KR101613478B1 - 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 하이드로겔에서 배양한 중간엽줄기세포 조성물, 보다 구체적으로 인간지방유래 중간엽줄기세포 조성물을 함유하는, 안정하며 즉시 사용 가능한 투여형태 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 중간엽줄기세포를 하이드로겔 내에서 배양한 후 세척하여 주사기에 충진하여 바로 투여가 가능한 형태의 조성물을 제공함으로써, 최종 이식세포 준비과정에서 효소처리가 필요하지 않고, 원심분리법 등을 이용하는 세척단계를 거치지 않고 하이드로겔 상태로 세척하게 되므로 세포의 손실이 거의 없으며, 하이드로겔 포어(pore) 내에 생리활성물질이 첩포되어 있어 개체에 투여한 직후부터 치료효과를 나타낸다는 장점을 갖는다.
Description
본 발명은 하이드로겔에서 배양한 중간엽줄기세포 조성물, 보다 구체적으로 인간지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 중간엽줄기세포를 하이드로겔 내에서 배양한 후 세척하여 주사기에 충진하여 제공함으로써, 바로 투여가 가능하고, 최종 이식세포 준비과정에서 효소처리가 필요하지 않으며, 원심분리법 등을 이용하는 세척단계를 거치지 않고 하이드로겔 상태로 세척하게 되므로 세포의 손실이 거의 없고, 하이드로겔 포어(pore) 내에 생리활성물질이 첩포되어 있어 개체에 투여한 직후부터 치료효과를 나타낸다는 장점을 갖는다.
종래의 1세대 줄기세포치료제는 트립신 또는 디스파아제 등의 단백질 분해효소를 처리하여 얻은 단리된 세포로 단백질 분해효소를 처리하는 동안 세포막에 노출되어 있는 모든 단백질을 비선택적으로 분해하기 때문에 세포간 결합과 기저막 단백질 등이 거의 유지되지 않는다. 또한 단백질분해효소를 비활성화시키기 위하여 FBS 등의 동물유래 물질을 첨가하게 되며, 이를 제거하기 위해 수회에 걸쳐 세척-원심분리과정을 수행하게 되는데, 통상적으로 1회 세척-원심분리 과정 동안 5~10% 정도의 세포 손실이 발생한다. 따라서 단백질분해효소를 사용한 세포수집과정은 매우 비효율적인 방법이다.
또한 단리 된 단일세포를 질환부위에 이식하면 확산 및 흡수 등을 통해 타겟 부위에서 유출되기 때문에 정착된 세포의 비율이 낮다. 이외에도 중간엽줄기세포는 부착성이 강한 세포이기 때문에 단일 세포로 분리하였을 때 6~24시간 내에 사멸하게 되며 생착률이 아주 낮다는 결점을 가지고 있다.
WO 2006/004951호에는 생체적합성 스캐폴드 내의 성체 중간엽 줄기세포(MSC)로부터 소정 형태와 규모의 연조직을 새로이(de novo) 생체 내(in vivo) 합성하는 방법 및 이러한 방법으로 제조된 조성물에 대하여 개시하고 있다. 상기 문헌에는 생체적합성 스캐폴드로 하이드로겔 중합체, 보다 구체적으로 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트를 사용하는 방법이 제시되어 있다. 그러나 상기 조성물은 연조직 결합의 복구를 위한 것으로서 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트가 스캐폴드로 사용되었을 경우 직경의 변화가 거의 없어야 한다는 점을 예정하고 있을 뿐, 배양 후 주사기에 충진하여 바로 투여가 가능하도록 하는 제조과정에 대하여는 개시 또는 암시하고 있지 않다.
한국등록특허 제1,289,834호에는 양수 유래 줄기세포를 함유하는 괄약근 재생 세포치료제가 개시되어 있고, 상기 세포치료제가 하이드로겔 복합체, 구체적으로는 알기네이트/PF-127/히알루론산에 주입되어 그 효과가 증대될 수 있다는 점이 제시되어 있다. 그러나 상기 문헌에서는 줄기세포를 수집하는 과정 자체를 개선하여 수득율을 높일 수 있다는 점에 대해서는 개시하고 있지 않다.
한국등록특허 684,940호에는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법이 개시되어 있으며, 더욱 구체적으로는 중간엽 줄기세포를 생분해성 고분자인 피브린/HA를 함유하는 혼합지지체에 고정하여 배양하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기 문헌에서는 피브린/HA를 지지체로 사용하는 경우 종래 세포분화를 위해 첨가되었던 TGF-beta를 첨가하지 않아도 중간엽 줄기세포가 연골세포로 분화가 촉진될 수 있다는 점이 개시되어 있을 뿐이다.
종래 방법의 경우, 최종 이식세포 준비과정에서 효소 처리를 하게 되므로 세포간 결합과 기저막단백질이 손상될 수 있고, 세포 수집, 세척, 바이알 충전단계 및 바이알에서 다시 주사기에 충진하는 각 단계에서 세포 손실이 발생할 수 있으며, 또한 효소처리 후 단일세포만을 수집하여 주사하게 되므로 세포배양 동안 합성된 콜라겐과 같은 활성물질은 대부분 제거된다는 문제가 있었다.
이에 본 발명에서는, 세포를 하이드로겔 내에서 배양한 후 세척하여 주사기에 충진하여 바로 투여가 가능한 형태의 조성물을 제공함으로써, 최종 이식세포 준비과정에서 효소처리가 불필요하고, 원심분리법 등을 이용하는 세척단계를 거치지 않고도 하이드로겔 상태로 세척하게 되므로 세포손실이 거의 없으며, 생리활성물질이 하이드로겔 포어(pore) 내에 첩포되어 있어 개체에 투여한 직후부터 유효한 치료효과를 나타낸다는 점을 새로이 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
Wu X, Ren J, Li J., Cytotheray, 2012 May; 14(5):555-62
Liao HT. et al., J. Trauma., 2011 Jan; 70(1): 228-37
Wang K. et al., Tissue Eng Part A., 2012 Dec; 18(23-24): 2507-17
Fang H. et al., J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci., 2004;24(3): 272-4
Inok Kim et al., Tissue Eng Part A., 2013; 19(21-22): 2373-81.
본 발명은 인간의 지방조직에서 분리한 중간엽줄기세포를 질환 치유에 사용하기 위한 것으로 1) 세포를 충분한 양으로 배양한 후 수집하는 과정에서 세포의 손실을 막고, 2) 단백질효소처리 등에 따른 세포의 손상을 막으며, 3) 타겟 부위에서 세포의 손실을 최소화하기 위한 최대한 개선된 방법의 세포 조성물의 제조 방법 및 이로부터 얻어진 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 개선된 방법으로 제조된 세포 조성물을 주사기에 충진하여 제공함으로써 사용이 용이하도록 하였다. 본 발명으로 제조되고 충진된 세포-하이드로겔은 20~25 게이지의 니들을 이용하여 국소투여가 가능한 모든 질환의 치료제로 적용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 지방유래 중간엽줄기세포를 하이드로겔에서 배양한 후 주사기를 이용하여 줄기세포-하이드로겔을 수집하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 질환 치료용 조성물에서, 중간엽 줄기세포는 CD29, CD44, CD73, CD90 등에 대하여 양성이며, CD34 및 CD45에 대해 음성인 자가 또는 동종 유래 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산 또는 이의 유도체, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 이 때 피브린 글루를 형성하는 피브리노겐의 농도는 0.4 내지 1.8 mg/mL일 수 있고, 보다 구체적으로 0.9 내지 1.6 mg/mL일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 줄기세포 100,000~2,000,000 개를 1 mL의 하이드로겔과 혼합하여 12~24 well plate에 1 mL ~ 2 mL 첨가하여 겔을 만든 후 배지를 첨가하여 3~6일 동안 배양하여 제조한다. 배지는 종래 특허 (누공 치료를 위한 자가 및 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포 조성물, 등록번호: 1,328,604)에서 제시하는 10% FBS 및 bFGF 또는 EGF가 포함된 DMEM 배지일 수 있으며 또는 1~10% 인간혈청알부민과 1~50%의 종래 특허 (고농도의 세포성장인자를 포함하는 중간엽줄기세포 배양액의 제조방법 및 이로부터 얻어진 조성물, 출원번호: 10-2011-0043953)에 따라 제조된 조성물을 포함하는 DMEM일 수 있다.
본 발명에 따른 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물의 제조방법은 세포를 하이드로겔 내에서 배양한 후 세척하여 바로 주사기에 충진하여 사용함으로써 최종 이식세포 준비과정에서 효소처리가 불필요하고, 원심분리법 등을 이용하는 세척단계를 거치지 않고 하이드로겔 상태로 세척하게 되므로 세포의 손실이 거의 없으며, 하이드로겔 포어(pore) 내에 생리활성물질이 첩포되어 있어 개체에 투여한 직후부터 치료효과를 나타내게 되어 매우 유용하다.
보다 구체적으로 설명하면, 본 발명에 따른 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물의 제조방법은 단백질 분해효소를 이용한 단리(선별) 단계를 거치지 않아 종래의 세포수집과정에 따른 세포의 손실을 막아 세포를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한 이와 같은 방법으로 얻어진 줄기세포는 고활성 상태로 질환부위에 투여할 수 있고, 투여된 세포는 하이드로겔이 분해되어 모두 흡수되기 전까지 타겟 부위에서 머물러 있어 치료효과를 지속적으로 나타낼 수 있다. 또한 배양 단계에서 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴과 같은 세포외기질이 온전하게 하이드로겔에 첩포되어 존재함으로써 종래 치료제에 비하여 치료능력이 현저히 우수하며, 치료기간을 단축시킬 수 있는 유리한 효과를 나타낸다.
실험결과, 본 발명에 따른 지방유래 중간엽 줄기세포-하이드로겔은, 줄기세포가 하이드로겔 내에서 일주일 이상 생존하고 섬유아세포 형태를 유지하여 종래 줄기세포치료제에 비하여 생존기간이 현저히 증가하였으며, 또한 1주 동안 세포 성장 및 혈관형성을 촉진하는 다양한 성장인자와 사이토카인이 지속적으로 분비되고, 다양한 종류의 세포외기질을 다량 분비할 뿐만 아니라 분비된 세포외기질이 하이드로겔 내에 머물러 있어 체내에 이식하였을 때 다양한 기질을 제공함으로써 상처치유를 용이하게 할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 면역반응을 유발하지 않으며 오히려 활성화된 면역세포에서 분비되는 염증유발물질인 TNF-alpha를 억제하여 염증을 완화시킴으로써 상처치유를 도울 수 있다는 장점이 있는 것으로 나타났다.
도 1은 인간지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔 사진으로 a는 배양 후 세포-하이드로겔을 형성한 상태이고, b는 a의 세포-하이드로겔을 주사기에 충진한 후의 사진, c와 d는 주사기에 충진된 세포-하이드로겔을 니들을 통해 주사하는 과정 및 주사 후 사진으로 겔 형태를 그대로 유지하고 있음을 보여주고 있다.
도 2a는 피브리노겐 및 트롬빈 용액을 단계별 희석하여 만든 피브린 겔과 혼합하여 배양한 인간 지방유래 중간엽 줄기세포를 주사기에 충진하고 곧바로 23 게이지 니들을 통해 주사한 줄기세포-하이드로겔을 광학현미경으로 관찰한 사진이다 (100 배율). 최종 하이드로겔에서의 피브리노겐과 트롬빈의 희석배수 및 농도를 표기하였다.
도 2b는 주사기에 충진한 세포-하이드로겔을 체내 온도와 동일한 37℃에서 24시간 보관한 후 23 게이지 니들을 통해 주사한 후 광학현미경으로 관찰한 사진이다 (100 배율). 최종 하이드로겔에서의 피브리노겐과 트롬빈의 희석배수 및 농도를 표기하였다.
도 3은 종래 기술에 따라 2차 배양한 세포의 수집, 세척, 바이알 충진, 그리고 주사기에 충진하는 각 단계에서 세포 회수율과 하이드로겔에서 배양한 세포의 수집, 세척, 그리고 주사기에 충진하는 단계에서 세포 회수율을 보여주는 그래프이다.
도 4는 종래 기술에 따라 2차 배양하여 바이알에 충진한 세포(비교예 1)와 하이드로겔에서 배양하여 주사기에 충진한 세포-하이드로겔(실시예 3)의 생존을 AO/EtBr로 염색하여 나타낸 사진이다.
도 5는 종래 기술에 따라 2차 배양, 수집, 세척, 충진한 세포현탁액(비교예 1)과 하이드로겔에서 배양, 세척, 주사기에 충진한 세포-하이드로겔(실시예 3)에 포함되어 있는 세포외기질인 콜라겐 타입 I의 양을 효소결합 면역흡수 분석법으로 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 2a는 피브리노겐 및 트롬빈 용액을 단계별 희석하여 만든 피브린 겔과 혼합하여 배양한 인간 지방유래 중간엽 줄기세포를 주사기에 충진하고 곧바로 23 게이지 니들을 통해 주사한 줄기세포-하이드로겔을 광학현미경으로 관찰한 사진이다 (100 배율). 최종 하이드로겔에서의 피브리노겐과 트롬빈의 희석배수 및 농도를 표기하였다.
도 2b는 주사기에 충진한 세포-하이드로겔을 체내 온도와 동일한 37℃에서 24시간 보관한 후 23 게이지 니들을 통해 주사한 후 광학현미경으로 관찰한 사진이다 (100 배율). 최종 하이드로겔에서의 피브리노겐과 트롬빈의 희석배수 및 농도를 표기하였다.
도 3은 종래 기술에 따라 2차 배양한 세포의 수집, 세척, 바이알 충진, 그리고 주사기에 충진하는 각 단계에서 세포 회수율과 하이드로겔에서 배양한 세포의 수집, 세척, 그리고 주사기에 충진하는 단계에서 세포 회수율을 보여주는 그래프이다.
도 4는 종래 기술에 따라 2차 배양하여 바이알에 충진한 세포(비교예 1)와 하이드로겔에서 배양하여 주사기에 충진한 세포-하이드로겔(실시예 3)의 생존을 AO/EtBr로 염색하여 나타낸 사진이다.
도 5는 종래 기술에 따라 2차 배양, 수집, 세척, 충진한 세포현탁액(비교예 1)과 하이드로겔에서 배양, 세척, 주사기에 충진한 세포-하이드로겔(실시예 3)에 포함되어 있는 세포외기질인 콜라겐 타입 I의 양을 효소결합 면역흡수 분석법으로 정량하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물의 제조방법을 제공하며, 본 발명의 제조방법을 사용하는 경우, 세포를 하이드로겔 내에서 배양한 후 세척하여 바로 주사기에 충진하여 사용함으로써 최종 이식세포 준비과정에서 효소처리가 불필요하고, 원심분리법 등을 이용하는 세척단계를 거치지 않고 하이드로겔 상태로 세척하게 되므로 세포의 손실이 거의 없으며, 하이드로겔 포어(pore) 내에 생리활성물질이 첩포되어 있어 개체에 투여한 직후부터 치료효과를 나타내게 되어 매우 유용하다.
이하, 보다 구체적으로 본 발명을 설명한다.
본 발명은 (a) 지방유래 중간엽줄기세포를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 지방유래 중간엽줄기세포와 하이드로겔 용액을 혼합하여 겔을 형성시키는 단계; 및 (c) 상기 겔을 배양하는 단계를 포함하는, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 하이드로겔로는 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 키토산, 셀룰로오스, 펙틴, 2-히드록시에틸 메타아크릴레이트 유도체 및 이의 공중합체, 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리비닐 알코올로 이루어진 하이드로겔 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 또는 2종 이상의 복합체를 사용할 수 있고, 보다 구체적으로 하이드로겔로는 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 또는 2종 이상의 복합체를 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 피브린 글루를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 피브린 글루는 0.4 내지 1.8 mg/mL의 농도의 피브리노겐을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 0.9 내지 1.6 mg/mL의 농도의 피브리노겐을 포함할 수 있다. 실험 결과, 피브린 글루의 최종 농도가 상기 범위를 벗어나는 경우, 세포가 잘 증식하지 못하거나 세포와 하이드로겔이 분리되는 것으로 나타났다.
본 발명의 일 양태에서, 피브린 글루는 1 내지 300 I.U./mL의 농도, 구체적으로 5 내지 30 I.U./mL 농도의 트롬빈을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 10 내지 15 I.U./mL 농도의 트롬빈을 포함할 수 있다. 상기 범위 내에서 세포의 증식 및 세포-하이드로겔 부착성 측면에서 문제가 발생하지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (c) 이후, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물을 앰플, 바이알 또는 주사기에 충진하는 단계 (d)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물은 20 내지 25 게이지의 니들을 사용하여 바로 국소투여가 가능하다.
본 발명의 일 양태에서, 단계 (d)에서 제조된 앰플, 바이알 또는 주사기에 충진된 중간엽줄기세포-하이드로겔에서 카운팅한 세포수는 단계 (c)에서 수득된 중간엽줄기세포를 카운팅한 세포수의 70% 이상, 보다 구체적으로 80% 이상일 수 있다.
실험결과 종래의 방법을 사용하는 경우, 주사기에 충진한 상태에서 측정한 결과 세포가 약 70% 이상 손실되는 것으로 나타난 반면 본 발명에 따른 제조방법을 사용하는 경우 20% 미만 정도만이 손실되는 것으로 나타나 세포 손실율이 종래 방법에 비하여 현저히 낮은 것으로 나타났다.
본 발명은, 상기 방법으로 제조된 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물을 유효성분으로 함유하는, 세포치료제를 제공한다.
본 발명에서 용어 “세포치료제”란 사람으로부터 분리, 배양 및 특수 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 특히 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 보다 구체적으로는 지방유래 줄기세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "개체"란 본 발명에 따른 세포치료제의 투여를 통해 예방 또는 치료할 수 있는 질환이 이미 발병되었거나, 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이고, 본 발명의 권리범위가 이로 한정되는 것을 의도하지 않는다.
실시예
1. 인간 지방유래
중간엽
줄기세포의 배양 방법
지방 조직은 보통 지방 흡입술로 얻을 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방유래 중간엽 줄기세포를 분리하였다: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 PBS로 3~4 회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37 ℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20 ℃, 1500 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기질배지를 넣어 현탁시킨 후, 20 ℃, 1200 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획으로, 상층액을 제거하였다. 스트로마-혈관 분획을 기질배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기질배지, 또는 기질배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 1 ng/㎖ 농도로 포함된 증식배지, 또는 기질배지에 표피세포 성장인자(EGF)가 5 ng/㎖ 농도로 포함된 배지를 이용하여 증식시켰다. 지방유래 중간엽 줄기세포가 배양용기의 80~90% 정도로 자라면 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다.
실시예
2.
피브린글루
하이드로겔의
농도결정
상기 실시예 1에서 얻은 지방유래 중간엽줄기세포 5 x 105 개/mL 에 트롬빈 용액 (400~600 I.U.)을 1:10, 1:20, 1:40의 비율로 첨가하였다. 피브리노겐 (71.5~126.5 mg/mL)은 각각 1:20, 1:40, 1:80으로 희석하여 준비하였다. 듀플로젝트 시린지 시스템을 이용하여 12well plate의 각 well에 피브리노겐과 트롬빈이 포함된 세포현탁액을 각각 500~700 uL씩 첨가하였다. 겔이 완전히 굳으면 10% FBS, 1 ng/mL bFGF가 포함된 배양배지를 첨가한 후 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 배양하였다. DMEM으로 3회 세척한 후 1 ng/mL bFGF가 포함된 DMEM을 첨가하고 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 약 12시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거하고 1 mL 주사기를 이용하여 세포-하이드로겔을 수집하였다. 주사기에 23 게이지 니들을 연결하여 세포-하이드로겔을 디쉬에 밀어낸 후 광학현미경으로 관찰하였다.
도 1a는 12well 에서 배양한 세포-하이드로겔을 디쉬로 옮겨 관찰한 사진으로 하이드로겔이 형성된 후 배양기간 동안 그대로 유지되었다.
도1b는 세포-하이드로겔을 주사기에 충진한 것으로 세포-하이드로겔이 주사기에 충진된 이후에도 겔 상태를 그대로 유지함을 보여주고 있다.
도 1c는 세포-하이드로겔이 충진된 주사기에23 게이지 니들을 연결한 후 세포-하이드로겔을 주사하는 과정이며, 도 1d는 23 게이지 니들을 통해 주사된 세포-하이드로겔이 여전히 하이드로겔 형태를 그대로 유지하고 있음을 알 수 있다.
도 2a는 각각의 비율로 제조된 세포-하이드로겔을 주사기에 충진하고 23 게이지 니들을 통해 플레이트에 주사한 후 현미경으로 관찰한 사진이다. 피브린글루 농도가 희석될수록 세포가 잘 증식하였으며, 피브린글루 최종 농도가 0.9~1.6 mg/mL 또는 0.4~0.8 mg/mL인 경우 세포가 잘 증식하고 세포와 피브린글루 하이드로겔이 잘 융화되어 있음을 보여주고 있다. 트롬빈 농도에 따른 유의적인 차이는 관찰되지 않았다.
도 2b는 각각의 비율로 제조된 세포-하이드로겔을 주사기에 충진하고 37℃ 에서 24시간 동안 방치한 23 게이지 니들을 통해 플레이트에 주사한 후 현미경으로 관찰한 사진이다. 피브리노겐의 최종 농도가 1.8~3.2 mg/mL인 경우와 0.4~0.8 mg/mL인 경우 세포와 하이드로겔이 거의 분리되어 있으나 피브리노겐의 최종 농도가 0.9~1.6 mg/mL일 때에는 24시간까지 세포가 하이드로겔 내에 잘 융화되어 있음을 보여주고 있다. 트롬빈 농도에 따른 유의적인 차이는 관찰되지 않았다.
실시예
3. 세포-
하이드로겔
배양액의 제조
상기 실시예 1에서 얻은 지방유래 중간엽줄기세포 5 x 105 개/mL 에 트롬빈 용액을 1:20의 비율로 첨가하고, 피브리노겐은 1:40으로 희석하여 준비한 후 실시예 2에 따라 배양하고, 세척한 후, 주사기에 충진하였다.
비교예
1. 종래 세포치료제의 배양법을 사용한 제조
종래의 세포치료제 배양법으로는 다음과 같은 방법을 사용하였다:
배양용기에 지방유래 중간엽줄기세포를 배양한 후 80% 정도 채워졌을 때 트립신-이디티에이를 첨가하여 단일세포로 분리한 후 우태아혈청이 포함된 DMEM으로 효소를 불활성화시키고 원심분리용 튜브에 모은 후 1,500 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 우태아혈청을 제거하기 위해 DMEM을 첨가하여 세포를 현탁한 후 다시 1,500 rpm으로 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 총 3회 세척하고 마지막 단계에서 세포를 적정 부피의 세포현탁제로 현탁한 후 바이알에 충진하였다. 충진된 세포는 23 게이지 니들이 연결된 1 mL 주사기로 옮겨 넣었다.
실험예
1. 세포 회수율 측정시험
상기 실시예 3의 각 단계에서 세포-하이드로겔에 트리플익스프레스 효소를 첨가하여 피브린글루를 녹인 후 세포수를 측정하였다. 마찬가지로 비교예 1의 각 단계에서 세포수를 측정하였다.
도 3a는 기존의 제조방법(비교예 1)에 따라 세포치료제 제조할 때 각 단계에서의 세포 회수율을 최초 수집단계 (트립신-이디티에이 불활성화)와 비교하여 나타낸 그래프로 각 단계별로 10~25%씩 감소하였으며, 최종적으로 주사기에 충진한 이후에는 최초 수집단계 대비 약 30%의 세포만 회수되었다.
도 3b는 본 발명의 제조방법(실시예 3)에 따라 제조할 때 각 단계에서의 세포회수율을 최초 수집단계 (배양 완료 후) 나타낸 그래프로 각 단계별로 1~5%의 세포가 감소하였으며, 최종 주사기 충진 단계까지 80% 이상의 세포가 회수되었다.
실험예
2. 세포-
하이드로겔에서
배양한 세포의 생존율 및 세포 형태
상기 실시예 3에 따라 하이드로겔에서 배양하여 1 mL 주사기에 충진한 후 상온에서 보관하고 0, 24, 48시간 및 7일 후에 세포 생존율을 아크리딘오렌지-에티듐브로마이드 (Acridin Orange/Etidium Bromide)로 염색하여 측정하였다. 대조군으로는 상기 실시예 3에서 기존 방법에 따라 제조하여 바이알에 충진한 세포를 이용하였다.
도 4에서 보여주는 것과 같이, 기존 방법으로 제조하여 바이알에 충진된 세포는 0 시간에는 95% 이상의 높은 생존율을 유지하였으나, 24시간째에는 세포 세포가 사멸하면서 세포막이 파괴되어 세포형태를 유지하지 못하거나 뭉치게 되었으며, 72시간째는 거의 모든 세포가 사멸하여 관찰되지 않았다. 반면 세포-하이드로겔에서 배양한 세포는 7일째까지 세포가 생존하였으며 섬유아세포 형태를 그대로 유지하였다.
실험예
3. 세포-
하이드로겔에
포함된
세포외기질
상기 실시예 3에 따라 하이드로겔에서 배양하여 1 mL 주사기에 충진된 세포-하이드로겔을 효소 처리하여 녹인 후 콜라겐 타입 I의 양을 효소결합 면역흡수 분석법 (ELISA)을 이용하여 분석하였다. 대조군으로는 상기 실시예 3의 기존 방법에 따라 배양한 후 1 mL 주사기에 충진된 세포현탁액을 이용하였다.
도 5에서 보여주는 것과 같이, 기존 세포치료제 제조방법에 따라 배양한 세포 현탁액에는 콜라겐이 거의 포함되어 있지 않았으나, 세포-하이드로겔에는 3 ug/mL 이상의 콜라겐이 포함되어 있다.
Claims (11)
- (a) 지방유래 중간엽줄기세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 지방유래 중간엽줄기세포와 하이드로겔 용액을 혼합하여 겔을 형성시키는 단계; 및
(c) 상기 겔을 배양하는 단계를 포함하고,
여기에서 하이드로겔은 피브린 글루이고, 피브린 글루는 0.4 내지 3.2 mg/mL 농도의 피브리노겐 및 1 내지 300 I.U./mL 농도의 트롬빈을 포함하는, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
피브린 글루는 0.4 내지 1.8 mg/mL의 농도의 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
피브린 글루는 0.9 내지 1.6 mg/mL의 농도의 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
피브린 글루는 10 내지 15 I.U./mL 농도의 트롬빈을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
단계 (c) 이후, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물을 앰플, 바이알 또는 주사기에 충진하는 단계 (d)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
- 제8항에 있어서,
단계 (d)에서 제조된 앰플, 바이알 또는 주사기에 충진된 중간엽줄기세포-하이드로겔에서 카운팅한 세포수가,
단계 (c)에서 수득된 중간엽줄기세포를 카운팅한 세포수의 70% 이상인 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
- 제8항에 있어서,
단계 (d)에서 제조된 앰플, 바이알 또는 주사기에 충진된 중간엽줄기세포-하이드로겔에서 카운팅한 세포수가,
단계 (c)에서 수득된 중간엽줄기세포를 카운팅한 세포수의 80% 이상인 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
- 삭제
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