPE)细胞是成熟的终末分化细胞的特征的视网膜色素上皮(RPE)细胞的细胞类型的过程。
如本文所用，“未分化的”是指显示未分化细胞的特征性标记和形态特征(其将它们与胚胎或成人来源的终末分化的细胞清楚地区分开来)的细胞。
“胚状体(EB)”是可以分化成内胚层、中胚层和外胚层的细胞的多能干细胞的聚集体。当多能干细胞聚集并使EB的非贴壁培养物悬浮时，形成球体结构。
“分离的”细胞已经基本上从生物体或培养物中的其他细胞中分离或纯化。分离的细胞可以是例如至少99％，至少98％纯的，至少95％纯的或至少90％纯的。
“胚胎”是指通过受精卵或具有人工重编程核的活化卵母细胞的一次或多次分裂获得的细胞团。
“胚胎干(ES)细胞”是未分化的多能细胞，其在早期阶段从胚胎(例如胚泡阶段的内细胞团)获得，或者通过人工方式(例如核转移)产生，并且可以在胚胎或成人中产生任何分化的细胞类型，包括生殖细胞(例如精子和卵子)。
“诱导多能干细胞(iPSC)”是通过表达因子(本文中称为重编程因子)的组合或诱导因子组合的表达重编程体细胞而产生的细胞。可以使用胎儿、出生后、新生儿、幼年或成人体细胞产生iPSC。在某些实施方案中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括例如Oct4(有时称为Oct 3/4)，Sox2，c-Myc和Klf4，Nanog和Lin28。在一些实施方案中，体细胞通过表达至少两种重编程因子，至少三种重编程因子或四种重编程因子来重编程，以将体细胞重编程为多能干细胞。
“等位基因”是指基因的两种或更多种形式中的一种。二倍体生物如人含有每个染色体的两个拷贝，因此每个染色体携带一个等位基因。
术语“纯合”被定义为在特定基因座处含有两个相同的等位基因。术语“杂合”是指在特定基因座处含有两个不同的等位基因。
“单倍型”是指沿着单个染色体在多个基因座处的等位基因的组合。单倍型可以基于单个染色体上的一组单核苷酸多态性(SNP)和/或主要组织相容性复合体中的等位基因。
如本文所用，术语“单倍型匹配的”被定义为细胞(例如iPSC细胞)和被治疗的受试者共有一种或多种主要组织相容性基因座单倍型。受试者的单倍型可以使用本领域公知的测定容易地确定。单倍型匹配的iPSC细胞可以是自体的或同种异体的。在组织培养中生长并分化为RPE细胞的自体细胞固有地与受试者单倍型匹配。
“基本上相同的HLA类型”表示供体的HLA类型与患者的类型匹配达到这样的程度：通过诱导来自供体体细胞的iPSC的分化而获得的移植细胞在被植入患者时能够被移植。
“超级供体”在本文中被称为对某些MHC I类和II类基因纯合的个体。这些纯合个体可以作为超级供体，并且它们的细胞(包括组织和包含其细胞的其他物质)可以被移植到该单倍型纯合或杂合的个体中。超级供体可以分别对于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ基因座等位基因是纯合的。
本文使用“无饲养细胞”或“不依赖饲养细胞”来指补充有细胞因子和生长因子(例如TGFβ，bFGF，LIF)的作为饲养细胞层的替代物的培养物。因此，可以使用“无饲养细胞”或不依赖饲养细胞的培养系统和培养基可用于培养和维持未分化和增殖状态的多能细胞。在一些情况下，无饲养细胞培养物利用基于动物的基质(例如MATRIGELTM)或生长在诸如纤连蛋白、胶原蛋白或玻连蛋白的基质上。这些方法允许人干细胞保持基本上未分化的状态，而不需要小鼠成纤维细胞“饲养层”。
“饲养层”在本文中定义为细胞的包被层，例如在培养皿的底部上。饲养细胞可以将营养素释放到培养基中并提供其他细胞如多能干细胞可以附着的表面。
当与培养基、细胞外基质或培养条件相关地使用时，术语“确定的”或“完全确定的”是指其中化学组成和几乎所有组分的量都是已知的培养基、细胞外基质或培养条件。例如，确定的培养基不含未确定的因子，例如在胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白中。通常，确定的培养基包括补充有重组白蛋白、化学确定的脂质和重组胰岛素的基础培养基(例如含有氨基酸、维生素、无机盐、缓冲剂、抗氧化剂和能源的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、F12或Roswell Park Memorial Institute Medium(RPMI)1640)。示例性的完全确定的培养基是Essential 8TM培养基。
当与培养基、细胞外基质或培养条件相关地使用时，术语“无异源(XF)”是指基本上不含异源动物来源的组分的培养基、细胞外基质或培养条件。为了培养人细胞，非人动物例如小鼠的任何蛋白质将是异种组分。在某些方面，无异源的基质可以基本上不含任何非人动物来源的组分，因此排除了小鼠饲养细胞或MATRIGELTM。MATRIGELTM是一种从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤(其是富含细胞外基质蛋白以包含层粘连蛋白(主要成分)，胶原IV，硫酸乙酰肝素蛋白多糖和内功素/巢蛋白的肿瘤)中提取的可溶性基底膜制剂。
“KNOCKOUTTM血清替代物”，在本文中被称为经过优化以生长并维持培养物中未分化细胞如干细胞的无血清制剂。
“汇合前”是指其中细胞覆盖的培养表面的比例为约60-80％的细胞培养物。通常，汇合前是指其中约70％的培养表面被细胞覆盖的培养物。
“视网膜”是指布置在眼睛内表面上的组织的光敏层。
“视网膜色素上皮细胞”是指脉络膜(充满血管的层)和视网膜之间的单层色素细胞。
本文中的“视网膜谱系细胞”是指可以产生或分化为RPE细胞的细胞。
“视网膜诱导培养基(RIM)”在本文中是指包含WNT途径抑制剂和BMP途径抑制剂并且可以导致PSC向视网膜谱系细胞分化的生长培养基。RIM还包含TGFβ途径抑制剂。
“视网膜分化培养基(RDM)”在本文中定义为包含WNT途径抑制剂、BMP途径抑制剂和MEK抑制剂并分化视网膜细胞的培养基。RDM还包含TGFβ途径抑制剂。
“视网膜培养基(RM)”定义为包含活化素A和烟酰胺的用于培养视网膜细胞的生长培养基。
本文中的“RPE成熟培养基(RPE-MM)”是指包含牛磺酸和氢化可的松的用于使RPE细胞成熟的培养基。RPE-MM还包含三碘甲状腺氨酸。RPE-MM也可以包含PD0325901或PGE2。
“成熟”RPE细胞在本文中称为RPE细胞，其具有未成熟RPE标记例如Pax6的表达下调和成熟RPE标记例如RPE65的上调表达。
RPE细胞“成熟”在本文中指调节RPE发育途径以产生成熟RPE细胞的过程。例如，调节纤毛功能可导致RPE成熟。
本文使用的“治疗有效量”是指当向受试者施用以治疗疾病或病症时足以实现此类治疗的化合物的量。
“诱导剂”在本文中定义为调节细胞内的基因表达的分子，例如激活基因。诱导剂可以结合抑制物或激活物。诱导剂通过使抑制物失能来起作用。
II.多能干细胞
A.胚胎干细胞
ES细胞来源于胚泡的内细胞团并具有高的体外分化能力。可以通过除去发育胚胎的外滋养层，然后在非生长细胞的饲养层上培养内细胞团来分离ES细胞。重新铺板的细胞可以继续增殖并产生新的ES细胞集落，其可以被移出、解离、再次重新铺板并使其生长。这种“传代培养”未分化ES细胞的过程可以重复许多次以产生含有未分化ES细胞的细胞系(美国专利号5,843,780；6,200,806；7,029,913)。ES细胞具有增殖潜力，同时维持其多能性。例如，ES细胞可用于研究细胞和控制细胞分化的基因。ES细胞的多能性结合遗传操作和选择可通过产生转基因、嵌合和敲除小鼠来用于体内基因分析研究。
生产小鼠ES细胞的方法是众所周知的。在一种方法中，将来自129小鼠品系的植入前胚泡用小鼠抗血清处理以除去滋养外胚层，并将内细胞团在含有胎牛血清的培养基中在化学灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养。在胎牛血清存在下，在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上将发育的未分化ES细胞的集落传代培养以产生ES细胞群体。在一些方法中，通过将细胞因子白血病抑制因子(LIF)加入含血清培养基，可以在没有饲养层的情况下培养小鼠ES细胞(Smith，2000)。在其他方法中，小鼠ES细胞可以在骨形态发生蛋白和LIF的存在下在无血清培养基中生长(Ying等人，2003)。
人ES细胞可以由受精卵或胚泡阶段的哺乳动物胚胎产生或衍生，所述哺乳动物胚胎如下产生：通过先前描述的方法(Thomson和Marshall，1998；Reubinoff等人，2000)，融合精子和卵细胞、核转移、孤雌生殖或染色质重编程以及随后将重编程的染色质掺入到质膜中以产生胚胎细胞。在一种方法中，将人胚泡暴露于抗人血清，将滋养外胚层细胞裂解并从在小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上培养的内细胞团中除去。此外，来自内细胞团的细胞块被化学或机械解离、重新铺板，并且通过微量移液器选择具有未分化形态的集落，将其解离并重新铺板(美国专利号6,833,269)。在一些方法中，通过在碱性成纤维细胞生长因子存在下在成纤维细胞的饲养层上培养ES细胞，可以在没有血清的情况下生长人ES细胞(Amit等人，2000)。在其他方法中，通过在包含碱性成纤维细胞生长因子的“条件化”培养基的存在下在蛋白质基质例如MATRIGELTM或层粘连蛋白上培养细胞，可以在没有饲养细胞层的情况下生长人ES细胞(Xu等人，2001)。
通过先前描述的方法(Thomson和Marshall，1998；Thomson等人，1995；Thomson和Odorico，2000)，ES细胞也可以来源于其他生物，包括恒河猴和绒猴，以及来源于已建立的小鼠和人细胞系。例如，已建立的人ES细胞系包括MAOI，MA09，ACT-4，HI，H7，H9，H13，H14和ACT30。作为另一个实例，已经建立的小鼠ES细胞系包括从小鼠品系129胚胎的内细胞团建立的CGR8细胞系，并且CGR8细胞的培养物可以在没有饲养层的情况下在LIF的存在下生长。
ES干细胞可以通过蛋白质标记来检测，包括转录因子Oct4，碱性磷酸酶(AP)，阶段特异性胚胎抗原SSEA-1，阶段特异性胚胎抗原SSEA-3，阶段特异性胚胎抗原SSEA-4，转录因子NANOG，肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)，肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81)，SOX2或REX1。
B.诱导的多能干细胞
多能性的诱导最初是在2006年使用小鼠细胞(Yamanaka等人，2006)和2007年使用人细胞(Yu等人，2007；Takahashi等人，2007)通过引入与多能性相关的转录因子重编程体细胞来实现的。多能干细胞可以保持未分化状态并能够分化成几乎任何细胞类型。使用iPSC可以避免与ES细胞的大规模临床使用相关的大多数伦理和实际问题，而具有iPSC来源的自体移植物的患者可能不需要终身免疫抑制治疗来预防移植排斥反应。
除了生殖细胞之外，任何细胞都可以用作iPSC的起点。例如，细胞类型可以是角质形成细胞，成纤维细胞，造血细胞，间充质细胞，肝细胞或胃细胞。T细胞也可以用作重编程体细胞的来源(美国专利号8,741,648)。对细胞分化的程度或收集细胞的动物的年龄没有限制；甚至未分化的祖细胞(包括成体干细胞)和最终分化的成熟细胞可以用作本文公开的方法中的体细胞的来源。在一个实施方案中，体细胞本身是RPE细胞，例如人RPE细胞。RPE细胞可以是成人或胎儿RPE细胞。iPSC可以在已知将人ES细胞分化成特定细胞类型的条件下生长，并表达人ES细胞标记，包括：SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和TRA-1-81。
可以使用本领域技术人员已知的方法将体细胞重编程以产生诱导性多能干细胞(iPSC)。本领域技术人员可以容易地产生诱导性多能干细胞，参见例如公开的美国专利申请号20090246875，公开的美国专利申请号2010/0210014；公布的美国专利申请号20120276636；美国专利号8,058,065；美国专利8,129,187；美国专利号8,278,620；PCT公开号WO 2007/069666 A1和美国专利号8,268,620，其通过引用并入本文。通常，核重编程因子用于从体细胞产生多能干细胞。在一些实施方案中，利用Klf4，c-Myc，Oct3/4，Sox2，Nanog和Lin28中的至少三种或至少四种。在其他实施方案中，利用Oct3/4，Sox2，c-Myc和Klf4。
用核重编程物质处理细胞，所述核重编程物质通常是能够从体细胞诱导iPSC的一种或多种因子或编码这些物质的核酸(包括整合入载体中的形式)。核重编程物质通常至少包括Oct3/4，Klf4和Sox2或编码这些分子的核酸。p53的功能性抑制剂，L-myc或编码L-myc的核酸和Lin28或Lin28b或编码Lin28或Lin28b的核酸可用作另外的核重编程物质。Nanog也可以用于核重新编程。如公开的美国专利申请号20120196360中所公开的，用于产生iPSC的示例性重编程因子包括(1)Oct3/4，Klf4，Sox2，L-Myc(Sox2可以被Sox1，Sox3，Sox15，Sox17或Sox18替换；Klf4可用Klf1，Klf2或Klf5替换)；(2)Oct3/4，Klf4，Sox2，L-Myc，TERT，SV40大T抗原(SV40LT)；(3)Oct3/4，Klf4，Sox2，L-Myc，TERT，人乳头瘤病毒(HPV)16E6；(4)Oct3/4，Klf4，Sox2，L-Myc，TERT，HPV16E7(5)Oct3/4，Klf4，Sox2，L-Myc，TERT，HPV16E6，HPV16E7；(6)Oct3/4,Klf4,Sox2,L-Myc,TERT,Bmil；(7)Oct3/4,Klf4,Sox2,L-Myc,Lin28；(8)Oct3/4,Klf4,Sox2,L-Myc,Lin28,SV40LT；(9)Oct3/4,Klf4,Sox2,L-Myc,Lin28,TERT,SV40LT；(10)Oct3/4,Klf4,Sox2,L-Myc,SV40LT；(11)Oct3/4,Esrrb,Sox2,L-Myc(Esrrb可用Esrrg替换)；(12)Oct3/4,Klf4,Sox2；(13)Oct3/4,Klf4,Sox2,TERT,SV40LT；(14)Oct3/4,Klf4,Sox2,TERT,HP VI 6E6；(15)Oct3/4,Klf4,Sox2,TERT,HPV16E7；(16)Oct3/4,Klf4,Sox2,TERT,HPV16E6,HPV16E7；(17)Oct3/4,Klf4,Sox2,TERT,Bmil；(18)Oct3/4,Klf4,Sox2,Lin28(19)Oct3/4,Klf4,Sox2,Lin28,SV40LT；(20)Oct3/4,Klf4,Sox2,Lin28,TERT,SV40LT；(21)Oct3/4,Klf4,Sox2,SV40LT；或(22)Oct3/4,Esrrb,Sox2(Esrrb可用Esrrg替换)。在一个非限制性实例中，使用Oct3/4，Klf4，Sox2和c-Myc。在其他实施方案中，使用Oct4，Nanog和Sox2，参见例如美国专利号7,682,828，其通过引用并入本文。这些因子包括但不限于Oct3/4，Klf4和Sox2。在其他实例中，这些因子包括但不限于Oct 3/4，Klf4和Myc。在一些非限制性实例中，使用Oct3/4，Klf4，c-Myc和Sox2。在其他非限制性实例中，使用Oct3/4，Klf4，Sox2和Sal 4。类似Nanog，Lin28，Klf4或c-Myc的因子可以提高重编程效率，并且可以从几种不同的表达载体表达。例如，可以使用整合载体诸如基于EBV元件的系统(美国专利号8,546,140)。另一方面，重编程蛋白质可通过蛋白质转导直接导入体细胞。重编程还可包括使细胞与一种或多种信号传导受体接触，所述信号传导受体包括糖原合酶激酶3(GSK-3)抑制剂，促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂，转化生长因子β(TGF-β)受体抑制剂或信号传导抑制剂，白血病抑制因子(LIF)，p53抑制剂，NF-κB抑制剂或其组合。那些调节剂可以包括小分子，抑制性核苷酸，表达盒或蛋白质因子。预期的是实际上可以使用任何iPS细胞或细胞系。
这些核重编程物质的小鼠和人cDNA序列可参考WO2007/069666中提及的NCBI登录号获得，该专利申请通过引用并入本文。用于引入一种或多种重编程物质或编码这些重编程物质的核酸的方法是本领域已知的，并且公开于例如公布的美国专利申请号2012/0196360和美国专利号8,071,369中，两者均通过引用并入本文。
一经获得，可以在足以维持多能性的培养基中培养iPSC。如美国专利号7,442,548和美国专利公开号2003/0211603中所述，iPSC可与各种培养多能干细胞更具体而言胚胎干细胞的培养基和技术一起使用。在小鼠细胞的情况下，通过向普通培养基中加入作为分化抑制因子的白血病抑制因子(LIF)进行培养。在人细胞的情况下，期望加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)来代替LIF。可以使用本领域技术人员已知的用于培养和维持iPSC的其他方法。
在某些实施方案中，可以使用未确定的条件；例如，多能细胞可以在成纤维细胞饲养细胞或已暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基上培养，以保持干细胞处于未分化状态。在一些实施方案中，将细胞在用辐射或抗生素处理以终止细胞分裂的小鼠胚胎成纤维细胞(作为饲养细胞)共存下培养。或者，可以使用确定的不依赖饲养细胞的培养系统(例如TESRTM培养基(Ludwig等人，2006a；Ludwig等人，2006b)或E8TM培养基(Chen等人，2011))培养多能细胞并维持基本上未分化的状态。
在一些实施方案中，可以修饰iPSC以表达外源核酸，例如以包括与启动子可操作连接的酪氨酸酶增强子和编码第一标记的核酸序列。酪氨酸酶基因例如在2013年1月1日可获得的
Figure BDA0001631938340000161
登录号22173中公开。该序列与小鼠品系C57BL/6位置5286971-5291691(反向)的染色体7对齐。4721个碱基对序列足以在RPE细胞中表达，参见Murisier等人，Dev.Biol.303:838-847,2007，其通过引用并入本文。该构建体在视网膜色素上皮细胞中表达。可以使用其他增强子。其他RPE特异性增强子包括D-MITF，DCT，TYRP1，RPE65，VMD2，MERTK，MYRIP和RAB27A。合适的启动子包括但不限于在视网膜色素上皮细胞中表达的任何启动子，包括酪氨酸酶启动子。构建体还可以包括其他元件，例如用于翻译起始的核糖体结合位点(内部核糖体结合序列)和转录/翻译终止子。通常，用构建体转染细胞是有利的。用于稳定转染的合适载体包括但不限于逆转录病毒载体，慢病毒载体和仙台病毒。
已经按多个目标设计了质粒，例如实现调节的高拷贝数并避免了细菌中质粒不稳定性的潜在原因，并提供了用于与哺乳动物细胞(包括人细胞)相容的质粒选择的工具。已特别关注用于人细胞的质粒的双重要求。首先，它们适用于大肠杆菌中的维持和发酵，从而可以生产和纯化大量的DNA。其次，它们安全和适合用于人患者和动物。第一个要求需要高拷贝数的质粒，这些质粒可以相对容易地选择并且在细菌发酵期间保持稳定。第二个要求需要关注元件例如选择性标记和其他编码序列。在一些实施方案中，编码标记的质粒由以下组成：(1)高拷贝数复制起点，(2)选择性标记，例如但不限于用卡那霉素进行抗生素选择的neo基因，(3)转录终止序列，包括酪氨酸酶增强子和(4)用于掺入各种核酸盒的多克隆位点；和(5)编码与酪氨酸酶启动子可操作连接的标记的核酸序列。本领域已知许多质粒载体用于诱导编码蛋白质的核酸。这些包括但不限于美国专利号6,103,470；美国专利号7,598,364；美国专利号7,989,425；和美国专利号6,416,998中公开的载体，其通过引用并入本文。
病毒基因递送系统可以是基于RNA或基于DNA的病毒载体。游离基因递送系统可以是质粒，基于Epstein-Barr病毒(EBV)的游离型载体，基于酵母的载体，基于腺病毒的载体，基于猿猴病毒40(SV40)的游离型载体，基于牛乳头瘤病毒(BPV)的载体或慢病毒载体。
标记包括但不限于荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白)，酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或萤火虫/海肾荧光素酶或nanoluc)或其他蛋白质。标记可以是蛋白质(包括分泌的、细胞表面或内部蛋白质；合成的或被细胞摄取的)；核酸(例如mRNA或酶活性核酸分子)或多糖。包括可通过抗体、凝集素、探针或核酸扩增反应检测的对感兴趣的细胞类型的标记特异的任何此类细胞组分的决定子。标记也可以通过取决于基因产物功能的生物化学或酶测定或生物反应来鉴定。编码这些标记的核酸序列可以与酪氨酸酶增强子可操作地连接。此外，还可以包括其他基因，如可能影响干细胞向RPE的分化或RPE功能或生理学或病理学的基因。因此，在一些实施方案中，包括编码以下的一种或多种的核酸：MITF,PAX6,TFEC,OTX2,LHX2,VMD2,CFTR,RPE65,MFRP,CTRP5,CFH,C3,C2B,APOE,APOB,mTOR,FOXO,AMPK,SIRT1-6,HTRP1,ABCA4,TIMP3,VEGFA,CFI,TLR3,TLR4,APP,CD46,BACE1,ELOLV4,ADAM10,CD55,CD59和ARMS2。
1.MHC单倍型匹配
主要组织相容性复合体是同种异体器官移植物的免疫排斥的主要原因。有三种主要的I类MHC单倍型(A，B和C)和三种主要的MHC II类单倍型(DR，DP和DQ)。HLA基因座具有高度多态性，并且分布在第6号染色体上的4Mb上。在该区域内对HLA基因进行单倍型分型的能力在临床上很重要，因为该区域与自身免疫和感染性疾病相关并且供体和受体之间HLA单倍型的相容性可以影响移植的临床结果。对应于MHC I类的HLA从细胞内呈递肽，对应于MHCII类的HLA从细胞外呈递抗原至T淋巴细胞。MHC单倍型在移植物和宿主之间的不相容性引发针对移植物的免疫应答并导致其排斥。因此，可以用免疫抑制剂治疗患者以防止排斥反应。HLA匹配的干细胞系可以克服免疫排斥的风险。
由于HLA在移植中的重要性，HLA基因座通常通过血清学和PCR分型以鉴定有利的供体-受体对。使用利用纯化的T或B淋巴细胞的补体介导的淋巴细胞毒性试验可以完成HLAI类和II类抗原的血清学检测。该程序主要用于匹配HLA-A和-B基因座。基于分子的组织分型通常比血清学检测更准确。低分辨率分子方法诸如SSOP(序列特异性寡核苷酸探针)方法(其中PCR产物针对一系列寡核苷酸探针进行测试)可用于鉴定HLA抗原，并且目前这些方法是用于II类-HLA分型的最常用方法。高分辨率技术如SSP(序列特异性引物)(其使用等位基因特异性引物进行PCR扩增)方法可鉴定特定的MHC等位基因。
如果供体细胞是HLA纯合的，即含有每个抗原呈递蛋白质的相同的等位基因，则供体和受体之间的MHC相容性显著增加。大多数个体对于MHC I类和II类基因是杂合的，但是某些个体对于这些基因是纯合的。这些纯合个体可以作为超级供体，由其细胞产生的移植物可以移植到所有对该单倍型纯合或杂合的个体中。此外，如果纯合供体细胞具有群体中高频率的单倍型，则这些细胞可用于大量个体的移植治疗。
因此，可以从待治疗的受试者的体细胞或具有与患者的HLA类型相同或基本相同的HLA类型的另一个受试者产生iPSC。在一种情况下，供体的主要HLA(例如HLA-A，HLA-B和HLA-DR的三个主要基因座)与受体的主要HLA相同。在一些情况下，体细胞供体可能是超级供体；因此，来源于MHC纯合超级供体的iPSC可用于产生RPE细胞。因此，来自超级供体的iPSC可以被移植到该单倍型纯合或杂合的受试者中。例如，iPSC可以在两个HLA等位基因例如HLA-A和HLA-B上是纯合的。如此，由超级供体产生的iPSC可用于本文所公开的方法中，以产生可潜在地“匹配”大量潜在接受者的RPE细胞。
2.游离型载体
在某些方面，重编程因子从包含在一种或多种外源游离型遗传元件中的表达盒表达(参见美国专利公开2010/0003757，通过引用并入本文)。因此，iPSC可以基本上不含外源遗传元件，例如不含逆转录病毒或慢病毒载体元件。这些iPSC通过使用染色体外复制载体(即游离型载体)来制备，所述载体是能够游离地复制以使iPSC基本上不含外源载体或病毒元件的载体(参见美国专利号8,546,140，通过引用并入本文；Yu等人，2009)。许多DNA病毒，例如腺病毒，猿猴空泡病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒(BPV)或出芽酵母ARS(自主复制序列)包含性质粒在哺乳动物细胞中在染色体外或游离地复制。这些游离型质粒内在地没有与整合载体相关的所有这些缺点(Bode等人，2001)。例如，如上定义的基于淋巴疱疹病毒的包括Epstein Barr病毒(EBV)可以在染色体外复制并帮助将重编程基因递送到体细胞。有用的EBV元件是OriP和EBNA-1，或其变体或功能等同物。游离型载体的另一个优点是外源性元件在被引入细胞后会随着时间流逝而丢失，导致自我维持的iPSC基本上不含这些元件。
其他染色体外载体包括其他基于淋巴疱疹病毒的载体。淋巴疱疹病毒是在淋巴母细胞(例如人B淋巴母细胞)中复制并成为其部分天然生命周期的质粒的疱疹病毒。单纯疱疹病毒(HSV)不是“淋巴营养性”疱疹病毒。示例性淋巴疱疹病毒包括但不限于EBV，卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)；松鼠猴疱疹病毒(HS)和马立克氏病病毒(MDV)。还设想了基于游离体的载体的其他来源，如酵母ARS，腺病毒，SV40或BPV。
C.体细胞核转移
多能干细胞可以通过体细胞核转移的方法制备。体细胞核移植涉及将供体细胞核转移至无纺锤体卵母细胞中。在一种方法中，通过电融合将来自恒河猴的皮肤成纤维细胞的供体成纤维细胞核引入无纺锤体的成熟中期II恒河猕猴卵母细胞的细胞质中(Byrne等人，2007)。融合的卵母细胞通过暴露于伊屋诺霉素而被激活，然后孵育直至胚泡阶段。然后培养选定胚泡的内细胞团以产生胚胎干细胞系。胚胎干细胞系显示正常的ES细胞形态，表达各种ES细胞标记，并在体外和体内分化成多种细胞类型。
III.视网膜色素上皮细胞
在本文公开的方法中产生了RPE细胞。视网膜中对光直接敏感的细胞是感光器细胞。感光器是视网膜外部的感光神经元，其可以是杆状或锥状的。在光转导的过程中，感光器细胞将由透镜聚焦的入射光能量转换为电信号，然后通过视神经送入大脑。脊椎动物有两种类型的感光器细胞，包括锥和杆细胞。锥细胞适用于检测细节、中央和色彩视觉，并在明亮的光线下正常工作。杆细胞负责周边和昏暗的光线视觉。来自杆和锥细胞的神经信号经过视网膜的其他神经元处理。
视网膜色素上皮充当血流和视网膜之间的屏障并且在维持视觉功能中与感光器紧密相互作用。视网膜色素上皮细胞由单层六角形细胞(其由吸收到达视网膜的光能的黑色素颗粒紧密堆叠)组成。特化的RPE细胞的主要功能包括：将营养物质如葡萄糖，视黄醇和脂肪酸从血液转运至感光器；水、代谢终产物和离子从视网膜下腔转运到血液；吸收光线并防止光氧化；全反式视黄醇重新异构化为11-顺式-视黄醛；棚感光器(shedphotoreceptor)膜的吞噬作用；和为视网膜的结构完整性分泌各种必需因子。
视网膜色素上皮细胞表达标记，例如细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，RPE65，贝斯特卵黄状黄斑营养不良基因(VMD2)和色素上皮细胞衍生因子(PEDF)。视网膜色素上皮功能障碍与许多改变视力的病症有关，例如视网膜色素上皮脱离，发育异常，萎缩，视网膜病，视网膜色素变性，黄斑营养不良或变性。
视网膜色素上皮(RPE)细胞可基于其色素沉着、上皮形态和顶端-基底极性来表征。分化的RPE细胞可以通过它们的鹅卵石形态和色素的初始外观被视觉识别。另外，分化的RPE细胞具有穿过单层的跨上皮电阻/TER和跨上皮电位/TEP(TER>100Ω.cm2；TEP>2mV)，从顶端到基底侧输送流体和CO2，和调节细胞因子的极化分泌。
RPE细胞表达几种蛋白质，其可以用作标记用于通过使用诸如免疫细胞化学、Western印迹分析、流式细胞术和酶联免疫测定(ELISA)的方法进行检测。例如，RPE特异性标记可包括：细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，小眼相关转录因子(MITF)，酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP-1)，视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)，前黑素体蛋白(PMEL17)，bestrophin 1(BEST1)和c-mer原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)。RPE细胞不表达(在任何可检测的水平上)胚胎干细胞标记Oct-4，nanog或Rex-2。具体而言，当通过定量RT-PCR评估时，这些基因在ES细胞或iPSC细胞中的表达是在RPE细胞中的表达的约100-1000倍。
可以例如通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹分析或点印迹杂交分析在标准扩增方法中使用序列特异性引物利用公共可用的序列数据
Figure BDA0001631938340000221
在mRNA水平上检测RPE细胞标记。如果蛋白质或mRNA水平是对照细胞如未分化的多能干细胞或其他不相关细胞类型的至少或约2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-或9倍，并且更特别地高于10-,20-,30,40-,50-倍或更高，则在蛋白质或mRNA水平检测到的组织特异性标记的表达被认为是阳性的。
RPE细胞的功能障碍、损伤和丧失是许多眼病和病症(包括年龄相关性黄斑变性(AMD)，遗传性黄斑变性(包括贝斯特病)和视网膜色素变性)的因素。对这些疾病的潜在治疗是将RPE细胞移植到需要这种治疗的人的视网膜中。据推测，通过移植补充RPE细胞可以延迟、阻止或逆转退化，改善视网膜功能并防止由这种情况引起的失明。然而，直接从人供体和胚胎获得RPE细胞是一个挑战。
A.从PSC的胚状体衍生RPE细胞
使用众所周知的重编程因子重编程的iPSC可产生神经元谱系的眼细胞，包括RPE细胞(Hirami等人，2009)。以全文引用的方式并入本文的PCT公开号2014/121077公开了这样的方法，其中用Wnt和Nodal拮抗剂在悬浮培养中处理由iPSC产生的胚状体(EB)以诱导视网膜祖细胞标记的表达。该出版物公开了其中通过将iPSC的EB分化成高度富集RPE细胞的培养物的过程来从iPSC衍生RPE细胞的方法。例如，通过添加rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制剂从iPSC产生胚状体并在包含两种WNT途径抑制剂和Nodal途径抑制剂的第一培养基中培养。此外，将EB铺板在第二培养基中的MATRIGELTM涂布的组织培养物上，所述第二培养基不包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，包含Nodal途径抑制剂，包含约20ng至约90ng的头蛋白，并且包含约1至约5％的敲除血清替代物以形成分化的RPE细胞。分化的RPE细胞在包含ACTIVIN和WNT3a的第三培养基中培养。然后将RPE细胞在包含约5％胎儿血清、典型WNT抑制剂、非典型WNT抑制剂和Sonic Hedgehog和FGF途径抑制剂的RPE培养基中培养以产生人RPE细胞。
使用EB来产生分化的细胞类型存在几个缺点。例如，随效率变化，EB的产生是不一致且不可重复的过程。由iPSC或ES细胞产生的EB的大小和形状不均匀，并且EBS的产生还涉及限速离心处理。本公开内容提供了允许大规模生产独立于EB的临床、研究或治疗应用所需的iPSC-或ES-衍生细胞的方法。
B.从基本上单细胞PSC衍生RPE细胞
在一些实施方案中，提供了从多能干细胞(PSC)如人iPSC的基本上单个细胞的悬浮液产生RPE细胞的方法。在一些实施方案中，将PSC培养至汇合前以防止任何细胞聚集体。在某些方面，通过与如TRYPSINTM或TRYPLETM例示的细胞解离酶孵育来解离PSC。通过移液也可将PSC解离成基本上单个细胞的悬浮液。另外，可以将Blebbistatin(例如约2.5μM)加入培养基中以在解离成单细胞后增加PSC存活，同时细胞不粘附于培养容器。替代Blebbistatin的ROCK抑制剂可以替代地用于在解离成单细胞后增加PSC存活。
为了有效区分RPE细胞与单细胞PSC，输入密度的准确计数可以增加RPE分化效率。因此，PSC的单细胞悬浮液通常在接种之前计数。例如，通过血细胞计数器或自动化细胞计数器(例如
Figure BDA0001631938340000232
或TC20)计数PSC的单细胞悬浮液。可将细胞稀释至约10,000至约500,000个细胞/mL，约50,000至约200,000个细胞/mL或约75,000至约150,000个细胞/mL的细胞密度。在非限制性实例中，在完全确定的培养基如ESSENTIAL 8TM(E8TM)培养基中将PSC的单细胞悬浮液稀释至约100,000个细胞/mL的密度。
一旦在已知的细胞密度下获得了PSC的单细胞悬液，通常将细胞接种在合适的培养容器中，例如组织培养板如烧瓶，6孔、24孔或96孔板。用于培养细胞的培养容器可以包括但不限于：烧瓶，用于组织培养的烧瓶，皿，培养皿，用于组织培养的皿，多皿(multi dish)，微板，微孔板，多板(multi plate)，多孔板，微型载玻片，腔室载玻片，管，托盘，
Figure BDA0001631938340000231
腔室，培养袋和滚瓶，只要其能够培养其中的干细胞。取决于培养的需要，细胞可以以至少或约0.2,0.5,1,2,5,10,20,30,40,50ml,100ml,150ml,200ml,250ml,300ml,350ml,400ml,450ml,500ml,550ml,600ml,800ml,1000ml,1500ml或其中可衍生的任何范围的体积培养。在某个实施方案中，培养容器可以是生物反应器，其可以指支持生物活性环境以使得细胞可以繁殖的任何离体装置或系统。生物反应器的体积可以为至少或约2,4,5,6,8,10,15,20,25,50,75,100,150,200,500升，1,2,4,6,8,10,15立方米或其中可衍生的任何范围。
在某些方面，PSC诸如iPSC以适于有效分化的细胞密度铺板。通常，细胞以约1,000至约75,000个细胞/cm2，例如约5,000至约40,000个细胞/cm2的细胞密度铺板。在6孔板中，细胞可以以每孔约50,000至约400,000个细胞的细胞密度接种。在示例性方法中，细胞以每孔约100,000，约150,00，约200,000，约250,000，约300,000或约350,000个细胞的细胞密度接种，例如每孔约200,00个细胞。
通常将PSC如iPSC培养在用一种或多种细胞粘附蛋白包被的培养板上以促进细胞粘附，同时维持细胞活力。例如，优选的细胞粘附蛋白包括细胞外基质蛋白，如玻连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白和/或纤连蛋白，其可用于包被培养表面，作为为多能细胞生长提供固体支持物的手段。术语“细胞外基质”在本领域中是公知的。它的组分包括一种或多种以下蛋白质：纤连蛋白，层粘连蛋白，玻连蛋白，腱生蛋白，巢蛋白，血小板反应蛋白，弹性蛋白，明胶，胶原蛋白，原纤蛋白，分层蛋白，锚蛋白，软骨粘连蛋白，连接蛋白，骨涎蛋白，骨钙蛋白，骨桥蛋白，epinectin，透明质粘连蛋白，粗纤维调节素，表皮整联配体蛋白和缰蛋白。在示例性方法中，PSC在涂有玻连蛋白或纤连蛋白的培养板上生长。在一些实施方案中，细胞粘附蛋白是人蛋白质。
细胞外基质(ECM)蛋白可以是天然来源的并且从人或动物组织纯化，或者，ECM蛋白可以是遗传改造的重组蛋白或天然合成的。ECM蛋白可以是完整的蛋白质或以天然或工程化的肽片段的形式。可用于细胞培养基质的ECM蛋白的实例包括层粘连蛋白，胶原蛋白I，胶原IV，纤连蛋白和玻连蛋白。在一些实施方案中，基质组合物包含合成产生的纤连蛋白或重组纤连蛋白的肽片段。在一些实施方案中，基质组合物是无异源的。例如，在培养人细胞的无异源基质中，可以使用人源的基质组分，其中可以排除任何非人动物组分。
在一些方面，基质组合物中的总蛋白质浓度可以是约1ng/mL至约1mg/mL。在一些优选的实施方案中，基质组合物中的总蛋白质浓度为约1μg/mL至约300μg/mL。在更优选的实施方案中，基质组合物中的总蛋白质浓度为约5μg/mL至约200μg/mL。
诸如RPE细胞或PSC的细胞可以与支持每种特定细胞群体生长所必需的营养素一起培养。通常，细胞在包括碳源、氮源和缓冲液的生长培养基中培养以保持pH。培养基还可以含有脂肪酸或脂质，氨基酸(如非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化物质，丙酮酸，缓冲剂和无机盐。示例性的生长培养基包含补充有各种营养素(例如非必需氨基酸和维生素)的最小必需培养基，例如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)或ESSENTIAL 8TM(E8TM)培养基以增强干细胞生长。最小基本培养基的实例包括但不限于最小必需培养基Eagle(MEM)Alpha培养基，Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，RPMI-1640培养基，199培养基和F12培养基。另外，最小必需培养基可补充添加剂，如马、小牛或胎牛血清。或者，培养基可以不含血清。在其他情况下，生长培养基可以含有“敲除血清替代物”，在本文中是指经过优化以在培养物中生长和维持未分化细胞例如干细胞的无血清制剂。例如，在美国专利申请No.2002/0076747中公开了KNOCKOUTTM血清替代物，该申请通过引用并入本文。优选地，PSC在完全确定的和无饲养层的培养基中培养。
因此，单细胞PSC通常在铺板后在完全确定的培养基中培养。在某些方面，接种约18-24小时后，吸出培养基并将新鲜培养基如E8TM培养基加入到培养物中。在某些方面，将单细胞PSC在完全确定的培养基中培养约1天，2天或3天。优选地，在进行分化过程之前，将单细胞PSC在完全确定的培养基中培养约2天。
在一些实施方案中，培养基可以含有或可以不含有血清的任何替代物。血清的替代物可以包括适当含有白蛋白的材料(例如富含脂质的白蛋白，白蛋白替代物如重组白蛋白，植物淀粉，葡聚糖和蛋白质水解物)，转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)，脂肪酸，胰岛素，胶原前体，微量元素，2-巯基乙醇，3'-硫代甘油或其等同物。例如，血清的替代物可以通过国际公开号WO 98/30679中公开的方法制备。或者，可以更方便地使用任何市售材料。市售材料包括KNOCKOUTTM血清替代物(KSR)，化学确定的浓缩脂质(Gibco)和GLUTAMAXTM(Gibco)。
其他培养条件可以被适当地限定。例如，培养温度可以是约30至40℃，例如至少或约31,32,33,34,35,36,37,38,39℃，但是不特定地限制于此。在一个实施方案中，细胞在37℃培养。CO2浓度可以是约1至10％，例如约2至5％，或者其中可衍生的任何范围。氧张力可以是至少，至多，或约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20％或其中可衍生的任何范围。
a.分化培养基
视网膜诱导培养基
在单细胞PSC粘附于培养板之后，优选将细胞在视网膜诱导培养基中培养以开始分化为视网膜谱系细胞的过程。视网膜诱导培养基(RIM)包含WNT途径抑制剂并可导致PSC向视网膜谱系细胞分化。RIM另外包含TGFβ途径抑制剂和BMP途径抑制剂。表3中示出了一个示例性的RIM培养基。
RIM可以包括约1:1比例的DMEM和F12。在示例性方法中，RIM中包含WNT途径抑制剂，例如CKI-7，包含BMP途径抑制剂如LDN193189，并包含TGFβ途径抑制剂，如SB431542。例如，RIM包含约5nM至约50nM，例如约10nM的LDN193189，约0.1μM至约5μM，例如约0.5μM的CKI-7和约0.5μM至约10μM，例如约1μM的SB431542。另外，RIM可包含敲除血清替代物，例如约1％至约5％的MEM非必需氨基酸(NEAA)，丙酮酸钠，N-2补充剂，B-27补充剂，抗坏血酸和胰岛素生长因子1(IGF1)。优选地，IGF1是无动物IGF1(AF-IGF1)并且以约0.1ng/mL至约10ng/mL，诸如约1ng/mL包含在RIM中。培养基例如每天吸出，并换上新鲜的RIM。通常将细胞在RIM中培养约1至约5天，例如约1、2、3、4或5天，诸如约2天以产生视网膜谱系细胞。
视网膜分化培养基
然后可以在视网膜分化培养基(RDM)中培养视网膜谱系细胞以进一步分化。RDM包含WNT途径抑制剂，BMP途径抑制剂，TGFβ途径抑制剂和MEK抑制剂。在一个实施方案中，RDM包含WNT途径抑制剂例如CKI-7，BMP途径抑制剂例如LDN193189，TGFβ途径抑制剂例如SB431542，和MEK抑制剂例如PD0325901。或者，RDM可以包含WNT途径抑制剂，BMP途径抑制剂，TGFβ途径抑制剂和bFGF抑制剂。通常，与RIM相比，RDM中Wnt途径抑制剂，BMP途径抑制剂和TGFβ途径抑制剂的浓度更高，例如是RIM中浓度的约9至约11倍，例如约10倍。在示例性方法中，RDM包含约50nM至约200nM，诸如约100nM的LDN193189，约1μM至约10μM，诸如约5μM的CKI-7，约1μM至约50μM，例如约10μM的SB431542，和约0.1μM至约10μM，诸如约1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM或9μM的PD0325901。表3中示出了一个示例性RDM培养基。
通常，RDM包含约1:1比例的DMEM和F12，敲除血清替代物(例如约1％至约5％，诸如约1.5％)，MEM NEAA，丙酮酸钠，N-2补充剂，B-27补充剂，抗坏血酸和IGF1(例如，约1ng/mL至约50ng/mL，如约10ng/mL)。在特定的方法中，吸出前一天的培养基后每天给予细胞新鲜的RDM。通常，将细胞在RDM中培养约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或16天，诸如约7天以衍生分化的视网膜细胞。
视网膜培养基
接下来，通过在视网膜培养基(RM)中培养细胞，可以进一步使分化的视网膜细胞分化。视网膜培养基包含激活素A并且可以另外包含烟酰胺。RM可包含约50至约200ng/mL，例如约100ng/mL的激活素A和约1mM至约50mM，例如约10mM的烟酰胺。或者，RM可以包含其它TGF-β途径活化剂，例如GDF1和/或WNT途径活化剂，例如WAY-316606，IQ1，QS11，SB-216763，BIO(6-溴靛玉红-3'-肟)或2-氨基-4-[3,4-(亚甲二氧基)苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。或者，RM可以另外包含WNT3a。表3中示出了一个示例性的RM培养基。
RM可包含约1:1比例的DMEM和F12，约1％至约5％例如约1.5％的敲除血清替代物，MEM非必需氨基酸(NEAA)，丙酮酸钠，N-2补充剂，B-27补充剂和抗坏血酸。培养基可以以室温RM每天更换。通常将细胞在RM中培养约8,9,10,11,12,13,14,15,16或17天，如约10天以衍生分化的RPE细胞。
RPE成熟培养基
为了进一步分化RPE细胞，优选将细胞在RPE成熟培养基(RPE-MM)中培养。示例性RPE-MM培养基显示于表3中。RPE成熟培养基可包含约100μg/mL至约300μg/mL，例如约250μg/mL牛磺酸，约10μg/L至约30μg/L，例如约20μg/L的氢化可的松和约0.001μg/L至约0.1μg/L，例如约0.013μg/L的三碘甲状腺氨酸。此外，RPE-MM可以包含MEMα，N-2补充剂，MEM非必需氨基酸(NEAA)和丙酮酸钠以及胎牛血清(例如约0.5％至约10％，例如约1％至约5％)。培养基可以每隔一天使用室温RPE-MM更换。通常将细胞在RPE-MM中培养约5至约10天，如约5天。然后可以将细胞例如用细胞解离酶解离，再接种并且培养另外的时间段，例如另外约5至约30天，例如约15至20天，以进一步分化成RPE细胞。在进一步的实施方案中，RPE-MM不包括WNT途径抑制剂。RPE细胞可以在此阶段冷冻保存。
b.RPE细胞的成熟
然后可以在RPE-MM中培养RPE细胞持续一段时间以使其成熟。在一些实施方案中，使RPE细胞在诸如6孔，12孔，24孔或10cm平板的孔中生长。可以将RPE细胞维持在RPE培养基中约4至约10周，例如约6至8周，例如6、7或8周。在用于RPE细胞的持续成熟的示例性方法中，细胞可以在细胞解离的酶例如TRYPLETM中解离，并且在可降解的支架组件上例如在专门的SNAPWELLTM设计中在具有MEK抑制剂如PD0325901的RPE-MM中重新接种约1至2周。或者，RPE-MM可以包含bFGF抑制剂而不是MEK抑制剂。在PCT公开号WO2014/121077中教导并描述了用于在可降解支架上培养RPE细胞的方法，其通过引用整体并入本文。简而言之，此方法的主要组分是
Figure BDA0001631938340000291
SNAPWELLTM板，生物惰性的0-环和生物可降解支架。SNAPWELLTM板为生物可降解支架提供结构和平台。创建顶端和基底侧的微孔膜非常适合为支架提供支撑，并隔离细胞的极化层的不同侧面。SNAPWELLTM插入物分离膜的能力允许将插入物的支撑环用作支架的锚。所得的分化的、极化的和汇合的功能性RPE细胞单层可在此阶段冷冻保存(例如，在无异源CS10培养基中)
在一些实施方案中，可通过在具有促进RPE成熟的其他化学品或小分子的RPE-MM中继续培养，将成熟RPE细胞进一步发育成功能性RPE细胞单层，其表现为完整RPE组织。例如，这些小分子是初级纤毛诱导剂，如前列腺素E2(PGE2)或阿非迪霉素。PGE2可以以约25μM至约250μM，例如约50μM至约100μM的浓度添加至培养基。或者，RPE-MM可以包含典型的WNT途径抑制剂。典型的WNT途径抑制剂是N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙酰胺(IWP2)或4-(1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4,7-亚甲基-2H-异吲哚-2-基)-N-8-喹啉基-苯甲酰胺(endo-IWR1)。细胞可以在该培养基中再培养一段时间，例如另外约1周至约5周，如约2至4周，以获得成熟和功能性RPE细胞单层。因此，本文公开的方法从多能细胞的单细胞悬浮液提供成熟的RPE细胞，其可以在临床应用中一致地大规模再生。
c.RPE细胞的冷冻保存
通过本文公开的方法产生的视网膜色素上皮细胞可以冷冻保存，参见例如PCT公开号2012/149484A2，其通过引用并入本文。细胞可以用或不用基底进行冷冻保存。在几个实施方案中，储存温度为约-50℃至约-60℃，约-60℃至约-70℃，约-70℃至约-80℃，约-80℃至约-90℃，约-90℃至约-100℃，以及其重叠范围。在一些实施方案中，较低温度用于冷冻保存的细胞的储存(例如维持)。在几个实施方案中，使用液氮(或其他类似的液体冷却剂)来储存细胞。在进一步的实施方案中，细胞储存大于约6小时。在另外的实施方案中，细胞储存约72小时。在几个实施方案中，细胞储存48小时至约一周。在其他实施方案中，细胞储存约1,2,3,4,5,6,7或8周。在进一步的实施方案中，细胞储存1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月。细胞也可以储存更长的时间。可以将细胞分开冷冻保存或冷冻保存在基底上，例如本文公开的任何基底。
在一些实施方案中，可以使用额外的冷冻保护剂。例如，细胞可以在包含一种或多种冷冻保护剂例如DM80、血清白蛋白例如人或牛血清白蛋白的冷冻保存溶液中冷冻保存。在某些实施方案中，溶液包含约1％，约1.5％，约2％，约2.5％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％或约10％的DMSO。在其它实施方案中，溶液包含约1％至约3％，约2％至约4％，约3％至约5％，约4％至约6％，约5％至约7％，约6％至约8％，约7％至约9％或约8％至约10％的二甲基亚砜(DMSO)或白蛋白。在具体实施方案中，溶液包含2.5％DMSO。在另一个具体实施方案中，溶液包含10％DMSO。
例如，可以在冷冻保存过程中以约1℃分钟冷却细胞。在一些实施方案中，冷冻保存温度为约-80℃至约-180℃，或约-125℃至约-140℃。在一些实施方案中，将细胞冷却至4℃，然后以约1℃/分钟冷却。冷冻保存的细胞可以在解冻使用前转移到液氮的气相中。在一些实施方式中，例如，一旦细胞达到约-80℃，它们被转移到液氮储存区域。冷冻保存也可以使用控制速率的冷冻机完成。可以将冷冻保存的细胞解冻，例如在约25℃至约40℃的温度下，通常在约37℃的温度下。
d.抑制剂
WNT途径抑制剂
WNT是一种高度保守的分泌的信号传导分子家族，其调节细胞与细胞的相互作用并且与果蝇区段极性基因wingless相关。在人中，WNT基因家族编码38至43kDa的富含半胱氨酸的糖蛋白。WNT蛋白具有疏水性信号序列，保守的天冬酰胺连接的寡糖共有序列(参见例如Shimizu等人，Cell Growth Differ 8：1349-1358(1997))和22个保守的半胱氨酸残基。由于其促进细胞质β-连环蛋白稳定的能力，WNT蛋白可以充当转录激活剂并抑制细胞凋亡。已经证明特定WNT蛋白的过表达与某些癌症有关。
本文中的WNT抑制剂指一般性的WNT抑制剂。因此，WNT抑制剂是指包括Wnt1，Wnt2，Wnt2b，Wnt3，Wnt4，Wnt5A，Wnt6，Wnt7A，Wnt7B，Wnt8A，Wnt9A，Wnt10a，Wnt11和Wnt16的WNT家族蛋白成员的任何抑制剂。本发明方法的某些实施方案涉及分化培养基中的WNT抑制剂。本领域已知的合适的WNT抑制剂的实例包括N-(2-氨基乙基)-5-氯异喹啉-8-磺酰胺二盐酸盐(CKI-7)，N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙酰胺(IWP2)，N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-3-(2-甲氧基苯基)-4-氧代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫代]-乙酰胺(IWP4)，2-苯氧基苯甲酸[(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]酰肼(PNU 74654)2,4-二氨基-喹唑啉，槲皮素，3,5,7,8-四氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮(XAV939)，2,5-二氯-N-(2-甲基-4-硝基苯基)苯磺酰胺(FH 535)，N-[4-[2-乙基-4-(3-甲基苯基)-5-噻唑基]-2-吡啶基]苯甲酰胺(TAK 715)，Dickkopf相关蛋白1(DKK1)和分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)。此外，WNT抑制剂可以包括WNT的抗体，WNT的显性阴性变体和抑制WNT表达的siRNA和反义核酸。使用RNA介导的干扰(RNAi)也可以实现WNT的抑制。
BMP途径抑制剂
骨形态发生蛋白(BMP)是属于转化生长因子β(TGFβ)超家族的多功能生长因子。BMP被认为构成一组关键的形态发生信号，其协调整个身体的架构。BMP信号在生理学中的重要功能由病理过程中失调的BMP信号传导的多种作用突出显示。
BMP途径抑制剂通常包括一般性的BMP信号传导抑制剂或对BMP1，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5，BMP6，BMP7，BMP8a，BMP8b，BMP10或BMP15特异性的抑制剂。示例性BMP抑制剂包括4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉盐酸盐(LDN193189)，6-[4-[2-1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶二盐酸盐(Dorsomorphin)，4-[6-[4-[1-甲基乙氧基]苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉(DMH1)，4-[6-[4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉(DMH-2)和5-[6-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉(ML 347)。
TGFβ途径抑制剂
转化生长因子β(TGFβ)是控制大多数细胞中增殖、细胞分化和其他功能的分泌蛋白。它是一种在免疫、癌症、支气管哮喘、肺纤维化、心脏病、糖尿病和多发性硬化中起作用的细胞因子。TGF-β以至少三种异构体存在，称为TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。TGF-β家族是被称为转化生长因子β超家族的蛋白超家族的一部分，其包括抑制素，激活素，抗苗勒管激素，骨形态发生蛋白，decapentaplegic和Vg-1。
一般而言，TGFβ途径抑制剂可包括任何TGFβ信号传导的抑制剂。例如，TGFβ途径抑制剂是4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)，6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉(SB525334)，2-(5-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐水合物(SB-505124)，4-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物，4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物，左右测定因子(Lefty)，3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(A 83-01)，4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二噁英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(D 4476)，4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺(GW 788388)，4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉(LY364847)，4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]苯基]-1H-吡唑-1-乙醇(R 268712)或2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-二氮杂萘(RepSox)。
MEK抑制剂
MEK抑制剂是抑制促分裂原活化蛋白激酶MEK1或MEK2的化学物质或药物。它们可以用来影响MAPK/ERK途径。例如，MEK抑制剂包括N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]苯甲酰胺(PD0325901)，N-[3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘苯胺基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基]乙酰胺(GSK1120212)，6-(4-溴-2-氟苯胺基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺(MEK162)，N-[3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺基)-6-甲氧基苯基]-1-(2,3-二羟基丙基)环丙烷-1-磺酰胺(RDEA119)和6-(4-溴-2-氯苯胺基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺(AZD6244)。
bFGF抑制剂
碱性成纤维细胞生长因子(也称为bFGF，FGF2或FGF-β)是成纤维细胞生长因子家族的成员。bFGF存在于基底膜和血管的内皮下细胞外基质中。另外，bFGF是人ESC培养基的常见组分，在其中其是细胞保持未分化状态所必需的。
本文中的bFGF抑制剂指一般性的bFGF抑制剂。例如，bFGF抑制剂包括但不限于N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)脲(PD173074)，2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(PD98059)，1-叔丁基-3-[6-(2,6-二氯苯基)-2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]脲(PD161570)，6-(2,6-二氯苯基)-2-[[4-[2-(二乙氨基)乙氧基]苯基]氨基]-8-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮二盐酸盐(PD166285)，N-[2-氨基-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲(PD166866)和MK-2206。
IV.视网膜色素上皮细胞的用途
某些方面提供了产生可用于许多重要研究、开发和商业目的的RPE或富含RPE的细胞群体的方法。
在一些方面，本文公开的方法导致至少或约106,107,108,5x108,109,1010个细胞(或其中可衍生的任何范围)的细胞群体包含至少或约90％(例如，至少或约90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或其中可衍生的任何范围)的RPE细胞。
在某些方面，用于本发明方法的起始细胞可以包括使用至少或约104,105,106,107,108,109,1010,1011,1012,1013个细胞或其中可衍生的任何范围。起始细胞群体可具有至少或约10,101,102,103,104,105,106,107,108个细胞/ml或其中可衍生的任何范围的接种密度。
通过本文公开的方法产生的RPE细胞可以用于本领域目前已知的RPE细胞的任何方法和应用。例如，可以提供评估化合物的方法，包括测定化合物对RPE细胞的药理学或毒理学性质。还可以提供评估化合物对RPE细胞的作用的方法，其包括：a)使本文提供的RPE细胞与化合物接触；和b)测定化合物对RPE细胞的作用。
A.测试化合物筛选
RPE细胞可以商业用于筛选影响这些细胞及其各种子代的特征的因子(如溶剂，小分子药物，肽，寡核苷酸)或环境条件(如培养条件或操作)。例如，测试化合物可以是化学化合物，小分子，多肽，生长因子，细胞因子或其他生物因子。
在一个实施方案中，方法包括使RPE细胞与测试药剂接触并测定测试药剂是否调节群体内RPE细胞的活性或功能。在一些应用中，筛选试验用于鉴定调节RPE细胞增殖或改变RPE细胞分化的试剂。筛选试验可以在体外或体内进行。筛选和鉴定眼剂或RPE剂的方法包括适用于高通量筛选的那些。例如，可以将RPE细胞定位或放置在培养皿，烧瓶，滚瓶或培养板(例如，单个多孔培养皿或皿如8、16、32、64,96、384和1536孔多孔培养板或皿)，任选地在确定的位置，用于鉴定潜在的治疗性分子。可筛选的文库包括例如小分子文库，siRNA文库和腺病毒转染载体文库。
其他筛选应用涉及药物化合物对视网膜组织维持或修复的影响的测试。因为化合物被设计为对细胞具有药理学作用，或者因为设计为具有其它效果的化合物可能对这种组织类型的细胞具有非预期的副作用，所以可以进行筛选。
B.治疗和移植
其他实施方案还可以提供RPE细胞用于增强对有需要的任何病症(包括视网膜变性或显著损伤)的眼组织维持和修复。
为了测定细胞组合物对治疗剂施用的适合性，可以首先在合适的动物模型中测试细胞。一方面，评估RPE细胞在体内存活和维持其表型的能力。将细胞组合物施用于免疫缺陷动物(例如，化学地或通过辐射导致免疫缺陷的裸鼠或动物)。生长一段时间后收获组织，并评估多能干细胞衍生细胞是否仍存在。
许多动物可用于测试RPE细胞组合物的适用性。例如，皇家外科医生大学(RCS)大鼠是众所周知的视网膜营养不良的模型(Lund等人，2006)。另外，可以通过移植(例如皮下或视网膜下)在免疫缺陷动物例如NOG小鼠中的基质胶中测定RPE细胞适合性和存活率(Kanemura等人，2014)。
本文所述的人RPE细胞或包含这些细胞的药物组合物可用于制造治疗有此需要的患者的病症的药物。RPE细胞可以预先冷冻保存。在某些方面，所公开的RPE细胞来源于iPSC，因此可用于为患有眼病的患者提供“个性化药物”。在一些实施方案中，可以对从患者获得的体细胞进行基因工程改造以矫正引起疾病的突变，分化成RPE并工程化以形成RPE组织。这种RPE组织可用于替代同一患者的内源性的退化的RPE。或者，可以使用由健康供体或HLA纯合“超级供体”产生的iPSC。可以用某些因子如色素上皮来源因子(PEDF)、转化生长因子(TGF)-β和/或视黄酸在体外处理RPE细胞以在体内产生抗炎和免疫抑制环境。
通过引入使用本文公开的方法获得的RPE细胞可以治疗或预防各种眼部病症。病症包括视网膜疾病或通常与视网膜功能障碍或降解、视网膜损伤和/或视网膜色素上皮丧失相关的病症。可以治疗的疾病包括但不限于视网膜退行性疾病，如Stargardt黄斑营养不良，视网膜色素变性，黄斑变性(如年龄相关性黄斑变性)，青光眼和糖尿病性视网膜病。其他病症包括Lebers先天性黑蒙，遗传性或获得性黄斑变性，贝斯特病，视网膜脱离，旋转肌萎缩，脉络膜血症，图形失养症，RPE的其他营养不良，以及由于光、激光、炎症、传染性、辐射、新生血管或创伤性损伤的任何一种引起的RPE和视网膜损伤。在某些实施方案中，提供了用于治疗或预防以视网膜变性为特征的病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的包含RPE细胞的组合物。这些方法可以包括选择具有一种或多种这些病症的受试者，并施用治疗有效量的足以治疗病症和/或改善病症症状的RPE细胞。RPE细胞可以以各种形式移植。例如，RPE细胞可以以细胞悬浮液的形式引入靶位点，或者以单层或组合的形式粘附到基质、细胞外基质或基底如生物可降解聚合物上。RPE细胞也可以与其他视网膜细胞一起移植(共移植)，例如与感光器一起移植。在一些实施方案中，RPE细胞由来自待治疗受试者的iPSC产生，因此是自体的。在其他实施方案中，RPE细胞由MHC匹配的供体产生。
在一些实施方案中，RPE细胞可用于适于接受再生医学的那些受试者的自体RPE移植物。可以将RPE细胞与其他视网膜细胞如感光器组合移植。通过所公开的方法产生的RPE细胞的移植可以通过本领域已知的各种技术来进行。例如，在美国专利号5,962,027和美国专利号6,045,791中描述了用于进行RPE移植的方法，其中的每一个专利通过引用整体并入本文。根据一个实施方案，通过玻璃体切割手术进行移植，随后通过小视网膜开口将细胞递送至视网膜下腔或通过直接注射进行移植。RPE细胞可以以细胞悬浮液的形式引入靶位点，粘附在基质如细胞外基质上或者提供在基底如生物可降解聚合物上。RPE细胞也可以与其他细胞一起移植(共移植)，例如具有感光器的视网膜细胞。因此，提供了包含通过本文公开的方法获得的RPE细胞的组合物。在一些实施方案中，这些RPE细胞包括可操作地连接至启动子和编码标记的核酸的酪氨酸酶增强子。在其他实施方案中，RPE细胞还包含与编码第二标记的核酸可操作连接的第二组成型启动子。
通过本文公开的方法产生RPE细胞的药物组合物。这些组合物可以包括至少约1×103个RPE细胞，约1×104个RPE细胞，约1×105个RPE细胞，约1×106个RPE细胞，约1×107个RPE细胞，约1×108个RPE细胞或约1×109个RPE细胞。在某些实施方案中，组合物是包含通过本文公开的方法产生的分化的RPE细胞的基本上纯(相对于非RPE细胞)的制剂。还提供了包含支架(例如聚合物载体和/或细胞外基质)和通过本文公开的方法产生的有效量的RPE细胞的组合物。例如，细胞被提供为单层细胞。基质材料通常是生理上可接受的并且适合用于体内应用。例如，生理上可接受的材料包括但不限于可吸收和/或不可吸收的固体基质材料，例如小肠粘膜下层(SIS)，交联或未交联的藻酸盐，水解胶体，泡沫，胶原凝胶，胶原海绵，聚乙醇酸(PGA)网，羊毛和生物粘合剂。
合适的聚合物载体还包括由合成或天然聚合物形成的多孔网状物或海绵以及聚合物溶液。例如，基质是聚合物网状物或海绵，或聚合物水凝胶。可以使用的天然聚合物包括蛋白质如胶原蛋白，白蛋白和纤维蛋白；和多糖如藻酸盐和透明质酸的聚合物。合成聚合物包括可生物降解和不可生物降解的聚合物。例如，生物可降解聚合物包括羟基酸的聚合物如聚乳酸(PLA)，聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-乙醇酸(PGLA)，聚原酸酯，聚酸酐，聚磷腈及其组合。不可生物降解的聚合物包括聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，乙烯乙酸乙烯酯和聚乙烯醇。
可以使用可以形成可延展的离子或共价交联的水凝胶的聚合物。水凝胶是当有机聚合物(天然或合成)通过共价键、离子键或氢键交联以形成三维开放晶格结构而形成的物质，所述三维开放晶格结构俘获水分子形成凝胶。可用于形成水凝胶的材料的实例包括离子交联的多糖如海藻酸盐，聚磷嗪和聚丙烯酸盐，或嵌段共聚物如PLURON1CSTM或TETRON1CSTM，通过温度或H交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。其他材料包括蛋白质如纤维蛋白，聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，透明质酸和胶原蛋白。
可任选地将药物组合物包装在合适的容器中，其具有用于期望目的的书面说明，例如重建RPE细胞功能以改善视网膜组织的疾病或异常。在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的RPE细胞可以被工程化以形成RPE，其可以用于代替有此需要的受试者的退化的RPE。
C.商业、治疗和研究目的的分配
在一些实施方案中，提供了试剂系统，其包括含有在制造、分配或使用过程中的任何时间存在的RPE富集细胞群体的一组细胞或细胞组合。细胞集合包含本文所述的细胞群体与未分化的多能干细胞或其他分化的细胞类型的任何组合，通常共有相同的基因组。每个细胞类型可以在相同或不同的时间，在同一工厂或不同地点，在共有商业关系的相同或不同实体的控制下包装在一起，或包装在不同容器中。
可任选将药物组合物包装在合适的容器中，并具有用于期望目的例如重建RPE细胞功能以改善眼部组织的疾病或损伤的书面说明。
V.试剂盒
在一些实施方案中，提供了可以包括例如用于产生RPE细胞的一种或多种培养基和组分的试剂盒。适当时，试剂系统可以以水性培养基或冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，组分可以放置在其中，并且优选合适地以等分式样放置在其中。当试剂盒中有多个组分时，试剂盒通常还会包含第二、第三或其他额外的容器，其他组分可以单独放入其中。然而，组分的各种组合可以包含在小瓶中。试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想，溶剂也可以在另一个容器装置中提供。这些试剂盒通常还包括一个装置，用于将试剂盒组分紧密封闭以用于商业销售。这样的容器可以包括注入或吹塑成型的塑料容器，其中保留了所需的小瓶。试剂盒还可以包含使用说明，例如印刷或电子格式，如数字格式。
VI.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在下面的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在所公开的具体实施方式中做出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1-起始多能干细胞群体的制备
RPE细胞的起始群体可以来源于多能干细胞，例如ES细胞和iPSC。在示例性方法中，RPE细胞来源于通过本领域已知的方法从体细胞重编程的人iPSC，例如美国专利号8,546,140，美国专利号8,741,648，美国专利号8,691,574，公开的美国专利申请号20090246875，公布的美国专利号8,278,104，公开的美国专利号9,005,967，美国专利号8,058,065，美国专利号8,129,187，PCT公开号WO 2007/069666A1，美国专利号8,183,038和美国专利号8,268,620，其通过引用并入本文。例如，核编程因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4被用于从体细胞产生多能干细胞。在另一个示例性方法中，使用核编程因子Oct4，Sox2，Nanog，Lin28，L-Myc和SV40大T抗原从体细胞产生多能干细胞。
使iPSC在完全确定的培养基如ESSENTIAL 8TM(E8TM)培养基中在没有小鼠或人饲养层的情况下在由玻连蛋白包被的平板上生长。将玻连蛋白在不含钙或镁的DPBS中以1:200稀释，培养板用玻连蛋白包被并在室温下孵育约1小时。iPSC在汇合前被分开并且不允许过度生长以防止不健康和/或分化的细胞(图1A)。
为了衍生RPE细胞，将iPSC解离成单细胞悬液以除去任何聚集体或胚状体。为了获得单细胞悬液，将细胞用DPBS洗涤并在37℃下在细胞解离酶如TRYPLETM中孵育约10分钟。然后通过用血清移液管移液将细胞分离，并将细胞悬液收集在锥形管中。如果细胞没有通过轻轻吸取被分离，培养物可以孵育更长时间，如2-3分钟。为了收集所有细胞，用室温E8TM培养基洗涤培养容器，然后将培养基加入含有细胞悬液的管中。此外，将Blebbistatin(例如2.5μM)加入到E8TM培养基中以在解离成单细胞后增加PSC存活，同时细胞未粘附于培养容器。为了收集细胞，将它们以400×g离心约5分钟，吸出上清液并将细胞重悬于适当体积的E8TM培养基中。
为了有效区分RPE细胞与单细胞iPSC，通过自动化细胞计数器如VICELLTM准确计数单细胞iPSC的输入密度，并在室温E8TM培养基中稀释至约1×105个细胞/mL的细胞悬液。一旦以已知的细胞密度获得了iPSC的单细胞悬液，将细胞涂布在合适的培养容器中，例如用玻连蛋白包被的6孔板。将细胞以每孔约200,000个细胞的细胞密度接种并置于37℃的潮湿培养箱中。约18-24小时后，吸出培养基并将新鲜的E8TM培养基加入培养物中。接种后将细胞在E8TM培养基中培养约2天以适当地粘附于平板上。
实施例2-将iPSC分化成RPE细胞
一旦如实施例1中那样以适当的细胞密度接种的单细胞iPSC被培养约2天，将它们在各种分化培养基中培养以衍生RPE细胞。在第3天，吸出E8TM培养基并加入室温视网膜诱导培养基(RIM)(例如表3)。简言之，RIM包含约1:1比例的DMEM和F12，敲除血清替代物，MEM非必需氨基酸(NEAA)，丙酮酸钠，N-2补充剂，B-27补充剂和抗坏血酸。此外，RIM包含WNT途径抑制剂，BMP途径抑制剂，TGFβ途径抑制剂和胰岛素生长因子1(IGF1)。每天吸出培养基并将新鲜的RIM加入细胞中。细胞在RIM中培养约2至4天。
接下来将细胞在视网膜分化培养基(RDM)中培养约7至14天。简言之，RDM(表2)包含约1:1比例的DMEM和F12，敲除血清替代物，MEM NEAA，丙酮酸钠，N-2补充剂，B-27补充剂和抗坏血酸。另外，RDM包含WNT途径抑制剂(例如CKI-7)，BMP途径抑制剂(例如LDN193189)，TGFβ途径抑制剂(例如SB431542)和MEK抑制剂(例如PD325901)。RDM中Wnt途径抑制剂、BMP途径抑制剂和TGFβ途径抑制剂的浓度是RIM中浓度的10倍。每天吸出培养基并将室温RDM加入细胞以产生分化的视网膜细胞。
为了衍生RPE细胞，随后将细胞在视网膜培养基(RM)中培养7至10天。RM包含约1:1比例的DMEM和F12，敲除血清替代物，MEM NEAA，丙酮酸钠，N-2补充剂，B-27补充剂和抗坏血酸。另外，RM包含烟酰胺和激活素A。每天用室温RM更换培养基，从而产生RPE细胞。
为了使RPE细胞成熟，将细胞在RPE成熟培养基(RPE-MM)中培养5-10天。RPE-MM(表2)包含MEMα，胎牛血清，N-2补充剂，MEM NEAA和丙酮酸钠。此外，RPE-MM含有牛磺酸，氢化可的松和3,3',5-三碘-L-甲状腺素(图1C)。使用室温RPE-MM每隔一天更换培养基。然后将细胞在细胞解离酶中解离并再接种在玻连蛋白包被的平板上。在此阶段，衍生的PRE细胞可以在无异源CS10培养基中冷冻保存。为了继续RPE成熟，将铺板的细胞再培养约15天。
实施例3-RPE细胞的成熟
为了实施例2中产生的RPE细胞的继续成熟，将细胞在细胞解离酶例如TRYPLETM中解离，并在具有MEK抑制剂如PD325901的RPE-MM中在专门的SNAPWELLTM设计中的可降解支架组件上再接种1-2周。这导致了功能性RPE细胞的分化的、极化的和汇合的单层(图1D)，其可以在无异源CS10培养基中在该阶段冷冻保存。
成熟的RPE细胞通过在具有另外的小分子如初级纤毛诱导剂如PGE 2或阿非迪霉素的RPE-MM中继续培养而进一步发育成功能性RPE细胞单层，其作为完整RPE组织发挥作用。不受理论束缚，这些初级纤毛诱导剂抑制经典的WNT途径，诱导细胞中的细胞周期退出，并诱导RPE单层中的顶-基极化。备选地，RPE成熟可以由典型的WNT途径抑制剂例如IWP2和endo-IWR1诱导，其也诱导RPE细胞中的细胞周期退出以促进RPE成熟。将细胞在该培养基中再培养2-3周以获得成熟和功能性RPE细胞单层。因此，本文公开的方法提供了来自多能细胞的成熟RPE细胞，其可以在临床应用中大规模、一致地再生。
实施例4-RPE细胞的冷冻保存
为了实施例2的分化的RPE细胞的冷冻保存，吸出培养基并用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤细胞两次。然后将细胞与细胞解离酶一起孵育，并将细胞悬液移液至锥形管中。将细胞离心，吸出上清液并将细胞重新悬浮于室温RPE-MM中。然后通过STERIFLIP细胞过滤器过滤细胞悬液并计数细胞。接下来，将细胞离心并以适当的密度(例如1×107个细胞/mL)重新悬浮于冷
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CS10中。将细胞悬液等分到预标记的冷冻管中，将其放置在冷冻容器中，并转移至-80℃冰箱12-24小时。然后将小瓶转移到液氮中储存。
实施例5-污染性非RPE细胞的MACS耗竭和通过CD24、CD56和/或CD90耗竭富集RPE细胞起始群体
在实施例2或3中获得的RPE细胞群体可以具有残留的污染性非RPE细胞以及未成熟的RPE细胞(统称为“污染细胞”)，两者都可以被分离并除去以产生成熟的RPE富集细胞群体。可以通过各种方法例如磁激活细胞分选
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荧光激活细胞分选(FACS)或单细胞分选从培养物中除去污染细胞。使用本领域已知的用于根据其表面抗原分离各种细胞群体的
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方法来将污染细胞与期望的更成熟的RPE细胞分离。
RPE细胞起始群体的污染细胞具有特定的细胞表面标记，其可用于从所需的成熟RPE细胞分离污染细胞。例如，CD24、CD56和/或CD90是在(但不限于)多能干细胞和其他神经细胞类型上表达的细胞表面抗原。CD24是在多能干细胞、一些B淋巴细胞和分化神经母细胞表面上表达的糖蛋白。CD56或神经细胞粘附分子(NCAM)是在神经元和自然杀伤细胞表面表达的糖蛋白。CD90或Thy-1是在各种干细胞以及神经元表面表达的标记。CD24、CD56和/或CD90的表达在干细胞分化成包括RPE细胞在内的许多成熟细胞类型期间丢失。因此，除去CD24、CD56和/或CD90阳性的细胞导致残留的污染细胞的耗竭。
为了实施分离技术，理想的是将RPE细胞的起始群体解离成单细胞悬液以进行分选(例如，MACS)。对于先前冷冻保存的细胞，细胞必须解冻并重新铺板。为了在贴壁培养中从细胞获得单细胞悬液，洗涤细胞(例如DPBS)并加入细胞解离酶(例如TRYPLETM)。将细胞在37℃孵育约5分钟后，轻轻敲击容器以分离神经元簇。细胞在DPBS中洗涤两次并加入细胞解离酶(例如TRYPLETM)。将细胞在37℃孵育约30分钟后，将细胞悬液收集在RPE-MM铺板培养基中，并以400xg离心5分钟。将细胞沉淀物重新悬浮在RPE-MM铺板培养基中，并通过细胞过滤器(例如20μM steriflip细胞过滤器)过滤细胞悬浮液以解离任何剩余的细胞簇。对细胞悬液计数(例如，使用ViCell计数器)活细胞以获得细胞浓度。计数的细胞悬浮液提供可用于分选或流式细胞术纯度测定的单细胞悬浮液。
为了从RPE细胞起始群体中除去污染细胞，使用MACS耗竭CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞。在将来自RPE细胞起始群体的细胞解离成单细胞悬液后，将细胞重悬于MACS缓冲液中，例如以1×107个细胞/mL。表3中包括了一个示例性MACS缓冲液。接下来，将细胞用抗CD24抗体，抗CD56抗体和/或抗CD90抗体(各自以1：500稀释)染色，并在4℃孵育20分钟以使抗体结合细胞上的抗原。所使用的抗体应以可结合第二抗体的标签(例如FITC)标记。孵育后，加入20mL MACS缓冲液，并将细胞以400xg离心5分钟。将细胞沉淀重悬于20mL MACS缓冲液中，剧烈混合，并以400xg离心5分钟以除去任何未结合的抗体。将细胞沉淀重悬于MACS缓冲液(例如，1.11x108个细胞/mL)中，加入用稀释(1:10)的第二抗体(例如抗FITC)包被的微珠，并将细胞在4℃孵育20分钟。孵育后，用MACS缓冲液洗涤细胞以除去未结合的微珠，并将高达1.25×108个细胞重悬于500μL MACS缓冲液中。将细胞悬浮液转移到置于强磁场中的LD柱中，附着于微珠的表达抗原CD24、CD56和/或CD90的细胞保留在柱中。LD柱用MACS缓冲液洗涤两次。使未表达抗原CD24、CD56和/或CD90的未标记细胞流过并收集。为了进一步表征和培养，将收集的未标记的细胞悬液离心(400×g，5分钟)并重新铺在RPE-MM铺板培养基中，并将一部分细胞悬液用于流式细胞术纯度测定。因此，MACS细胞分选导致RPE富集细胞群体耗竭CD24、CD56和/或CD90阳性的细胞。应注意的是，该方法的使用不限于由实施例2中详述的方法产生的起始群体，并且可用于从由其他方法产生的RPE群体中除去污染细胞，所述方法例如但不限于方法描述于美国申请号12/523,444和14/405,730中。
表1：MACS细胞分选概述
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RPE标记阳性的细胞的分选前百分比是存在于实施例2的RPE细胞起始群体中的那些细胞。CD24阳性的细胞和CD56阳性的细胞的组合的耗竭导致比仅CD24阳性的细胞的耗竭更高的RPE细胞的富集。CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和CD90阳性的细胞的耗竭导致细胞群体中超过99％的RPE细胞。
实施例6-用于表征RPE富集细胞群体的流式细胞术纯度测定
在进行MACS分选之前和之后，通过包括BEST1、CRALBP、TYRP1、PMEL17，MAP2，NES和MITF在内的相关标记组对RPE细胞进行表征(例如，分选前和分选后)。进行流式细胞术纯度测定以获得通过MACS除去CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞之前和之后各个标记阳性的细胞的百分比(表1)的测量值(图2和图3)。
进行流式细胞术纯度测定以测定通过本公开内容的分选方法获得的RPE细胞的百分比。从MACS分析中收集的等分试样细胞悬浮液(2×106个细胞于5mL FACS试管中，每种样品)以400×g离心3分钟。将细胞沉淀重新悬浮于1mL染色剂(例如Live-Dead Red染色剂)中并在室温下在黑暗中孵育15分钟。孵育后，加入2mL洗涤缓冲液并将细胞在400×g下离心3分钟以除去任何未结合的染色剂。将细胞沉淀重悬于固定缓冲液中并在室温下避光孵育15分钟。孵育后，加入2mL洗涤缓冲液，将细胞以400×g离心3分钟，倾析出上清液。将细胞沉淀物重新悬浮于2mL洗涤缓冲液中以制备1x106个细胞/mL悬浮液，并将200μL细胞悬浮液转移至FACS管中。向每个管中加入2mL的Perm缓冲液并将细胞在400×g下离心3分钟。将用于RPE特异性标记物的一级抗体在Perm缓冲液中稀释，并将100μL稀释的抗体溶液加入到每个管中。在黑暗中于4℃孵育过夜后，将细胞在2mL Perm缓冲液中洗涤两次。将二抗溶液加入每个管中，并将细胞在室温下在黑暗中孵育1-2小时。孵育后，将细胞用Perm缓冲液洗涤两次，离心(400×g，3分钟)并重悬于100μL洗涤缓冲液中用于流式细胞术分析。流式细胞术分析通过本领域技术人员已知的方法进行，例如美国专利号8,682,810和Herzenberg等人，2006，其通过引用并入本文，以获得每种测试标记阳性的细胞的百分比(表1)。流式细胞术纯度测定显示与起始细胞群体(78.6％)相比，MACS分选以耗竭CD24、CD56和/或CD90阳性的污染细胞产生了RPE细胞富集群体(95-99％)，如由BEST1标记测定的。
实施例7-用于分化RPE细胞的替代方法
关于实施例2和3中描述的方法，在iPSC铺板后的第2天开始到分化过程结束的某些时间窗内(包括在MACS培养后)将浓度为1μM的PD0325901包含在培养基中，可以提高RPE群体的纯度(意味着污染细胞的减少)以及所产生的RPE群体的成熟。已经显示，当在本文描述的RPE过程的RDM以及RPE-MM(大约第42到50天)中包含1μM PD 0325901时，可以提高RPE群体的纯度和成熟度。
实施例8-用于分化RPE细胞的替代方法
关于实施例2和3中描述的方法，RPE-MM和RPE-MM铺板培养基中胎牛血清百分比从5％降低至0.5-1％可以提高RPE群体的纯度(意味着污染细胞的减少)以及所产生的RPE群体的成熟。
实施例9-成熟RPE细胞的功能性
为了分析用PGE 2处理产生的成熟RPE细胞，进行RPE单层的免疫染色以通过ZO1染色以及iPSC-RPE细胞的透射电子显微镜(图4D)确认紧密连接的六角形结构(图4A-4C)。染色显示PGE2处理的RPE细胞具有降低的β-连环蛋白和增加的RPE65。另外，用IWP2+endo-IWR1或IWP2处理也导致β-连环蛋白减少(图5A)和RPE65增加(图5C)。发现IWP2+endo-IWR1的组合比单独使用IWP2或单独使用endo-IWR1更有效。因此，用PGE2、IWP2或IWP2+endo-IWR1处理产生成熟的RPE细胞。
为了测量通过本发明方法产生的RPE细胞的屏障功能，通过跨越单层的离子梯度测量跨上皮电位(TEP)，所述离子梯度由调节通过细胞的通道的能量驱动的离子泵产生，跨上皮电阻(TER)主要通过紧密连接结构的精细结构测量穿过细胞旁空间的物质的电阻(图7A)。
还表征了用IWP2或endo-IWR1处理的成熟RPE细胞的功能。未经处理的RPE细胞与用PGE2或IWP2+endo-IWR1处理的RPE细胞的TEP和TER测量显示经处理的成熟RPE细胞的功能性增加(图7C-7E)。
接下来，测试了RPE-MM+PGE2培养基中PGE2浓度从50μM到100μM的增加是否会改善RPE群体的纯度(即，污染细胞的减少)以及所产生的RPE群体的成熟度。为了测定50μM与100μM PGE2处理的培养物的成熟度和功能性，测量了跨上皮电阻(TER)方面的屏障功能(图7F)以比较通过细胞旁空间的物质抗性，如实施例9所解释的。为了测定在RPE-MM+PGE2培养基中用50μM或100μM处理iPSC来源的RPE培养物后获得的纯RPE细胞的百分比，就RPE特异性标记进行流式细胞术纯度测定(图7G)，如实施例6中所描述。结果显示，较高浓度的初级诱导剂PGE2促进了iPSC来源的RPE分化过程中RPE群体的纯度和成熟度。
实施例10-RPE分化方法的重现性
为了测试RPE分化过程的再现性，三个iPSC细胞系由多个操作者分化为RPE细胞(图6A)。通过流式细胞术测量RPE标记视黄醛结合蛋白1(Crap1bp)来表征所得RPE细胞的平均纯度(表2)。发现RPE分化过程在不同起始细胞群体以及不同操作者之间高度可重现。另外，通过来自包括3D1，AMD1B，BEST1L，BEST3A，BEST8A，AMD Donor3D和HLA系A的不同起始细胞系的RPE分化证实了重现性(图6B)。HLA系A(21525.102)是由HLA-A*01和HLA-B*08纯合的供体产生的iPSC细胞系，其可以提供11.38％的美国人群的有益匹配。此外，RPE也已成功使用该方法使用由HLA-A*03和HLA-B*07纯合的称为HLA系C(21526.101)的供体产生的iPSC系产生，其可潜在地提供对7.63％美国人群有益的匹配。如上文所述的在HLA-A和HLA-B上纯合的HLA系A(21525.102)和HLA系C(21526.101)是Cellular Dynamics International，Inc的提供的。另外，通过测量纯化之前和之后Cralbp阳性的细胞的百分比在来自13个供体的28个iPSC细胞系上进行的109个RPE分化中进一步确认了重现性(图6C-D)。虽然RPE分化后Cralbp阳性的细胞的百分比变化，但MACS纯化一致地导致纯度超过95％，并且在大多数情况下纯度接近100％。因此，本发明的RPE分化方法比任何从胚状体产生RPE细胞的方法具有明显的优势，因为它提供了在供体基因型和不同操作者进行的更一致和可重复的结果。
表2：多操作者RPE分化
Figure BDA0001631938340000481
实施例11-材料和方法
实施例1-10中使用的材料显示在表3中。
表3：示例性的培养基组分
Figure BDA0001631938340000482
Figure BDA0001631938340000491
Figure BDA0001631938340000501
Figure BDA0001631938340000511
Figure BDA0001631938340000521
Figure BDA0001631938340000531
Figure BDA0001631938340000541
Figure BDA0001631938340000551
Figure BDA0001631938340000561
Figure BDA0001631938340000571
Figure BDA0001631938340000581
Figure BDA0001631938340000591
通过将20mL FBS加入到1000mL DPBS(即不含钙和镁)中来制备流式细胞术洗涤缓冲液。缓冲液经过过滤消毒，可以在4℃下保存多达4周。
通过将20mL FBS加入到1000mL DPBS(即不含钙和镁)中来制备流式细胞术perm缓冲液。加入1克皂素并充分混合。缓冲液经过过滤消毒，可以在4℃下保存多达4周。
通过在DPBS中稀释1:1000的Live-Dead染色剂(即不含钙和镁)来制备流式细胞术Live-Dead Red染色剂。每待测定的1×106个细胞制备1mL染色剂。使用前新鲜制备染色剂。
通过将1mL的36.5％的甲醛添加至8.1mL的DPBS(即不含钙和镁)来制备流式细胞术固定缓冲液。每待测定的1×106细胞制备1mL染色剂。缓冲液在使用前新鲜制备。
根据本公开内容，可以在没有过度实验的情况下制作和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员来说明显的是，可以在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下对所述方法的步骤或者所述方法的步骤顺序进行变化。更具体地说，明显的是，化学和生理学上相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，而获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (15)

1.一种提供富集的视网膜色素上皮(RPE)细胞群体的方法，其包括：
a)获得包含RPE细胞的起始细胞群体，其中所述起始细胞群体由诱导性多能干细胞制备；和
b)通过从所述起始细胞群体中耗竭(i)CD24阳性的细胞，或(ii)CD56阳性的细胞，或(iii)CD24阳性的细胞和CD56阳性的细胞，或(iv)CD24阳性的细胞和CD90阳性的细胞，或(v)CD56阳性的细胞和CD90阳性的细胞，或(vi)CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和CD90阳性的细胞，来富集所述起始细胞群体的RPE细胞，由此提供与起始细胞群体相比富含具有Pax6的下调表达和RPE65的上调表达的RPE细胞的RPE富集细胞群体，其中所述RPE富集细胞群体在使用BEST1、CRALBP、TYRP1、PMEL17或MITF作为标记测定时是至少90％纯的RPE细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述RPE富集细胞群体是至少95％的RPE细胞。
3.权利要求2所述的方法，其中所述RPE富集细胞群体是至少99％的RPE细胞。
4.权利要求3所述的方法，其中所述RPE富集细胞群体是纯的RPE细胞。
5.权利要求1所述的方法，其中所述RPE细胞是人RPE细胞。
6.权利要求1所述的方法，其中通过基于磁珠的分选或基于荧光的分选耗竭CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞或CD90阳性的细胞。
7.权利要求1所述的方法，其中分别使用识别CD24、CD56或CD90的抗体或适体耗竭CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞或CD90阳性的细胞。
8.权利要求1所述的方法，其中所述RPE富集细胞群体未经遗传修饰。
9.权利要求1所述的方法，其中步骤b)在没有对所述起始细胞群体进行遗传改造的情况下进行。
10.权利要求1所述的方法，其中通过从所述起始细胞群体中耗竭CD24阳性的细胞而富集所述起始细胞群体的RPE细胞。
11.权利要求1所述的方法，其中通过从所述起始细胞群体中耗竭CD56阳性的细胞而富集所述起始细胞群体的RPE细胞。
12.权利要求1所述的方法，其中通过从所述起始细胞群体中耗竭CD24阳性的细胞和CD90阳性的细胞而富集所述起始细胞群体的RPE细胞。
13.权利要求1所述的方法，其中通过从所述起始细胞群体中耗竭CD90阳性的细胞、CD56阳性的细胞和CD24阳性的细胞而富集所述起始细胞群体的RPE细胞。
14.权利要求1所述的方法，其中通过从所述起始细胞群体中耗竭CD24阳性的细胞和CD56阳性的细胞而富集所述起始细胞群体的RPE细胞。
15.权利要求1所述的方法，其中通过从所述起始细胞群体中耗竭CD56阳性的细胞和CD90阳性的细胞而富集所述起始细胞群体的RPE细胞。
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