KR20210069619A - 오가노이드의 생체 이식용 조성물 - Google Patents
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Abstract
오가노이드를 포함하는 생체 이식용 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따르면 콜라겐, 젤라틴, 또는 피브린 글루를 오가노이드 이식을 위한 스캐폴드로 사용한 경우 오가노이드의 이식율, 생존율이 높고 안정성 또한 우수한 효과가 있다.
Description
오가노이드의 생체 이식용 조성물, 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
오가노이드는 기본 실험 모델, 이식가능한 조직의 소스 및 약물 스크리닝을 위한 생리학적으로 적절한 플랫폼으로 여겨진다. 불멸화 세포의 배양과는 달리, 장 오가노이드는, 예를 들어, 움(crypt) 유사 돌출부에 존재하는 생존 가능한 줄기세포를 포함하고, 여러 기능 세포 유형을 생산하기 위한 재생 및 분화의 연속적인 사이클을 거쳐 장의 발달 및 항상성의 주요 측면을 반복한다.
상피 오가노이드는 또한 인체 결장(human colon), 선종 및 선암 조직으로부터 형성되어 맞춤의학 (personalized medicine) 및 환자 유래 움(crypt) 또는 생체외(ex vivo)에서 배양되고 확대된 줄기세포를 사용하는 자가이식을 위한 가능성을 열었다. 이전과는 비교할 수 없는 원래의 조직에 대한 조직학적 정확성에도 불구하고, 위장관(GI tract)의 줄기세포 유래 오가노이드는 몇 가지 한계를 가지고 있는데, 그 중 주요한 것은 3D 스캐폴드로서 매트리젤(Matrigel)에 의존하는 것이다.
매트리젤은 모든 세포 유형의 오가노이드 성장을 위한 3D 스캐폴드를 제공하기 위해 널리 사용되는 상업용 제품이다. 이것은 장, 망막, 신장, 간, 위, 전립선, 유방, 내이, 심장 근섬유, 간 내피, 췌장, 나팔관, 및 대뇌 오가노이드를 성장시키는데 사용된다. 또한, 닭, 래트 및 인간을 포함하는 다양한 종으로부터의 오가노이드를 성장시키는데 사용된다. 그러나, 오가노이드 성장을 위한 스캐폴드로서의 매트리젤 또는 유사하게 자연적으로 유도된 생체 고분자 매트 릭스에 대한 의존성은 생성된 오가노이드의 연구와 사용에 여러 유의한 제한을 초래한다. 매트리젤은 기저막 ECM-풍부 마우스 육종(sarcoma)에서 유래된 것으로, 따라서 환자에게 주어지는 경우 면역원이나 병원균을 옮길 위험이 크며, 면역억제 후의 감염에 관련된 심각한 환자 사망과 병적 상태(morbidity)의 분야에서 특히 문제가 되고, 혈관신생 및 암 발생을 촉진시킨다고 알려져 있다. 또한, 매트리젤의 배치 대 배치(batch-to-batch) 가변성은, 기본 및 중개연구(translational research) 모두의 해석을 복잡하게 하는 미지의 잠재적 혼란 변수를 도입하는 일관성 없는 세포 거동을 초래할 수 있다. 게다가, 매트리젤은 현재의 오가노이드 배양 모델의 결정적인 요소임에도 불구하고, 오가노이드 형성에 있어서의 그 역할은 아직 밝혀지지 않았다.
따라서, 오가노이드 분야에서 메트리젤을 대체할 수 있을 만큼 효과적이면서도 생체 이식에 적합하여 인체 주입을 위한 스캐폴드에 대한 연구가 필요한 실정이다.
일 양상은 오가노이드; 젤라틴, 콜라겐, 피브린 글루, 또는 이들의 조합을 포함하는 생체 이식용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 젤라틴, 콜라겐, 피브린 글루, 또는 이들의 조합을 오가노이드와 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 오가노이드의 이식 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 오가노이드; 젤라틴, 콜라겐, 피브린 글루, 또는 이들의 조합을 포함하는 생체 이식용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "오가노이드(organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포덩어리를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 축소되고 단순화된 버전의 기관을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 오가노이드는 조직, 줄기세포, 예를 들면 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포에서 파생될 수 있으며, 자가재생 및 분화능력으로 인해 3차원으로 배양될 수 있다. 상기 오가노이드는 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다. 이에 따라 본 발명에서 3D 오가노이드는 실제로 in vivo에서 상호 작용을 하고 있는 장기를 거의 완벽히 모사하여, 질병의 치료제 개발 및 등을 관찰할 수 있는 훌륭한 모델이 될 수 있다. 인체의 생리활성기능을 유사하게 재현할 수 있고, 환자의 조직으로부터 장기유사체를 구축함으로써 환자의 유전정보를 기반으로 한 질병 모델링, 반복시험을 통한 약물 스크리닝 등을 가능하게 한다. 이러한 기능을 위해서는 생체에 이식 시 이식율, 이식 효율, 생존율 및 안정성이 우수할 것이 요구된다. 본 명세서에서 용어 "젤라틴(gelatin)"은 동물의 가죽, 연골, 힘줄 등에 구성된 천연 단백질을 분해하고 정제함으로써 얻어지는 단백질의 일종이다.
본 명세서에서 용어 "콜라겐(collagen)"은 인체에 과장 광범위하게 분포하는 단백질로, 결합 조직의 주성분이며 뼈와 피부에 주로 있지만, 관절, 각 장기의 막, 머리카락 등 우리 몸 전체에 분포되어 있는 성분이다. '교원질'(膠原質)이라고도 불리는 경단백질이다.
본 명세서에서 용어 "피브린 글루(fibrin glue)"는 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘, 및 선용 효소의 저해제로 이루어진 조직 접착체로서 말초신경의 봉합, 미소 혈관의 봉합 뇌신경 외과수술, 뼈의 접착 등 정형외과 수술, 열상 환자의 지혈 등에 이용되고 있다. 조직에 상처가 생기면 절단 주변의 모세혈관으로부터 혈액성분과 함께 피브리노겐을 유출하여 피브린을 형성시키는 물질을 의미한다.
상기 젤라틴, 콜라겐, 및 피브린 글루는 모두 생체 적합성, 체내에서 안정성이 우수한 특징이 있다.
본 명세서에서 용어 "생체 이식(bio implanting)", 생체 이식용 조성물은 개체에 투여되어 이식 부위에 되는 현상을 의미할 수 있다.
생체 이식을 위해서는 이식되는 부위에 영향을 주지 않아야 하고, 생존율과 이식율이 높을 것이 요구된다.
상기 오가노이드는 젤라틴, 콜라겐, 피브린 글루, 또는 이들의 조합을 스캐폴드(scaffold)로 사용하여 이식될 수 있는 오가노이드라면 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 오가노이드는 장 오가노이드, 망막 오가노이드, 신장 오가노이드, 간 오가노이드, 위 오가노이드, 전립선 오가노이드, 유방 오가노이드, 내이 오가노이드, 심장 근섬유 오가노이드, 간 내피 오가노이드, 췌장 오가노이드, 나팔관 오가노이드, 및 대뇌 오가노이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 젤라틴은 조성물 총 중량에 대해 약 2.5 내지 10%(w/v) 포함될 수 있다. 상기 젤라틴이 약 10%(w/v) 초과인 경우 젤라틴의 내독성으로 인해 이식된 오가노이드에 대해 세포독성이 일어날 수 있다.
상기 콜라겐은 조성물 총 중량에 대해 약 10 내지 20%(v/v) 포함될 수 있다.
상기 피브린 글루는 조성물 총 중량에 대해 약 10 내지 15%(v/v) 포함될 수 있다. 상기 피브린 글루가 약 15%(v/v) 초과인 경우 조성물이 지나치게 빠르게 굳어 오가노이드의 이식율이 저하될 수 있다.
상기 젤라틴, 콜라겐, 또는 피브린 글루는 상업적으로 이용 가능한 것을 구입하여 사용하거나, 자연에 존재하는 것을 분리하여 사용하거나, 또는 합성하여 사용할 수 있다.
상기 조성물은 오가노이드를 이식, 배양 시 통상적으로 포함될 수 있는 물질을 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에서, 오가노이드, 젤라틴, 콜라겐, 또는 피브린 글루는 이식을 위한 의료적 장치에 부착된 형태일 수 있다. 상기 의료적 장치는 예를 들어 스탠트, 핀, 스티치, 스플릿, 페이스메이커, 인공 피부, 및 로드(rods)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 따른 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다.
다른 양상은 오가노이드; 젤라틴, 콜라겐, 피브린 글루, 또는 이들의 조합을 포함하는 세포치료제를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.
일 양상에 따른 세포치료제는 염증성 장질환이나 점막의 손상과 같은 점막 자체가 손실된 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다.
다른 양상은 젤라틴, 콜라겐, 피브린 글루, 또는 이들의 조합을 오가노이드와 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 오가노이드의 이식 방법을 제공한다.
젤라틴, 콜라겐, 피브린 글루, 오가노이드에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 개체는 오가노이드를 이식하여 형성시킬 필요가 있는 개체일 수 있다.
상기 개체는 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
본 명세서에서 용어 "투여하는", "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
상기 방법에서, 투여는 오가노이드의 이식이 필요한 병변 부위에 투여될 수 있다. 투여를 위해 내시경 장비를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 내시경을 이용한 식도, 위, 십이지장, 대장, 또는 결장 등에 투여되는 것이 대표적이며, 그 외에도 외과적인 수술을 통한 신체 모든 장기, 예를 들면 침샘, 눈물샘, 근육, 폐, 간, 췌장, 신장, 자궁, 전립성 등에 투여될 수 있다. 예를 들어 염증성 장질환이나 점막의 손상과 같은 점막 자체가 손실된 경우 오가노이드를 이식하여 손상된 점막을 대체하는데 사용될 수 있다.
상기 방법은 콜라겐, 젤라틴, 또는 피브린 글루를 오가노이드 이식을 위한 스캐폴드로 사용함으로써 종래 사용되던 매트리젤과 유사한 이식 안정성, 이식 효율성을 나타내면서도 임상적으로 안전하게 적용 가능한 특징이 있다.
오가노이드는 상기에서 살펴본 바와 같이 in vitro에서도 성체-유사 특성을 갖는 오가노이드로 분화할 수 있고, 무엇보다도 환자 자신의 성체 세포를 활용하기 때문에 향후 조직치료제로써의 활용에서 장애가 되는 면역원성 등의 기술적 문제, 윤리적 문제가 없다는 장점이 있다.
일 양상에 따르면 콜라겐, 젤라틴, 또는 피브린 글루를 오가노이드 이식을 위한 스캐폴드로 사용한 경우 오가노이드의 이식율, 생존율이 높고 안정성 또한 우수한 효과가 있다.
도 1은 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 대장 조직에 이식된 오가노이드로부터 방출된 GFP 신호를 스캐폴드 별로 측정한 사진이다.
도 2는 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 대장 조직에 이식된 오가노이드의 면적을 나타낸 그래프이다.
도 3은 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 대장 조직 단면을 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 오가노이드를 이식한 대장의 형태 사진이다.
도 5는 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 오가노이드를 이식한 대장의 중량/길이를 계산한 결과 그래프이다.
도 6은 대장 오가노이드의 이식 후 2차 오가노이드를 형성시킨 후 GFP 신호를 확인한 결과 사진이다.
도 7은 대장 오가노이드의 이식 후 2차 오가노이드를 형성시킨 후 GFP를 발현하는 오가노이드의 수를 측정하여 이식된 면적과의 연관성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 양상에 따른 오가노이드 이식 및 이식 후 분석에 대한 모식도이다.
도 2는 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 대장 조직에 이식된 오가노이드의 면적을 나타낸 그래프이다.
도 3은 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 대장 조직 단면을 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 오가노이드를 이식한 대장의 형태 사진이다.
도 5는 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 오가노이드를 이식한 대장의 중량/길이를 계산한 결과 그래프이다.
도 6은 대장 오가노이드의 이식 후 2차 오가노이드를 형성시킨 후 GFP 신호를 확인한 결과 사진이다.
도 7은 대장 오가노이드의 이식 후 2차 오가노이드를 형성시킨 후 GFP를 발현하는 오가노이드의 수를 측정하여 이식된 면적과의 연관성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 양상에 따른 오가노이드 이식 및 이식 후 분석에 대한 모식도이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1. 대장 오가노이드 제작 및 배양
EGFP 마우스로부터 대장 조직을 분리하여 효소을 사용하여 대장 움(crypt)를 분리하고 매트리젤과 대장 오가노이드용 배지를 1:1로 섞어서 코팅되지 않은 48웰 플레이트에 접종하였다. 이를 인큐베이터에 넣고 20분후에 매트리젤이 굳은 것을 확인하고, 대장 오가노이드용 배지를 첨가하여 5일 동안 배양하여, 하기 사용될 생체 이식용 대장 오가노이드를 제작하였다.
실시예 1. 생체 이식용 오가노이드 제작 및 이식
1.1. 대장 조직 손상 모델 제작
오가노이드를 제작할 대장 조직 손상 모델을 다음과 같이 제조하였다. 대장 오가노이드를 이식할 야생형 마우스에 0.5M EDTA를 5분동안 노출시키고, 전동 칫솔로 2분 동안 대장 내벽의 움들이 제거 되도록 물리적인 손상을 가했다.
1.2. 생체 이식용 오가노이드의 제작 및 이식
상기에서 제작한 대장 오가노이드가 GFP를 발현하도록 대장 오가노이드(colon organoid)를 준비하였다. 모든 대장 오가노이드는 이식 1일전 10μM의 Y-27632를 오가노이드 배지에 처리하여 생존율을 극대화하였다. 또한, 세포 회복 용액(Cell recovery solution)을 처리하여 배양 시 사용하던 매트릭스를 완전히 제거하였다.
이후 다음과 같은 세 가지의 스캐폴드를 하기 기재된 조건으로 혼합하여 1.1.에서 제작한 대장 조직 손상 마우스 모델의 항문에 50㎕의 부피로 이식하였다.
1) 젤라틴: 5%의 젤라틴이 녹여져 있는 PBS에 GFP+ 대장 오가노이드를 젤라틴:오가노이드가 함유된 배지 = 1:2 의 비율로 섞어서 이식하였다. 이때에 오가노이드가 함유된 배지는 10μM의 Y-27632가 포함되어있다.
2) 콜라겐: 100%의 콜라겐 원액에 GFP+ 대장 오가노이드를 콜라겐:오가노이드가 함유된 배지 = 1:9 의 비율로 섞어서 이식하였다. 이때에 오가노이드가 함유된 배지는 10μM의 Y-27632가 포함되어있다.
3) 피브린 글루: GFP+ 대장 오가노이드를 10μM의 Y-27632가 포함된 colonoid culture 배지 45㎕에 섞어서 Colonoid solution을 준비하고 트롬빈이 PBS에 1:100으로 희석된 용액에 피브린을 1:1로 섞어서 5㎕를 만들어 준비된 45㎕ 의 Colonoid solution과 섞어서 이식한다.
대조군으로는 매트리젤을 사용하였다.
매트리젤은 오가노이드가 함유된 colonoid culture 배지에 10%의 농도로 섞어서 이식하였다. 이때에 오가노이드가 함유된 배지는 10μM의 Y-27632가 포함되어있다.
이식 후 3M Vetbond 10㎕를 사용하여 항문을 봉합하였으며 14시간 후에 봉합을 풀어주어 정상적인 배변 활동을 유도하였다.
실시예 2. 오가노이드의 이식율 평가
상기 실시예 1.에서 이식한 대장 오가노이드의 스캐폴드에 따른 이식율을 평가하기 위해 다음과 같이 수행하였다.
대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 대장 조직을 부검하여 이식된 오가노이드로부터 방출되는 GFP 신호를 측정하였다. 구체적으로, 오가노이드가 이식된 대장조직을 세로로 절개하며 평면구조를 만들고 이 조직을 슬라이드 글라스 위에 얇게 펴서 그 위에 글라스 커버를 덮었다. 이때에 움(crypt)이 아래면으로 향하도록 하였다. 이렇게 준비된 슬라이드글라스를 형광현미경의 제물대에 올려서 GFP 형광이 발현하는 부위를 관찰하였다.
도 1은 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 대장 조직에 이식된 오가노이드로부터 방출된 GFP 신호를 스캐폴드 별로 측정한 사진이다.
도 2는 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 대장 조직에 이식된 오가노이드의 면적을 나타낸 그래프이다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 스캐폴드가 없는 경우, GFP 신호가 가장 약해 이식율이 낮은 것으로 확인되었다. 반면, 젤라틴, 콜라겐, 및 피브린 글루를 스캐폴드로 사용한 경우 모두 양성 대조군인 매트리젤을 스캐폴드로 사용한 경우와 유사한 수준의 이식율 및 이식된 면적을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 젤라틴, 콜라겐, 또는 피브린 글루를 오가노이드 이식용 스캐폴드로 사용하면 오가노이드의 이식율이 유의적으로 증가한다.
실시예 3.
오가노이드의 생존율 및 이식 효율 평가
상기 실시예 1.에서 이식한 대장 오가노이드의 스캐폴드에 따른 생존율 및 이식 효율을 평가하기 위해 다음과 같이 수행하였다.
각 스캐폴드 실험군별로 10~13마리의 개체를 사용하였으며, GFP 오가노이드를 대장에 이식후 1주일차에 조직부검을 실시하여 대장에서 GFP가 발현하는 것을 이식에 성공한 개체로 분류하고 GFP가 발현하지 않는 개체를 이식에 성공하지 못한 개체로 분류하여 전체 마리수 중에 이식된 마리수의 백분율을 계산하여 최종 이식율을 산출하였다. 그리고 이식 후 7일이내에 죽은 개체들을 계산하여 최종 생존율을 산출 하였다.
그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Number of transplantation | Engraftment successes | Engraftment failed | Dead | Survival rate % | Engraftment ratio(%) | |
No scaffold | 13 | 8 | 1 | 2 | 84.62 | 61.54 |
Matrigel | 10 | 9 | 0 | 1 | 90.00 | 90.00 |
Gelatin | 13 | 9 | 1 | 3 | 76.92 | 69.23 |
Collagen | 10 | 9 | 1 | 0 | 100.00 | 90.00 |
Fibrin glue | 10 | 9 | 0 | 1 | 90.00 | 90.00 |
표 1에 나타낸 바와 같이, 젤라틴, 콜라겐, 및 피브린 글루를 스캐폴드로 사용한 경우 생존율이 각각 76.92, 100, 및 90%였고, 이식 효율은 각각 69.23, 90, 및 90%로 높게 확인되므로, 생존율 및 이식 효율이 우수한 것을 확인하였다. 이는 양성 대조군인 매트리젤을 사용한 경우와 유사한 수준이었다.
도 3은 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 대장 조직 단면을 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 젤라틴, 콜라겐 및 피브린 글루를 스캐폴드로 사용한 경우에 모두 오가노이드가 성공적으로 안착되어 대장 움(crypt)을 형성한 것을 확인하였다.
실시예 4. 안정성 평가
상기 실시예 1.에서 이식한 대장 오가노이드의 안정성을 평가하기 위해, 이식 후 7일차에 부검하고, 부검 조직의 형태 및 병변 발생 여부를 확인하였다.
도 4는 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 오가노이드를 이식한 대장의 형태 사진이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 젤라틴, 콜라겐, 및 피브린 글루를 스캐폴드로 사용한 경우 오가노이드를 이식한 대장에서 나타날 수 있는 부종이나 혈변 등이 부검 조직에서 관찰되지 않았다.
도 5는 대장 오가노이드의 이식 후 7일차에 오가노이드를 이식한 대장의 중량/길이를 계산한 결과 그래프이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 오가노이드를 이식한 대장의 중량/길이를 계산해 염증이 발생하였을 때에 나타날 수 있는 부종의 부피를 관찰한 결과, 매트리젤을 사용한 대조군과 비교해서 유의적 차이가 없었다.
따라서, 젤라틴, 콜라겐, 및 피브린 글루를 스캐폴드로 사용하여 오가노이드를 이식하는 경우 안정성이 우수한 것을 확인하였다.
실시예 5. 이식된 조직으로부터 정상 오가노이드 형성 평가
상기 실시예 1.에서 이식한 대장 오가노이드로부터 정상적인 오가노이드가 형성되는지 평가하기 위해, 이식되어진 대장 조직으로부터 두번째 대장 오가노이드(2차 오가노이드)를 형성시켰다.
구체적으로, 이식된 대장 조직의 GFP를 형광 현미경으로 확인 후, 수술용가위로 잘게 잘라서 crypt chelating buffer가 담겨있는 튜브에 넣고 37℃ 20분동안 shaking incubator에서 반응시킨후 18Gage needle이 장착된 10ml 주사기에 넣고 20회 분쇄하여 Crypt를 분리해낸다. 분리된 Crypt를 원심분리하여 한데 모은후 70um 필터로 걸러낸 후 Y-27632가 첨가된 배지와 매트리젤을 1:1 비율로 섞어서 48웰 플레이트에 20㎕/웰 의 농도로 접종하였다. 30분동안 37℃ 인큐베이터에 넣어 매트리젤을 굳힌후 Y-27632가 첨가된 배지를 첨가해서 5일동안 배양하였다. 배양 5일차에 GFP가 발현하는 대장 오가노이드를 추적관찰 하였다.
도 6은 대장 오가노이드의 이식 후 2차 오가노이드를 형성시킨 후 GFP 신호를 확인한 결과 사진이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 젤라틴, 콜라겐, 및 피브린 글루를 스캐폴드로 사용한 경우 GFP를 발현하는 2차 오가노이드가 효과적으로 형성되었다. 이는 양성 대조군인 매트리젤을 사용한 경우와 유사한 수준인 것으로 확인하였다.
도 7은 대장 오가노이드의 이식 후 2차 오가노이드를 형성시킨 후 GFP를 발현하는 오가노이드의 수를 측정하여 이식된 면적과의 연관성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 2차 오가노이드의 수와 면적이 비례하여 증가된 것을 확인하였다.
따라서, 젤라틴, 콜라겐, 및 피브린 글루는 정상적인 오가노이드 형성에 유의적인 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다.
Claims (6)
- 오가노이드; 젤라틴, 콜라겐, 피브린 글루, 또는 이들의 조합을 포함하는 생체 이식용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 오가노이드는 장 오가노이드, 망막 오가노이드, 신장 오가노이드, 간 오가노이드, 위 오가노이드, 전립선 오가노이드, 유방 오가노이드, 내이 오가노이드, 심장 근섬유 오가노이드, 간 내피 오가노이드, 췌장 오가노이드, 나팔관 오가노이드, 및 대뇌 오가노이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 젤라틴은 조성물 총 중량에 대해 2.5 내지 10%(w/v) 포함되는 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 콜라겐은 조성물 총 중량에 대해 10 내지 20%(v/v) 포함되는 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 피브린 글루는 조성물 총 중량에 대해 10 내지 15%(v/v) 포함되는 것인 조성물.
- 젤라틴, 콜라겐, 피브린 글루, 또는 이들의 조합을 오가노이드와 혼합하는 단계; 및
상기 혼합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 오가노이드의 이식 방법.
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