JP2020501543A - 網膜色素上皮移植のためのフィブリン支持体を用いた方法及び材料 - Google Patents
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Abstract
Description
本文書は網膜色素上皮移植に関する。例えば、本文書は、網膜色素上皮移植のためにフィブリン支持体を使用するための方法及び材料に関する。
黄斑変性疾患は、種々の疾患及び病因を表すが、一般的に網膜色素上皮(RPE)機能不全に由来する。ベストロフィノパチーを含む遺伝的黄斑変性は、RPE機能に関与するタンパク質変異のために起こる。ベストロフィノパチー(例えばベスト病)はBest1遺伝子の突然変異から生じ、RPE機能不全を引き起こし、最終的には光受容体が死に至る。罹患率は以前に16,000〜21,500人に1人と報告されている(Dalvin et al., Ophthalmic Genet., Epub:1-5 (2016))。遺伝的に生じる黄斑変性は稀であるが、加齢黄斑変性(AMD)は先進国において失明の主な原因である。それは2050年に米国で500万の症例を占めると推定されている。AMDは直接RPE機能に影響を与える免疫と血管機能のより複雑な疾患である。
化学物質
フィブリノーゲンは3つの供与源から取得した:EvicelとしてEthicon(60mg/mL)から、TisseelとしてBaxter(95mg/mL)から、及び研究グレード材料としてSigma-Aldrich(57mg/mL)から。トロンビンもまた3つの供与源から取得した:Evicelの一部としてEthiconから、Tisseelの一部としてBaxterから、及び研究グレード材料としてSigma-Aldrichから。プラスミノーゲンは、研究グレード材料としてSigma-Aldrichから取得した。組換え組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)は研究グレード材料としてSigma-Aldrichから取得した。
IPSC-RPE細胞を、他に記載されているように変更を加えて作製した(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015))。膜支持体を、トランスウエル又はHA膜のいずれかを含む、頂端及び基底培地と共に使用した。膜表面を、製造業者のプロトコルによりコラーゲンゲルでコーティングし、その後又はその替わりに、ゲルトレックス(geltrex)又はマトリゲル(matrigel)溶液で最大0.1mg/mLで37℃で2時間かけてコーティングした。続いて細胞をプレーティングし、最大1カ月にわたって単層を形成させた。この研究のため、健常対照患者からのIPSC-RPEを使用した。分化ステージ(diff stage)5の後の細胞を使用した。経上皮抵抗を100オーム以上で測定した。使用前に色素沈着が見られた。
フィブリノーゲン濃度及びトロンビン濃度を変動させてフィブリンゲルを形成させた。薄層ゲルを最初にプレートサンドイッチ法により形成させたが、その方法では、フィブリノーゲン及びトロンビン溶液の混合物を、200μmギャップ厚を有するプラスチック鋳型内の2層のパラフィルムの間に挟む。湿潤37℃で最大1時間にわたり溶液をゲル化させた。パラフィルムを除き、ゲルを使用前に水和してPBSで洗浄した。この方法により形成されたゲルは、196±90μmの平均厚を有していた。
噴霧器システムを使用してゲル形成後、ゲルを0.01mg/mL FITCイソチオアネート(isothioanate)溶液で1時間かけて染色し、振盪した。続くPBSによる洗浄によって非標識FITCを除去した。共焦点z系画像をゲルを通して撮影し、そしてFITC染色スライスの測定値を測定して厚さを得た。
他に記載されているように、圧縮試験を用いてゲルバイオメカニクスを得た(Uehara et al., J. Bone Joint Surg. Am., 97:1792-1798 (2015))。種々のフィブリノーゲン濃度でゲルを作製し厚みを測定した。簡単に説明すると、ゲルを特注のステンレス鋼ブロックに載せた。圧縮試験は、平らな円筒形アルミニウム圧子を用いて行った。直径の直径は1.3mmであった。試験は、Bose Electroforce 3200アクチュエータを使用して実施した。力は、10グラムのHoneywellミニチュアロードセルを用いて測定した。置換(displacement)は、Bose Electroforce 3200内部線形可変差動変換器(internal linear variable differential transformer)を使用して測定した。データはLabVIEWを使用して収集した。破壊まで電界偏向試験を0.05mm/sで行った。応力とひずみ曲線をグラフ化し、線形領域にフィッティングし、ヤングス率の値を得た。
フィブリノーゲン濃度(40〜60mg/mL)を変動させてサンドイッチ法により種々のゲルを作製した。トロンビン濃度は剛性(stiffness)又は分解動力学には影響を及ぼさないようであり、100U/mLで一定に保った。種々のプラスミノーゲン濃度(0.8〜4.0U/mL)を、ゲル化前にフィブリノーゲン濃度と混合することによりゲル内にロードした。形成後、特注サイズのハンドヘルド中空パンチを用いてゲルをパンチした。形状は高さ1.5mm、幅5mmの楕円形とした(図5)。パンチされたゲルを様々な濃度のtPA溶液(0.1〜1,000U/mL)中でインキュベートした。経時的に、懸濁液溶液からサンプルを採取した。各変数(すなわち、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン及びtPA濃度)の効果を明らかにするために、他の2つを一定に保ちながらそれぞれを変化させた。
細胞の剥離は、フィブリンゲル並置の前及び後の両方で達成された。膜支持体上の細胞をPBSで洗浄した。細胞を、基礎750U/mL精製コラゲナーゼ(Worthington)又は1U/mLディスパーゼ(DMEM中(Stem Cell Tech))中で最大30分までインキュベートした。トランスウェルを取り出して乾燥し、その間に膜を切り取ってパラフィルムの上に置いた。次にフィブリンをその上に噴霧し、そして完全にゲル化させた。あるいは、サンドイッチ法を用いてフィブリノーゲン及びトロンビン混合物を頂端RPE単層上に並置し、そして完全にゲル化させた。水和後、ピンセットを用いてフィブリン/RPE系(FRPE)を剥がした。次いで、FRPEを培地中でインキュベートした。
単層表現型の維持を決定するため、FRPEをZO-1(上皮細胞に見られる細胞間結合タンパク質)について染色した。FRPEサンプルをパンチし、10%ホルマリン中で1時間かけて固定した。他に記載されているように(Johnson et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619-4630 (2015))染色を実施した。固定細胞をNGSでブロッキングし、一次抗体中で4℃で一晩インキュベートし、二次抗体中で2時間インキュベートした。アクアマウント(aquamount)を用いてサンプルをスライドガラスに載せ、Nikon蛍光顕微鏡下でイメージングした。
パンチしたFRPE移植物を明視野顕微鏡を用いて経時的にモニターした。細胞生存率を決定するために、製造元のプロトコルに従って、生存/死滅キットをFRPEに対して利用した。生細胞をFITCスペクトル(吸光度:495 nm;発光:520 nm)下で可視化し、死細胞をTRITCスペクトル(吸光度:543 nm;発光:560 nm)下で可視化した。細胞生存率は百分率として算出した(染色された生細胞を可視化された総細胞で除したもの)。
培養支持体からの剥離の24時間後及びフィブリン支持体の分解の24時間後に、細胞の機能性を確認するため細胞に対してPCRを実施した。マーカーには、PEDF、RPE65、Best1及び対照が含まれた。
図5は、RPEの頂端面へのフィブリンの付着及びディスパーゼを用いた培養表面からの剥離の成功を示す。機械的パンチ後、細胞は依然としてフィブリンに付着したままである。
フィブリンゲルの付着及び維持、並びに細胞生存率に対するアプロチニンの効果を決定するために研究を行った。50U/mLアプロチニンを含む培地中でgeltrex コーティングあり(図14A)及びなし(図14B)のフィブリンゲル上でiPSC-RPE細胞を2週間培養した。培地中へのアプロチニンの導入は、フィブリンゲル分解を防止するようであった。さらに、これらの試験は、フィブリンゲルへの細胞の付着がgeltrexの存在とは無関係に生じ得ることを示している。ゲルをプレートから取り出した後も細胞は接着したままであり(図15A)、ゲルを切断した後も細胞の除去は最小限であった(図15B)。
(1)セルロースエステル膜フィルターインサート上への2.5mg/mLコラーゲンのゲル化。
a.1.0〜5.0 mg/mLコラーゲン
b.セルロースエステル、ポリカーボネート、PTFE、TCPS膜フィルター
(2)マトリゲル(matrigel)の1:5希釈によるコラーゲン表面のコーティング。
a.範囲:1:1〜1:50希釈
b.マトリゲル(Matrigel)、ゲルトレックス(geltrex)又は精製ラミニン
(3)0.5×106細胞/cm2での細胞のプレーティング。
a.0.1〜2.0×106細胞/cm2
(4)約2週間にわたる培養
a.1〜6週間
(5)PBSによる細胞の洗浄
(6)細胞表面の乾燥
(7)80μLの混合した50mg/mLフィブリノーゲン、2U/mLプラスミノーゲン及び100U/mLトロンビンの噴霧(合計流速80μL/秒、高さ10cmで1秒当たり0.8バール)。
a.30〜200μLの混合物の噴霧
b.30〜70mg/mLのフィブリノーゲン
c.0.1〜4.0U/mLのプラスミノーゲン
d.10〜600U/mLのトロンビン
e.30〜400μL/秒の流速
f.0.6〜1.2バール
g.5〜15cm高
(8)37℃にて1時間フィブリノーゲンをゲル化。
a.30分から2時間ゲル化
(9)PBSによる再水和。
(10)750U/mLコラゲナーゼにインサートを配置することによる単層の剥離。
a.400-1500U/mLコラゲナーゼ
(11)PBSで穏やかに洗浄。
(12)フィブリン-RPE移植物を平面に移動しパンチして複数の移植物にする。
(13)移植物を外科用デバイスにローディング。
(14)眼を外科手術用に準備する。
(15)移植物を網膜下腔に入れる(Plunge)。
(16)レーザー鋲。
(17)複数の移植物を 網膜下腔内に敷き詰める(Tile)。
(18)眼を閉じる。
(19)24時間後、100μLの4,000U/mL 組織プラスミノーゲン活性化因子の硝子体内注射。
a.手術の3〜72時間後
b.50〜200μL注射
c.100〜35,000U/mL。
このプロトコルは、頂端フィブリンヒドロゲルによって支持されたRPE単層を生じる。
(1)ゲルへの30mg/mLフィブリノーゲン及び100U/mLトロンビンの混合溶液のプレーティング
a.20〜80mg/mLフィブリノーゲン
b.10〜600U/mLトロンビン
c.均一な広がりを確保するためプレートを旋回する
d.鋳型を使用してゲルを所望の厚みに圧縮する
e.厚み:50μm〜1mm
f.混合物をTCPS、ポリカーボネート、セルロースエステル上にプレーティングする
g.あるいは、フィブリンゲルの平面シートを鋳型を使用して予め形成し、細胞培養インサートに載せる
h.混合物を表面上に噴霧する
(2)1:5希釈マトリゲルによるゲル表面のコーティング。
a.範囲:1:1〜1:50希釈
b.マトリゲル(Matrigel)、ゲルトレックス(geltrex)、ラミニン521、ラミニン511
c.コーティングステップは必要ない
(3)細胞を0.5×106細胞/cm2でプレーティング
a.0.1〜2.0×106細胞/cm2
(4) 50U/mLアプロチニンを含む培地を用いて2週間培養。
a.範囲:20〜150U/mL
b.1〜10週間
(5)支持体からフィブリンをピールすることによりフィブリン-RPEを動かす。
(6)任意手順:基底フィブリンゲルへのプラスミノーゲンの導入。
a.プラスミノーゲン溶液中でのフィブリン-RPEのインキュベート
i.0.001〜40U/mL(例えば1〜40U/mL)プラスミノーゲン
ii.2〜6時間
(7)任意手順:さらなる支持体のための頂端ゲル。
a.80μLの混合した50mg/mLフィブリノーゲン、2U/mLプラスミノーゲン及び100U/mLトロンビンの噴霧(合計流速80μL/秒、高さ10cmで1秒当たり0.8バール)。
i.30〜200μLの混合物の噴霧
ii.30〜70mg/mLのフィブリノーゲン
iii.0.1〜4.0U/mLのプラスミノーゲン
iv.10〜600U/mLのトロンビン
v.30〜400μL/秒の流速
vi.0.6〜1.2バール
vii.5〜15cm高
b.37℃にて1時間フィブリノーゲンをゲル化。
i.30分から2時間ゲル化
(8)フィブリン-RPE移植物を平面に移動しパンチして複数の移植物にする。
(9)移植物を外科用デバイスにローディング。
(10)眼を外科手術用に準備する。
(11)移植物を網膜下腔に入れる(Plunge)。
(12)レーザー鋲。
(13)複数の移植物を 網膜下腔内に敷き詰める(Tile)。
(14)眼を閉じる。
(15)24時間後、100μLの4,000U/mL 組織プラスミノーゲン活性化因子の硝子体内注射。
a.手術の3〜72時間後
b.50〜200μL注射
c.100〜35,000U/mL。
このプロトコルは、基底フィブリン支持体を有するRPE単層を生じる。
診療所は、患者の皮膚生検を得て、それをGMP施設に送って、他に記載されているように(Sonoda et al., Nat. Protoc., 4:662-673 (2009); Johnson et al., Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015); Brandl et al., NeuroMolecular Med., 16:551-564 (2014); Idelson et al., Cell Stem Cell., 5:396-408 (2009);及びCarr et al., Mol. Vis., 15:283-295 (2009))iPSC-RPE細胞を作製する。iPSC-RPEは、細胞培養インサートを使用して最大3ヶ月間フィブリンヒドロゲル上で培養される。RPE/フィブリンゲルは、患者のニーズに合わせて切断される。切断された移植物は移植デバイスの先端部品に装填され、プラスミノーゲンを含む又は含まない培地に保存され、そして診療所に輸送される。
RPE移植のための基質としてのフィブリンの適合性を確認するために以下を行った。種々のフィブリンヒドロゲルを、フィブリノーゲン及びトロンビンの濃度を変化させて作製し、時間のスケールで分解に関する規定のパラメータを有する薄い剛性ヒドロゲルを形成した。続いて、最適化条件を使用してフィブリンゲルを作製し、その上でiPSC-RPEを培養し、十分に分化した単層を形成した。最後に、フィブリン支持体をin vitroで分解し、RPE単層に対するこの分解の影響を評価した。本明細書に提供する結果は、フィブリンヒドロゲルを幹細胞からのRPEの分化のための長寿命の基質として使用し得ること、そして網膜下腔への送達後は制御された環境下で迅速に分解し得ることを実証している。
フィブリノーゲン及びトロンビンは、Ethicon(Somerville, NJ)(Evicel, フィブリノーゲン、60mg/mL)、Baxter(Deerfield, IL)(Tisseel, フィブリノーゲン、95mg/mL)、及びSigma-Aldrich(St Louis, MO)(フィブリノーゲン、57mg/mL)から入手した。プラスミノーゲン及び組換え組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)をSigma-Aldrichから入手した。
フィブリノーゲン濃度及びトロンビン濃度を変化させることによりフィブリンゲルを形成した。最初の試験はトロンビン濃度による最小の変動を示し、全ての実験は最終濃度100U/mLのトロンビンを使用した。無細胞実験のために、薄層ゲルを、厚さ0〜200μmの範囲の規定された厚さのスペーサーを有する2枚のポリカルボネートプレート及び2層のパラフィルムからなる特注厚の鋳型を用いて形成した。フィブリノーゲン及びトロンビン溶液の混合物を混合直後に2つの層の間に挟み、そしてその溶液を加湿インキュベーター中で37℃で1〜2時間かけてゲル化させた。トッププレート及びパラフィルムを除去した後、ゲルを水和させ、そしてPBS中で洗浄した。特注機械的パンチを使用して、1.5mm×5mmの横長の形状に同様のサイズのゲルを切り出した。ピンセットを慎重に使用してゲルを操作した。
パンチしたゲルをOCTを使用して画像化し、厚みを決定した。Envisu R4110(Leica; Wetzlar, Germany)をゲルに向けたカメラ及び付属のテレセントリックレンズと共にAIMテーブルを使用してセットアップした。画像化の前に、透明60mmペトリ皿のPBS中にゲルを配置した。ゲルのA及びBスキャンを撮影し、ゲル当たりの厚みをランダムな4つの位置について平均化した。
フィブリンヒドロゲルの走査型電子顕微鏡法(SEM)画像をHitachi S-4700(Hitachi High Technologies; Schaumburg, IL)及びHitachi SEMソフトウエア(V3.6)を使用して取得した。二価カチオンを含む0.1Mリン酸バッファーpH7中2.5%パラホルムアルデヒド及び1%グルタルアルデヒドにおいて一晩かけてゲルを固定した。続いてゲルを二酸化炭素を用いて臨界点乾燥し、アルミニウムスタブ上にマウントし、そして金-パラジウムを用いて60秒間スパッタコーティングした。
ゲルバイオメカニクスは、他(Uehara et al., J. Bone Joint Surg. Am., 97:1792-1798 (2015))に記載の設定を使用してバルジテストを用いて取得した。種々のフィブリノーゲン濃度及び厚さで作製されたゲルを測定した。簡単に説明すると、ゲルを、グリップを高めるために研磨した内径2mmのリングピンセット(WPI; Sarasota, FL)にマウントした。ピンセットをXYステージ(Klinger; Irvine, CA)にマウントして、圧子(indenter)をゲルと整列させた(図34A)。試験は、外径1.3mmの特注の平らな円筒形アルミニウム圧子を用いて行った。テストは、特注で作られたzステージドライバで行った。力を10gの小型ロードセル(Honeywell; Morris Plains, NJ)を使用して測定し、データをLabVIEW V12.0(National Instruments; Austin, TX)を使用して収集した。破壊まで1mm/秒で電界偏向試験を行った。線形領域が機械的応力値を与えるように力と変位(displacement)曲線をグラフ化してフィットさせた(図34B)。最大荷重も曲線のピークとして得られた。
ゲル分解動力学を、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、又は組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)の濃度を変動させることにより決定した。トロンビン濃度は剛性又は分解動力学に影響を及ぼさないようであり、10U/mLで一定に保った。同一サイズのゲル(1.5mm×5.0mm横長)を特注パンチを使用して作製した。パンチされたゲルは、種々の濃度のプラスミノーゲン(0.01〜1U/mL)及びtPA溶液(0.1〜1,000U/mL)中でインキュベートした。それぞれの変数(フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、及びtPA濃度)の影響を解明するため、それぞれ他の2つを一定に保ったまま変動させた。
21歳の白人女性ドナーから作製されたiPSC 006-BIOTR-001株を使用した(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015))。この株から、他(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015))に記載されている分化プロセスを使用して、LAgen Laboratories (Rochester, MN)によりiPSC-RPE細胞が作製された。
iPSC-RPEにおけるタンパク質発現を可視化するために免疫蛍光を使用した。サンプルを100%氷冷メタノール中で−20℃で10分間かけて固定した。他(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015))に記載のように、以下の一次抗体を1:1000希釈で使用して染色を行った:ポリクローナルウサギ抗Best1(pAB125)、ポリクローナルウサギ抗エズリン(Cell Signaling; Danvers, MA)、及びポリクローナルウサギ抗ZO1(Life Technologies)。サンプルをFluoromountを使用してスライドガラスに載せ、Nikon E600蛍光顕微鏡(Nikon; Tokyo, Japan)を使用して画像化した。
LIVE/DEAD生存力/細胞毒性キット(Live Technologies)を製造業者のプロトコルにより使用して生存/死滅アッセイを実施した。生細胞はFITCフィルター(吸光度:495nm/発光:520nm)を使用して可視化し、死細胞はTRITCフィルター(吸光度:543nm/発光:560nm)を使用して可視化した。フィブリン上で培養したRPE単層を分解の前又は後に使用した。100U/mL tPAを含む1U/mLプラスミノーゲンを使用して分解を達成した。細胞生存力を、可視化された総細胞で除した生染色細胞の割合(%)として計算した。実験群の結果を対照群に対して正規化した。
フィブリン上で培養したRPEを1X DPBSに掻き取り、4℃にて5,000gで5分間遠心した。細胞をTrizol中で溶解し、そして全RNAを全RNA単離キット(Zymo; Irvine, CA)を用いて単離した。全RNAをRNase不含のDNAse I(Roche Bio; Basel, Switzerland)で処理した。Superscript III逆転写酵素(Life Technologies)を用いて全RNAからcDNAを合成した。全RNAをオリゴdT(Life Technologies)でプライミングした。プライマーは、Primer-BLASTソフトウエアを使用して設計した(Ye et al., BMC Bioinformatics, 13:134 (2012))。Sendai Viral Primer配列は、CytoTuneTM-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kitからのものであった。プライマーはIDT(Coralville, IA)から脱塩して注文した。10〜100ngの投入cDNA及びPowerUp Sybr Green Master Mix(Applied Biosystems; Foster City, CA)を用いた40サイクルのPCRを、Applied Biosystems QuantStudio 5 qPCR装置で行った。プライマーセットのアニーリング温度に従ってPCR反応をバッチ処理した。CTが37サイクル未満であれば、遺伝子が存在するとみなした。
ELISAアッセイキット(RND Systems; Minneapolis, MN)を使用して製造業者のプロトコルに従って、プレコーティングしたプレートを用いて48時間後に回収された培地からVEGF及びPEDF分泌を定量した。総タンパク質は標準曲線を使用して決定した。
RPEを、1%Triton-X、20mM Tris、150mM NaCl、及び5mM EDTA, pH 8.0を含むTPIバッファー中にフィブリンから掻き取った。細胞を4℃で1時間かけて溶解した。製造元の溶液キット及びプロトコルを用いて、サンプルを希釈し、そしてキャピラリー電気泳動に基づくウエスタンブロット装置(Protein Simple Wes; San Jose, CA)で分離した。一次抗体は、RPE65(401.8B11.3D9)、Bestrophin 1(pAB125)、CRALBP(B2)、及びβ-アクチン(AC-15)を含めた。
JMP 10(SAS; Cary, NC)を使用してデータを解析した。フィブリン機械的試験及び分解試験のために、一方向ANOVA検定を使用した。アプロチニン毒性試験のために、二方向ANOVA検定を使用した。ANOVA解析後、Tukey HSD検定を使用して群間の有意性を検定した。全ての細胞定量データについて、ステューデントのt検定を使用して個々の群を比較した。統計学的有意性はp<0.05について検討した。
ゲル形成機械的特性
RPE移植のために本明細書で提供される材料は、外科用器具で操作しながら平坦性を維持するのに十分な強度を有する薄い層状シートになるように設計することができる。フィブリノーゲン及びトロンビンの濃度を変えながら、特注鋳型(50mm×50mm平方、400μm厚)を使用して同じ厚さのゲルを製造した。トロンビン濃度は、他(Rowe et al., Acta Biomater., 3:59-67 (2007))に記載されているように、1U*mL-1*mg-2を超える濃度のフィブリノーゲンで製造されたフィブリンヒドロゲルの機械的特性に影響を及ぼさなかった。以下の研究は、一定のトロンビン濃度(100U/mL)を用いて行われた。
フィブリンゲルは、室温でPBS中に無菌的に貯蔵した場合、それ自体では顕著な分解を受けなかった。現在まで、フィブリンゲルは9ヶ月を超えて室温で保存されている。PBS中のフィブリンゲルは、tPAに曝露された場合に顕著な分解を受けなかった(図36A)。しかし、プラスミノーゲンとtPAの組み合わせが添加された場合には、フィブリンゲルは急速に分解し始めた。分解はゲルの全体的な薄化として進行し、一部のゲルはより小さな断片に分解した。可視できる残存物がなくなったとき、分解は完了したとみなした。
RPE培養のため、メニスカスを平らにするための特注のテフロン(登録商標)ウェイトを使用して、フィブリンゲルを様々な細胞培養フォーマットに適合するように形成した。全ての細胞培養は、40mg/mLのフィブリノーゲン濃度で形成されたフィブリンゲルを用いて行った。最初にフィブリン上で培養したRPEは、最初の48時間以内に基質を分解した(図37A)。これに対処するために、プロテアーゼ阻害剤であるアプロチニンを使用した。アプロチニンはヒトでの使用がFDAにより承認されている。
フィブリン上で培養されたiPSC-RPEは着色し、そして石畳状(cobblestone)の細胞単層を形成する(図38A)。生存/死滅アッセイは、細胞が生存可能であることを確認した(図38B)。RPE表現型の検証は、20の主要RPEマーカーのパネルを用いてqPCRによって行った(図40)。PCRの37サイクル目の前にピークが観察された場合、マーカーが存在すると見なした。マトリゲルコーティング組織培養プラスチック上で増殖したiPSC-RPEについて観察されたものと同様に、10週間フィブリンゲル上で増殖したiPSC-RPEにおいてすべてのRPEマーカー(特に、RPE65、CRALBP及びMITF)が検出された。多能性マーカーLIN28A及びセンダイウイルス送達「Yamanaka」因子(KLF、KOS、c-myc)のマーカーは、全ての群において陰性であった。
この試験の目的は、RPE単層の増殖及び移植のための急速に分解可能な支持体を作製することであった。急速に分解可能で適切なサイズ及び機械的強度を有するフィブリンヒドロゲルを製造するためのパラメータを確立したので、iPSC-RPE単層の存在及びアプロチニン中での増殖がゲルの分解動力学を変更するかどうか並びに分解がin vitroにおけるiPSC-RPEの生存力を変更するかどうかを決定するために以下を行った。iPSC-RPEのために(sans)ゲルを用いて蓄積されたデータに基づいて、0.5U/mLプラスミノーゲン及び100U/mL tPAを用いて分解試験を行った。図39Aに示すように、フィブリンが分解し始めるにつれて、RPE単層は端部からそれ自体の上にカールし始めた(図39A)。フィブリン支持体が残っていない領域でしわが見られた。フィブリンがまだ無傷の領域では、RPEは平坦に見えた。完全に分解された後、RPEは多くのカール及びしわを有する単層シートのままであり、そして外科用器具を用いて取り扱うことが困難になった。しかしながら、RPEは連続的な色素性組織として現れた(図39A)。
フィブリンヒドロゲルをウサギ眼の網膜下腔に移植した(図41)。フィブリンヒドロゲルは、フィブリノーゲン溶液(最終:40mg/mL)及びトロンビン溶液(最終:100U/mL)を特注鋳型において混合して薄シート(200μm)を作製することにより調製した。移植後のゲルの視覚化を容易にするために、少量のトリパンブルーを加えた。移植物を1.5mm×5 mmの横長の形状にパンチした。調製後、移植物を移植デバイスに装填した。外科的移植を行うために、白色の雌ニュージーランドウサギ(3kg)を麻酔し、外科手術の準備をした。標準的な3ポート硝子体切除術を実施し、続いて細いカニューレを使用してブレブ(bleb)形成を行い、そして網膜切開術を網膜鋏を使用して作製した。強膜を通して切開部を作成するために3.2mmのスリットナイフを使用した。移植デバイスを眼に挿入し、網膜切開術の下に配置した。移植物は適所に配置された。移植デバイスを取り除いた後、強膜切開部を縫合して閉じた。動物が目覚める前は、移植物は平らな網膜の下に平面シートとして見えていた。動物を48時間後に犠牲にし、眼を摘出した。肉眼的解剖検査では、フィブリンハイドロゲルの証拠は残っていないことが明らかになった。
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、前述の記載は例示することを意図したものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は添付の特許請求の範囲内にある。
Claims (42)
- (a)頂端面及び基底面を有する網膜色素上皮単層と、(b) 該単層の該頂端面に付着したフィブリンヒドロゲル層とを含む網膜移植物。
- 前記フィブリンヒドロゲル層が約20μm〜約400μm厚である、請求項1に記載の移植物。
- 前記移植物がプラスミノーゲンを含む、請求項1〜2のいずれか1項に記載の移植物。
- 前記移植物が、1mL当たり約0.1Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲン、又は1mL当たり約0.001Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲンを含む、請求項1〜2のいずれか1項に記載の移植物。
- 網膜移植物の作製方法であって、
(a)頂端面及び基底面を有する網膜色素上皮単層を取得すること、並びに
(b)前記単層の前記頂端面上にフィブリノーゲン及びトロンビンのコーティングを沈着させること
を含む、上記方法。 - 前記コーティングが約20μm〜約400μm厚である、請求項5に記載の方法。
- 前記コーティングが1mL当たり約20mgのフィブリノーゲンから1mL当たり約80mgのフィブリノーゲンを含む、請求項5〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コーティングが1mL当たり約2Uのトロンビンから1mL当たり約1500Uのトロンビンを含む、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記単層の前記頂端面上にプラスミノーゲンを沈着させることを含む、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コーティングが、1mL当たり約0.1Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲン、又は1mL当たり約0.001Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲンを含む、請求項9に記載の方法。
- プロテアーゼ阻害剤又は抗線維素溶解剤を含む培地中でフィブリン基底支持基質上で網膜上皮細胞を培養することを含む、網膜移植物の作製方法。
- 前記培地が前記プロテアーゼ阻害剤を含み、前記プロテアーゼ阻害剤がアプロチニンである、請求項11に記載の方法。
- 前記培地が、1mL当たり約5Uのアプロチニンから1mL当たり約500Uのアプロチニンを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記培地が前記抗線維素溶解剤を含み、前記抗線維素溶解剤がトラネキサム酸(transexamic acid)又はアミノカプロン酸である、請求項11に記載の方法。
- 前記培地がプラスミノーゲンをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記培地が、1mL当たり約0.1Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲン、又は1mL当たり約0.001Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲンを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記フィブリン基底支持基質が内皮細胞を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記内皮細胞が、iPSC由来内皮細胞、血管内皮前駆細胞(BOEC)、内皮コロニー形成細胞(ECFC)、内皮前駆細胞(EPC)、及び臍静脈内皮細胞(UVEC)からなる群より選択される供与源から取得されたものである、請求項17に記載の方法。
- (a) 頂端面及び基底面を有する網膜色素上皮単層と、(b) 該単層の該基底面に付着したフィブリンヒドロゲル層とを含む網膜移植物。
- 前記フィブリンヒドロゲル層が約20μm〜約400μm厚である、請求項19に記載の移植物。
- 前記移植物がプラスミノーゲンを含む、請求項19〜20のいずれか1項に記載の移植物。
- 前記移植物が、1mL当たり約0.1Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲン、又は1mL当たり約0.001Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲンを含む、請求項19〜20のいずれか1項に記載の移植物。
- 前記フィブリンヒドロゲル層がコーティングを含む、請求項19〜22のいずれか1項に記載の移植物。
- 前記コーティングが、基底膜タンパク質、マトリゲル(matrigel)、又はgeltrexを含む、請求項23に記載の移植物。
- 網膜移植物の作製方法であって、
(a)フィブリンヒドロゲル層を取得すること、
(b)前記フィブリンヒドロゲル層の表面を剤でコーティングすること、並びに
(c)前記コーティング上に頂端面及び基底面を有する網膜色素上皮単層を形成することであって、前記基底面が前記頂端面よりも前記フィブリンヒドロゲル層に近いものである、
を含む、上記方法。 - 前記フィブリンヒドロゲル層が約20μm〜約400μm厚である、請求項25に記載の方法。
- 前記フィブリンヒドロゲル層が、1mL当たり約20mgのフィブリノーゲンから1mL当たり約80mgのフィブリノーゲンを含む、請求項25〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フィブリンヒドロゲル層が、1mL当たり約2Uのトロンビンから1mL当たり約1500Uのトロンビンを含む、請求項25〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フィブリンヒドロゲル層が、1mL当たり約0.1Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲン、又は1mL当たり約0.001Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲンを含む、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
- プロテアーゼ阻害剤又は抗線維素溶解剤を含む培地中でフィブリン基底支持基質上で網膜上皮細胞を培養することを含む、網膜移植物の作製方法。
- 前記培地が前記プロテアーゼ阻害剤を含み、前記プロテアーゼ阻害剤がアプロチニンである、請求項30に記載の方法。
- 前記培地が1mL当たり約5Uのアプロチニンから1mL当たり約500Uのアプロチニンを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記培地が抗線維素溶解剤を含み、前記抗線維素溶解剤がトラネキサム酸(transexamic acid)又はアミノカプロン酸である、請求項30に記載の方法。
- 前記培地がプラスミノーゲンをさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 前記培地が、1mL当たり約0.1Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲン、又は1mL当たり約0.001Uのプラスミノーゲンから1mL当たり約40Uのプラスミノーゲンを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記フィブリン基底支持基質が内皮細胞を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記内皮細胞が、iPSC由来内皮細胞、血管内皮前駆細胞(BOEC)、内皮コロニー形成細胞(ECFC)、内皮前駆細胞(EPC)、及び臍静脈内皮細胞(UVEC)からなる群より選択される供与源から取得される、請求項36に記載の方法。
- 前記フィブリン基底支持基質がコーティングを含む、請求項30〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コーティングが、基底膜タンパク質、マトリゲル(matrigel)、又はgeltrexを含む、請求項38に記載の移植物。
- 前記コーティングが、前記フィブリン基底支持基質上での前記網膜上皮細胞の培養前に存在していたものである、請求項38に記載の移植物。
- 前記フィブリン基底支持基質がRPE下組織細胞集団を含む、請求項11又は30に記載の方法。
- 前記RPE下組織細胞集団が、メラニン形成細胞、周皮細胞、又は線維芽細胞を含む、請求項41に記載の方法。
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