ES2903442T3 - Purificación basada en MACS del epitelio pigmentario de la retina derivado de células madre - Google Patents

Abstract

Un método para proporcionar una población enriquecida de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) que comprende: a) obtener una población celular de partida que comprende células RPE, en donde la población celular de partida se prepara a partir de células madre pluripotentes inducidas; y b) enriquecer dicha población de células de partida para células RPE eliminando de la misma células que son positivas para CD24, células que son positivas para CD56 y/o células que son positivas para CD90, proporcionando así una población de células enriquecida en RPE que está enriquecida para células RPE en comparación con la población de células de partida.

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación basada en MACS del epitelio pigmentario de la retina derivado de células madre

Campo técnico

La presente solicitud reclama el beneficio prioritario de la solicitud provisional de Estados Unidos número 62/215.272, presentada el 8 de septiembre de 2015.

La presente invención se refiere en general al campo de la biología de células madre. Más particularmente, se refiere a métodos para enriquecer poblaciones de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de células madre.

Antecedentes de la invención

La retina es una capa de tejido sensible a la luz que recubre la superficie interna del ojo. Las células fotorreceptoras, ya sean bastones o conos, en la retina son directamente sensibles a la luz y transforman las señales de luz químicas en eventos eléctricos que desencadenan impulsos nerviosos. El epitelio pigmentario de la retina (“RPE”, por sus siglas en inglés) es una capa de células pigmentadas que forma la barrera hematorretiniana. Las células RPE juegan un papel importante en el mantenimiento de la función visual y el transporte de iones, agua y productos finales metabólicos desde el espacio subretiniano a la sangre (Strauss et al., 2005). Además, las células RPE establecen el privilegio inmunológico del ojo al secretar factores inmunosupresores. Un trastorno o lesión de las células RPE puede provocar la degeneración de la retina, la pérdida de la función visual y la ceguera. Varios trastornos de la retina, incluyendo la degeneración macular aguda y relacionada con la edad y la enfermedad de Best, implican la degeneración del RPE; por lo tanto, la terapia de reemplazo celular es una posible opción terapéutica para preservar la visión (Buchholz et al., 2009).

En general, las células madre son células indiferenciadas que pueden dar lugar a una sucesión de células funcionales maduras. Por ejemplo, una célula madre hematopoyética puede dar lugar a cualquiera de los diferentes tipos de células sanguíneas diferenciadas terminalmente. Las células madre embrionarias (“ES”, por sus siglas en inglés) se derivan del embrión y son pluripotentes, por lo que poseen la capacidad de convertirse en cualquier tipo de órgano o tejido, incluyendo las células RPE.

En 2006, la producción de células madre pluripotentes inducidas (“iPSCs”, por sus siglas en inglés) a partir de células de ratón somáticas adultas proporcionó un avance importante para la investigación de células madre, el desarrollo de fármacos, modelos de enfermedad y terapéutica celular (Takahashi et al., 2006). Las iPSCs humanas se pueden diferenciar en tipos de células especializadas y tienen el potencial de células inmuno-emparejadas específicas del paciente para la medicina regenerativa (Yu et al., 2007).

Se ha demostrado que las iPSCs dan lugar a células oculares, incluidas las células RPE (Hirami et al., 2009). Sin embargo, el uso de células RPE derivadas de iPSCs para fines terapéuticos, ensayos de detección, modelos de enfermedades de la retina e investigación biológica del RPE requiere la eliminación de las células contaminantes de la población de células RPE diferenciadas y/o el enriquecimiento de las poblaciones de interés.

Breve descripción de la invención

Las presentes realizaciones superan una deficiencia importante en la técnica al proporcionar métodos para obtener una población enriquecida en células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) a partir de una población de células RPE inicial mediante la eliminación de células positivas para CD24, células positivas para CD56 y/o células positivas para CD90. En ciertas realizaciones, la población de células RPE de partida puede obtenerse a partir de células madre pluripotentes, tales como, por ejemplo, células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas.

En una realización, se proporcionan métodos para proporcionar una población enriquecida de células epiteliales del epitelio pigmentario de la retina (RPE) que comprenden (a) obtener una población de células de partida que comprende células RPE, en donde la población de células de partida se prepara a partir de células madre pluripotentes inducidas; y (b) enriquecer la población celular para células RPE eliminando de la misma células que son positivas para CD24, células que son positivas para CD56 y/o células que son positivas para CD90, proporcionando así una población de células enriquecida con RPE que está enriquecida para células RPE en comparación con la población celular de partida. En algunos aspectos, la población de células de partida no se somete a ingeniería genética ni se modifica genéticamente. En algunos aspectos, el enriquecimiento de la población celular no comprende la ingeniería genética de las células. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la población de células enriquecidas en RPE no se somete a ingeniería genética ni se modifica genéticamente.

En algunos aspectos, los métodos pueden comprender además determinar un nivel de enriquecimiento de las células RPE en la población enriquecida con RPE. En ciertos aspectos, el nivel de enriquecimiento se determina mediante el uso de un marcador específico del epitelio de la retina. Por ejemplo, el marcador específico del epitelio de la retina puede ser BEST1, CRALBP, TYRP1, PMEL17 o MITF. En un aspecto específico, la población de células enriquecidas en RPE se enriquece para células RPE en comparación con la población de células de partida determinada mediante clasificación BEST1.

En ciertos aspectos, la población enriquecida en RPE es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de células RPE. En otros aspectos, la población enriquecida en RPE es esencialmente células RPE puras.

En las realizaciones, la población de células de partida se prepara a partir de células madre pluripotentes, en donde las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes inducidas. Por ejemplo, las células RPE pueden ser células RPE humanas.

En ciertos aspectos, se eliminan las células que son positivas para CD24, las células que son positivas para CD56 y/o las células que son positivas para CD90. Por ejemplo, las células que son positivas para CD24, las células que son positivas para CD56 y/o las células que son positivas para CD90 pueden eliminarse mediante clasificación basada en perlas magnéticas o clasificación basada en fluorescencia. En ciertos aspectos, las células que son positivas para CD24, las células que son positivas para CD56 y/o las células que son positivas para CD90 se eliminan utilizando un anticuerpo o un aptámero que reconozca CD24, c D56 y/o CD90.

En ciertos aspectos, una población celular se enriquece para células RPE eliminando de la misma las células que son positivas para CD24. En otros aspectos, una población celular se enriquece para células RPE eliminando de la misma las células que son positivas para CD56. En otro aspecto más, una población celular se enriquece para células RPE eliminando de la misma células que son positivas para CD90. En otro aspecto, una población celular se enriquece para células RPE eliminando de la misma células que son positivas para CD90, células que son positivas para CD56 y células que son positivas para CD24.

La población celular proporcionada en la presente puede estar esencialmente libre de células no RPE contaminantes, tales como fibroblastos o células madre pluripotentes indiferenciadas. En otro aspecto, las células RPE son células RPE de ratón o humanas. En un aspecto particular, las células RPE pueden ser células RPE crioconservadas.

Las células RPE producidas por los métodos de la presente pueden usarse en cualquier método y aplicación actualmente conocida en la técnica para células RPE. Por ejemplo, se puede proporcionar un método para evaluar un compuesto, que comprende analizar una propiedad farmacológica o toxicológica del compuesto en la célula RPE. También se puede proporcionar un método para evaluar el efecto de un compuesto en una célula RPE, que comprende: a) poner en contacto las células RPE proporcionadas en la presente con el compuesto; y b) ensayar un efecto del compuesto sobre las células RPE.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar más ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en la presente.

Figura 1A, Figura 1B, Figura 1C y Figura 1D: Figura 1A) Imagen de iPSCs pre-confluentes. Figura 1B) Imagen de ejemplo para el día 25 de diferenciación de RPE. Figura 1C) Imagen de ejemplo para el día 40 de diferenciación de RPE. Figura 1D) Imágenes de ejemplo en el día 60 después de sembrar nuevamente en placa en el día 40 con cultivo en medio de maduración de RPE (“Rp E-MM”, por sus siglas en inglés) en campo claro 100x.

Figura 2A y Figura 2B: Análisis de citometría de flujo de marcadores relevantes, incluyendo MAP2, NES, PAX6, MITF, PMEL17, TYRP1, CRALBP y BEST1, antes de la clasificación celular de la población de células RPE derivadas de iPSC.

Figura 3A, Figura 3B y Figura 3C: Análisis de citometría de flujo de marcadores relevantes, incluyendo MAP2, NES, PAX6, MITF, PMEL17, TYRp1, CRALBP y BEST1, después de la clasificación celular de una población de células RPE derivadas de iPSC para eliminar células positivas para CD24, positivas para CD24 y positivas para CD56, células positivas para CD24 y positivas para CD90 y células positivas para CD24, positivas para CD56 y positivas para CD90.

Figura 4A, Figura 4B, Figura 4C y Figura 4D: Figura 4A) Tinción con beta catenina y actina F de células iPSC-RPE no tratadas y células iPSC-RPE tratadas con PGE2. La tinción con beta catenina se observa en el citoplasma de las células no tratadas y en la membrana de las células tratadas. Figura 4B) Tinción con pERM (Ezrin) y ZO1 de células iPSC-RPE no tratadas y células iPSC-RPE tratadas con PGE2. La tinción con ERM es baja en el citoplasma de las células no tratadas y alta en el citoplasma de las células tratadas, mientras que la tinción con ZO1 se observa en las uniones estrechas de la membrana plasmática de las células tratadas y no tratadas. Figura 4C) Tinción con RPE65 y ZO1 de células iPSC-RPE no tratadas y células iPSC-RPE tratadas con PGE2. La tinción con RPE65 es baja en el citoplasma de las células no tratadas y alta en el citoplasma de las células tratadas. Figura 4D) Micrografías electrónicas de transmisión de células iPSC-RPE no tratadas y células iPSC-RPE tratadas con PGE2. Las células tratadas con PGE2 tienen procesos apicales más extensos.

Figura 5A, Figura 5B, Figura 5C y Figura 5D: Figura 5A) Tinción con beta catenina de células tratadas con IWP2+endo-IWR1, IWP2 o LiCl. Las células tratadas con IWP2 o IWp2+endo-IWR1 tienen beta catenina en la membrana celular. Las células tratadas con LiCl tienen beta catenina en el núcleo y las células no tratadas tienen beta catenina en el citoplasma. Figura 5B) Tinción con p27 de células tratadas con IWP2+endo-IWRl, IWP2 o LiCl. Las células tratadas con IWP2 o IWP2+endo-IWR1 tienen una mayor expresión de p27 en el núcleo, lo que sugiere que las células han salido del ciclo celular. Las células tratadas con LiCl o las células no tratadas tienen una expresión de p27 débil en el núcleo. Figura 5C) Uniones estrechas de RPE65 y ZO1 de células tratadas con IWP2+IWR1, iW p2 o LiCl. El RPE65 es alto en el citoplasma de las células tratadas con IWP2+IWR1 y en las células IWP2, bajo en las células no tratadas, y no se observa tinción en las células tratadas con LiCl. Figura 5D) Imágenes de microscopía electrónica de uniones estrechas funcionales de células tratadas con IWP2+IWR1, IWP2 o LiCl.

Figura 6A, Figura 6B, Figura 6C y Figura 6D: Figura 6A) Diferenciación de RPE con multioperador. Los datos que se muestran representan la configuración de diferenciaciones de RPE utilizando el protocolo optimizado en tres líneas con múltiples operadores medidos por citometría de flujo para el marcador de RPE proteína 1 de unión a retinaldehído (“Cralbp”, por sus siglas en inglés). Figura 6B) La reproducibilidad del protocolo de diferenciación de RPE se muestra entre diferentes poblaciones de líneas celulares de partida, incluyendo 3D1, AMD1B, BEST1L, BEST3A, BEST8A, AMD Donor3D, AMD Donor3C y HLA Línea A. Figura 6C-Figura 6D) La reproducibilidad del protocolo de diferenciación de RPE se muestra entre diferentes poblaciones de líneas celulares. Los datos representan 109 diferenciaciones realizadas por cinco operadores en 28 líneas iPSC derivadas de 13 donantes. El porcentaje de células positivas para Cralbp aumentó entre un 90 y un 100% en comparación con la pureza variada de la población celular pre-purificación.

Figura 7A, Figura 7B, Figura 7C, Figura 7D, Figura 7E, Figura 7F y Figura 7G: Figura 7A) La funcionalidad de la función de barrera de las células RPE generadas utilizando el protocolo de diferenciación RPE se muestra mediante la medición del potencial eléctrico transepitelial (“TEP”, por sus siglas en inglés) del gradiente iónico en la monocapa. Figura 7B) Funcionalidad de células RPE tratadas con IWP2 o IWP2+endo-IWR2. Figura 7C, Figura 7D, Figura 7E) Resistencia eléctrica transepitelial (“TER”, por sus siglas en inglés) y TEP (línea más clara) de células no tratadas, células tratadas con PGE2 y células tratadas con IWP2+endo-IWR1. Figura 7F) Respuesta funcional (TER) de células maduradas con PGE2 50 mM frente a 100 mM en el medio RPE-MM PGE2 desde el día 54 hasta el día 75 del protocolo de diferenciación derivado de iPSC. Hubo un aumento progresivo en la medida de la TER durante el curso de su diferenciación con 100 mM en comparación con las células RPE derivadas de iPSC cultivadas usando PGE250 mM en medio RPE-MM PGE2 desde el día 54 hasta el día 75 del protocolo de diferenciación. Esto demuestra que un aumento en la concentración de PGE2 promueve la madurez y la eficiencia funcional de los cultivos de células RPE derivadas de iPSC. Figura 7G) Pureza de células RPE derivadas de iPSC por porcentaje de expresión de marcadores de células RPE maduras el día 75 en cultivos con PGE250 mM frente a 100 mM iniciados en el día 54 al día 75 del protocolo de diferenciación de células RPE derivadas de iPSC. Existe una expresión comparable de Pmel17, Trypl y Cralbp (marcadores específicos de RPE) a las células RPE derivadas de iPSC cultivadas usando PGE250 mM. Esto muestra que PGE2 promueve la diferenciación de células RPE derivadas de iPSC a lo largo de un rango de concentraciones. La expresión del marcador Best 1 (marcador de RPE de madurez tardía) es mucho mayor en las células tratadas con PGE2 100 mM en comparación con las células tratadas con PGE250 mM, lo que demuestra que el aumento de la concentración de PGE2 mejora la pureza y la madurez de las células RPE derivadas de iPSC.

Descripción detallada de la Invención

La presente divulgación supera varios problemas importantes con las tecnologías actuales al proporcionar métodos para enriquecer una población de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) derivadas de células madre. Las células RPE pueden derivarse de células madre pluripotentes, tales como células ES y células iPS; sin embargo, incluso dentro de una población RPE derivada de células madre usando técnicas existentes, se encuentra presente una cierta cantidad de células contaminantes (por ejemplo, células madre indiferenciadas). La presente invención proporciona un método para separar y eliminar células contaminantes de una población de partida de células RPE. Las células que contaminan la población de células RPE tienen antígenos de superficie celular específicos que se pueden usar para reducir las células contaminantes que no son RPE de la población, tales como CD24, CD56 y/o CD90. Por lo tanto, la eliminación de las células positivas para uno o más de estos marcadores de superficie celular específicos puede producir una población de células enriquecidas en RPE que tiene un mayor porcentaje de células RPE que la población de partida. Ciertas metodologías, tales como la clasificación de células activadas magnéticamente (“MACS”, por sus siglas en inglés), la clasificación de células activadas por fluorescencia (“FACS”, por sus siglas en inglés), o la clasificación de células individuales, y similares, son conocidas en la técnica para separar varias poblaciones celulares dependiendo de sus antígenos de superficie. En realizaciones preferidas, la presente descripción comprende un método para usar estas metodologías de clasificación, preferiblemente MACS, para agotar las células positivas para CD24, CD56 y/o CD90 de una población de células RPE de partida para obtener una población de células enriquecidas en RPE. Por lo tanto, los métodos actuales pueden ser más eficientes en cuanto a tiempo y coste, y pueden permitir la fabricación de poblaciones de células enriquecidas en RPE para terapias a partir de una fuente renovable, las células madre. A continuación, se describen realizaciones y ventajas adicionales de la presente descripción.

I. Definiciones

El término “purificado” no requiere pureza absoluta; más bien, está pensado como un término relativo. Por lo tanto, una población de células purificadas es superior a aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% pura o, lo más preferiblemente, esencialmente libre de otros tipos de células.

De la manera que se usa en la presente, “esencialmente” o “esencialmente libre”, en términos de un componente especificado, significa que ninguno de los componentes especificados se ha formulado a propósito en una composición y/o está presente sólo como contaminante o en cantidades mínimas. Por lo tanto, la cantidad total del componente especificado resultante de cualquier contaminación no intencionada de una composición está muy por debajo del 0,05%, preferiblemente por debajo del 0,01%. La más preferida es una composición en la que no se puede detectar ninguna cantidad del componente especificado con métodos analíticos estándar.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “un” o “una” pueden significar uno o más. Como se usa en la presente en la(s) reivindicación(es), cuando se usan junto con la palabra “que comprende”, las palabras “un” o “una” pueden significar uno o más de uno.

El uso del término “o” en las reivindicaciones significa “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refiere sólo a alternativas o las alternativas se excluyan mutuamente, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere sólo a alternativas y a “y/ o”. Como se usa en la presente, “otro” puede significar al menos un segundo o más.

A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

El término “célula” se usa en la presente para referirse a una unidad estructural y funcional de un organismo que puede replicarse independientemente, está rodeada por una membrana, y contiene biomoléculas y material genético. Las células utilizadas en el presente documento pueden ser células de origen natural o células modificadas artificialmente (por ejemplo, células de fusión, células modificadas genéticamente, etc.).

El término “población celular” se usa en la presente para referirse a un grupo de células, normalmente de un tipo común. La población celular puede derivarse de un progenitor común o puede comprender más de un tipo de células. Una población celular “enriquecida” se refiere a una población celular derivada de una población celular de partida (por ejemplo, una población celular heterogénea no fraccionada) que contiene un porcentaje mayor de un tipo de células específico que el porcentaje de ese tipo de células en la población de partida. Las poblaciones de células pueden enriquecerse en uno o más tipos de células y agotarse en uno o más tipos de células.

En la presente, el término “célula madre” se refiere a una célula que bajo condiciones adecuadas es capaz de diferenciarse en un rango diverso de tipos de células especializadas, mientras que bajo otras condiciones adecuadas es capaz de autorrenovarse y permanecer en un estado pluripotente esencialmente indiferenciado. El término “célula madre” también abarca una célula pluripotente, una célula multipotente, una célula precursora y una célula progenitora. Los ejemplos de células madre humanas pueden obtenerse a partir de células madre hematopoyéticas o mesenquimales obtenidas de tejido de médula ósea, células madre embrionarias obtenidas de tejido embrionario o células germinales embrionarias obtenidas de tejido genital de un feto. Las células madre pluripotentes ejemplares también pueden producirse a partir de células somáticas reprogramándolas a un estado pluripotente mediante la expresión de ciertos factores de transcripción asociados con la pluripotencia; estas células se denominan “células madre pluripotentes inducidas” o “iPSCs”.

El término “pluripotente” se refiere a la propiedad de una célula para diferenciarse en todos los demás tipos de células en un organismo, con la excepción de las células extraembrionarias o placentarias. Las células madre pluripotentes son capaces de diferenciarse en tipos de células de las tres capas germinales (por ejemplo, tipos de células ectodérmicas, mesodérmicas y endodérmicas) incluso después de un cultivo prolongado. Una célula madre pluripotente puede ser una célula madre embrionaria derivada de la masa celular interna de un blastocisto. En ciertas realizaciones, la célula madre pluripotente definida en las reivindicaciones es una célula madre pluripotente inducida derivada de la reprogramación de células somáticas.

El término “diferenciación” se refiere al proceso mediante el cual una célula no especializada se convierte en un tipo más especializado con cambios en las propiedades estructurales y/o funcionales. La célula madura normalmente tiene una estructura celular alterada y proteínas específicas de tejido. Más específicamente, en el contexto de los presentes métodos indica el proceso de una célula madre humana que adquiere el tipo de células de una célula del epitelio pigmentario de la retina (RPE) con características indicativas de que dicha célula RPE es una célula diferenciada terminalmente madura.

Como se usa en la presente, el término “indiferenciado” se refiere a células que muestran marcadores característicos y características morfológicas de células indiferenciadas que las distinguen claramente de las células diferenciadas terminalmente de origen embrionario o adulto.

Los “cuerpos embrioides (“EBs”, por sus siglas en inglés)” son agregados de células madre pluripotentes que pueden experimentar diferenciación en células de las capas germinales de endodermo, mesodermo y ectodermo. Las estructuras esferoides se forman cuando las células madre pluripotentes se agregan y permiten el cultivo no adherente de EBs en suspensión.

Una célula “aislada” se ha separado o purificado sustancialmente de otras células en un organismo o cultivo. Las células aisladas pueden ser, por ejemplo, al menos 99%, al menos 98% puras, al menos 95% puras o al menos 90% puras.

Un “embrión” se refiere a una masa celular obtenida por una o más divisiones de un cigoto o un ovocito activado con un núcleo reprogramado artificialmente.

Una “célula madre embrionaria (ES)” se refiere a una célula pluripotente indiferenciada que se obtiene de un embrión en una etapa temprana, tal como la masa celular interna en la etapa de blastocisto, o se produce por medios artificiales (por ejemplo, transferencia nuclear) y puede dar lugar a cualquier tipo de célula diferenciada en un embrión o un adulto, incluyendo las células germinales (por ejemplo, espermatozoides y óvulos).

Las “células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)” son células generadas reprogramando una célula somática expresando o induciendo la expresión de una combinación de factores (denominados en la presente factores de reprogramación). Las iPSCs se pueden generar utilizando células somáticas fetales, post-natales, recién nacidas, juveniles o adultas. En ciertas realizaciones, los factores que pueden usarse para reprogramar células somáticas a células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, Oct4 (a veces denominado como Oct 3/4), Sox2, c-Myc y Klf4, Nanog y Lin28. En algunas realizaciones, las células somáticas se reprograman expresando al menos dos factores de reprogramación, al menos tres factores de reprogramación o cuatro factores de reprogramación para reprogramar una célula somática en una célula madre pluripotente.

Un “alelo” se refiere a una de dos o más formas de un gen. Los organismos diploides, tales como los humanos, contienen dos copias de cada cromosoma y, por lo tanto, portan un alelo en cada uno.

El término “homocigoto” se define como que contiene dos de los mismos alelos en un locus particular. El término “heterocigoto” se refiere a que contiene dos alelos diferentes en un locus particular.

Un “haplotipo” se refiere a una combinación de alelos en múltiples loci a lo largo de un único cromosoma. Un haplotipo puede basarse en un conjunto de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en un único cromosoma y/o los alelos en el complejo mayor de histocompatibilidad.

Como se usa en la presente, el término “coincidencia de haplotipos” se define como que la célula (por ejemplo, célula iPSC) y el sujeto que se trata comparten uno o más haplotipos de locus mayor de histocompatibilidad. El haplotipo del sujeto se puede determinar fácilmente utilizando ensayos bien conocidos en la técnica. La célula iPSC con haplotipo emparejado puede ser autóloga o alogénica. Las células autólogas que crecen en cultivo de tejidos y se diferencian a células RPE son inherentemente emparejadas por haplotipos con el sujeto.

“Sustancialmente el mismo tipo de HLA” indica que el tipo de HLA del donante coincide con el de un paciente en la medida en que las células trasplantadas, que se han obtenido induciendo la diferenciación de iPSCs derivadas de las células somáticas del donante, pueden injertarse cuando se trasplantado al paciente.

En la presente, los “superdonantes” se denominan individuos que son homocigotos para ciertos genes del complejo mayor de histocompatibilidad (“MHC”, por sus siglas en inglés) de clase I y II. Estos individuos homocigotos pueden actuar como superdonantes y sus células, incluyendo los tejidos y otros materiales que componen sus células, pueden trasplantarse en individuos que son homocigotos o heterocigotos para ese haplotipo. El superdonante puede ser homocigoto para los alelos de locus/loci HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP o HlA-DQ, respectivamente.

“Libre de alimentador” o “independiente del alimentador” se utiliza en la presente para referirse a un cultivo suplementado con citocinas y factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento transformante beta (“TGFp”, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de fibroblastos básico (“bFGF”, por sus siglas en inglés), factor inhibidor de leucemia (“LIF”, por sus siglas en inglés)) como reemplazo de la capa de células alimentadoras. Por lo tanto, los sistemas y medios de cultivo “libres de alimentador” o independientes del alimentador pueden usarse para cultivar y mantener células pluripotentes en un estado proliferativo e indiferenciado. En algunos casos, los cultivos libres de alimentador utilizan una matriz basada en animales (por ejemplo, MATRIGEL™) o se cultivan en un sustrato, tal como fibronectina, colágeno o vitronectina. Estos enfoques permiten que las células madre humanas permanezcan en un estado esencialmente indiferenciado sin la necesidad de “capas alimentadoras” de fibroblastos de ratón.

Las “capas alimentadoras” se definen en la presente como una capa de recubrimiento de células, tal como en el fondo de una placa de cultivo. Las células alimentadoras pueden liberar nutrientes en el medio de cultivo y proporcionar una superficie a la que se pueden unir otras células, tales como las células madre pluripotentes.

El término “definido” o “completamente definido”, cuando se usa en relación con un medio, una matriz extracelular o una condición de cultivo, se refiere a un medio, una matriz extracelular o una condición de cultivo en los que se conocen la composición química y cantidades de aproximadamente todos los componentes. Por ejemplo, un medio definido no contiene factores indefinidos, tales como suero fetal bovino, albúmina sérica bovina o albúmina sérica humana. En general, un medio definido comprende un medio basal (por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco (“DMEM”, por sus siglas en inglés), F12 o medio de Roswell Park Memorial Institute (“RPMI”, por sus siglas en inglés) 1640, que contiene aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, soluciones amortiguadoras, antioxidantes y fuentes de energía) que se complementa con albúmina recombinante, lípidos químicamente definidos e insulina recombinante. Un medio completamente definido a modo de ejemplo es el medio Essential 8™.

El término “libre de xeno (“XenoFree”, en inglés, o XF)”, cuando se usa en relación con un medio, una matriz extracelular o una condición de cultivo, se refiere a un medio, una matriz extracelular o una condición de cultivo que está esencialmente libre de componentes derivados de animales heterogéneos. Para el cultivo de células humanas, cualquier proteína de un animal no humano, tal como un ratón, sería un componente xeno. En ciertos aspectos, la matriz libre de xeno puede estar esencialmente libre de componentes derivados de animales no humanos, por lo que excluye las células alimentadoras de ratón o MATRIGEL™. MATRIGEL™ es una preparación de membrana basal solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), un tumor rico en proteínas de la matriz extracelular que incluye laminina (un componente principal), colágeno IV, proteoglicanos de heparán sulfato y entactina/nidogen.

“Reemplazo de suero KNOCKOUT™”, al que se hace referencia en la presente como una formulación libre de suero optimizada para crecer y mantener células indiferenciadas, tales como células madre, en cultivo.

“Pre-confluente” se refiere a un cultivo celular en el que la proporción de la superficie de cultivo que está cubierta por células es de aproximadamente 60-80%. Por lo general, pre-confluente se refiere a un cultivo en el que aproximadamente el 70% de la superficie de cultivo está cubierta por células.

La “retina” se refiere a una capa de tejido sensible a la luz que recubre la superficie interna del ojo.

El “epitelio pigmentario de la retina” se refiere a una monocapa de células pigmentadas entre la coroides, una capa llena de vasos sanguíneos, y la retina.

En la presente, “células de linaje retinal” se refiere a células que pueden dar lugar o diferenciarse a células RPE.

En la presente, “medio de inducción retiniana (“RIM”, por sus siglas en inglés)” se refiere a un medio de crecimiento que comprende un inhibidor de la vía WNT y un inhibidor de la vía de proteína morfogénica ósea (“BMP”, por sus siglas en inglés), y puede dar como resultado la diferenciación de PSCs en células de linaje retiniano. El RIM también comprende un inhibidor de la vía TGFp.

En la presente, el “medio de diferenciación retiniana (“RDM”, por sus siglas en inglés)” se define como un medio que comprende un inhibidor de la vía WNT, un inhibidor de la vía BMP y un inhibidor de MEK, y diferencia las células de la retina. El RDM también comprende un inhibidor de la vía TGFp.

El “medio retiniano (“RM”, por sus siglas en inglés)” se define como un medio de crecimiento para el cultivo de células retinianas que comprenden Activina A y Nicotinamida.

En la presente, el “medio de maduración de RPE (RPE-MM)” se refiere a un medio para la maduración de células RPE que comprende taurina e hidrocortisona. El RPE-MM también comprende triyodotironina. El RPE-MM también puede comprender PD0325901 o PGE2.

En la presente, las células RPE “maduras” se denominan células RPE que tienen una expresión reducida de marcadores RPE inmaduros, tales como Pax6 y una expresión reducida de marcadores RPE maduros, tales como RPE65.

La “maduración” de las células RPE se refiere en la presente al proceso mediante el cual se modulan las vías de desarrollo del RPE para generar células RPE maduras. Por ejemplo, la modulación de la función de los cilios puede dar como resultado la maduración de células RPE.

Una “cantidad terapéuticamente efectiva” utilizada en la presente se refiere a la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto para el tratamiento de una enfermedad o afección, es suficiente para efectuar dicho tratamiento. “Inductor” se define en la presente como una molécula que regula la expresión génica, tal como la activación de genes dentro de una célula. Un inductor puede unirse a represores o activadores. Los inductores funcionan desactivando los represores.

II. Células madre pluripotentes

A. Células madre embrionarias (sólo como referencia)

Las células ES se derivan de la masa celular interna de los blastocistos y tienen una alta capacidad de diferenciación in vitro. Las células madre embrionarias se pueden aislar eliminando la capa externa del trofectodermo de un embrión en desarrollo y posteriormente cultivando las células de la masa interna en una capa alimentadora de células que no crecen.

Las células sembradas nuevamente en placas pueden seguir proliferando y producir nuevas colonias de células ES que se pueden eliminar, disociar, sembrar nuevamente y permitir que crezcan. Este proceso de “subcultivo” de células madre embrionarias indiferenciadas se puede repetir varias veces para producir líneas celulares que contienen células madre embrionarias no diferenciadas (Patentes de EE. UU. No. 5.843.780; 6.200.806; 7.029.913). Las células madre embrionarias tienen el potencial de proliferar mientras mantienen su pluripotencia. Por ejemplo, las células ES son útiles en la investigación de células y genes que controlan la diferenciación celular. La pluripotencialidad de las células ES combinada con la manipulación y selección genética se puede utilizar para estudios de análisis de genes in vivo a través de la generación de ratones transgénicos, quiméricos y knockout.

Los métodos para producir células ES de ratón son bien conocidos. En un método, un blastocisto de preimplantación de la cepa 129 de ratones se trata con antisuero de ratón para eliminar el trofoectodermo, y la masa celular interna se cultiva en una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados químicamente en un medio que contiene suero fetal de ternera. Las colonias de células ES indiferenciadas que se desarrollan se subcultivan en capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón en presencia de suero fetal de ternera para producir poblaciones de células ES. En algunos métodos, las células ES de ratón se pueden cultivar en ausencia de una capa alimentadora al añadir el factor inhibidor de leucemia de citoquinas (LIF) al medio de cultivo que contiene suero (Smith, 2000). En otros métodos, las células ES de ratón se pueden cultivar en medio libre de suero en presencia de proteína morfogenética ósea y LIF (Ying et al., 2003).

Sólo como referencia, las células ES humanas se pueden producir o derivar de un embrión de mamífero en etapa de cigoto o blastocisto producido por la fusión de un espermatozoide y un óvulo, la transferencia nuclear, la patogénesis o la reprogramación de la cromatina y la posterior incorporación de la cromatina reprogramada en una membrana plasmática para producir una célula embrionaria mediante métodos previamente descritos (Thomson & Marshall, 1998; Reubinoff et al., 2000). En un método, los blastocistos humanos se exponen a suero anti-humano y las células del trofectodermo se lisan y se extraen de la masa celular interna que se cultiva en una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de ratón. Además, los grupos de células derivadas de la masa celular interna se disocian química o mecánicamente, se siembran nuevamente y las colonias con morfología indiferenciada se seleccionan mediante micropipeta, se disocian y se siembran nuevamente (Patente de EE. UU. No. 6.833.269). En algunos métodos, las células madre embrionarias humanas pueden cultivarse sin suero mediante el cultivo de las células madre embrionarias en una capa alimentadora de fibroblastos en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos básico (Amit et al., 2000). En otros métodos, las células madre embrionarias humanas se pueden cultivar sin una capa de células alimentadoras mediante el cultivo de las células en una matriz de proteína, tal como MATRIGEL™, o laminina en presencia de medio “acondicionado” que contiene factor de crecimiento de fibroblastos básico (Xu et al., 2001).

Las células madre embrionarias también pueden derivarse de otros organismos, incluyendo el mono rhesus y el tití, mediante métodos descritos anteriormente (Thomson & Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson & Odorico, 2000), así como de líneas celulares de ratón y humanas establecidas. Por ejemplo, las líneas celulares ES humanas establecidas incluyen MAOI, MA09, ACT-4, HI, H7, H9, H13, H14 y ACT30. Como ejemplo adicional, las líneas de células ES de ratón que se han establecido incluyen la línea de células CGR8 establecida a partir de la masa celular interna de los embriones de la cepa de ratón 129, y los cultivos de células CGR8 se pueden cultivar en presencia de LIF sin capas alimentadoras.

Las células madre ES pueden detectarse mediante marcadores de proteínas, incluyendo el factor de transcripción Oct4, la fosfatasa alcalina (“AP”, por sus siglas en inglés), el antígeno embrionario específico de la etapa SSEA-1, el antígeno embrionario específico de la etapa SSEA-3, el antígeno embrionario específico de la etapa SSEA-4, el factor de transcripción nA n OG, antígeno de rechazo tumoral 1-60 (“TRA-1-60”, por sus siglas en inglés), antígeno de rechazo tumoral 1-81 (TRA-1-81), SOX2 o REX1.

B. Células madre pluripotentes inducidas

La inducción de pluripotencialidad se logró originalmente en 2006 utilizando células de ratón (Yamanaka et al. 2006) y en 2007 usando células humanas (Yu et al. 2007; Takahashi et al. 2007) mediante la reprogramación de células somáticas mediante la introducción de factores de transcripción que están relacionados con la pluripotencia. Las células madre pluripotentes se pueden mantener en un estado indiferenciado y son capaces de diferenciarse en casi cualquier tipo de célula. El uso de iPSCs evita la mayoría de los problemas éticos y prácticos asociados con el uso clínico a gran escala de células ES, y es posible que los pacientes con trasplantes autólogos derivados de iPSC no requieran tratamientos inmunosupresores de por vida para prevenir el rechazo del injerto.

Con la excepción de las células germinales, cualquier célula se puede utilizar como punto de partida para las iPSCs. Por ejemplo, los tipos de células podrían ser queratinocitos, fibroblastos, células hematopoyéticas, células mesenquimales, células hepáticas o células estomacales. Las células T también pueden usarse como fuente de células somáticas para la reprogramación (Patente de EE. UU. No. 8.741.648). No hay limitación sobre el grado de diferenciación celular o la edad de un animal del que se recolectan las células; incluso las células progenitoras no diferenciadas (incluyendo las células madre somáticas) y finalmente las células maduras diferenciadas pueden usarse como fuentes de células somáticas en los métodos descritos en la presente. En una realización, la célula somática es en sí misma una célula RPE, tal como una célula RPE humana. La célula RPE puede ser una célula RPE adulta o fetal. Las iPSCs se pueden cultivar en condiciones que se sabe que diferencian las células madre embrionarias humanas en tipos de células específicas y expresan marcadores de células madre embrionarias humanas, incluyendo: SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, y TRA-1-81.

Las células somáticas se pueden reprogramar para producir células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Un experto en la técnica puede producir fácilmente células madre pluripotentes inducidas, véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada No. 20090246875, la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada No. 2010/0210014; Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada No. 20120276636; Patente de EE. UU. No. 8.058.065; Patente de EE. UU. No. 8.129.187; Patente de EE. UU. No. 8.278.620; Publicación PCT No. WO 2007/069666 A1 y Patente de EE. UU. No. 8.268.620, que se incorporan en la presente como referencia. Generalmente, los factores de reprogramación nuclear se utilizan para producir células madre pluripotentes a partir de una célula somática. En algunas realizaciones, se utilizan al menos tres o al menos cuatro de Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28. En otras realizaciones, se utilizan Oct3/4, Sox2, c-Myc y Klf4.

Las células se tratan con una sustancia de reprogramación nuclear, que generalmente es uno o más factores capaces de inducir una iPSC de una célula somática o un ácido nucleico que codifica estas sustancias (incluyendo las formas integradas en un vector). Las sustancias de reprogramación nuclear generalmente incluyen al menos Oct3/4, Klf4 y Sox2, o ácidos nucleicos que codifican estas moléculas. Un inhibidor funcional de p53, L-myc o un ácido nucleico que codifica L-myc, y Lin28 o Lin28b, o un ácido nucleico que codifica Lin28 o Lin28b, pueden utilizarse como sustancias de reprogramación nuclear adicionales. Nanog también se puede utilizar para la reprogramación nuclear. Como se describe en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada No. 20120196360, los factores de reprogramación ejemplares para la producción de iPSCs incluyen (1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc (Sox2 se puede reemplazar con Soxl, Sox3, Soxl5, Soxl7 o Soxl8; Klf4 puede reemplazarse con Klfl, Klf2 o Klf5); (2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, antígeno T grande de SV40 (“SV40LT”, por sus siglas en inglés); (3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, virus del papiloma humano (“HPV”, por sus siglas en inglés)16 E6; (4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7 (5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L- Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmil; (7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28; (8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT; (9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT; (10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT; (11) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc (Esrrb puede reemplazarse con Esrrg); (12) Oct3/4, Klf4, Sox2; (13) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT; (14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HP VI 6 E6; (15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7; (16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmil; (18) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28 (19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT; (20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT; (21) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT; o (22) Oct3/4, Esrrb, Sox2 (Esrrb puede reemplazarse con Esrrg). En un ejemplo no limitativo, se utilizan Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc. En otras realizaciones, se utilizan Oct4, Nanog y Sox2, véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. No. 7.682.828, que se incorpora en la presente como referencia. Estos factores incluyen, entre otros, Oct3/4, Klf4 y Sox2. En otros ejemplos, los factores incluyen, entre otros, Oct 3/4, Klf4 and Myc. En algunos ejemplos no limitativos, se utilizan Oct3/4, Klf4, c-Myc y Sox2. En otros ejemplos no limitativos, se utilizan Oct3/4, Klf4, Sox2 y Sal 4. Factores como Nanog, Lin28, Klf4 o c-Myc pueden aumentar la eficiencia de la reprogramación y pueden expresarse a partir de varios vectores de expresión diferentes. Por ejemplo, se puede utilizar un vector integrador, tal como el sistema basado en elementos EBV (Patente de EE. UU. No.

8.546.140). En otro aspecto, las proteínas de reprogramación podrían introducirse directamente en las células somáticas mediante la transducción de proteínas. La reprogramación puede comprender además poner en contacto las células con uno o más receptores de señalización, incluyendo el inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (“GSK-3”, por sus siglas en inglés), un inhibidor de la quinasa proteína quinasa activada por mitógeno (“MEK”, por sus siglas en inglés), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) o inhibidor de señalización, factor inhibidor de leucemia (LIF), un inhibidor de p53, un inhibidor de NF-kappa B o una combinación de los mismos. Esos reguladores pueden incluir moléculas pequeñas, nucleótidos inhibidores, casetes de expresión o factores proteicos. Se anticipa que se pueden utilizar virtualmente todas las células iPS o líneas celulares.

Las secuencias de ADNc de ratón y humano de estas sustancias de reprogramación nuclear están disponibles con referencia a los números de acceso de NCBI mencionados en WO 2007/069666, que se incorpora en la presente como referencia. Los métodos para introducir una o más sustancias de reprogramación, o ácidos nucleicos que codifican estas sustancias de reprogramación, son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EE. UU. publicada No. 2012/0196360 y la Patente de EE. UU. No. 8.071.369, ambas incorporadas en la presente como referencia.

Una vez derivadas, las iPSCs se pueden cultivar en un medio suficiente para mantener la pluripotencialidad. Las iPSC se pueden usar con varios medios y técnicas desarrolladas para cultivar células madre pluripotentes, más específicamente, células madre embrionarias, como se describe en la Patente de EE. UU. No. 7.442.548 y la Publicación de Patente de EE. UU. No. 2003/0211603. En el caso de células de ratón, el cultivo se realiza con la adición del factor inhibidor de leucemia (LIF) como un factor de supresión de la diferenciación a un medio ordinario. En el caso de células humanas, es deseable que se añada factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en lugar de LIF. Se pueden usar otros métodos para el cultivo y mantenimiento de iPSC, como sabría bien un experto en la técnica.

En ciertas realizaciones, se pueden usar condiciones indefinidas; por ejemplo, las células pluripotentes pueden cultivarse en células alimentadoras de fibroblastos o en un medio que ha sido expuesto a células alimentadoras de fibroblastos para mantener las células madre en un estado indiferenciado. En algunas realizaciones, la célula se cultiva en presencia conjunta de fibroblastos embrionarios de ratón tratados con radiación o un antibiótico para terminar la división celular, tal como células alimentadoras. Alternativamente, las células pluripotentes pueden cultivarse y mantenerse en un estado esencialmente indiferenciado utilizando un sistema de cultivo definido e independiente del alimentador, tal como un medio TESR™ (Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b) o un medio E8™ (Chen et al., 2011).

En algunas realizaciones, la iPSC se puede modificar para expresar ácidos nucleicos exógenos, tal como para incluir un potenciador de tirosinasa unido operativamente a un promotor y una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer marcador. El gen de la tirosinasa se divulga, por ejemplo, en GENBANK® No. de acceso: 22173, disponible el 1 de enero de 2013. Esta secuencia se alinea con el cromosoma 7 de la ubicación 5286971-5291691 de la cepa de ratón C57BL/6 (orientación invertida). Una secuencia de 4721 pares de bases es suficiente para la expresión en células RPE, véase Murisier et al., Dev. Biol. 303: 838-847, 2007, que se incorpora en la presente como referencia. Esta construcción se expresa en las células del epitelio pigmentario de la retina. Se pueden utilizar otros potenciadores. Otros potenciadores específicos de RPE incluyen D-MITF, DCT, TYRP1, RPE65, VMD2, MERTK, MYRIP y RAB27A. Los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, cualquier promotor expresado en células del epitelio pigmentario de la retina, incluyendo el promotor de tirosinasa. La construcción también puede incluir otros elementos, tal como un sitio de unión a ribosomas para el inicio de la traducción (secuencias de unión a ribosomas internas) y un terminador de transcripción/traducción. Generalmente, es ventajoso transfectar células con la construcción. Los vectores adecuados para la transfección estable incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, vectores lentivirales y virus Sendai.

Los plásmidos se han diseñado con una serie de objetivos en mente, tal como lograr un alto número de copias regulado y evitar posibles causas de inestabilidad de plásmidos en bacterias, y proporcionar medios para la selección de plásmidos que sean compatibles con el uso en células de mamíferos, incluyendo las células humanas. Se ha prestado especial atención a los requisitos duales de los plásmidos para su uso en células humanas. En primer lugar, son adecuados para el mantenimiento y la fermentación en E. coli, por lo que se pueden producir y purificar grandes cantidades de ADN. En segundo lugar, son seguros y adecuados para su uso en pacientes humanos y animales. El primer requisito exige plásmidos de alto número de copias que se puedan seleccionar y mantener de forma estable con relativa facilidad durante la fermentación bacteriana. El segundo requisito llama la atención sobre elementos tales como marcadores seleccionables y otras secuencias de codificación. En algunas realizaciones, los plásmidos que codifican un marcador se componen de: (1) un origen de replicación de alto número de copias, (2) un marcador seleccionable, tal como, entre otros, el gen neo para la selección de antibióticos con kanamicina, (3) secuencias de terminación de la transcripción, incluyendo el potenciador de tirosinasa, y (4) un sitio de multiclonación para la incorporación de varios casetes de ácido nucleico; y (5) una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador unido operativamente al promotor de tirosinasa. Existen numerosos vectores plásmidos que se conocen en la técnica para inducir un ácido nucleico que codifica una proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a, los vectores descritos en la Patente de EE. UU. No. 6.103.470; Patente de EE. UU. No. 7.598.364; Patente de EE. UU. No. 7.989.425; y la Patente de EE. UU. No. 6.416.998, que se incorporan en la presente como referencia.

Un sistema de suministro de genes virales puede ser un vector viral basado en ARN o basado en ADN. Un sistema de administración de genes episomales puede ser un plásmido, un vector episomal basado en el virus de Epstein-Barr (“EBV”, por sus siglas en inglés), un vector basado en levadura, un vector basado en adenovirus, un vector episomal basado en el virus símico 40 (“SV40”, por sus siglas en inglés), un virus del papiloma bovino (“BPV”, por sus siglas en inglés) basado en un vector, o un vector lentiviral.

Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fluorescencia (por ejemplo, proteína fluorescente verde o proteína fluorescente roja), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina o luciferasa de luciérnaga/renilla o nanoluc) u otras proteínas. Un marcador puede ser una proteína (incluyendo las proteínas secretadas, de la superficie celular o internas; sintetizadas o absorbidas por la célula); un ácido nucleico (tal como un ARNm o una molécula de ácido nucleico enzimáticamente activa) o un polisacárido. Se incluyen determinantes de cualquiera de dichos componentes celulares que son detectables por reacción de amplificación de anticuerpos, lectina, sonda o ácido nucleico que son específicos para el marcador del tipo de células de interés. Los marcadores también pueden identificarse mediante un ensayo bioquímico o enzimático, o una respuesta biológica que depende de la función del producto génico. Las secuencias de ácido nucleico que codifican estos marcadores pueden unirse operativamente al potenciador de tirosinasa. Además, se pueden incluir otros genes, tales como genes que pueden influir en la diferenciación de células madre para RPE, función RPE, fisiología o patología. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se incluye un ácido nucleico que codifica uno o más de MITF, PAX6, TFEC, OTX2, LHX2, VMD2, CFTR, RPE65, MFRP, CTRP5, CFH, C3, C2B, APOE, APOB, mTOR, FOXO, AMPK, SIRT1-6, HTRP1, ABCA4, TIMP3, VEGFA, CFI, TLR3, TLR4, APP, CD46, BACE1, ELOLV4, ADAM 10, CD55, CD59, y ARMS2.

1. Emparejamiento de haplotipos de MHC

El complejo mayor de histocompatibilidad es la principal causa de rechazo inmunológico de los trasplantes de órganos alogénicos. Hay tres haplotipos principales de MHC de clase I (A, B y C) y tres haplotipos principales de MHC de clase II (DR, DP y DQ). Los loci de HLA son altamente polimórficos y se distribuyen en 4 Mb en el cromosoma 6. La capacidad de haplotipar los genes HLA dentro de la región es clínicamente importante, ya que esta región está asociada con enfermedades autoinmunes e infecciosas y la compatibilidad de los haplotipos h La entre el donante y el receptor puede influir en los resultados clínicos del trasplante. Los HLA correspondientes al MHC de clase I presentan péptidos del interior de la célula y los HLA correspondientes al MHC de clase II presentan antígenos del exterior de la célula a los linfocitos T. La incompatibilidad de los haplotipos de MHC entre el injerto y el huésped desencadena una respuesta inmunitaria contra el injerto y conduce a su rechazo. Por lo tanto, un paciente puede tratarse con un inmunosupresor para prevenir el rechazo.

Las líneas de células madre compatibles con HLA pueden superar el riesgo de rechazo inmunológico.

Debido a la importancia del HLA en el trasplante, los loci de HLA generalmente se tipifican mediante serología y reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”, por sus siglas en inglés) para identificar pares favorables de donante-receptor. La detección serológica de antígenos HLA de clase I y II puede lograrse mediante una prueba de linfocitotoxicidad mediada por complemento con linfocitos T o B purificados. Este procedimiento se utiliza predominantemente para emparejar loci de HLA-A y -B. La tipificación de tejidos de base molecular a menudo puede ser más precisa que las pruebas serológicas. Los métodos moleculares de baja resolución, tales como los métodos de sondas de oligonucleótidos específicos de secuencia (“SSOP”, por sus siglas en inglés), en los que los productos de PCR se analizan frente a una serie de sondas de oligonucleótidos, se pueden usar para identificar antígenos HLA, y actualmente estos métodos son los métodos más comunes utilizados para la tipificación de HLA de clase II. Las técnicas de alta resolución, tales como los métodos de cebador específico de secuencia (“SSP”, por sus siglas en inglés) que utilizan cebadores específicos de alelo para la amplificación por PCR pueden identificar alelos MHC específicos.

La compatibilidad del MHC entre un donante y un receptor aumenta significativamente si las células del donante son homocigotas de HLA, es decir, contienen alelos idénticos para cada proteína presentadora de antígeno. La mayoría de los individuos son heterocigotos para los genes MHC de clase I y II, pero algunos individuos son homocigotos para estos genes. Estos individuos homocigotos pueden servir como superdonantes y los injertos generados a partir de sus células se pueden trasplantar en todos los individuos que sean homocigotos o heterocigotos para ese haplotipo. Además, si las células de donantes homocigotos tienen un haplotipo que se encuentra con alta frecuencia en una población, estas células pueden tener aplicación en terapias de trasplante para un gran número de individuos.

Por consiguiente, las iPSCs se pueden producir a partir de células somáticas del sujeto a tratar, o de otro sujeto con el mismo o sustancialmente el mismo tipo de HLA que el del paciente. En un caso, los HLAs principales (por ejemplo, los tres loci principales de HLA-A, HLA-B y HLA-DR) del donante son idénticos a los HLAs principales del receptor. En algunos casos, el donante de células somáticas puede ser un superdonante; por lo tanto, las iPSCs derivadas de un superdonante homocigoto de MHC pueden usarse para generar células RPE. Por lo tanto, las iPSCs derivadas de un superdonante se pueden trasplantar en sujetos que son homocigotos o heterocigotos para ese haplotipo. Por ejemplo, las iPSCs pueden ser homocigotas en dos alelos HLA, tal como HLA-A y HLA-B. Como tales, las iPSCs producidas a partir de superdonantes se pueden usar en los métodos descritos en la presente para producir células RPE que potencialmente pueden “emparejarse” con una gran cantidad de receptores potenciales.

2. Vectores episomales

En ciertos aspectos, los factores de reprogramación se expresan a partir de casetes de expresión comprendidos en uno o más elementos genéticos episomales exógenos (véase la Publicación de Patente de EE. UU. 2010/0003757, incorporada en la presente como referencia). Por lo tanto, las iPSCs pueden estar esencialmente libres de elementos genéticos exógenos, tales como elementos de vectores retrovirales o lentivirales. Estas iPSCs se preparan mediante el uso de vectores que se replican extracromosómicamente (es decir, vectores episomales), que son vectores capaces de replicarse episómicamente para hacer que las iPSCs estén esencialmente libres de vectores exógenos o elementos virales (véase la Patente de EE. UU. No. 8.546.140, incorporada en la presente como referencia; Yu et al., 2009). Varios virus de ADN, tales como los adenovirus, el virus vacuolizante símico 40 (SV40) o el virus del papiloma bovino (BPV), o los plásmidos que contienen secuencias de replicación autónoma (“ARS”, por sus siglas en inglés) de levadura en ciernes, se replican extracromosómicamente o episomalmente en células de mamífero. Estos plásmidos episomales están intrínsecamente libres de todas estas desventajas (Bode et al., 2001) asociadas con los vectores de integración. Por ejemplo, un virus basado en el herpes linfotrófico, incluyendo el virus de Epstein Barr (EBV), como se definió anteriormente puede replicarse extracromosómicamente y ayudar a administrar genes de reprogramación a las células somáticas. Los elementos de EBV útiles son OriP y EBNA-1, o sus variantes o equivalentes funcionales. Una ventaja adicional de los vectores episomales es que los elementos exógenos se perderán con el tiempo después de ser introducidos en las células, lo que conducirá a iPSCs autosuficientes esencialmente libres de estos elementos.

Otros vectores extracromosómicos incluyen otros vectores basados en el virus del herpes linfotrófico. El virus del herpes linfotrófico es un virus del herpes que se replica en un linfoblasto (por ejemplo, un linfoblasto B humano) y se convierte en un plásmido durante una parte de su ciclo de vida natural. El virus del herpes simple (“HSV”, por sus siglas en inglés) no es un virus del herpes “linfotrófico”. Los virus del herpes linfotróficos ejemplares incluyen, pero no se limitan a EBV, virus del herpes del sarcoma de Kaposi (“KSHV”, por sus siglas en inglés); Herpesvirus saimiri (HS) y virus de la enfermedad de Marek (“MDV”, por sus siglas en inglés). También se contemplan otras fuentes de vectores basados en episomas, tales como ARS de levadura, adenovirus, SV40 o BPV.

C. Transferencia nuclear de células somáticas (sólo como referencia)

Las células madre pluripotentes se pueden preparar mediante el método de transferencia nuclear de células somáticas. La transferencia nuclear de células somáticas implica la transferencia de un núcleo donante a un ovocito libre de huso. En un método, los núcleos de fibroblastos de donantes de fibroblastos de la piel de un macaco rhesus se introducen en el citoplasma de ovocitos maduros de macaco rhesus en metafase II libre de huso mediante electrofusión (Byrne et al., 2007). Los ovocitos fusionados se activan mediante la exposición a ionomicina y posteriormente se incuban hasta la etapa de blastocisto. La masa celular interna de los blastocistos seleccionados se cultiva posteriormente para producir líneas de células madre embrionarias. Las líneas de células madre embrionarias muestran una morfología de células madre embrionarias normal, expresan varios marcadores de células madre embrionarias y se diferencian en múltiples tipos de células tanto in vitro como in vivo.

III. Células del epitelio pigmentario de la retina

Las células RPE se producen en los métodos descritos en la presente. Las células de la retina que son directamente sensibles a la luz son las células fotorreceptoras. Los fotorreceptores son neuronas fotosensibles en la parte externa de la retina y pueden ser bastones o conos. En el proceso de fototransducción, las células fotorreceptoras convierten la energía de la luz incidente enfocada por el cristalino en señales eléctricas que luego se envían a través del nervio óptico al cerebro. Los vertebrados tienen dos tipos de células fotorreceptoras, incluyendo conos y bastones. Los conos están adaptados para detectar detalles finos, visión central y de color, y funcionan bien con luz brillante. Los bastones son responsables de la visión periférica y de la luz tenue. Las señales neuronales de los bastones y conos son procesadas por otras neuronas de la retina.

El epitelio pigmentario de la retina actúa como una barrera entre el torrente sanguíneo y la retina, e interactúa estrechamente con los fotorreceptores en el mantenimiento de la función visual. El epitelio pigmentario de la retina está compuesto por una sola capa de células hexagonales que están densamente empaquetadas con gránulos de melanina que absorben la energía luminosa que llega a la retina. Las principales funciones de las células RPE especializadas incluyen: transporte de nutrientes, tales como glucosa, retinol y ácidos grasos de la sangre a los fotorreceptores; transporte de agua, productos finales metabólicos e iones desde el espacio subretiniano a la sangre; absorción de luz y protección contra la fotooxidación; reisomerización de todo-trans-retinol en 11 -cis-retinal; fagocitosis de membranas de fotorreceptores desprendidos; y secreción de varios factores esenciales para la integridad estructural de la retina.

El epitelio pigmentario de la retina expresa marcadores tales como la proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), RPE65, el gen de la distrofia macular viteliforme de Best (“VMD2”, por sus siglas en inglés) y el factor derivado del epitelio pigmentario (“PEDF”, por sus siglas en inglés). El mal funcionamiento del epitelio pigmentario de la retina se asocia con una serie de afecciones que alteran la visión, tal como desprendimiento del epitelio pigmentario de la retina, displasia, atrofia, retinopatía, retinosis pigmentaria, distrofia macular o degeneración.

Las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) se pueden caracterizar en función de su pigmentación, morfología epitelial y polaridad apical-basal. Las células RPE diferenciadas se pueden reconocer visualmente por su morfología de adoquines y la apariencia inicial de pigmento. Además, las células r Pe diferenciadas tienen resistencia transepitelial/TER y potencial transepitelial/TEP a través de la monocapa (TER >100 ohms. cm2; TEP >2 mV), transportan líquido y CO2 desde el lado apical al basal y regulan una secreción polarizada de citoquinas.

Las células RPE expresan varias proteínas que pueden actuar como marcadores para la detección mediante el uso de metodologías, tales como inmunocitoquímica, análisis de Western Blot, citometría de flujo e inmunoensayo ligado a enzimas (“ELISA”, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, los marcadores específicos del RPE pueden incluir: proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), factor de transcripción asociado a la microftalmía (“MITF”, por sus siglas en inglés), proteína relacionada con la tirosinasa 1 (“TYRP-1”, por sus siglas en inglés), proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (“RPE65”, por sus siglas en inglés), proteína premelanosoma (“PMEL17”, por sus siglas en inglés), bestrofina 1 (BEST1) y tirosina quinasa del protooncogén c-mer (“MERTK”, por sus siglas en inglés). Las células RPE no expresan (en ningún nivel detectable) los marcadores de células madre embrionarias Oct-4, nanog o Rex-2. Específicamente, la expresión de estos genes es aproximadamente 100-1000 veces menor en células RPE que en células ES o iPSC, cuando se evalúa mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (“RT-PCR”, por sus siglas en inglés) cuantitativa.

Los marcadores de células RPE pueden detectarse a nivel de ARNm, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), análisis de Northern Blot o análisis de hibridación de transferencia puntual utilizando cebadores específicos de secuencia en métodos de amplificación estándar utilizando datos de secuencia disponibles públicamente (GENBANK®). La expresión de marcadores específicos de tejido detectada a nivel de proteína o ARNm se considera positiva si el nivel es al menos o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces, y más particularmente más de 10, 20, 30, 40, 50 veces o más por encima del de una célula de control, tal como una célula madre pluripotente indiferenciada u otro tipo de célula no relacionada.

La disfunción, las lesiones y la pérdida de las células RPE son factores de muchas enfermedades y trastornos oculares, incluyendo la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), las degeneraciones maculares hereditarias, incluyendo la enfermedad de Best, y la retinosis pigmentaria. Un tratamiento potencial para tales enfermedades es el trasplante de células RPE en la retina de quienes lo necesitan. Se especula que la reposición de las células RPE mediante su trasplante puede retrasar, detener o revertir la degradación, mejorar la función de la retina y prevenir la ceguera derivada de tales condiciones. Sin embargo, la obtención de células RPE directamente de donantes y embriones humanos es un desafío.

A. Derivación de células RPE de cuerpos embrioides de PSCs

Las iPSCs reprogramadas utilizando factores de reprogramación bien conocidos pueden dar lugar a células oculares de linaje neuronal, incluyendo las células RPE (Hirami et al., 2009). La publicación PCT No. 2014/121077 describe métodos en los que los cuerpos embrioides (EBs) producidos a partir de iPSCs se tratan con antagonistas de Wnt y Nodal en cultivo en suspensión para inducir la expresión de marcadores de células progenitoras de la retina. Esta publicación describe métodos en donde las células r Pe se derivan de iPSCd a través de un proceso de diferenciación de EBs de las iPSCs en cultivos altamente enriquecidos para células RPE. Por ejemplo, los cuerpos embrioides se producen a partir de iPSCs mediante la adición de un inhibidor de la quinasa en espiral asociada a rho (“ROCK”, por sus siglas en inglés) y se cultivan en un primer medio que comprende dos inhibidores de la vía WNT y un inhibidor de la vía Nodal. Además, los EBs se colocan en placas en un cultivo de tejido recubierto con MATRIGEL™ en un segundo medio que no comprende el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), comprende un inhibidor de la vía Nodal, comprende de aproximadamente 20 ng a aproximadamente 90 ng de Noggin y comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5% de reemplazo de suero KnockOut para formar células RPE diferenciadoras. Las células RPE diferenciadoras se cultivan en un tercer medio que comprende ACTIVINA y WNT3a. A continuación, las células RPE se cultivan en medio RPE que incluye aproximadamente 5% de suero fetal, un inhibidor de WNT canónico, un inhibidor de WNT no canónico e inhibidores de las vías Sonic Hedgehog y FGF para producir células RPE humanas.

Existen varias desventajas en el uso de EBs para la producción de tipos de células diferenciadas. Por ejemplo, la producción de EBs es un proceso no consistente y no reproducible ya que la eficiencia varía. El tamaño y la forma de los EBs producidos a partir de iPSCs o células ES no son homogéneos, y la producción de EBs también implica un tratamiento de centrifugación que limita la velocidad. La presente descripción proporciona métodos que permiten la producción a gran escala de células derivadas de iPSCs o ES necesarias para aplicaciones clínicas, de investigación o terapéuticas que son independientes de los EBs.

B. Derivación de células RPE a partir de PSCs esencialmente unicelulares

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para producir células RPE a partir de una suspensión esencialmente unicelular de células madre pluripotentes (PSCs), tales como iPSCs humanas. En algunas realizaciones, las PSCs se cultivan hasta la confluencia previa para evitar cualquier agregado celular. En ciertos aspectos, las PSCs se disocian mediante incubación con una enzima de disociación celular, tal como la ejemplificada por TRYPSIN™ o TRYPLE™. Las PSCs también se pueden disociar en una suspensión esencialmente unicelular mediante pipeteo. Además, se puede añadir blebbistatina (por ejemplo, aproximadamente 2,5 mM) al medio para aumentar la supervivencia de las PSCs después de la disociación en células individuales mientras las células no están adheridas a un recipiente de cultivo. Alternativamente, se puede usar un inhibidor de ROCK en lugar de blebbistatina para aumentar la supervivencia de la PSC después de disociarse en células individuales.

Para diferenciar de manera eficiente las células RPE de las PSCs unicelulares, un recuento preciso de la densidad de entrada puede aumentar la eficiencia de diferenciación de RPE. Por lo tanto, la suspensión unicelular de PSCs generalmente se recuenta antes de la siembra. Por ejemplo, la suspensión unicelular de PSCs se recuenta con un hemocitómetro o un contador de células automatizado, tal como VICELL® o TC20. Las células se pueden diluir hasta una densidad celular de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 500.000 células/mL, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 200.000 células/mL, o de aproximadamente 75.000 a aproximadamente 150.000 células/mL. En un ejemplo no limitativo, la suspensión unicelular de PSCs se diluye a una densidad de aproximadamente 100.000 células/mL en un medio de cultivo completamente definido, tal como el medio ESSENTIAL 8™ (E8™).

Una vez que se obtiene una suspensión unicelular de PSCs con una densidad celular conocida, las células generalmente se siembran en un recipiente de cultivo apropiado, tal como una placa de cultivo tisular, tal como un matraz, una placa de 6 pocillos, 24 pocillos o 96 pocillos. Un recipiente de cultivo utilizado para cultivar la(s) célula(s) puede incluir, entre otros: matraz, matraz para cultivo tisular, placa, placa de Petri, placa para cultivo tisular, multiplaca, microplaca, placa de micropocillos, multiplaca, placa de múltiples pocillos, microportaobjetos, portaobjetos de cámara, tubo, bandeja, cámaras CELLSTACK®, bolsa de cultivo y botella rotatoria, siempre que sea capaz de cultivar las células madre en su interior. Las células pueden cultivarse en un volumen de al menos o aproximadamente 0,2, 0,5, 1,2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 mL, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL, 500 mL, 550 mL, 600 mL, 800 mL, 1000 mL, 1500 mL, o cualquier rango que se derive de los mismos, dependiendo de las necesidades del cultivo. En una cierta realización, el recipiente de cultivo puede ser un biorreactor, que puede referirse a cualquier dispositivo o sistema ex vivo que admita un entorno biológicamente activo de modo que las células puedan propagarse. El biorreactor puede tener un volumen de al menos o aproximadamente 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 litros, 1,2, 4, 6, 8, 10, 15 metros cúbicos o cualquier rango que se derive de los mismos.

En ciertos aspectos, las PSCs, tales como las iPSCs, se colocan en placas a una densidad celular adecuada para una diferenciación eficaz. Generalmente, las células se siembran en placas a una densidad celular de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 75.000 células/cm2, tal como de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 40.000 células/cm2 En una placa de 6 pocillos, las células se pueden sembrar a una densidad celular de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 400.000 células por pocillo. En métodos ejemplares, las células se siembran a una densidad celular de aproximadamente 100.000, aproximadamente 150.000, aproximadamente 200.000, aproximadamente 250.000, aproximadamente 300.000 o aproximadamente 350.000 células por pocillo, tal como aproximadamente 200.000 células por pocillo.

Las PSCs, tales como las iPSC, generalmente se cultivan en placas de cultivo recubiertas por una o más proteínas de adhesión celular para promover la adhesión celular mientras se mantiene la viabilidad celular. Por ejemplo, las proteínas de adhesión celular preferidas incluyen proteínas de la matriz extracelular, tales como vitronectina, laminina, colágeno y/o fibronectina que pueden usarse para recubrir una superficie de cultivo como un medio para proporcionar un soporte sólido para el crecimiento celular pluripotente. El término “matriz extracelular” se reconoce en la técnica. Sus componentes incluyen una o más de las siguientes proteínas: fibronectina, laminina, vitronectina, tenascina, entactina, trombospondina, elastina, gelatina, colágeno, fibrilina, merosina, anclarina, condronectina, proteína de enlace, sialoproteína ósea, osteocalcina, osteopontina, epinectina, hialuronectina, ondulina, epiligrina y kalinina. En métodos ejemplares, las PSCs se cultivan en placas de cultivo recubiertas con vitronectina o fibronectina. En algunas realizaciones, las proteínas de adhesión celular son proteínas humanas.

Las proteínas de la matriz extracelular (“ECM”, por sus siglas en inglés) pueden ser de origen natural y estar purificadas a partir de tejidos humanos o animales o, alternativamente, las proteínas ECM pueden ser proteínas recombinantes modificadas genéticamente o de naturaleza sintética. Las proteínas ECM pueden ser una proteína completa o en forma de fragmentos de péptidos, nativos o modificados. Los ejemplos de proteína ECM que pueden ser útiles en la matriz para cultivo celular incluyen laminina, colágeno I, colágeno IV, fibronectina y vitronectina. En algunas realizaciones, la composición de matriz incluye fragmentos peptídicos de fibronectina o fibronectina recombinante generados sintéticamente. En algunas realizaciones, la composición de la matriz está libre de xeno. Por ejemplo, en la matriz libre de xeno para cultivar células humanas, se pueden usar componentes de la matriz de origen humano, en donde se puede excluir cualquier componente animal no humano.

En algunos aspectos, la concentración de proteína total en la composición de la matriz puede ser de aproximadamente 1 ng/mL a aproximadamente 1 mg/mL. En algunas realizaciones preferidas, la concentración de proteína total en la composición de la matriz es de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 300 mg/mL. En realizaciones más preferidas, la concentración de proteína total en la composición de la matriz es de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL.

Las células, como las células RPE o PSC, se pueden cultivar con los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de cada población específica de células. Generalmente, las células se cultivan en medios de cultivo que incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y un solución amortiguadora para mantener el pH. El medio también puede contener ácidos grasos o lípidos, aminoácidos (tales como aminoácidos no esenciales), vitamina(s), factores de crecimiento, citoquinas, sustancias antioxidantes, ácido pirúvico, agentes amortiguadores y sales inorgánicas. Un medio de crecimiento ejemplar contiene un medio esencial mínimo, tal como el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) o el medio ESSENTIAL 8™ (E8™), complementado con varios nutrientes, tales como aminoácidos no esenciales y vitaminas, para mejorar el crecimiento de las células madre. Los ejemplos de medios mínimos esenciales incluyen, pero no se limitan a, medio mínimo esencial de Eagle (“MEM”, por sus siglas en inglés), medio Alfa, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio RPMI-1640, medio 199 y medio F12. Además, los medios esenciales mínimos se pueden complementar con aditivos, tales como suero de caballo, ternera o fetal bovino. Alternativamente, el medio puede estar libre de suero. En otros casos, los medios de crecimiento pueden contener “reemplazo de suero KnockOut”, denominado en la presente una formulación libre de suero optimizada para cultivar y mantener células no diferenciadas, tales como células madre, en cultivo. El reemplazo de suero KNOCKOUT™ se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EE. UU. No.

2002/0076747, que se incorpora en la presente como referencia. Preferiblemente, las PSCs se cultivan en un medio completamente definido y libre de alimentador.

Por consiguiente, las PSCs unicelulares generalmente se cultivan en un medio de cultivo completamente definido después de la siembra en placas. En ciertos aspectos, aproximadamente 18-24 horas después de la siembra, el medio se aspira y se añade medio fresco, tal como el medio E8™, al cultivo. En ciertos aspectos, las PSCs unicelulares se cultivan en el medio de cultivo completamente definido durante aproximadamente 1, 2 o 3 días después de la siembra en placas. Preferiblemente, las PSCs unicelulares se cultivan en el medio de cultivo completamente definido durante aproximadamente 2 días antes de continuar con el proceso de diferenciación.

En algunas realizaciones, el medio puede contener o no contener alternativas al suero. Las alternativas al suero pueden incluir materiales que contengan apropiadamente albúmina (tal como albúmina rica en lípidos, sustitutos de albúmina, tal como albúmina recombinante, almidón vegetal, dextranos e hidrolizados de proteínas), transferrina (u otros transportadores de hierro), ácidos grasos, insulina, precursores de colágeno, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, 3'-tiolgiycerol o sus equivalentes. Las alternativas al suero se pueden preparar mediante el método descrito en la Publicación Internacional No. WO 98/30679, por ejemplo. Alternativamente, se puede utilizar cualquier material disponible comercialmente para mayor comodidad. Los materiales disponibles comercialmente incluyen el reemplazo de suero KNOCKOUT™ (“KSR”, por sus siglas en inglés), concentrado de lípidos químicamente definidos (Gibco) y GLUTAMAX™ (Gibco).

Se pueden definir apropiadamente otras condiciones de cultivo. Por ejemplo, la temperatura de cultivo puede ser de aproximadamente 30 a 40°C, por ejemplo, al menos o aproximadamente 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C, pero sin limitarse a ellos particularmente. En una realización, las células se cultivan a 37°C. La concentración de CO2 puede ser de aproximadamente 1 a 10%, por ejemplo, de aproximadamente 2 a 5%, o cualquier rango derivable de la misma. La tensión de oxígeno puede ser al menos, hasta, o aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20% o cualquier rango derivado de la misma.

a. Medios de diferenciación

Medio de inducción retiniana

Después de que las PSCs de células individuales se hayan adherido a la placa de cultivo, las células se cultivan preferiblemente en medio de inducción retiniana para iniciar el proceso de diferenciación en células de linaje retiniano. El medio de inducción retiniana (RIM) comprende un inhibidor de la vía WNT y puede dar como resultado la diferenciación de PSCs en células de linaje retiniano. El RIM comprende además un inhibidor de la vía TGFp y un inhibidor de la vía BMP. En la Tabla 3 se muestra un medio RIM ejemplar.

El RIM puede incluir DMEM y F12 en una proporción de aproximadamente 1:1. En métodos ejemplares, se incluye un inhibidor de la vía WNT en el RIM, tal como CKI-7, se incluye un inhibidor de la vía BMP, tal como LDN193189, y se incluye el inhibidor de la vía TGFp, tal como SB431542. Por ejemplo, el RIM comprende de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 50 nM, tal como aproximadamente 10 nM, de LDN193189, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM, tal como aproximadamente 0,5 mM, de CKI-7 y de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 10 mM, tal como aproximadamente 1 mM, de SB431542. Además, el RIM puede incluir reemplazo de suero KnockOut, tal como de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aminoácidos no esenciales (“NEAA”, por sus siglas en inglés) de MEM, piruvato de sodio, suplemento N-2, suplemento B-27, ácido ascórbico y factor de crecimiento de insulina 1 (“IGF1”, por sus siglas en inglés). Preferiblemente, el IGF1 es IGF1 libre de animales (AF-IGF1) y está comprendido en el RIM de aproximadamente 0,1 ng/mL a aproximadamente 10 ng/mL, tal como aproximadamente 1 ng/mL. El medio es tal como se aspira cada día y se reemplaza con RIM nuevo. Las células generalmente se cultivan en el RIM durante de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 días, tal como aproximadamente 1,2, 3, 4 o 5 días, tal como aproximadamente 2 días para producir células de linaje retiniano.

Medio de diferenciación retiniana

Las células del linaje retiniano se pueden cultivar en medio de diferenciación retiniana (RDM) para una diferenciación adicional. El RDM comprende un inhibidor de la vía WNT, un inhibidor de la vía BMP, un inhibidor de la vía TGFp y un inhibidor de MEK. En una realización, el RDM comprende un inhibidor de la vía WNT, tal como CKI-7, un inhibidor de la vía BMP, tal como LDN193189, un inhibidor de la vía TGFp, tal como SB431542, y un inhibidor de MEK, tal como PD0325901. Alternativamente, el RDM puede comprender un inhibidor de la vía WNT, un inhibidor de la vía BMP, un inhibidor de la vía TGFp y un inhibidor de bFGF. Generalmente, las concentraciones del inhibidor de la vía Wnt, el inhibidor de la vía BMP y el inhibidor de la vía TGFp son más altas en el RDM en comparación con el RIM, tal como de aproximadamente 9 a aproximadamente 11 veces más altas, tal como aproximadamente 10 veces más altas. En métodos ejemplares, el RDM comprende de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 200 nM, tal como aproximadamente 100 nM de LDN193189, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM, tal como aproximadamente 5 mM de CKI-7, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, tal como aproximadamente 10 mM de SB431542, y de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM, tal como aproximadamente 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM o 9 mM de PD0325901. En la Tabla 3 se muestra un medio RDM ejemplar.

Generalmente, el RDM comprende DMEM y F12 en una proporción de aproximadamente 1:1, reemplazo de suero KnockOut (por ejemplo, de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, tal como aproximadamente 1,5%), NEAA de MEM, piruvato de sodio, suplemento N-2, B- 27, ácido ascórbico e IGF1 (por ejemplo, de aproximadamente 1 ng/mL a aproximadamente 50 ng/mL, tal como aproximadamente 10 ng/mL). En métodos particulares, las células reciben RDM nuevo cada día después de la aspiración del medio del día anterior. Generalmente, las células se cultivan en el RDM durante aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 días, tal como durante aproximadamente 7 días para derivar células retinianas diferenciadas.

Medio retiniano

A continuación, las células retinianas diferenciadas se pueden diferenciar aún más cultivando las células en medio retiniano (RM). El medio retiniano comprende Activina A y puede comprender adicionalmente Nicotinamida. El RM puede comprender de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 ng/mL, tal como aproximadamente 100 ng/mL, de ACTIVINA A, y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, tal como aproximadamente 10 mM, de nicotinamida. Alternativamente, el RM puede comprender otros activadores de la vía TGF-p, tal como GDF1 y/o activadores de la vía WNT, tales como WAY-316606, IQ1, QS11, SB-216763, BIO (6-bromoindirrubina-3'-oxima) o 2-amino-4-[3,4-(metilendioxi)bencil-amino]-6-(3-metoxifenil)pirimidina. Alternativamente, el RM puede comprender adicionalmente WNT3a. En la Tabla 3 se muestra un medio RM ejemplar.

El RM puede incluir DMEM y F12 en una proporción de aproximadamente 1:1, reemplazo de suero KnockOut en de aproximadamente 1% a aproximadamente un 5%, tal como aproximadamente 1,5%, aminoácidos no esenciales (NEAA) de MEM, piruvato de sodio, suplemento N-2 , suplemento B-27 y ácido ascórbico. El medio se puede cambiar diariamente con RM a temperatura ambiente. Las células generalmente se cultivan en el RM durante aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 días, por ejemplo, durante aproximadamente 10 días, para obtener células RPE diferenciadas.

Medio de maduración de RPE

Para una mayor diferenciación de las células RPE, las células se cultivan preferiblemente en medio de maduración de RPE (RPE-MM). Los medios RPE-MM de ejemplo se muestran en la Tabla 3. El medio de maduración de RPE puede comprender de aproximadamente 100 mg/mL a aproximadamente 300 mg/mL, tal como aproximadamente 250 mg/mL, de taurina, de aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, tal como aproximadamente 20 mg/L, de hidrocortisona y de aproximadamente 0,001 mg/L a aproximadamente 0,1 mg/L, tal como aproximadamente 0,013 mg/L, de triyodotironina. Además, el RPE-MM puede comprender MEM Alfa, suplemento N-2, aminoácidos no esenciales (NEAA) de MEM y piruvato de sodio, y suero bovino fetal (por ejemplo, aproximadamente 5%). El medio se puede cambiar cada dos días con RPE-MM a temperatura ambiente. Las células se cultivan generalmente en RPE-MM durante de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 días, tal como aproximadamente 5 días. A continuación, las células pueden disociarse, por ejemplo, con una enzima de disociación celular, sembrarse nuevamente y cultivarse durante un período de tiempo adicional, tal como de aproximadamente 5 a 30 días adicionales, tal como de aproximadamente 15 a 20 días, para una mayor diferenciación en células RPE. En realizaciones adicionales, el RPE-MM no incluye un inhibidor de la vía WNT. Las células RPE se pueden crioconservar en esta etapa.

B. Maduración de células RPE

A continuación, las células RPE se pueden cultivar en el RPE-MM durante un período de tiempo continuo para la maduración. En algunas realizaciones, las células RPE se cultivan en pocillos, tal como una placa de 6, 12, 24 o 10 cm. Las células RPE se pueden mantener en medio RPE durante de aproximadamente cuatro a aproximadamente diez semanas, tal como durante de aproximadamente seis a ocho semanas, tal como durante seis, siete u ocho semanas. En métodos ejemplares para la maduración continua de las células RPE, las células pueden disociarse en una enzima disociada de células, tal como TRYPLE™ y sembrarse nuevamente en un ensamblaje de andamio degradable, tal como en un diseño especializado SNAPWELL™ durante aproximadamente una o dos semanas en RPE- MM con un inhibidor de MEK, tal como PD0325901. Alternativamente, el RPE-MM puede comprender un inhibidor de bFGF en lugar del inhibidor de MEK. Los métodos para cultivar células RPE en un andamio degradable se enseñan y describen en la publicación PCT No. WO 2014/121077, que se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. En resumen, los componentes principales de este método son una placa CORNING® COSTAR® SNAPWELL™, una junta tórica bioinerte y un andamio biodegradable. Las placas SNAPWELL™ proporcionan la estructura y plataforma para los andamios biodegradables. La membrana microporosa que crea un lado apical y basal es ideal para brindar soporte al andamio y aislar los distintos lados de la capa polarizada de células. La capacidad del inserto SNAPWELL™ para separar la membrana permite que el anillo de soporte del inserto se utilice como un ancla para el andamio. Las monocapas resultantes diferenciadas, polarizadas y confluentes de células RPE funcionales pueden crioconservarse en esta etapa (por ejemplo, en medio libre de xeno CS10).

En una realización, las células RPE maduras se pueden desarrollar adicionalmente en monocapas de células RPE funcionales que se comportan como tejido RPE intacto mediante cultivo continuo en RPE-MM con productos químicos adicionales o moléculas pequeñas que promueven la maduración de RPE. Por ejemplo, estas moléculas pequeñas son inductores de cilio primarios, tales como la prostaglandina E2 (PGE2) o la afidicolina. La PGE2 se puede añadir al medio a una concentración de alrededor de 25 mM a alrededor de 250 mM, tal como aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM. Alternativamente, el RPE-MM puede comprender inhibidores canónicos de la vía WNT. Los inhibidores canónicos ejemplares de la vía WNT son N-(6-metil-2-benzotiazolil)-2-[(3,4,6,7-tetrahidro-4-oxo-3-feniltieno[3,2-d]pirimidin-2-il)tio]-acetamida (IWP2) o 4-(1,3,3a,4,7,7a-hexahidro-1,3-dioxo-4,7-metano-2H-isoindol-2-il)-N-8-quinolinil-benzamida (endo-IWR1). Las células se pueden cultivar en este medio durante un período de tiempo adicional, tal como de aproximadamente una semana a aproximadamente cinco semanas adicionales, tal como aproximadamente de otras dos a cuatro semanas para obtener monocapas de células RPE maduras y funcionales. Por lo tanto, los métodos descritos actualmente proporcionan células RPE maduras a partir de suspensiones unicelulares de células pluripotentes que se pueden reproducir de forma consistente a gran escala para aplicaciones clínicas.

C. Crioconservación de células RPE

Las células del epitelio pigmentario de la retina producidas mediante los métodos descritos en la presente se pueden crioconservar, véase, por ejemplo, la publicación PCT No. 2012/149484 A2. Las células se pueden crioconservar con o sin sustrato. En varias realizaciones, la temperatura de almacenamiento varía de aproximadamente -50°C a aproximadamente -60°C, aproximadamente -60°C a aproximadamente -70°C, aproximadamente -70°C a aproximadamente -80°C, aproximadamente -80°C a aproximadamente -90°C, aproximadamente -90°C a aproximadamente -100°C, y rangos superpuestos de los mismos. En algunas realizaciones, se usan temperaturas más bajas para el almacenamiento (por ejemplo, mantenimiento) de las células crioconservadas. En varias realizaciones, se usa nitrógeno líquido (u otro refrigerante líquido similar) para almacenar las células. En otras realizaciones, las células se almacenan durante más de aproximadamente 6 horas. En realizaciones adicionales, las células se almacenan aproximadamente 72 horas. En varias realizaciones, las células se almacenan de 48 horas a aproximadamente una semana. En aún otras realizaciones, las células se almacenan durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas. En realizaciones adicionales, las células se almacenan durante 1, 2, 3, 4, 5, 67, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. Las células también se pueden almacenar durante más tiempo. Las células se pueden crioconservar por separado o sobre un sustrato, tal como cualquiera de los sustratos descritos en la presente.

En algunas realizaciones, se pueden usar crioprotectores adicionales. Por ejemplo, las células se pueden crioconservar en una solución de crioconservación que comprende uno o más crioprotectores, tales como DM80, albúmina sérica, tal como albúmina sérica humana o bovina. En ciertas realizaciones, la solución comprende aproximadamente 1%, aproximadamente 1,5%, aproximadamente 2%, aproximadamente 2,5%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, o aproximadamente 10% de DMSO. En otras realizaciones, la solución comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 3%, de aproximadamente 2% a aproximadamente 4%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 4% a aproximadamente 6%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 7%, de aproximadamente 6% a aproximadamente 8%, de aproximadamente 7% a aproximadamente 9%, o de aproximadamente 8% a aproximadamente 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) o albúmina. En una realización específica, la solución comprende DMSO al 2,5%. En otra realización específica, la solución comprende DMSO al 10%.

Las células se pueden enfriar, por ejemplo, a aproximadamente 1°C por minuto durante la crioconservación. En algunas realizaciones, la temperatura de crioconservación es de aproximadamente -80° a aproximadamente -180°C, o de aproximadamente -125°C a aproximadamente -140°C. En algunas realizaciones, las células se enfrían a 4°C antes del enfriamiento a aproximadamente 1°C/minuto. Las células crioconservadas se pueden transferir a la fase de vapor de nitrógeno líquido antes de descongelarlas para su uso. En algunas realizaciones, por ejemplo, una vez que las células han alcanzado aproximadamente -80°C, se transfieren a un área de almacenamiento de nitrógeno líquido. La crioconservación también se puede realizar utilizando un congelador de velocidad controlada. Las células crioconservadas se pueden descongelar, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, y típicamente a una temperatura de aproximadamente 37°C.

d. Inhibidores

Inhibidores de la vía WNT

WNT es una familia de moléculas de señalización secretadas y altamente conservadas que regulan las interacciones de célula a célula y están relacionadas con el gen de polaridad del segmento de Drosophila, sin alas. En los seres humanos, la familia de genes WNT codifica glucoproteínas ricas en cisteína de 38 a 43 kDa. Las proteínas WNT tienen una secuencia de señal hidrofóbica, una secuencia de consenso de oligosacárido ligada a asparagina conservada (véase, por ejemplo, Shimizu et al., Cell Growth Differ 8: 1349-1358 (1997)) y 22 residuos de cisteína conservados. Debido a su capacidad para promover la estabilización de la beta-catenina citoplasmática, las proteínas WNT pueden actuar como activadores de la transcripción e inhibir la apoptosis. Se ha demostrado que la sobreexpresión de determinadas proteínas WNT está asociada con ciertos cánceres.

En la presente, un inhibidor de WNT se refiere a inhibidores de WNT en general. Por lo tanto, un inhibidor de WNT se refiere a cualquier inhibidor de un miembro de la familia de proteínas WNT, incluyendo Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt4, Wnt5A, Wnt6, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt9A, Wnt10a, Wnt11 y Wnt16. Ciertas realizaciones de los presentes métodos se refieren a un inhibidor de WNT en el medio de diferenciación. Los ejemplos de inhibidores de WNT adecuados, ya conocidos en la técnica, incluyen diclorhidrato de N-(2-aminoetil)-5-cloroisoquinolina-8-sulfonamida (CKI-7), N-(6-metil-2-benzotiazolil)-2-[(3,4,6,7-tetrahidro-4-oxo-3-feniltieno[3,2-d]pirimidin-2-il)tio]-acetamida (IWP2), N-(6-metil-2-benzotiazolil)-2-[(3,4,6,7-tetrahidro-3-(2-metoxifenil)-4-oxotieno[3,2-d]pirimidin-2-il) tio]-acetamida (IWP4), ácido 2-fenoxibenzoico-[(5-metil-2-furanil)metileno]hidrazida (PNU 74654) 2,4-diamino-quinazolina, quercetina, 3,5,7,8-tetrahidro-2-[4-(trifluorometil)fenil]-4H-tiopirano[4,3-d]pirimidin-4-ona (XAV939), 2,5-dicloro-N-(2-metil-4-nitrofenil)bencenosulfonamida (FH 535), N-[4-[2-etil-4-(3-metilfenil)-5-tiazolil]-2-piridinil]benzamida (TAK 715), proteína 1 relacionada con Dickkopf (DKK1), y proteína relacionada con frizzled secretada (SFRP1) 1. Además, los inhibidores de WNT pueden incluir anticuerpos contra, variantes negativas dominantes de, y ARNip y ácidos nucleicos antisentido que suprimen la expresión de WNT. La inhibición de WNT también se puede lograr usando interferencia mediada por ARN (iARN).

Inhibidores de la vía BMP

Las proteínas morfogénicas óseas (BMPs) son factores de crecimiento multifuncionales que pertenecen a la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGFp). Se considera que las BMP constituyen un grupo de señales morfogenéticas fundamentales que orquestan la arquitectura a través del cuerpo. Se destaca el importante funcionamiento de las señales de BMP en fisiología mediante la multitud de funciones de la señalización de BMP desregulada en los procesos patológicos.

Los inhibidores de la vía de BMP pueden incluir inhibidores de la señalización de BMP en general o inhibidores específicos de BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP10 o BMP15. Ejemplos de inhibidores de BMP incluyen clorhidrato de 4-(6-(4-(piperazin-1-il)fenil)pirazolo[1,5-a] pirimidin-3-il)quinolina (LDN193189), diclorhidrato de 6-[4-[2-(1-piperidinil)etoxi]fenil]-3-(4-piridinil)-pi razolo[1,5-a] pirimidina (dorsomorfina), 4-[6-[4-(1-metiletoxi)fenil]pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-quinolina (DMH1), 4-[6-[4-[2-(4-morfolinil)etoxi]fenil]pirazolo[1,5-a]pi rimidin-3il]quinolina (DMH-2), y 5-[6-(4-metoxifenil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]quinolina (ML 347).

Inhibidores de la vía de TGFp

El factor de crecimiento transformante beta (TGFp) es una proteína secretada que controla la proliferación, la diferenciación celular y otras funciones en la mayoría de las células. Es un tipo de citoquina que desempeña un papel en la inmunidad, el cáncer, el asma bronquial, la fibrosis pulmonar, las enfermedades cardíacas, la diabetes y la esclerosis múltiple. El TGF-p existe en al menos tres isoformas denominadas TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3. La familia TGF-p forma parte de una superfamilia de proteínas conocida como superfamilia del factor de crecimiento transformante beta, que incluye inhibinas, activina, hormona anti-mülleriana, proteína morfogenética ósea, decapentapléjica y Vg-1.

Los inhibidores de la vía TGFp pueden incluir cualquier inhibidor de la señalización de TGFp en general. Por ejemplo, el inhibidor de la vía TGFp es 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida (SB431542), 6-[2-(1,1-dimetiletil)-5-(6-metil-2-piridinil)-1H-imidazol-4-il]quinoxalina (SB525334), hidrato de clorhidrato de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-ieributil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina (Sb -505124), hidrato de 4-(5-benzol[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)-benzamida, hidrato de 4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida , factor de determinación izquierda-derecha (Lefty), 3-(6-Metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1 H-pirazol-1 -carbotioamida (A 83­ 01), 4-[4-(2,3-Dihidro-1,4-benzodioxin-6-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida (D 4476), 4-[4-[3-(2-Piridinil)-1H-pirazol-4-il]-2-piridinil]-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-benzamida (GW 788388), 4-[3-(2-Piridinil)-1 H-pirazol-4-il]-quinolina (LY 364847), 4-[2-Fluoro-5-[3-(6-metil-2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]fenil]-1H-pirazol-1-etanol (R 268712) o 2-(3-(6-Metilpiridin-2-il)-1 H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina (RepSox).

Inhibidores de MEK

Un inhibidor de MEK es una sustancia química o fármaco que inhibe las enzimas de proteína quinasa activadas por mitógenos MEK1 o MEK2. Se pueden usar para afectar la vía MAPK/ERK. Por ejemplo, los inhibidores de MEK incluyen N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-benzamida (PD0325901), N-[3-[3-ciclopropil-5-(2-luoro-4-yodoanilino)-6,8-dimetil1-2,4,7-trioxopirido[4,3-d]pirimidin-1-il]fenil]acetamida (GSK1120212), 6-(4-bromo-2-fluoroanilino)-7-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-3-metilbencimidazol-5-carboxamida (MEK162), N-[3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-yodoanilino)-6-metoxifenil]-1-(2,3-dihidroxipropil)ciclopropano-1-sulfonamida (RDEA119), y 6-(4-bromo-2-cloroanilino)-7-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-3-metilbencimidazol-5-carboxamida (AZD6244).

Inhibidores de bFGF

El factor de crecimiento de fibroblastos básico (también conocido como bFGF, FGF2 o FGF-p) es un miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos. bFGF está presente en las membranas basales y en la matriz extracelular subendotelial de los vasos sanguíneos. Además, el bFGF es un componente común del medio de cultivo ESC humano en el que es necesario que las células permanezcan en un estado indiferenciado.

Los inhibidores de bFGF en la presente se refieren a inhibidores de bFGF en general. Por ejemplo, los inhibidores de bFGF incluyen, pero no se limitan a, N-[2-[[4-(dietilamino)butil]amino-6-(3,5-dimetoxifenil)pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N'-(1,1 -dimetiletil)urea (PD173074), 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H-1-benzopiran-4-ona (PD 98059), 1-terc-butil-3-[6-(2,6-diclorofenil)-2-[[4-(dietilamino)butil]amino]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]urea (PD161570), hidrato de diclorhidrato de 6-(2,6-diclorofenil)-2-[[4-[2-(dietilamino)etoxi]fenil]amino]-8-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PD166285), N-[2-amino-6-(3,5-dimetoxifenil)pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N'-(1,1-dimetiletil)-urea (PD166866) y ^m K-2206.

IV. Uso de células del epitelio pigmentario de la retina

Ciertos aspectos proporcionan un método para producir un RPE o una población de células enriquecidas en RPE que se puede usar para varios fines importantes de investigación, desarrollo y comerciales.

En algunos aspectos, los métodos descritos en la presente dan como resultado una población celular de al menos o aproximadamente 106, 107, 108, 5*108, 109, 1010 células (o cualquier rango derivado de las mismas) que comprende al menos o aproximadamente 90% (por ejemplo, al menos o aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, o cualquier rango derivable de las mismas) de células RPE.

En ciertos aspectos, las células de partida para los presentes métodos pueden comprender el uso de al menos o aproximadamente 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 células o cualquier rango derivable de las mismas. La población de células de partida puede tener una densidad de siembra de al menos o aproximadamente 10, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 células/mL, o cualquier rango derivado de la misma.

Las células RPE producidas por los métodos descritos en la presente pueden usarse en cualquier método y aplicación actualmente conocida en la técnica para células RPE. Por ejemplo, se puede proporcionar un método para evaluar un compuesto, que comprende analizar una propiedad farmacológica o toxicológica del compuesto en la célula RPE. También se puede proporcionar un método para evaluar el efecto de un compuesto en una célula RPE, que comprende: a) poner en contacto las células RPE proporcionadas en la presente con el compuesto; y b) ensayar un efecto del compuesto sobre las células RPE.

A. Prueba de detección de compuestos

Las células RPE se pueden usar comercialmente para detectar factores (tales como solventes, fármacos de molécula pequeña, péptidos, oligonucleótidos) o condiciones ambientales (tales como condiciones de cultivo o manipulación) que afectan las características de dichas células y su diversa progenie. Por ejemplo, los compuestos de prueba pueden ser compuestos químicos, moléculas pequeñas, polipéptidos, factores de crecimiento, citoquinas u otros agentes biológicos.

En una realización, un método incluye poner en contacto una célula RPE con un agente de prueba y determinar si el agente de prueba modula la actividad o función de las células RPE dentro de la población. En algunas aplicaciones, los ensayos de cribado se utilizan para la identificación de agentes que modulan la proliferación de las células RPE o alteran la diferenciación de las células RPE. Los ensayos de cribado se pueden realizar in vitro o in vivo. Los métodos de cribado e identificación de agentes oculares o agentes de RPE incluyen los adecuados para el cribado de alto rendimiento. Por ejemplo, las células RPE se pueden posicionar o colocar en una placa de cultivo, un matraz, una botella rotatoria o una placa (por ejemplo, una única placa o placa de múltiples pocillos, tal como un plato o placa de múltiples pocillos de 8, 16, 32, 64, 96, 384 y 1536), opcionalmente en ubicaciones definidas, para la identificación de moléculas potencialmente terapéuticas. Las bibliotecas que pueden examinarse incluyen, por ejemplo, bibliotecas de moléculas pequeñas, bibliotecas de ARNip y bibliotecas de vectores de transfección adenoviral.

Otras aplicaciones de detección se relacionan con la prueba de compuestos farmacéuticos para determinar su efecto sobre el mantenimiento o la reparación del tejido retiniano. El cribado se puede realizar debido a que el compuesto está diseñado para tener un efecto farmacológico en las células o debido a que un compuesto diseñado para tener efectos en otros lugares puede tener efectos secundarios no deseados en las células de este tipo de tejido.

B. Terapia y trasplante

Otras realizaciones también pueden proporcionar el uso de células RPE para mejorar el mantenimiento del tejido ocular y la reparación de cualquier afección que lo necesite, incluyendo la degeneración de la retina o una lesión significativa.

Para determinar la idoneidad de las composiciones celulares para la administración terapéutica, las células se pueden probar primero en un modelo animal adecuado. En un aspecto, las células RPE se evalúan en cuanto a su capacidad para sobrevivir y mantener su fenotipo in vivo. Las composiciones celulares se administran a animales inmunodeficientes (por ejemplo, ratones desnudos o animales que se vuelven inmunodeficientes químicamente o por irradiación). Los tejidos se recolectan después de un período de crecimiento y se evalúa si las células derivadas de células madre pluripotentes todavía están presentes.

Existen varios animales disponibles para probar la idoneidad de las composiciones de las células RPE. Por ejemplo, la rata del Real Colegio de Cirujanos (“RCS”, por sus siglas en inglés) es un modelo bien conocido de distrofia retiniana (Lund et al., 2006). Además, la idoneidad y la supervivencia de las células RPE pueden determinarse mediante trasplante (por ejemplo, subcutáneo o subretiniano) en matrigel en animales inmunodeficientes, tales como los ratones NOG (Kanemura et al., 2014).

Las células RPE humanas descritas en la presente, o una composición farmacéutica que incluye estas células, se pueden usar para la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite. Las células RPE se pueden crioconservar previamente. En ciertos aspectos, las células RPE descritas se derivan de iPSCs y, por lo tanto, se pueden usar para proporcionar “medicina personalizada” para pacientes con enfermedades oculares. En algunas realizaciones, las células somáticas obtenidas de pacientes pueden modificarse genéticamente para corregir la mutación que causa la enfermedad, diferenciarse en RPE y modificarse para formar un tejido RPE. Este tejido RPE se puede utilizar para reemplazar el RPE degenerado endógeno del mismo paciente. Alternativamente, se pueden utilizar iPSCs generadas a partir de un donante sano o de “superdonantes” homocigotos de HLA. Las células RPE se pueden tratar in vitro con ciertos factores, tal como el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), el factor de crecimiento transformante (TGF)-beta y/o el ácido retinoico para generar un entorno antiinflamatorio e inmunosupresor in vivo.

Pueden tratarse o prevenirse diversas afecciones oculares mediante la introducción de células RPE obtenidas usando los métodos descritos en la presente. Las condiciones incluyen enfermedades o trastornos de la retina generalmente asociados con disfunción o degradación de la retina, lesión de la retina y/o pérdida del epitelio pigmentario de la retina. Las condiciones que pueden tratarse incluyen, sin limitación, enfermedades degenerativas de la retina, tales como distrofia macular de Stargardt, retinitis pigmentosa, degeneración macular (tal como degeneración macular relacionada con la edad), glaucoma y retinopatía diabética. Las afecciones adicionales incluyen amaurosis congénita de Lebers, degeneración macular hereditaria o adquirida, enfermedad de Best, desprendimiento de retina, atrofia giratoria, coroideremia, distrofia de patrón, otras distrofias del RPE, y daño retiniano y del RPE debido al daño causado por cualquiera de efectos fóticos, láser, lesión inflamatoria, infecciosa, por radiación, neovascular o traumática. En ciertas realizaciones, se proporcionan métodos para tratar o prevenir una afección caracterizada por degeneración de la retina, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de una composición que comprende células RPE. Estos métodos pueden incluir seleccionar un sujeto con una o más de estas afecciones y administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de células RPE suficiente para tratar la afección y/o mejorar los síntomas de la afección. Las células RPE se pueden trasplantar en diversos formatos. Por ejemplo, las células RPE pueden introducirse en el sitio objetivo en forma de suspensión celular o adherirse a una matriz, matriz extracelular o sustrato, tal como un polímero biodegradable, tal como una monocapa o una combinación. Las células RPE también se pueden trasplantar en conjunto (co-trasplante) con otras células de la retina, tal como con fotorreceptores. En algunas realizaciones, las células RPE se producen a partir de iPSCs del sujeto a tratar y, por lo tanto, son autólogas. En otras realizaciones, las células RPE se producen a partir de un donante compatible con MHC.

En alguna realización, las células RPE se pueden usar para injertos autólogos de RPE en aquellos sujetos que son adecuados para recibir medicina regenerativa. Las células RPE se pueden trasplantar en combinación con otras células de la retina, tal como con fotorreceptores. El trasplante de las células RPE producidas mediante los métodos descritos se puede realizar mediante diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los métodos para realizar trasplantes de RPE se describen en la Patente de EE. UU. No. 5.962.027 y la Patente de EE. UU. No. 6.045.791, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. De acuerdo con una realización, el trasplante se realiza mediante cirugía de vitrectomía pars pana seguida de la administración de las células a través de una pequeña abertura retiniana al espacio subretiniano o mediante inyección directa. Las células RPE pueden introducirse en el sitio objetivo en forma de suspensión celular, adherirse a una matriz, tal como una matriz extracelular, o proporcionarse sobre un sustrato, tal como un polímero biodegradable. Las células RPE también se pueden trasplantar en conjunto (co-trasplante) con otras células, tal como las células de la retina con fotorreceptores. Por lo tanto, se proporciona una composición que comprende células RPE obtenidas mediante los métodos descritos en la presente. En algunas realizaciones, estas células RPE incluyen un potenciador de tirosinasa unido operativamente a un promotor y un ácido nucleico que codifica un marcador. En otras realizaciones, las células RPE también incluyen un segundo promotor constitutivo unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un segundo marcador.

Composiciones farmacéuticas de las células RPE producidas por los métodos descritos en la presente. Esta composición puede incluir al menos aproximadamente 1 * 103 células RPE, aproximadamente 1 * 104 células RPE, aproximadamente 1 * 105 células RPE, aproximadamente 1 * 106 células RPE, aproximadamente 1 * 107 células RPE, aproximadamente 1 * 108 células RPE o aproximadamente 1 * 109 células RPE. En ciertas realizaciones, las composiciones son preparaciones sustancialmente purificadas (con respecto a las células que no son RPE) que comprenden células RPE diferenciadas producidas por los métodos descritos en la presente. También se proporcionan composiciones que incluyen un andamio, tal como un portador polimérico y/o una matriz extracelular, y una cantidad efectiva de células RPE producidas por los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, las células se proporcionan como una monocapa de células. El material de la matriz es generalmente fisiológicamente aceptable y adecuado para su uso en aplicaciones in vivo. Por ejemplo, los materiales fisiológicamente aceptables incluyen, entre otros, materiales de matriz sólida que son absorbibles y/o no absorbibles, tales como submucosa del intestino delgado (“SIS”, por sus siglas en inglés), alginato reticulado o no reticulado, hidrocoloide, espumas, gel de colágeno, esponja de colágeno, malla de ácido poliglicólico (“PGA”, por sus siglas en inglés), fibras y bioadhesivos.

Los portadores poliméricos adecuados también incluyen mallas o esponjas porosas formadas por polímeros sintéticos o naturales, así como soluciones poliméricas. Por ejemplo, la matriz es una malla o esponja polimérica, o un hidrogel polimérico. Los polímeros naturales que pueden usarse incluyen proteínas, tales como colágeno, albúmina y fibrina; y polisacáridos, tales como alginato y polímeros de ácido hialurónico. Los polímeros sintéticos incluyen polímeros biodegradables y no biodegradables. Por ejemplo, los polímeros biodegradables incluyen polímeros de hidroxiácidos, tales como ácido poliáctico (“PLA”, por sus siglas en inglés), ácido poliglicólico (PGA) y ácido poliláctico-ácido glicólico (“PGLA”, por sus siglas en inglés), poliortoésteres, polianhídridos, polifosfacenos y combinaciones de los mismos. Los polímeros no biodegradables incluyen poliacrilatos, polimetacrilatos, etileno acetato de vinilo y alcoholes polivinílicos.

Se pueden usar polímeros que pueden formar hidrogeles iónicos o reticulados covalentemente que son maleables. Un hidrogel es una sustancia que se forma cuando un polímero orgánico (natural o sintético) se reticula mediante enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura de celosía abierta tridimensional que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Ejemplos de materiales que pueden usarse para formar un hidrogel incluyen polisacáridos, tales como alginato, polifosfazinas y poliacrilatos, que se reticulan iónicamente, o copolímeros de bloque, tales como PLURONICS™ o TETRONICS™, copolímeros de bloque de óxido de polietileno-polipropilenglicol que se reticulan mediante temperatura o H, respectivamente. Otros materiales incluyen proteínas, tal como la fibrina, polímeros, tales como la polivinilpirrolidona, el ácido hialurónico y el colágeno.

Las composiciones farmacéuticas pueden envasarse opcionalmente en un recipiente adecuado con instrucciones escritas para un fin deseado, tal como la reconstitución de la función de las células RPE para mejorar una enfermedad o anomalía del tejido retiniano. En algunas realizaciones, las células RPE producidas por los métodos descritos pueden diseñarse para formar RPE, que puede usarse para reemplazar el RPE degenerado de un sujeto que lo necesite.

C. Distribución con fines comerciales, terapéuticos y de investigación

En algunas realizaciones, se proporciona un sistema de reactivos que incluye un conjunto o combinación de células que comprenden una población de células enriquecidas en RPE que existe en cualquier momento durante la fabricación, distribución o uso. Los conjuntos de células comprenden cualquier combinación de la población celular descrita en la presente en combinación con células madre pluripotentes indiferenciadas u otros tipos de células diferenciadas, que a menudo comparten el mismo genoma. Cada tipo de célula puede envasarse en conjunto o en contenedores separados en la misma instalación, o en diferentes lugares, en el mismo momento o en momentos diferentes, bajo el control de la misma entidad o de diferentes entidades que comparten una relación comercial.

Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar opcionalmente en un recipiente adecuado con instrucciones escritas para un propósito deseado, tal como la reconstitución de la función de las células RPE para mejorar una enfermedad o lesión del tejido ocular.

V. Kits

En algunas realizaciones, se proporciona un kit que puede incluir, por ejemplo, uno o más medios y componentes para la producción de células RPE. El sistema de reactivos puede envasarse en medios acuosos o en forma liofilizada, según sea el caso. Los medios de recipiente de los kits incluirán generalmente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio de recipiente, en el que se puede colocar un componente y, preferiblemente, dividirlo en alícuotas adecuadas. Cuando hay más de un componente en el kit, el kit también generalmente contendrá un segundo, tercer u otro recipiente adicional en el que los componentes adicionales se pueden colocar por separado. Sin embargo, se pueden incluir diversas combinaciones de componentes en un vial. Los componentes del kit se pueden proporcionar como polvo(s) seco(s). Cuando los reactivos y/o componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un solvente adecuado. Se prevé que el solvente también se pueda proporcionar en otros medios de recipiente. Normalmente, los kits también incluirán un medio para contener los componentes del kit en un espacio cerrado para la venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o por soplado en los que se retienen los viales deseados. El kit también puede incluir instrucciones de uso, tal como en formato impreso o electrónico, tal como en formato digital.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben entender que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas que el inventor ha descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención y, por lo tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían, en vista de la presente divulgación, entender que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen y todavía obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1 - Preparación de la población de células madre pluripotentes de partida

Una población inicial de células RPE puede derivarse de células madre pluripotentes, tales como células ES e iPSCs. En métodos ejemplares, las células RPE se derivaron de iPSCs humanas reprogramadas a partir de células somáticas mediante métodos conocidos en la técnica, tal como la Patente de EE. UU. No. 8.546.140, Patente de EE. UU. No.

8.741.648, Patente de EE. UU. No. 8.691.574, Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada No. 20090246875, Patente de EE. UU. Publicada No. 8.278.104, Patente de EE. UU. Publicada No. 9.005.967, Patente de EE. UU. No. 8.058.065, Patente de EE. UU. No. 8.129.187, Publicación PCT No. WO 2007/069666 A1, Patente de EE. UU. No. 8.183.038 y Patente de EE. UU. No. 8.268.620, que se incorporan en la presente como referencia. Por ejemplo, los factores de programación nuclear Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4 se utilizaron para producir células madre pluripotentes a partir de una célula somática. En otro método ejemplar, se usaron los factores de programación nuclear Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, L-Myc y antígeno T grande de SV40 para producir células madre pluripotentes a partir de una célula somática.

Las iPSCs se cultivaron sin capas alimentadoras humanas o de ratón en un medio de cultivo completamente definido, tal como el medio ESSENTIAL 8™ (E8™), en una placa recubierta con vitronectina. La vitronectina se diluyó 1:200 en solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (“DPBS”, por sus siglas en inglés) sin calcio o magnesio y las placas de cultivo se recubrieron con vitronectina y se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Las iPSCs se dividieron cuando eran preconfluentes y no se permitió que crecieran demasiado para evitar células enfermas y/o diferenciadas (Figura 1A).

Para derivar células RPE, las iPSCs se disociaron en una suspensión unicelular para eliminar cualquier agregado o cuerpo embrioide. Para obtener la suspensión unicelular, las células se lavaron con DPBS y se incubaron en una enzima de disociación celular, tal como t Ry PLE™, durante aproximadamente 10 minutos a 37°C. A continuación, las células se separaron pipeteando con una pipeta serológica y la suspensión celular se recolectó en un tubo cónico. Si las células no se desprendieron al pipetear suavemente, se permitió que los cultivos se incubaran por más tiempo, tal como 2-3 minutos más. Para recolectar todas las células, el recipiente de cultivo se lavó con medio E8™ a temperatura ambiente y posteriormente se añadió el medio al tubo que contenía la suspensión celular. Además, se añadió blebbistatina (por ejemplo, 2,5 mM) al medio E8™ para aumentar la supervivencia de las PSCs después de la disociación en células individuales mientras las células no estaban adheridas a un recipiente de cultivo. Para recolectar las células, se centrifugaron a 400 xg durante aproximadamente 5 minutos, se aspiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en un volumen adecuado de medio E8™.

Con el fin de diferenciar eficientemente las células RPE de las iPSCs unicelulares, la densidad de entrada de las iPSCs unicelulares se contó con precisión mediante un contador de células automatizado, tal como VICELL™, y se diluyó en una suspensión celular de aproximadamente 1*105 células/mL en medio E8™ a temperatura ambiente. Una vez que se obtuvo la suspensión de células individuales de iPSCs a una densidad celular conocida, las células se sembraron en un recipiente de cultivo adecuado, tal como una placa de 6 pocillos recubierta con vitronectina. Las células se sembraron a una densidad celular de aproximadamente 200.000 células por pocillo y se colocaron en una incubadora humidificada a 37°C. Después de aproximadamente 18-24 horas, se aspiró el medio y se añadió medio E8 ™ nuevo al cultivo. Las células se cultivaron en el medio E8™ durante aproximadamente 2 días después de la siembra para una correcta adherencia a la placa.

Ejemplo 2 - Diferenciación de iPSCs en células RPE

Una vez que se cultivaron las iPSCs unicelulares sembradas a la densidad celular adecuada durante aproximadamente 2 días como en el Ejemplo 1, se cultivaron en varios medios de diferenciación para derivar células RPE. El día 3, se aspiró el medio E8™ y se añadió medio de inducción retiniana (RIM) a temperatura ambiente (por ejemplo, Tabla 3). Brevemente, el RIM comprendía DMEM y F12 en una proporción de aproximadamente 1:1, reemplazo de suero KnockOut, MEM aminoácidos no esenciales (NEAa ), piruvato de sodio, suplemento N-2, suplemento B-27 y ácido ascórbico. Además, el RIM comprendía un inhibidor de la vía WNT, un inhibidor de la vía BMP, un inhibidor de la vía TGFp y el factor de crecimiento de insulina 1 (IGF1). Cada día se aspiró el medio y se añadió RIM nuevo a las células. Las células se cultivaron en el RIM durante aproximadamente de dos a cuatro días.

A continuación, las células se cultivaron en medio de diferenciación retiniana (RDM) durante aproximadamente de siete a catorce días. Brevemente, el RDM (Tabla 2) comprendía DMEM y F12 en una proporción de aproximadamente 1:1, reemplazo de suero KnockOut, NEAA de MEM, piruvato de sodio, suplemento de N-2, suplemento de B-27 y ácido ascórbico. Además, el RDM comprendía un inhibidor de la vía WNT (por ejemplo, CKI-7), un inhibidor de la vía b Mp (por ejemplo, LDN193189), un inhibidor de la vía TGFp (por ejemplo, SB431542) y un inhibidor de MEK (por ejemplo, PD325901). La concentración del inhibidor de la vía Wnt, el inhibidor de la vía BMP y el inhibidor de la vía TGFp fue diez veces mayor en el RDM en comparación con el RIM. Cada día se aspiró el medio y se añadió RDM a temperatura ambiente a las células para producir células retinianas diferenciadas.

Para derivar células RPE, las células se cultivaron posteriormente en medio retiniano (RM) durante de siete a diez días. El RM comprendía DMEM y F12 en una proporción de aproximadamente 1:1, reemplazo de suero KnockOut, NEAA de MEM, piruvato de sodio, suplemento N-2, suplemento B-27 y ácido ascórbico. Además, el RM comprendía nicotinamida y activina A. El medio se cambió diariamente con RM a temperatura ambiente dando como resultado células RPE.

Para la maduración de las células RPE, las células se cultivaron en medio de maduración de RPE (RPE-MM) durante de cinco a diez días. El RPE-MM (Tabla 2) comprendía MEM Alfa, suero bovino fetal, suplemento N-2, NEAA de MEM y piruvato de sodio. Además, el RPE-MM contenía taurina, hidrocortisona y 3,3',5-triyodo-L-tironina (Figura 1C). El medio se cambió cada dos días con RPE-MM a temperatura ambiente. A continuación, las células se disociaron en una enzima de disociación celular y se volvieron a sembrar en placas recubiertas de vitronectina. En esta etapa, las células PRE derivadas se pueden crioconservar en medio libre de xeno CS10. Para continuar la maduración del RPE, las células en placa se cultivan durante aproximadamente quince días más.

Ejemplo 3 - Maduración de células RPE

Para la maduración continua de las células RPE producidas en el Ejemplo 2 , las células se disociaron en una enzima de disociación celular, tal como TRYPLE™ y se volvieron a sembrar en un ensamblaje de andamio degradable en un diseño SNAPWELL™ especializado durante 1-2 semanas en el RPE-MM con un Inhibidor de MEK, tal como PD325901. Esto dio como resultado monocapas diferenciadas, polarizadas y confluentes de células RPE funcionales (Figura 1D) que pueden crioconservarse en esta etapa en medio libre de xeno CS10.

Las células RPE maduras se desarrollaron más en monocapas de células RPE funcionales que funcionan como un tejido RPE intacto mediante cultivo continuo en el RPE-MM con moléculas pequeñas adicionales, tal como inductores de cilio primarios, tales como PGE2 o afidicolina. Sin limitarse a una teoría particular, estos inductores de cilio primarios suprimen la vía canónica de WNT, inducen la salida del ciclo celular en las células e inducen la polarización apical-basal en la monocapa de RPE. La madurez de RPE se puede inducir alternativamente mediante inhibidores canónicos de la vía WNT, tales como IWP2 y endo-IWR1, que también inducen la salida del ciclo celular en las células RPE para promover la maduración de RPE. Las células se cultivaron en este medio durante otras 2-3 semanas para obtener monocapas de células RPE maduras y funcionales. Por lo tanto, los métodos descritos en la presente proporcionan células RPE maduras a partir de células pluripotentes que pueden reproducirse consistentemente a gran escala para aplicaciones clínicas.

Ejemplo 4 - Crioconservación de células RPE

Para la crioconservación de las células RPE diferenciadas del Ejemplo 2 , se aspiró el medio y se lavaron las células dos veces con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBs ). A continuación, las células se incubaron con una enzima de disociación celular y la suspensión celular se pipeteó en un tubo cónico. Las células se centrifugaron, el sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en RPE-MM a temperatura ambiente. A continuación, la suspensión celular se filtró a través de un filtro de células STERIFLIP® y se contaron las células. A continuación, las células se centrifugaron y se resuspendieron a una densidad adecuada (por ejemplo, 1*107 células/mL) en CryoStor® CS10 frío. La suspensión celular se dividió en alícuotas en crioviales pre-etiquetados que se colocaron en un recipiente de congelación frío y se transfirieron a un congelador a -80°C durante 12-24 horas. A continuación, los viales se transfirieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Ejemplo 5 - Agotamiento de MACS de células no RPE contaminantes y enriquecimiento de la población inicial de células RPE mediante agotamiento de CD24, CD56 y/o CD90

La población de células RPE obtenida en el Ejemplo 2 o 3 puede tener células residuales no RPE contaminantes, así como células RPE inmaduras (denominadas colectivamente como las “células contaminantes”), las cuales pueden separarse y eliminarse para producir una población de células maduras enriquecidas en RPE. Las células contaminantes pueden eliminarse del cultivo mediante diversas metodologías, tales como, por ejemplo, clasificación de células activadas magnéticamente (MACS®), clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o clasificación unicelular. La metodología MACS®, que se conoce en la técnica para separar diversas poblaciones celulares dependiendo de sus antígenos de superficie, se usó para separar las células contaminantes de las células RPE más maduras deseadas.

Las células contaminantes de la población de células RPE de partida tienen marcadores de superficie celular específicos que se pueden usar para separar las células contaminantes de las células RPE maduras deseadas. Por ejemplo, CD24, CD56 y/o CD90 son antígenos de la superficie celular que se expresan en (pero no se limitan a) células madre pluripotentes y otros tipos de células neurales. CD24 es una glicoproteína expresada en la superficie de células madre pluripotentes, algunos linfocitos B y neuroblastos diferenciadores. CD56 o molécula de adhesión celular neural (“NCAM”, por sus siglas en inglés) es una glicoproteína expresada en la superficie de las neuronas y las células citolíticas naturales. CD90 o Thy-1 es un marcador expresado en la superficie de diversas células madre, así como neuronas. La expresión de CD24, CD56 y/o CD90 se pierde durante la diferenciación de células madre a muchos tipos de células maduras, incluyendo las células RPE. Por lo tanto, la eliminación de células positivas para CD24, CD56 y/o CD90 da como resultado el agotamiento de las células contaminantes residuales.

Para llevar a cabo una técnica de separación, es deseable disociar la población de partida de células RPE en una única suspensión celular para realizar la clasificación (por ejemplo, MACS). En el caso de las células que se crioconservaron previamente, las células deben descongelarse y sembrarse nuevamente. Para obtener una suspensión de células individuales a partir de células en cultivo adherente, las células se lavaron (por ejemplo, con DPBS) y se añadió una enzima de disociación celular (por ejemplo, TRYPLE™). Después de incubar las células a 37°C durante aproximadamente 5 min, se golpeó suavemente el recipiente para separar los cúmulos neuronales. Las células se lavaron dos veces en DPBS y se añadió una enzima de disociación celular (por ejemplo, TRYPLE™). Después de incubar las células a 37°C durante aproximadamente 30 min, la suspensión celular se recolectó en medio de siembra en placas RPE-MM y se centrifugó a 400 xg durante 5 min. El sedimento celular se resuspendió en medio de siembra en placas RPE-MM y la suspensión celular se filtró a través de un filtro celular (por ejemplo, filtro celular steriflip 20 mM) para disociar cualquier grupo celular restante. Se contó la suspensión celular (por ejemplo, usando un contador ViCell) en busca de células viables para obtener una concentración celular. La suspensión de células contadas proporcionó una suspensión unicelular que podría usarse para la clasificación o el ensayo de pureza mediante citometría de flujo.

Para eliminar las células contaminantes de la población de células RPE de partida, se utilizó MACS para eliminar las células positivas para CD24, las células positivas para CD56 y/o las células positivas para CD90. Después de que las células de la población de células RPE de partida se disociaran en una suspensión unicelular, las células se resuspendieron en solución amortiguadora de MACS, por ejemplo, a 1*107 células/mL. En la Tabla 3 se incluye una solución amortiguadora de MACS de ejemplo. A continuación, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD24, un anticuerpo anti-CD56 y/o un anticuerpo anti-CD90 (cada uno diluido 1:500) y se incubaron a 4°C durante 20 min para permitir que el anticuerpo se uniera al antígeno en las células. Los anticuerpos utilizados deben marcarse con una etiqueta (por ejemplo, FITC) que se unirá al anticuerpo secundario. Después de la incubación, se añadieron 20 mL de solución amortiguadora de MACS y las células se centrifugaron a 400 xg durante 5 min. El sedimento celular se resuspendió en 20 mL de solución amortiguadora de MACS, se mezcló vigorosamente y se centrifugó a 400 xg durante 5 min para eliminar cualquier anticuerpo no unido. El sedimento celular se resuspendió en solución amortiguadora de MACS (por ejemplo, a 1 ,1 l3 l08 células/mL), se añadieron microperlas recubiertas con el anticuerpo secundario diluido (1:10) (por ejemplo, anti-FITC) y las células se incubaron a 4°C durante 20 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron con solución amortiguadora de MACS para eliminar las microperlas no unidas y se resuspendieron hasta 1,253108 células en 500 mL de solución amortiguadora de MACS. La suspensión celular se transfirió a una columna LD colocada en un campo magnético fuerte y las células que expresan el antígeno CD24, CD56 y/o CD90 unidas a las microperlas permanecieron en la columna. La columna LD se lavó dos veces con solución amortiguadora de MACS. Las células no marcadas que no expresan los antígenos CD24, CD56 y/o CD90 se dejaron fluir y se recolectaron. Para una caracterización y cultivo adicionales, la suspensión de células no etiquetadas recolectada se centrifugó (400 xg durante 5 min) y se sembró nuevamente en medio de siembra en placas RPE-MM, y se usó una alícuota de la suspensión de células para el ensayo de pureza por citometría de flujo. Por lo tanto, la clasificación celular mediante MACS dio como resultado una población de células enriquecida en RPE agotada en células positivas para CD24, CD56 y/o CD90. Se observa que el uso de este método no se limita a la población de partida resultante del método detallado en el Ejemplo 2 y se puede emplear para eliminar células contaminantes de una población RPE producida por otros métodos, tales como, pero sin limitarse a, los métodos descritos en las Solicitudes de EE. UU. No. 12/523,444 y 14/405,730.

Ejemplo 6 - Ensayo de pureza por citometría de flujo para la caracterización de la población celular enriquecida con RPE

Antes y después de que se realizara la clasificación MACS, se realizó la caracterización de las células RPE mediante un panel de marcadores relevantes, incluyendo BEST1, CRALBP, TYRP1, PMEL17, MAP2, NES y MITF (por ejemplo, antes de la clasificación y después de la clasificación). El ensayo de pureza por citometría de flujo se realizó para obtener una medida de los porcentajes (Tabla 1) de células positivas para cada marcador antes y después de la eliminación de células CD24 positivas, CD56 positivas y/o CD90 positivas por Ma CS (Figura 2 y Figura 3).

El ensayo de pureza por citometría de flujo se realizó para determinar el porcentaje de células RPE obtenidas mediante un método de clasificación de la presente divulgación. Se centrifugó una alícuota de la suspensión celular recolectada del ensayo MACS (2*106 células en un tubo FACS de 5 mL por muestra) a 400 xg durante 3 min. El sedimento celular se resuspendió en 1 mL de una tinción (por ejemplo, tinción Live-Dead de color rojo) y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. Después de la incubación, se añadieron 2 mL de solución amortiguadora de lavado y las células se centrifugaron a 400 xg durante 3 min para eliminar cualquier tinción no unida. El sedimento celular se resuspendió en solución amortiguadora de fijación y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. Después de la incubación, se añadieron 2 mL de solución amortiguadora de lavado y las células se centrifugaron a 400 xg durante 3 min y se decantó el sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió en 2 mL de solución amortiguadora de lavado para preparar una suspensión de 1*106 células/mL y se transfirieron 200 mL de la suspensión celular a un tubo FACS. A cada tubo, se le añadieron 2 mL de solución amortiguadora de permeabilización y las células se centrifugaron a 400 xg durante 3 min. Los anticuerpos primarios para los marcadores específicos de RPE se diluyeron en solución amortiguadora de permeabilización y se añadieron 100 mL de solución de anticuerpo diluido a cada tubo. Después de la incubación durante la noche a 4°C en la oscuridad, las células se lavaron en 2 mL de solución amortiguadora de permeabilización dos veces. Se añadió una solución secundaria de anticuerpo a cada uno de los tubos y las células se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1-2 horas. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con solución amortiguadora de permeabilización, se centrifugaron (400 xg durante 3 min) y se resuspendieron en 100 mL de solución amortiguadora de lavado para análisis de citometría de flujo. El análisis de citometría de flujo se realizó mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tal como en la Patente de EE. UU. No. 8.682.810 y Herzenberg et al., 2006, incorporada en la presente como referencia, para obtener porcentajes de células positivas para cada uno de los marcadores probados (Tabla 1). El ensayo de pureza por citometría de flujo mostró que la clasificación MACS para agotar las células contaminantes positivas para CD24, CD56 y/o CD90 dio como resultado una población enriquecida en células RPE (95-99%) en comparación con la población celular inicial (78,6%) según lo determinado por el marcador BEST1.

Ejemplo 7 - Método alternativo para la diferenciación de células RPE

Con respecto a los métodos descritos en los Ejemplos 2 y 3 , la inclusión de PD0325901 a una concentración de 1 mM en el medio durante ciertas ventanas de tiempo desde el Día 2 después de la siembra en placas de iPSC hasta el final del proceso de diferenciación, incluyendo el cultivo posterior a MACS, puede mejorar tanto la pureza de la población RPE (es decir, una disminución de las células contaminantes) como la madurez de la población RPE resultante. Se ha demostrado que la inclusión de PD0325901 1 mM mejora tanto la pureza como la madurez de la población RPE cuando se incluye en RDM así como en RPE-MM (aproximadamente los días 42 a 50) del proceso de RPE descrito en la presente.

Tabla 1: Resumen de clasificación celular mediante MACS

Ejemplo 6 - Ensayo de pureza por citometría de flujo para la caracterización de la población celular enriquecida con RPE

Antes y después de que se realizara la clasificación MACS, se realizó la caracterización de las células RPE mediante un panel de marcadores relevantes, incluyendo BEST1, CRALBP, TYRP1, PMEL17, MAP2, NES y MITF (por ejemplo, antes de la clasificación y después de la clasificación). El ensayo de pureza por citometría de flujo se realizó para obtener una medida de los porcentajes (Tabla 1) de células positivas para cada marcador antes y después de la eliminación de células CD24 positivas, CD56 positivas y/o CD90 positivas por Ma CS (Figura 2 y Figura 3).

El ensayo de pureza por citometría de flujo se realizó para determinar el porcentaje de células RPE obtenidas mediante un método de clasificación de la presente divulgación. Se centrifugó una alícuota de la suspensión celular recolectada del ensayo MACS (2*106 células en un tubo FACS de 5 mL por muestra) a 400 xg durante 3 min. El sedimento celular se resuspendió en 1 mL de una tinción (por ejemplo, tinción Live-Dead de color rojo) y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. Después de la incubación, se añadieron 2 mL de solución amortiguadora de lavado y las células se centrifugaron a 400 xg durante 3 min para eliminar cualquier tinción no unida. El sedimento celular se resuspendió en solución amortiguadora de fijación y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. Después de la incubación, se añadieron 2 mL de solución amortiguadora de lavado y las células se centrifugaron a 400 xg durante 3 min y se decantó el sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió en 2 mL de solución amortiguadora de lavado para preparar una suspensión de 1*106 células/mL y se transfirieron 200 mL de la suspensión celular a un tubo FACS. A cada tubo, se le añadieron 2 mL de solución amortiguadora de permeabilización y las células se centrifugaron a 400 xg durante 3 min. Los anticuerpos primarios para los marcadores específicos de RPE se diluyeron en solución amortiguadora de permeabilización y se añadieron 100 mL de solución de anticuerpo diluido a cada tubo. Después de la incubación durante la noche a 4°C en la oscuridad, las células se lavaron en 2 mL de solución amortiguadora de permeabilización dos veces. Se añadió una solución secundaria de anticuerpo a cada uno de los tubos y las células se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1-2 horas. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con solución amortiguadora de permeabilización, se centrifugaron (400 xg durante 3 min) y se resuspendieron en 100 mL de solución amortiguadora de lavado para análisis de citometría de flujo. El análisis de citometría de flujo se realizó mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tal como en la Patente de EE. UU. No. 8.682.810 y Herzenberg et al., 2006, incorporada en la presente como referencia, para obtener porcentajes de células positivas para cada uno de los marcadores probados (Tabla 1). El ensayo de pureza por citometría de flujo mostró que la clasificación MACS para agotar las células contaminantes positivas para CD24, CD56 y/o CD90 dio como resultado una población enriquecida en células RPE (95-99%) en comparación con la población celular inicial (78,6%) según lo determinado por el marcador BEST1.

Ejemplo 7 - Método alternativo para la diferenciación de células RPE

Con respecto a los métodos descritos en los Ejemplos 2 y 3 , la inclusión de PD0325901 a una concentración de 1 mM en el medio durante ciertas ventanas de tiempo desde el Día 2 después de la siembra en placas de iPSC hasta el final del proceso de diferenciación, incluyendo el cultivo posterior a MACS, puede mejorar tanto la pureza de la población RPE (es decir, una disminución de las células contaminantes) como la madurez de la población RPE resultante. Se ha demostrado que la inclusión de PD0325901 1 mM mejora tanto la pureza como la madurez de la población RPE cuando se incluye en RDM así como en RPE-MM (aproximadamente los días 42 a 50) del proceso de RPE descrito en la presente.

Ejemplo 8 - Método alternativo para la diferenciación de células RPE

Con respecto a los métodos descritos en los Ejemplos 2 y 3, una disminución en el porcentaje de suero bovino fetal del 5% al 0,5-1% en RPE-MM y medio de siembra en placas RPE-MM puede mejorar tanto la pureza de la población RPE (lo que significa una disminución de las células contaminantes), así como la madurez de la población RPE resultante.

Ejemplo 9 - Funcionalidad de células RPE maduras

Para el análisis de las células RPE maduras producidas a partir del tratamiento con PGE2, se realizó inmunotinción de la monocapa RPE para confirmar la arquitectura hexagonal (Figura 4A, Figura 4B y Figura 4C) de las uniones estrechas mediante tinción con ZO1, así como microscopía electrónica de transmisión de las células iPSC-RPE (Figura 4D). La tinción mostró que las células RPE tratadas con PGE2 tenían una disminución de beta catenina y un aumento de RPE65. Además, el tratamiento con IWP2+endo-IWR1 o IWP2 también da como resultado una disminución de la beta catenina (Figura 5A) y un aumento de RPE65 (Figura 5C). Se encontró que la combinación de IWP2+endo-IWR1 era más efectiva en comparación con IWP2 solo o endo-IWR1 solo. Por lo tanto, el tratamiento con PGE2, IWP2 o IWP2+endo-IWR1 produce células RPE maduras.

Para medir la función de barrera de las células RPE generadas por los métodos presentes, se midió el potencial eléctrico transepitelial (TEP), el gradiente de iones a través de la monocapa generado por bombas de iones impulsadas por energía que regulan el paso a través de las células y la resistencia eléctrica transepitelial (TER) mide la resistencia de las sustancias a través del espacio paracelular principalmente a través de la estructura fina de la estructura de unión estrecha (Figura 7A).

También se caracterizó la funcionalidad de las células RPE maduras tratadas con IWP2 o endo-IWR1. Las mediciones de TEP y TER de células RPE no tratadas frente a células RPE tratadas con PGE2 o IWP2+endo-IWR1 muestran una mayor funcionalidad de las células RPE maduras tratadas (Figuras 7C, Figura 7D, Figura 7E).

A continuación, se probó si un aumento en la concentración de PGE2 de 50 mM a 100 mM en el medio RPE-MM+PGE2 mejoraría tanto la pureza de la población RPE (es decir, una disminución de las células contaminantes) como la madurez de la población RPE resultante. Para determinar la madurez y la funcionalidad de los cultivos tratados con PGE250 mM frente a 100 mM, se midió la función de barrera en términos de resistencia eléctrica transepitelial (TER) (Figura 7F) para comparar la resistencia de sustancias a través del espacio paracelular como se explica en el Ejemplo 9. Para determinar el porcentaje de células RPE puras obtenidas después del tratamiento de los cultivos de células RPE derivadas de iPSC con 50 mM o 100 mM en el medio RPE-MM PGE2, se realizó un ensayo de pureza por citometría de flujo para marcadores específicos de RPE (Figura 7G) como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados mostraron que una concentración más alta del inductor de cilio primario PGE2 promueve tanto la pureza como la madurez de la población RPE en el proceso de diferenciación de células RPE derivadas de iPSC.

Ejemplo 10 - Reproducibilidad del método de diferenciación de RPE

Para probar la reproducibilidad del proceso de diferenciación de RPE, múltiples operadores diferenciaron tres líneas de iPSCs en células RPE (Figura 6A). La pureza promedio de las células RPE resultantes se caracterizó mediante la medición del marcador de RPE proteína 1 de unión a retinaldehído (Craplbp) mediante citometría de flujo (Tabla 2). Se encontró que el proceso de diferenciación de RPE era altamente reproducible entre diferentes poblaciones celulares de partida, así como entre diferentes operadores. Además, la reproducibilidad se confirmó mediante la diferenciación de RPE a partir de diferentes líneas celulares de partida, incluyendo 3D1, AMD1B, BEST 1L, BEST3A, BEST8A, AMD Donor3D y HLA Línea A (Figura 6B). HLA Línea A (21525,102) es una línea iPSC producida a partir de un donante homocigoto para HLA-A*01 y HLA-B*08 que podría proporcionar una compatibilidad beneficiosa para el 11,38 % de la población de EE. UU. Además, RPE también se ha producido con éxito usando este proceso utilizando una línea iPSC producida a partir de un donante homocigoto para HLA-A*03 y HLA-B*07 llamado HLA Línea C (21526,101) que podría proporcionar una compatibilidad beneficiosa para el 7,63 % de la población estadounidense. HLA Línea A (21525,102) y HLA Línea C (21526,101) homocigotos en HLA-A y HLA-B como se describió anteriormente son propiedad de Cellular Dynamics International, Inc. Además, la reproducibilidad se confirmó en 109 diferenciaciones de RPE realizadas en 28 líneas de iPSC derivadas de 13 donantes midiendo el porcentaje de células positivas para Cralbp antes y después de la purificación (Figura 6C, Figura 6D). Si bien el porcentaje de células positivas para Cralbp después de la diferenciación de RPE varió, la purificación mediante MACS consistentemente dio como resultado más del 95 por ciento de pureza y, en la mayoría de los casos, cerca del 100 por ciento de pureza. Por lo tanto, el presente método de diferenciación de RPE tiene una clara ventaja sobre cualquier método que produzca células RPE a partir de cuerpos embrioides, ya que proporciona resultados más consistentes y reproducibles entre genotipos de donantes y cuando diferentes operadores lo llevan a cabo.

Tabla 2: Diferenciación de RPE con multioperadores

Ejemplo 11 - Materiales y métodos

Los materiales usados en los Ejemplos 1-10 se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: Componentes de medios ejemplares

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

La solución amortiguadora de lavado de citometría de flujo se preparó añadiendo 20 mL de FBS a 1000 mL de DPBS (es decir, sin calcio ni magnesio). La solución amortiguadora se esterilizó mediante filtración y se puede almacenar a 4°C hasta durante 4 semanas.

La solución amortiguadora de permeabilización de citometría de flujo se preparó añadiendo 20 mL de FBS a 1000 mL de DPBS (es decir, sin calcio ni magnesio). Se añadió un gramo de saponina y se mezcló bien. La solución amortiguadora se esterilizó mediante filtración y se puede almacenar a 4°C hasta durante 4 semanas.

La tinción Live-Dead de color rojo de citometría de flujo se preparó diluyendo tinte Live-Dead 1:1000 en DPBS (es decir, sin calcio ni magnesio). Se preparó un mL de la tinción por cada 1*10® células analizadas. La tinción se preparó nuevamente antes de su uso.

La solución amortiguadora de fijación de citometría de flujo se preparó añadiendo 1 mL de formaldehído al 36,5 % a 8,1 mL de DPBS (es decir, sin calcio ni magnesio). Se preparó un mL de tinción por cada 1*106 células analizadas. La solución amortiguadora se preparó nuevamente antes de su uso.

Todos los métodos divulgados y reivindicados en la presente pueden llevarse a cabo y ejecutarse sin experimentación indebida en vista de la presente divulgación.

Referencias

Se proporcionan las siguientes referencias, en la medida en que proporcionen detalles de procedimiento u otros detalles complementarios a los establecidos en la presente,

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Publicación de Patente de EE. UU. No. 2010/0003757.

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Ying et al., Cell, 115:281-292, 2003.

Yu et al., Science, 318: 1917-1920, 2007.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un método para proporcionar una población enriquecida de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) que comprende:

a) obtener una población celular de partida que comprende células RPE, en donde la población celular de partida se prepara a partir de células madre pluripotentes inducidas; y

b) enriquecer dicha población de células de partida para células RPE eliminando de la misma células que son positivas para CD24, células que son positivas para CD56 y/o células que son positivas para CD90, proporcionando así una población de células enriquecida en RPE que está enriquecida para células RPE en comparación con la población de células de partida.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además determinar un nivel de enriquecimiento de las células RPE en dicha población enriquecida en RPE.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el nivel de enriquecimiento se determina mediante el uso de un marcador específico del epitelio de la retina seleccionado del grupo que consiste en BEST1, CRALBP, TYRP1, PMEL17 y MITF.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la población de células enriquecidas en RPE se enriquece para células RPE en comparación con la población de células de partida determinada mediante clasificación BEST1.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la población enriquecida en RPE es al menos un 95% de células RPE.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la población enriquecida en RPE es al menos un 99% de células RPE.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde la población enriquecida en RPE son células RPE puras.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células RPE son células RPE humanas.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células que son positivas para CD24, las células que son positivas para CD56 y/o las células que son positivas para CD90 se eliminan mediante clasificación basada en perlas magnéticas o clasificación basada en fluorescencia.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células que son positivas para CD24, las células que son positivas para CD56 y/o las células que son positivas para CD90 se eliminan usando un anticuerpo o un aptámero que reconoce Cd 24, CD56 y/o CD90.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la población de células enriquecidas en RPE no está modificada genéticamente.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el paso b) se lleva a cabo sin modificar genéticamente la población celular de partida.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha población de células de partida se enriquece en células RPE eliminando de la misma las células que son positivas para CD24.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha población de células de partida se enriquece en células RPE eliminando de la misma las células que son positivas para CD56.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha población de células de partida se enriquece en células RPE eliminando de la misma las células que son positivas para CD90.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha población celular de partida se enriquece para células RPE eliminando de la misma células que son positivas para CD90, células que son positivas para CD56 y células que son positivas para CD24.