CN111197024B - 类胰腺结构体及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种类胰腺结构体及其构建方法，所述构建方法包括：A、将干细胞和/或祖细胞在体外诱导分化为类胰腺细胞团；B、将血管化细胞、类胰腺细胞团与水凝胶材料混合后进行生物打印，得到预凝胶三维结构体；C、采用多细胞培养液和/或生物反应器培养预凝胶三维结构体，即得类胰腺结构体。本发明提供的类胰腺结构体由血管化细胞及类胰腺组织细胞构成，具有天然组织的形态、表型特征和生理功能。本发明可用于类器官构建、组织/器官/人体芯片、组织工程、再生医学、体外生理模型/病理模型/药理模型构建、细胞生物学或药物研究等方面。

Description

类胰腺结构体及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种类胰腺结构体及其构建方法与应用。
背景技术
类器官属于三维细胞培养物的一种，包含其代表器官的部分关键特性。此类体外培养的人工结构体包括具有自我更新能力的干细胞群和/或祖细胞群，可分化为对应器官特异性的细胞类型，与对应器官具有类似的空间结构并能够再现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关的体外系统。目前已见到将类器官技术用于构建肠道、肝脏、胰腺、肾脏、前列腺、肺脏、视杯以及大脑的报道，并展示出超出传统技术的极好的与天然组织类似的结构与功能。虽然类器官技术仍处于起步阶段，但作为一种研究工具，该技术在发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生医疗、精准医疗以及药物毒性和药效试验等领域已显示出巨大的研究和应用价值。
胰腺是人体的重要器官之一，其作用必不可少。胰腺为混合性分泌腺体，主要有外分泌和内分泌两大功能。它的外分泌主要成分是胰液，内含碱性的碳酸氢盐和各种消化酶，其功能是中和胃酸，消化糖、蛋白质和脂肪。内分泌主要成分是胰岛素、胰高血糖素，其次是生长激素释放抑制激素、肠血管活性肽、胃泌素等。胰岛是胰腺的基本结构和功能单元，由弥散分布在胰腺中的许多细胞团所组成。胰岛主要由4种不同的内分泌细胞所组成，即B、A、D及PP细胞，其中B细胞有分泌胰岛素的功能。胰岛的血液循环十分丰富，血管分布有利于细胞间的协调作用。在胰岛中央区，B细胞的排列有一定的方向性，使B细胞与微血管之间有一致的衔接关系。
胰腺类器官对于研究疾病(如糖尿病、能量代谢系统疾病、胰腺癌等)发生、发展和治疗、药物开发、疾病的精准治疗和药物有效性、安全性测试具有重要意义。
目前类器官构建方法均采用水凝胶材料包裹技术，该方法操作简便，但可控性非常差，无法实现高通量稳定制备和高通量筛选。目前亟需开发新的类器官构建方法，实现其稳定可控制备。
发明内容
本发明的目的是提供一种类胰腺结构体及其构建方法。
本发明的另一目的是提供所构建的类胰腺结构体在组织/器官/人体芯片、组织工程、体外生理模型/病理模型/药理模型构建、发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生医疗、精准医疗以及药物毒性和药效试验等方面的用途。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明类胰腺结构体的构建方法，所述方法包括以下步骤：
A、类胰腺细胞团的制备：将干细胞和/或祖细胞在体外诱导分化为类胰腺细胞团；
B、将血管化细胞、步骤A制备的类胰腺细胞团与水凝胶材料混合后进行生物打印，得到预凝胶三维结构体；
C、采用多细胞培养液和/或生物反应器培养预凝胶三维结构体，即得类胰腺结构体。
其中，步骤C所述多细胞培养液中含有如下物质中的至少一种：2-mercaptoethanol、5-AZA、amphotericin B、Activin-A、ascorbic acid、all-transretionic acid、activin-βB、β-cellulin、bovine pituitary extract、BSA、BSA Cohnfraction V、butylated hydroxyanisole、bFGF、B-27、CHIR99021、DAPT、DMSO、Dibutyryl-cAMP、dorsomorphin、EGF、EnGS、ES-qualified fetal calf serum、Exendin-1、Exendin-4、fibronectin、FGF家族、gentamicin、GLP-1、GA-1000、HEPES、heparin、Hydrocortisone、HGF、IGF-1、IGF-2、insulin、IndolactamV、KAAD-cyclopamine、LiCl、L-glutamine、laminin、nicotinic acid、Nicotinamide、N-2、non-essential amino acids、noggin、PDGF、Pentagastrin、γ-secretase inhibitor、selenium、sodium butyrate、sodiumpyruvate、sodium chlorate、SB431542、TGF-β1、TGF-β3、transferrin、taurine、trolox、TSA、VEGF、Wnt3a、Zn2SO4。
步骤A中采用预分化培养液培养所述干细胞和/或祖细胞，使其分化为类胰腺细胞团(可表达insulin等胰岛细胞关键标志物)。其中，所述预分化培养液中含有如下物质中的至少一种：Nicotinamide、Activin-A、Exendin-4、Pentagastrin、HGF、EGF、bFGF、VEGF、FGF家族、TGF-β1、TGF-β3、IGF-1、IGF-2、BSA、BSA Cohn fraction V、insulin、transferrin、selenium、sodium butyrate、sodium pyruvate、2-mercaptoethanol、taurine、GLP-1、B-27、N-2、non-essential amino acids、CHIR99021、LiCl、all-trans retionic acid、dorsomorphin、SB431542、KAAD-cyclopamine、ascorbic acid、DAPT、Dibutyryl-cAMP、Wnt3a、noggin、activin-βB、trolox、sodium chlorate、γ-secretase inhibitor、L-glutamine、fibronectin、laminin、Zn2SO4、HEPES、Exendin-1、ES-qualified fetal calfserum、IndolactamV、nicotinic acid、heparin、5-AZA、TSA、β-cellulin、DMSO、butylatedhydroxyanisole等。
本发明所述干细胞或祖细胞为具有自我更新能力的干/祖细胞，选自胚胎干细胞(人胚胎干细胞除外)、诱导性多能干细胞、成体干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、周边血干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、皮肤干细胞、胰腺干细胞、胰腺祖细胞、血液祖细胞、皮肤祖细胞、小肠祖细胞、肺脏祖细胞以及其他组织来源的干细胞或祖细胞中的至少一种，优选成体干细胞和胰腺祖细胞。
本发明所述血管化细胞选自血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、微血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管成纤维细胞、间充质干细胞、周细胞等中的至少一种，优选血管内皮细胞和血管内皮祖细胞。这些细胞可以是组织中提取获得的，也可以是干细胞分化而来的。
本发明所述水凝胶材料为天然和/或人工合成的具有生物相容性的水凝胶材料。
所述水凝胶材料可选自如下天然生物材料中的至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、DNA水凝胶材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶等，优选藻酸钠、明胶、基质胶或胶原。
所述水凝胶材料可选自如下人工合成生物材料中的至少一种：聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯等，优选聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。
在本发明的一个具体实施方式中，类胰腺结构体的构建方法如下：
a)干细胞ADSC和血管化细胞HUVEC的培养
将干细胞ADSC在ADSC细胞扩增培养液中进行培养，当细胞90％汇合时按照1:2-4(优选1:3)的比例传代，每2-3天更换一次培养液；
将血管化细胞HUVEC在HUVEC细胞扩增培养液中进行培养，当细胞90％汇合时按照1:2-4(优选1:3)的比例传代，每2-3天更换一次培养液；
b)干细胞ADSC在24孔板中平面预分化
用胰蛋白酶消化第2-5代(优选第4代)的ADSC细胞，离心收集细胞沉淀，以1×105-5×106个/ml(优选2×105个/ml)的密度重悬于ADSC细胞分化培养液中，得ADSC细胞溶液；向24孔板的各孔内加1-2mL(优选1ml)ADSC细胞溶液，于培养箱内培养5天，每1-3天更换一次培养液；然后收集1-25个(2个)24孔板中平面预分化得到的类胰腺细胞团，用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞沉淀，用100-500μl(优选320μl)ADSC细胞分化培养液重悬，得到类胰腺细胞团溶液；
其中，所述ADSC细胞分化培养液的成分为：等体积比混合的DMEM培养基和DMEM/F-12培养基中含有10mM Nicotinamide，2nM Activin A，10nM Exendin-4，10nMPentagastrin，100pM hepatocyte growth factor，2％ B-27supplement，1％ N-2supplement和1％青链霉素；
c)类胰腺细胞团、血管化细胞与水凝胶材料混合共打印
用胰蛋白酶消化第2-4代(优选第3代)的HUVEC细胞，离心收集细胞沉淀，用100-200μl(优选120μl)HUVEC细胞扩增培养液重悬，得到浓度为6×106个/ml的HUVEC细胞溶液；
将类胰腺细胞团溶液、HUVEC细胞溶液与200-500μl(优选400μl)海藻酸钠溶液和300-600μl(优选480μl)基质胶在冰上混合，于37℃培养箱孵育3-10min(优选5min)；然后37℃明胶溶液300-600μl(优选400μl)，混合后得细胞打印溶液，装载到生物三维打印设备中进行生物打印，得到预凝胶三维结构体；
其中，所述海藻酸钠溶液是由海藻酸钠粉末与0.9％氯化钠溶液按质量比15:100混合而成；所述明胶溶液是由明胶粉末与0.9％氯化钠溶液按质量比4:100混合而成，加热至明胶完全溶解，即得；
d)采用多细胞培养液和/或生物反应器培养预凝胶三维结构体5-30天(优选5天)，即得类胰腺结构体；
其中，所述多细胞培养液由所述ADSC细胞分化培养液和HUVEC细胞扩增培养液按1:1体积比混合而成。
在本发明的另一个具体实施方式中，类胰腺结构体的构建方法如下：
a′)干细胞ADSC和血管化细胞HUVEC的培养：同上述a)；
b′)干细胞ADSC在微图案孔板中平面预分化
用胰蛋白酶消化第2-5代(优选第4代)的ADSC细胞，离心收集细胞沉淀，以1×105-5×106个/ml(优选6×105个/ml)的密度重悬于ADSC细胞分化培养液中，得ADSC细胞溶液；向AggreWellTM400微图案24孔板的各孔内加2-3ml(优选2ml)ADSC细胞溶液，于培养箱内培养5天，每2-3天更换一次培养液；然后收集2-60个(优选2个)优选微图案24孔板中平面预分化得到的类胰腺细胞团，用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞沉淀，用100-500μl(优选200μl)ADSC细胞分化培养液重悬，得到类胰腺细胞团溶液；
c′)类胰腺细胞团、血管化细胞与水凝胶材料混合共打印
用胰蛋白酶消化第1-5代(优选第4代)的HUVEC细胞，离心收集细胞沉淀，用100-200μl(优选120μl)HUVEC细胞扩增培养液重悬，得到浓度为106-108个/ml的HUVEC细胞溶液；
将类胰腺细胞团溶液、HUVEC细胞溶液与200-500μl(优选350μl)海藻酸钠溶液和300-600μl(优选480μl)基质胶在冰上混合，于37℃培养箱孵育3-10min(5min)；然后37℃明胶溶液300-600μl(优选450μl)，混合后得细胞打印溶液，装载到生物三维打印设备中进行生物打印，得到预凝胶三维结构体；
d′)采用多细胞培养液和/或生物反应器培养预凝胶三维结构体10天，即得类胰腺结构体。
本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
(1)将干细胞诱导分化为胰岛样细胞团簇：在平面培养条件下，通过诱导培养液诱导干细胞分化为胰岛样细胞，此时细胞呈团簇形态；
(2)细胞3D打印技术构建胰岛样细胞团簇与血管化细胞共培养三维结构体：在计算机控制下，利用细胞打印机将步骤(1)获得的胰岛样细胞团簇、血管化细胞和生物材料的混合溶液按照预先设计的路径和速度均匀挤出，并在一定的温度下使该混合溶液快速凝结形成凝胶物；重复以上操作，以层层扫描的方式完成多细胞三维结构体的构建，可以采用二次交联进一步提高细胞结构体的力学性能；
(3)采用多细胞培养液长期培养多细胞三维结构体，干细胞继续分化、血管化细胞与干细胞和胰岛样细胞团簇相互作用，获得人体血管化类器官结构体。
步骤(1)中，平面培养条件为如下条件的任意一种：培养皿、培养盘、多孔板、微孔板、微图案多孔板，优选微图案多孔板。
步骤(1)中，诱导培养基含有如下物质中的一种或多种：Nicotinamide、Activin-A、Exendin-4、Pentagastrin、HGF、EGF、bFGF、VEGF、FGF家族、TGF-β1、TGF-β3、IGF-1、IGF-2、BSA、BSA Cohn fraction V、insulin、transferrin、selenium、sodium butyrate、sodiumpyruvate、2-mercaptoethanol、taurine、GLP-1、B-27、N-2、non-essential amino acids、CHIR99021、LiCl、all-trans retionic acid、dorsomorphin、SB431542、KAAD-cyclopamine、ascorbic acid、DAPT、Dibutyryl-cAMP、Wnt3a、noggin、activin-βB、trolox、sodium chlorate、γ-secretase inhibitor、L-glutamine、fibronectin、laminin、Zn2SO4、HEPES、Exendin-1、ES-qualified fetal calf serum、IndolactamV、nicotinic acid、heparin、5-AZA、TSA、β-cellulin、DMSO、butylated hydroxyanisole。
步骤(2)中，所述细胞打印机为商业化产品，为如下打印方式的任意一种：生物绘图式、喷墨打印式、微接触打印式、微滴喷射打印式、激光直写/转移式、立体光刻打印式，以及以上任意两种或多种的组合方式。
步骤(2)中，所述生物材料为如下材料中的至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、DNA水凝胶材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶，更优选为藻酸钠、明胶或胶原。
步骤(2)中，所述血管化细胞包括血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、微血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管成纤维细胞、间充质干细胞和周细胞，这些细胞可以是组织中提取获得的，也可以是干细胞分化而来的，优选血管内皮细胞或血管内皮祖细胞。
步骤(2)中，所述细胞和材料混合溶液中的细胞密度为105～108个/mL。
步骤(2)中，所述一定温度为0℃～40℃范围内的任意温度，优选20℃～37℃。
步骤(2)中，所述二次交联可以是化学交联、物理交联、酶交联、光交联等任意方式，优选化学交联方式。
步骤(3)中，多细胞培养液含有如下物质中的一种或多种：2-mercaptoethanol、5-AZA、amphotericin B、Activin-A、ascorbic acid、all-trans retionic acid、activin-βB、β-cellulin、bovine pituitary extract、BSA、BSACohn fraction V、butylatedhydroxyanisole、bFGF、B-27、CHIR99021、DAPT、DMSO、Dibutyryl-cAMP、dorsomorphin、EGF、EnGS、ES-qualified fetal calf serum、Exendin-1、Exendin-4、fibronectin、FGF家族、gentamicin、GLP-1、GA-1000、HEPES、heparin、Hydrocortisone、HGF、IGF-1、IGF-2、insulin、IndolactamV、KAAD-cyclopamine、LiCl、L-glutamine、laminin、nicotinic acid、Nicotinamide、N-2、non-essential amino acids、noggin、PDGF、Pentagastrin、γ-secretase inhibitor、selenium、sodium butyrate、sodium pyruvate、sodium chlorate、SB431542、TGF-β1、TGF-β3、transferrin、taurine、trolox、TSA、VEGF、Wnt3a、Zn2SO4。
步骤(3)中，长期培养条件可以是静态培养或动态培养的任意一种，如培养皿静态培养、悬浮培养、微重力培养装置、灌流培养装置和生物反应器、搅拌培养装置和生物反应器、波浪式培养装置和生物反应器等。采用的培养条件是本领域培养细胞结构体常用的，可依据本领域的公知技术选择。
步骤(3)中，长期培养的时间周期根据细胞生长状况确定，可在3～30天范围内调整，优选5～10天。
第二方面，本发明提供由上述方法构建获得的类胰腺结构体。所构建的血管化结构体包含具有自我更新能力的干细胞和祖细胞、胰腺组织特异性的胰岛细胞和血管形成相关细胞等多种细胞，细胞被生物材料包裹，生物材料形成凝胶物，将细胞可控分布在预先设计的空间位置，并形成三维细胞结构体。所述三维细胞结构体具有天然组织的形态、表型特征和生理功能。
第三方面，本发明提供所述类胰腺结构体的以下任一用途：
(1)制备用于治疗疾病或病症的材料；
(2)制备组织修复或再生的材料；
(3)制备矫形或整形的材料；
(4)药物开发、药物筛选、药物检测或药物测试；
(5)构建药理模型、病理模型、组织/器官模型或肿瘤模型。
进一步地，本发明可用于类器官构建、组织/器官/人体芯片、组织工程、体外生理模型/病理模型/药理模型构建、发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生医疗、精准医疗以及药物毒性和药效试验等方面。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)细胞活性和功能好
一般细胞打印方法采用离散分布的单个细胞作为基本的生物单元，与此不同，本发明先在二维平面培养条件下得到类胰岛细胞团，再与血管化细胞共打印和共培养，构建类器官结构体。本发明提供的细胞团簇结构，既保证了类胰岛细胞的功能和分化发育潜力，又减少了打印过程对细胞的损伤；同时，与血管化细胞的共打印和共培养，还能够实现对多种细胞的多维控制，进而实现多种细胞协同作用、相互促进以及类组织功能的出现和维持。
(二)类器官结构体结构、形态可控
传统的类器官构建方法一般为凝胶包裹，该方法简便易行，但可控性极差，导致成功率较低、稳定性较差、批内差和批间差较大。本方法通过打印技术将多种细胞和生物材料定位组装在预先计算机设计的空间位置，极大提高构建类器官结构体可控性、稳定性和成功率，大大缩小批间差和批内差。
(三)可实现三维水平细胞自组装
本发明通过平面诱导分化和多细胞三维打印两个步骤，分别完成干细胞向胰岛样细胞分化和胰岛样细胞团簇与内皮细胞三维自组装形成类器官。两个步骤的协同配合，能实现细胞团簇尺寸及成分、多种细胞的浓度和比例、细胞的空间位置和距离、生物材料成分种类和空间位置等重要因素的可控可调，进而实现三维水平的细胞自组装。
(四)类器官功能好
本发明构建的人体类器官含有增殖特征干细胞、组织细胞和血管化细胞，且组织细胞呈团簇形态，血管化细胞形成细胞层均匀包裹在组织细胞团簇外层，该形态与天然组织高度相似，类器官生物学表型正常，生物功能好。为解决人体胰腺组织来源受限和工程化人工胰腺组织功能较差的问题提出了新的解决方案。
附图说明
图1为打印本发明类胰腺结构体的过程示意图以及人工结构体的示意图。其中，1：打印喷头；2：人工结构体宏观示意图；3：结构体中的类胰岛细胞团簇；4：血管化细胞形成的类血管网结构。
图2为本发明实施例3中干细胞平面诱导分化过程中细胞形貌变化。其中，(A)分化第0天；(B)分化第3天；(C)分化第5天。
图3为本发明实施例4中干细胞在AggreWell中向组织细胞诱导分化过程中细胞形貌变化。其中，(A)分化第0天；(B)分化第3天；(C)分化第5天；(D)收集得到的组织细胞团簇形态。
图4为本发明实施例6中构建的类器官结构体形貌、细胞死活和蛋白表达鉴定。其中，(A)类器官宏观形貌。(B)放大形貌，材料微丝中均匀分布多个组织细胞团簇和间充质干细胞(即血管化细胞)。(C)类器官构建完成后死活染色检测。细胞团簇的存活率为100％，血管化细胞的存活率为95％以上，黄色所示为单个存在的间充质干细胞。(D)免疫荧光蛋白表达检测，结构体长期培养(20天)维持了胰岛细胞关键蛋白(Pax6、Isl1、Insulin、Pax1)表达。
图5为本发明实施例8中多细胞类器官共培养过程中细胞形态变化。其中，(A)共培养第0天。黄色所示为血管内皮细胞HUVEC。(B)共培养第3天。黄色所示为血管内皮细胞。(C)共培养第8天。黄色所示为血管内皮细胞。标尺200μm。(D)免疫荧光染色显示组织细胞团簇外侧包裹一层血管内皮细胞。蓝色显示细胞核，红色显示胰岛细胞标志物Pdx1，绿色显示内皮细胞标志物CD31。标尺100μm。
图6为本发明实施例9中胰岛分泌功能检测结果。其中，(A)细胞在24孔板分化、微图案孔板分化和人工结构体中胰岛素分泌水平检测。人工结构体是24孔板分化、微图案孔板分化组分泌量的3倍以上，数据有显著性差异。(B)细胞在24孔板分化、微图案孔板分化和人工结构体中C-peptide分泌水平检测。人工结构体与24孔板分化、微图案孔板分化组分泌量的4倍左右，数据有显著性差异。**表示p<0.01。
图7为本发明实施例10中细胞在24孔板分化、微图案孔板分化和人工结构体中高糖刺激试验结果。可以看出人工结构体对高糖刺激的响应性更明显。
图8为本发明实施例11中人工结构体体内移植后再生血管化胰腺组织。其中，(A)insulin胰岛素蛋白免疫荧光染色。(B)CD31血管标志物染色鉴定血管化。(C)扫描电镜检测再生组织，观察到含有红细胞的功能性血管，白色箭头所示。(D)人工结构体体内再生血管密度检测，与对照组相比，数据有显著性差异。***表示p<0.001。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
图1为打印本发明类胰腺结构体的过程示意图以及人工结构体的示意图。
实施例1生物材料原溶液配制
明胶溶液：将明胶粉末(Sigma,G1890)与0.9％氯化钠溶液按照质量比为15:100的比例混合，将溶液振荡涡旋1分钟，在60℃条件下加热2小时，再重复此振荡涡旋和加热的操作2次，最终使其均匀溶解，之后分装，于4℃低温保存。每次使用前在细胞培养箱中保温10min后使其融化为均匀溶液。
海藻酸钠溶液：将海藻酸钠粉末(Sigma,A2033)与0.9％氯化钠溶液按照质量比为4:100的比例混合，将溶液振荡涡旋1分钟，在60℃条件下加热2小时，再重复此振荡涡旋和加热的操作2次，最终使其均匀溶解，于4℃低温保存。
基质胶：将基质胶(Corning,356234)4℃解冻后，在冰上将其分装，于-20℃低温保存。使用前在4℃解冻，并在24h内使用。
实施例2干细胞和血管化细胞培养
人脂肪来源间充质干细胞(Adipose-derived stem cell，ADSC)(Sciencell,7510)在ADSC细胞扩增培养液中进行培养，ADSC细胞扩增培养液按照MSCM培养基试剂盒(Sciencell,7501)进行配制；培养瓶预先使用无菌水稀释8倍的PLL溶液(Sigma,P4832)进行铺底，铺底1h；当细胞90％汇合时按照1:3的比例传代，每2-3天更换一次培养液。
人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)(ATCC，PCS-100-010)在HUVEC细胞扩增培养液中进行培养。HUVEC细胞扩增培养液按照EBM-2培养基试剂盒(LONZA，CC-3162)进行配制。当细胞90％汇合时按照1:3的比例传代，每2-3天更换一次培养液。
实施例3干细胞在多孔板中平面预分化
使用第4代的ADSC细胞进行分化。分化前使用上述方法对普通24孔板进行铺底。将ADSC细胞用0.25％的trypsin/EDTA(Gibco,25200)的消化液消化后，1200rpm离心5min收集细胞沉淀，以2×105个/ml的密度悬浮在ADSC细胞分化培养液中，得ADSC细胞溶液，24孔板每个孔加入1ml ADSC细胞溶液。分化液的成分为在1:1体积比混合的DMEM培养基(Gibco,11965)和DMEM/F-12培养基(Gibco,11320)中，加入10mM Nicotinamide(Sigma，72340)，2nMActivin A(R&D，294-HG)，10nM Exendin-4(Sigma,E7144)，10nM Pentagastrin(Sigma,B1636)，100pM hepatocyte growth factor(Sigma,SRP6014)，2％B-27supplement(Gibco,17504)，1％N-2supplement(Gibco,A13707)，1％青链霉素(Gibco,15140122)，每2-3天进行换液，共分化5天，得类胰腺(ILC，islet-like cell)细胞团。然后收集2个24孔板中平面预分化得到的类胰腺细胞团，用0.25％的trypsin/EDTA的消化液消化后，500rpm离心1min收集细胞团簇，用320μl ADSC细胞分化培养液重悬，得到类胰腺细胞团溶液(ILC细胞团溶液)。
图2为干细胞平面诱导分化过程中细胞形貌变化。
实施例4干细胞在微图案孔板中平面预分化
与实施例3不同，干细胞还可以在微图案孔板中完成平面预分化。
采用AggreWellTM400微图案24孔板(Sciencell，34450)。使用第4代的ADSC细胞进行分化，将ADSC细胞用0.25％的trypsin/EDTA的消化液消化后，1200rpm离心5min收集细胞沉淀，以6×105个/ml的密度悬浮在ADSC细胞分化培养液中，得ADSC细胞溶液，微图案24孔板每个孔加入2ml ADSC细胞溶液。分化液的成分同实施例3中所述。每2-3天进行换液，共分化5天，得ILC细胞团。然后收集12个微图案24孔板中预分化得到的类胰腺细胞团，用0.25％的trypsin/EDTA的消化液消化后，500rpm离心1min收集细胞沉淀，用200μl ADSC细胞分化培养液重悬，得到类胰腺细胞团溶液(ILC细胞团溶液)。
图3为干细胞在AggreWell中向组织细胞诱导分化过程中细胞形貌变化。
实施例5多孔板分化的组织细胞团与血管化细胞共打印构建类器官
1、将明胶溶液在37℃的细胞培养箱中预热20min备用。用0.25％的trypsin/EDTA消化液消化第3代HUVEC细胞，用120μl HUVEC细胞扩增培养液进行重悬，得HUVEC细胞悬液，细胞浓度为6×106个/ml；ILC细胞团溶液和HUVEC细胞溶液混合，得到多种细胞的细胞悬液；取海藻酸钠溶液400μl、基质胶480μl在冰上和细胞溶液混合，置于37℃的细胞培养箱5min；加入明胶溶液400μl，混合后得细胞打印溶液，并将其装载到1ml一次性无菌注射器中。
2、将无菌注射器装载到生物三维打印设备中(具体方法可参见Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue Engineered Adipose Tissue,Journal ofBioactive and Compatible Polymer,2009；24：5)，常温下，在计算机软件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步进电机速度1mm/s，扫描速度3mm/s的参数条件下，在无菌的平面平台上三维打印，形成体积为8mm×8mm×5mm的预凝胶三维结构体。
3、获得的预凝胶结构体用100mM的氯化钙溶液交联3min，然后吸去氯化钙溶液并加入ADSC细胞分化培养液，常规条件下(37℃，5％ CO2孵箱)培养细胞三维结构体5天，使用ADSC细胞分化培养基和HUVEC细胞扩增培养基1:1体积比混合得到的混合培养基进行培养，培养过程中每2～3天换液。
实施例6微图案多孔板分化的组织细胞团与血管化细胞(间充质干细胞)共打印构建类器官
1、将明胶溶液在37℃的细胞培养箱中预热20min备用。用0.25％的trypsin/EDTA消化液消化第4代ADSC细胞，使用120μl ADSC细胞扩增培养液进行重悬，得细胞浓度为107个/ml；ILC细胞团溶液和ADSC细胞溶液混合，得到最终的细胞溶液；取海藻酸钠溶液350μl、基质胶480μl在冰上和细胞溶液混合，置于37℃的细胞培养箱5min；加入明胶溶液450μl，混合后得细胞打印溶液，并将其装载到1ml一次性无菌注射器中。
2、将无菌注射器装载到生物三维打印设备中，常温下，在计算机软件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步进电机速度1mm/s，扫描速度3mm/s的参数条件下，在无菌的平面平台上三维打印，形成体积为8mm×8mm×5mm的预凝胶三维结构体。
3、获得的预凝胶结构体用100mM的氯化钙溶液交联3min，然后吸去氯化钙溶液并加入ADSC细胞分化培养液，常规条件下(37℃，5％ CO2孵箱)培养细胞三维结构体20天，使用ADSC细胞分化培养基和ADSC细胞扩增培养基1:1体积比混合得到的混合培养基进行培养，培养过程中每2～3天换液。
4、死活细胞染色检测：采用Live-Dead Cell Staining Kit(Biovision K501-100)活-死细胞染色试剂盒检测细胞存活情况，Live-Dye染料能对活细胞染色，是一种能穿透细胞的绿色荧光染料(Ex/Em＝488/518nm)。死细胞用碘化吡啶(PI)染色，PI是一种不能透过细胞膜的红色荧光染料(Ex/Em＝488/615)。使用荧光显微镜(Nikon)观察并记录。
图4所示为本发明构建的类器官结构体形貌、细胞死活和蛋白表达鉴定。其中，(A)类器官宏观形貌。(B)放大形貌，材料微丝中均匀分布多个组织细胞团簇和间充质干细胞(即血管化细胞)。(C)类器官构建完成后死活染色检测。细胞团簇的存活率为100％，血管化细胞的存活率为95％以上，黄色所示为单个存在的间充质干细胞。
实施例7免疫荧光染色检测
使用常规免疫荧光染色法检测实施例3～6中ILC细胞团关键蛋白的表达。具体操作步骤为：
吸去培养液，用磷酸缓冲液(phosphatic buffer solution,PBS)(BI,02-024-1AC)洗涤1次；用4％多聚甲醛在室温下固定5分钟，用PBS洗涤1次；用0.3％ Triton-X(Sigma，X100)破膜处理10min；用10％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)封闭1h；加入一抗溶液，包括anti-PAX6 antibody(Abcam，ab5790)，anti-Isl1 antibody(Abcam,ab86472)，anti-PDX1 antibody(Abcam,ab47383)，anti-insulin antibody(Abcam,ab7842)。一抗中含有0.3％Triton-X和1％ BSA。4℃过夜。用PBS洗涤3次，每次3分钟；加入对应二抗，如Alexa594(Abcam，150080，稀释1000倍)、Alexa />488(Abcam，150113，稀释1000倍)，加入相应二抗，室温避光孵育2h后，用磷酸缓冲液(Sigma)冲洗组织3次，每次5分钟；加入1μg/ml的DAPI染色细胞核，室温避光孵育15min。利用激光共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)进行观察。
图4D免疫荧光蛋白表达检测结果表明，结构体长期培养(20天)维持了胰岛细胞关键蛋白(Pax6、Isl1、Insulin、Pax1)的表达。
实施例8微图案多孔板分化的组织细胞团与血管内皮细胞共打印构建类器官
1、将明胶溶液在37℃的细胞培养箱中预热20min备用。用0.25％的trypsin/EDTA消化液消化第4代ADSC细胞，使用120μl HUVEC细胞扩增培养液进行重悬，得细胞浓度为107个/ml；ILC细胞团溶液和HUVEC细胞溶液混合，得到最终的细胞溶液；取海藻酸钠溶液350μl在冰上和细胞溶液混合，置于37℃的细胞培养箱5min；加入明胶溶液450μl，混合后得细胞打印溶液，并将其装载到1ml一次性无菌注射器中。
2、将无菌注射器装载到生物三维打印设备中，常温下，在计算机软件(Microsoft,AT640，Redmond,WA)控制下，以步进电机速度1mm/s，扫描速度3mm/s的参数条件下，在无菌的平面平台上三维打印，形成体积为8mm×8mm×5mm的预凝胶三维结构体。
3、获得的预凝胶结构体用100mM的氯化钙溶液交联3min，然后吸去氯化钙溶液并加入共培养液，常规条件下(37℃，5％ CO2孵箱)培养细胞三维结构体8天。共培养液成分为ADSC细胞分化培养液和HUVEC细胞扩增培养基1:1体积比均匀混合，培养过程中每2～3天换液。
4、类器官培养的第8天采用免疫荧光染色检测内皮细胞和胰岛细胞的蛋白表达。具体操作步骤为：吸去培养液，用磷酸缓冲液(phosphatic buffer solution,PBS)(BI,02-024-1AC)洗涤1次；用4％多聚甲醛在室温下固定5分钟，用PBS洗涤1次；用0.3％Triton-X(Sigma,X100)破膜处理10min；用10％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)封闭1h；加入一抗溶液，包括anti-PDX1 antibody(Abcam,ab47383)，anti-CD31(Abcam,ab28364)。一抗中含有0.3％Triton-X和1％ BSA。4℃过夜。用PBS洗涤3次，每次3分钟；加入对应二抗，如Alexa594(Abcam，150080，稀释1000倍)、Alexa/>488(Abcam，150113，稀释1000倍)，室温避光孵育2h后，用磷酸缓冲液(Sigma)冲洗组织3次，每次5分钟；加入1μg/ml的DAPI染色细胞核，室温避光孵育15min；使用激光共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)来进行图片观察。
图5显示了多细胞类器官共培养过程中细胞形态变化。其中，(A)共培养第0天。黄色所示为血管内皮细胞HUVEC。(B)共培养第3天。黄色所示为血管内皮细胞。(C)共培养第8天。黄色所示为血管内皮细胞。标尺200μm。(D)免疫荧光染色显示组织细胞团簇外侧包裹一层血管内皮细胞。蓝色显示细胞核，红色显示胰岛细胞标志物Pdx1，绿色显示内皮细胞标志物CD31。标尺100μm。
实施例9胰岛素分泌检测
使用胰岛素分泌检测试剂盒(R&D，DINS00)以及C-肽分泌检测试剂盒(R&D，DICP00)按照试剂盒说明书，检测实施例3、4、6中所得ILC细胞团在多孔板平面分化、微图案24孔板分化以及类器官构建培养后的胰岛素分泌能力。结果如图6所示。类器官的胰岛素分泌量是24孔板分化组、微图案孔板分化组分泌量的3倍以上，数据有显著性差异。类器官的c-peptide分泌量是24孔板分化、微图案孔板分化组分泌量的4倍左右，数据有显著性差异。
实施例10糖刺激检测
对实施例3、4、8中ILC细胞团受到糖刺激后的蛋白分泌进行检测。具体操作步骤为：
通过细胞消化、吹打的方式，收集ILC细胞团。取100个细胞团，500rpm 1min离心后，加入100μl KRBH培养液。KRBH培养液成分为在无菌水中加入120mM NaCl,5mM KCl,2.5mM CaCl2，1.1mM MgCl2，25mM NaHCO3,10mM HEPES(Sigma,H3375),0.1％ BSA。于37℃细胞培养箱培养1小时。500rpm 1min离心，除去上清液，换用含有5.5mM葡萄糖(Sigma,G8270)的KRBH培养液。于37℃细胞培养箱培养1小时后，收集上清液。500rpm 1min离心，除去上清液，换用含有22mM葡萄糖(Sigma,G8270)的KRBH培养液。于37℃细胞培养箱培养1小时后，收集上清液并采用实施例8所述方法的检测胰岛素分泌。
结果如图7所示。类器官对高糖刺激的响应性比24孔板分化组、微图案孔板分化组更明显。
实施例11体内移植实验
将实施例8制备的胰腺类器官移植入免疫缺陷裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，BALB/c-nude，N＝4)皮下。对照组为实施例4制备的微图案分化组。在植入28天后，挑选注射部位样品取出，冰冻切片，并进行免疫荧光染色insulin和CD31染色，在光学显微镜(DP70,Olympus)下观察植入物切片，结果如图8所示。
从体内移植结果可以看出，本发明提供的类器官明显在体内再生血管化组织，这些组织具有对应组织的形态特征和蛋白表达(insulin)，并且观察到大量血管和红细胞的存在，证明再生了丰富的功能性血管。每个样品选取3个随机视野，根据CD31染色图片定量分析得到结构体中生成的血管密度(图8D)。由检测结果可以看出，本发明提供的类器官明显在体内再生血管化组织，新生血管密度是对照组的3倍左右，数据有显著性差异。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.类胰腺结构体的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A、类胰腺细胞团的制备：将干细胞和/或祖细胞在体外诱导分化为类胰腺细胞团；
B、将血管化细胞、步骤A制备的类胰腺细胞团与水凝胶材料混合后进行生物打印，得到预凝胶三维结构体；
C、采用多细胞培养液和/或生物反应器培养预凝胶三维结构体，即得类胰腺结构体；
其中，步骤C所述多细胞培养液中含有如下物质中的至少一种：2-mercaptoethanol、5-AZA、amphotericin B、Activin-A、ascorbic acid、all-trans retionic acid、activin-βB、β-cellulin、bovine pituitary extract、BSA、BSA Cohn fraction V、butylatedhydroxyanisole、B-27、CHIR99021、DAPT、DMSO、Dibutyryl-cAMP、dorsomorphin、EGF、EnGS、ES-qualified fetal calf serum、Exendin-1、Exendin-4、fibronectin、FGF家族、gentamicin、GLP-1、GA-1000、HEPES、heparin、Hydrocortisone、HGF、IGF-1、IGF-2、insulin、IndolactamV、KAAD-cyclopamine、LiCl、L-glutamine、laminin、nicotinic acid、Nicotinamide、N-2、non-essential amino acids、noggin、PDGF、Pentagastrin、γ-secretase inhibitor、selenium、sodium butyrate、sodium pyruvate、sodium chlorate、SB431542、TGF-β1、TGF-β3、transferrin、taurine、trolox、TSA、VEGF、Wnt3a、Zn2SO4；
步骤A中采用预分化培养液培养所述干细胞和/或祖细胞，使其分化为类胰腺细胞团；
所述预分化培养液中含有如下物质中的至少一种：Nicotinamide、Activin-A、Exendin-4、Pentagastrin、HGF、EGF、VEGF、FGF家族、TGF-β1、TGF-β3、IGF-1、IGF-2、BSA、BSACohn fraction V、insulin、transferrin、selenium、sodium butyrate、sodium pyruvate、2-mercaptoethanol、taurine、GLP-1、B-27、N-2、non-essential amino acids、CHIR99021、LiCl、all-trans retionic acid、dorsomorphin、SB431542、KAAD-cyclopamine、ascorbicacid、DAPT、Dibutyryl-cAMP、Wnt3a、noggin、activin-βB、trolox、sodium chlorate、γ-secretase inhibitor、L-glutamine、fibronectin、laminin、Zn2SO4、HEPES、Exendin-1、ES-qualified fetal calf serum、IndolactamV、nicotinic acid、heparin、5-AZA、TSA、β-cellulin、DMSO、butylated hydroxyanisole；
步骤A中所述干细胞或祖细胞选自诱导性多能干细胞、成体干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、周边血干细胞、造血干细胞、胰腺干细胞、胰腺祖细胞中的至少一种；
步骤B中所述血管化细胞选自血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、微血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管成纤维细胞、间充质干细胞、周细胞中的至少一种；
其中，所述血管化细胞是组织中提取获得的，或者由干细胞分化而来的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为成体干细胞、胰腺祖细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血管化细胞为血管内皮细胞、血管内皮祖细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述水凝胶材料为天然和/或人工合成的具有生物相容性的水凝胶材料。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述水凝胶材料选自如下天然生物材料中的至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶；和/或
所述水凝胶材料选自如下人工合成生物材料中的至少一种：聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述水凝胶材料选自藻酸钠、明胶、基质胶或胶原。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述水凝胶材料选自聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)干细胞ADSC和血管化细胞HUVEC的培养
将干细胞ADSC在ADSC细胞扩增培养液中进行培养，当细胞90％汇合时按照1:2-4的比例传代，每2-3天更换一次培养液；
将血管化细胞HUVEC在HUVEC细胞扩增培养液中进行培养，当细胞90％汇合时按照1:2-4的比例传代，每2-3天更换一次培养液；
b)干细胞ADSC在24孔板中平面预分化
用胰蛋白酶消化第2-5代的ADSC细胞，离心收集细胞沉淀，以1×105-5×106个/ml的密度重悬于ADSC细胞分化培养液中，得ADSC细胞溶液；向24孔板的各孔内加1-2mL ADSC细胞溶液，于培养箱内培养5天，每1-3天更换一次培养液；然后收集1-25个24孔板中平面预分化得到的类胰腺细胞团，用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞沉淀，用100-500μlADSC细胞分化培养液重悬，得到类胰腺细胞团溶液；
其中，所述ADSC细胞分化培养液的成分为：等体积比混合的DMEM培养基和DMEM/F-12培养基中含有10mM Nicotinamide，2nM Activin A，10nM Exendin-4，10nM Pentagastrin，100pM hepatocyte growth factor，2％B-27supplement，1％N-2supplement和1％青链霉素；
c)类胰腺细胞团、血管化细胞与水凝胶材料混合共打印
用胰蛋白酶消化第2-4代的HUVEC细胞，离心收集细胞沉淀，用100-200μlHUVEC细胞扩增培养液重悬，得到浓度为106-108个/ml的HUVEC细胞溶液；
将类胰腺细胞团溶液、HUVEC细胞溶液与200-500μl海藻酸钠溶液和300-600μl基质胶在冰上混合，于37℃培养箱孵育3-10min；然后与37℃明胶溶液300-600μl混合后得细胞打印溶液，装载到生物三维打印设备中进行生物打印，得到预凝胶三维结构体；
其中，所述海藻酸钠溶液是由海藻酸钠粉末与0.9％氯化钠溶液按质量比4:100混合而成；所述明胶溶液是由明胶粉末与0.9％氯化钠溶液按质量比15:100混合而成，加热至明胶完全溶解，即得；
d)采用多细胞培养液和/或生物反应器培养预凝胶三维结构体5-30天，即得类胰腺结构体；
其中，所述多细胞培养液由所述ADSC细胞分化培养液和HUVEC细胞扩增培养液按1:1体积比混合而成。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a′)干细胞ADSC和血管化细胞HUVEC的培养：同权利要求8中所述；
b′)干细胞ADSC在微图案孔板中平面预分化
用胰蛋白酶消化第2-5代的ADSC细胞，离心收集细胞沉淀，以1×105-5×106个/ml的密度重悬于ADSC细胞分化培养液中，得ADSC细胞溶液；向AggreWellTM400微图案24孔板的各孔内加ADSC细胞溶液2-3ml，于培养箱内培养5天，每2-3天更换一次培养液；然后收集2-60个微图案24孔板中平面预分化得到的类胰腺细胞团，用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞沉淀，用100-500μl ADSC细胞分化培养液重悬，得到类胰腺细胞团溶液；
其中，所述ADSC细胞分化培养液的定义同权利要求8中所述；
c′)类胰腺细胞团、血管化细胞与水凝胶材料混合共打印
用胰蛋白酶消化第1-5代的ADSC细胞，离心收集细胞沉淀，用100-200μl ADSC细胞扩增培养液重悬，得到浓度为106-108个/ml的ADSC细胞溶液；
将类胰腺细胞团溶液、ADSC细胞溶液与200-500μl海藻酸钠溶液和300-600μl基质胶在冰上混合，于37℃培养箱孵育3-10min；然后与37℃明胶溶液300-600μl混合后得细胞打印溶液，装载到生物三维打印设备中进行生物打印，得到预凝胶三维结构体；
其中，所述海藻酸钠溶液、所述明胶溶液的定义同权利要求8中所述；
d′)采用多细胞培养液和/或生物反应器培养预凝胶三维结构体1-30天，即得类胰腺结构体。
10.由权利要求1-9任一项所述方法构建获得的类胰腺结构体。
11.权利要求10所述类胰腺结构体的以下任一用途：
(1)制备胰腺组织修复或再生的材料；
(2)构建胰腺组织/器官模型。
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