CN102198022B - 一种活性细胞-水凝胶类器官结构体的立体成形方法 - Google Patents
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Abstract
一种活性细胞-水凝胶类器官结构体的立体成形方法，先根据自然器官设计出水凝胶单元模型，再利用微制造技术制造出该单元的物理原型，填充获得其结构负型，然后处理结构负型的表面，用生物材料-细胞混合溶液填充负型模具，再选择交联方式使混合溶液凝胶化，获得具有仿生血液流道的活性细胞-水凝胶单元，再进行层层定位叠加，进行二次交联，组装成活性细胞-水凝胶结构体，最后在体外培养或体内植入，构建出预血管化的活性类器官前体，本发明能够通过二维活性细胞-水凝胶结构单元的叠加组装实现立体类器官复杂微流道系统的构建以及细胞在三维空间上的均匀有序种植。
Description
技术领域
本发明涉及一种人工活性类器官结构体的成形方法，特别涉及一种活性细胞-水凝胶类器官结构体的立体成形方法。
背景技术
二十一世纪，通过制造技术与生物医学的结合实现人体组织与器官的体外制造将给临床治疗方式带来根本性的变革，从而使成千上万的患者受益。目前人工皮肤、软骨、骨、膀胱等进入临床应用或实验阶段，但肝脏、肾脏、肺、心脏等重要器官的体外制造至今未取得突破性进展。其难点在于利用软质生物材料在体外仿生构建出与自然器官相似的立体微结构系统与细胞生长环境。传统的先成形支架结构后种植细胞的组织工程模式无法实现细胞在支架内的高密度均匀种植及不同细胞的有序分布，更重要的是无法快速实现血管化，从而使支架内部的细胞常因缺乏充足的营养供应而生长缓慢或死亡。因此，如何实现细胞在支架材料内均匀有序的种植，并同时构建出仿生的微结构系统以加快血管化进程，已成为解决重要器官体外制造的关键问题之一。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种活性细胞-水凝胶类器官结构体的立体成形方法，能够通过二维活性细胞-水凝胶结构单元的叠加组装实现立体类器官复杂微流道系统的构建以及细胞在三维空间上的均匀有序种植。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种活性细胞-水凝胶类器官结构体的立体成形方法，包括以下步骤：
1)根据肝脏、心脏、肾脏或肺的微结构单元特征，采用计算机辅助软件Pro/Engineer或UG设计出具有仿生血液或培养液流道系统的水凝胶单元模型，水凝胶单元模型流道宽度介于50μm-1mm，深度为0.3-0.8mm，
2)利用光固化快速成形或光刻技术制造出水凝胶单元的物理原型，然后利用液态医用硅胶或5％-10％质量分数的琼脂糖水溶液在真空条件下填充水凝胶单元的物理原型，液态医用硅胶的硅胶与固化剂质量比为10∶1，凝固脱模后可获得水凝胶单元的结构负型，
3)用氧等离子体照射水凝胶单元的结构负型的表面0.5-2分钟，然后用生物材料-细胞混合溶液填充负型模具，
生物材料-细胞混合溶液的生物材料为光敏医用明胶、海藻酸钠、胶原蛋白或它们的等比混合物，其质量浓度为1％-6％；细胞为原代器官实质细胞或干细胞，其浓度为1×106-5×107个/ml，
4)根据生物材料的成胶方式，选择紫外光照射、氯化钙溶液渗透或改变温度的交联方式使混合溶液凝胶化，获得具有仿生血液流道的活性细胞-水凝胶单元，凝胶化过程在4-37℃条件下进行，
采用紫外光照射的交联方式时，其中紫外光照射时间小于60秒，强度为6.9mW/cm2；采用氯化钙溶液渗透的交联方式时，氯化钙溶液浓度为2-5％，凝胶化时间为2-5分钟；采用改变温度的交联方式时，将胶原蛋白-细胞溶液温度从4℃升高到37℃，并在100％湿度环境下保持30-45分钟，
5)将细胞-水凝胶单元根据结构特征层层定位叠加，然后在水凝胶外表面涂覆一层与水凝胶材料相同的生物材料溶液，利用步骤4)的交联方式进行二次交联，从而将细胞-水凝胶单元组装成具有复杂空间血液流道和细胞均匀可控分布的活性细胞-水凝胶结构体，
6)在体外培养或体内植入时，将血管内皮细胞种植在活性细胞-水凝胶结构体内部的血液流道系统，以促进血管形成，从而在体外构建出预血管化的活性类器官前体。
与其他组织或器官的生物制造方法相比，本发明将复杂器官的三维制造问题转变为二维活性水凝胶单元的制造与组装，成形过程既能保证内部三维仿生血管管道的相互导通，又可实现细胞、生长因子等生物物质的均匀种植与活性保持；在后期体外培养或体内植入时，可以将血管内皮细胞种植在仿生的血流管道内，并通过水凝胶纳米级多孔网络结构与内部细胞进行异质细胞作用与信号传递，可加快血管化进程；同时，本发明所提出的器官制造方法，可根据不同器官内部细胞浓度分布、基质材料成分、力学特性及微结构特征的差异性，选择不同水凝胶材料，如光敏明胶、海藻酸钠、胶原蛋白等，不同的凝胶化方式，如紫外光交联、钙离子交联、温度交联等，不同的细胞-材料溶液浓度及水凝胶单元结构设计。
附图说明
图1为本发明的活性细胞-水凝胶单元示意图。
图2为采用所发明的成形方法制备的预血管化活性类器官前体示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
一种活性细胞-水凝胶类器官结构体的立体成形方法，包括以下步骤：
1)根据肝脏、心脏、肾脏或肺的微结构单元特征，采用三维CAD软件Pro/Engineer或UG设计出具有仿生血液或培养液流道系统的水凝胶单元模型，或采用AutoCAD、CorelDraw等软件设计仿生血液或培养液流道系统的光固化掩膜，水凝胶单元模型流道系统宽度为50μm-1mm，深度为0.3-0.8mm，
2)将设计的水凝胶单元模型以.STL格式导出，利用光固化快速成形或光刻技术制造出水凝胶单元的物理原型，然后利用液态医用硅胶或5％-10％质量分数的琼脂糖水溶液在真空条件下填充水凝胶单元的物理原型，液态医用硅胶的硅胶与固化剂质量比为10∶1，液态硅橡胶的凝固条件为在80℃条件下静置2小时；琼脂糖水溶液的凝固条件为在4℃条件下静置10-15分钟，凝固脱模后可获得水凝胶单元的结构负型，
3)用氧等离子体照射水凝胶单元的结构负型的表面以提高亲水性，照射时间为0.5-2分钟，然后用生物材料-细胞混合溶液填充负型模具，
生物材料-细胞混合溶液的生物材料为光敏医用明胶、海藻酸钠、胶原蛋白或它们的等比混合物，其中光敏医用明胶溶液浓度为3％-6％，光引发剂含量为0.5-1mg/ml；海藻酸钠溶液浓度为1-3％；胶原蛋白溶液浓度为2-4mg/ml；细胞为器官实质细胞或干细胞，其浓度为1×106-5×107个/ml，在填充时，光敏明胶与胶原蛋白溶液采用医用硅胶模具，而海藻酸钠溶液采用琼脂糖模具，
4)根据生物材料的成胶方式，选择紫外光照射、氯化钙溶液渗透或改变温度的交联方式使混合溶液凝胶化，获得具有仿生血液或培养液流道系统的活性细胞-水凝胶单元，凝胶化过程在4-37℃条件下进行，
采用紫外光照射的交联方式时，其中紫外光照射时间为20-60秒，强度为6.9mW/cm2；采用氯化钙溶液渗透的交联方式时，氯化钙溶液浓度为2-5％，凝胶化时间为2-5分钟；采用改变温度的交联方式时，将胶原蛋白-细胞溶液温度从4℃升高到37℃，并在100％湿度环境下保持30-45分钟，
参照图1，活性细胞-水凝胶单元包含生物材料水凝胶1、仿生血液或培养液流道系统2以及活性器官实质细胞或干细胞3，
5)将细胞-水凝胶单元根据结构特征层层定位叠加，然后在水凝胶外表面涂覆一层与水凝胶材料相同的生物材料溶液，利用步骤4)的交联方式进行二次交联，从而将细胞-水凝胶单元组装成具有复杂空间血液流道和细胞均匀可控分布的活性细胞-水凝胶结构体，
6)在体外培养或体内植入时，将血管内皮细胞种植在活性细胞-水凝胶结构体的血液或培养液流道系统1内部，待4-6小时血管内皮细胞贴壁后，从而在体外构建出预血管化的活性类器官前体，参照图2，图2为组装形成的预血管化的活性类器官前体，其中包含五层活性-细胞水凝胶单元及血管内皮细胞4。
Claims (1)
1.一种活性细胞-水凝胶类器官结构体的立体成形方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）根据肝脏、心脏、肾脏或肺的微结构单元特征，采用计算机辅助软件Pro/Engineer或UG设计出具有仿生血液或培养液流道系统的水凝胶单元模型，水凝胶单元模型流道宽度介于50μm-1mm，深度为0.3-0.8mm，
2）利用光固化快速成形或光刻技术制造出水凝胶单元的物理原型，然后利用液态医用硅胶或5%-10%质量分数的琼脂糖水溶液在真空条件下填充水凝胶单元的物理原型，液态医用硅胶的硅胶与固化剂质量比为10:1，凝固脱模后可获得水凝胶单元的结构负型，
3）用氧等离子体照射水凝胶单元的结构负型的表面0.5-2分钟，然后用生物材料-细胞混合溶液填充负型模具，
生物材料-细胞混合溶液的生物材料为光敏医用明胶、海藻酸钠、胶原蛋白或它们的等比混合物，其质量浓度为1%-6%；细胞为原代器官实质细胞或干细胞，其浓度为1×106-5×107个/ml，
4）根据生物材料的成胶方式，选择紫外光照射、氯化钙溶液渗透或改变温度的交联方式使混合溶液凝胶化，获得具有仿生血液流道的活性细胞-水凝胶单元，凝胶化过程在4-37℃条件下进行，
采用紫外光照射的交联方式时，其中紫外光照射时间小于60秒，强度为6.9mW/cm2；采用氯化钙溶液渗透的交联方式时，氯化钙溶液浓度为2-5%，凝胶化时间为2-5分钟；采用改变温度的交联方式时，将胶原蛋白-细胞溶液温度从4℃升高到37℃，并在100%湿度环境下保持30-45分钟，
5）将细胞-水凝胶单元根据结构特征层层定位叠加，然后在细胞-水凝胶单元外表面涂覆一层与生物材料-细胞混合溶液的生物材料相同的生物材料溶液，利用步骤4）的交联方式进行二次交联，从而将细胞-水凝胶单元组装成具有复杂空间血液流道和细胞均匀可控分布的活性细胞-水凝胶结构体，
6）在体外培养时，将血管内皮细胞种植在活性细胞-水凝胶结构体内部的血液流道系统，以促进血管形成，从而在体外构建出预血管化的活性类器官前体。
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