CN115702953A - 一种骨组织单元-支架材料复合体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种骨组织单元‑支架材料复合体及其构建方法与应用，该方法首先将具有成骨分化潜力的细胞接种或包裹于微凝胶支架材料中，在体外诱导分化、培养一段时间，获得相对成熟的骨组织单元。然后将骨组织单元接种于生物相容性支架材料，即可制备基于骨组织单元‑支架材料复合体的组织工程骨。本发明还提供基于骨组织单元‑支架材料复合体的组织工程骨在整形美容、骨缺损修复与再生领域的应用。

Description

一种骨组织单元-支架材料复合体及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学组织工程领域，尤其是涉及一种骨组织单元-支架材料复合体及其构建方法与应用。

背景技术

当前，对于严重创伤、肿瘤切除后导致的大段骨缺损一直都是临床医生亟需解决的难题。临床上，自体骨或异体骨的骨诱导、骨生成作用被认为是植骨融合的金标准。但是，自体骨的供体十分有限，异体骨又面临免疫排异反应的问题。因此，临床上通常采用生物材料来替代治疗，例如骨水泥、生物陶瓷、脱钙骨基质、生物可降解复合材料等。随着组织工程技术的发展，经典的骨组织工程修复策略为骨缺损修复提供了另一种有效的途径。简而言之，骨组织工程是基于细胞负载支架材料进行诱导、培养来实现的。但是，目前以细胞接种支架材料的骨组织工程仍然存在诸多问题：1)支架材料的孔径与细胞的尺寸大小难以匹配，往往会导致接种后细胞流失，大大降低细胞利用率；2)大尺寸的组织工程骨构建往往会由于营养物质难以完全渗透，导致中心区域再生骨组织坏死。因此，进一步优化细胞的接种方式是解决上述问题一种可能的构建策略。

众所周知，水凝胶材料以其高度含水、合适的力学强度，是组织工程与再生医学领域最为理想的支架材料。其中，微凝胶是水凝胶材料在微米尺寸的形态模式，即通过一定技术手段将水凝胶制备成微米尺寸范围内的凝胶，被广泛应用于微组织构建。然而如何将微凝胶应用于骨组织构建仍是一个需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种骨组织单元-支架材料复合体及其构建方法与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供微凝胶支架材料的制备方法。

微凝胶支架材料的制备方法，将水凝胶材料利用机械研磨法、乳液聚合法、微流控技术、自组装、喷雾法等中的一种或几种，制备得到微凝胶支架材料。

在本发明的一个实施方式中，所述微凝胶支架材料的制备方法选自机械研磨法、乳液聚合法、微流控技术、自组装、喷雾法等中的一种或几种。优选为机械研磨法、乳液聚合法或微流控技术。

在本发明的一个实施方式中，用于获得微凝胶支架材料的水凝胶材料，可以选自天然多糖类或天然蛋白类高分子构建的水凝胶材料。

在本发明的一个实施方式中，所述天然多糖类高分子选自透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐中的一种或几种。

在本发明的一个实施方式中，所述天然蛋白类高分子选自各种亲水或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白、明胶、多肽。优选为透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖或明胶。

在本发明的一个实施方式中，所述微凝胶支架材料的尺寸可以为1μm-1mm，优选为100μm-500μm。

在本发明的一个实施方式中，所述微凝胶支架材料的制备方法，可实现的实施方式之一为：将用于制备水凝胶的高分子溶于去离子水，加入交联剂搅拌反应，得到交联水凝胶材料，然后将交联水凝胶材料倒入透析袋中，用去离子水透析2-3d，除去多余的交联剂，通过机械研磨的方式制备交联水凝胶材料的微凝胶，然后冷冻干燥，并筛选合适尺寸的微颗粒，即可得到所述微凝胶支架材料。

在本发明的一个实施方式中，所述交联剂选自BDDE(丁二醇缩水甘油醚)，DVS(二乙烯基砜)，ADH(乙二酸二酰肼)，EDC(碳二亚胺)或GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)中的一种或几种。进一步优选为BDDE或DVS交联剂。

在本发明的一个实施方式中，提供了一种具体交联透明质酸微凝胶的制备方法，可实现的实施方式之一为：将透明质酸溶于去离子水，加入交联剂搅拌反应，然后将交联透明质酸倒入透析袋中，用去离子水透析2-3d，除去多余的交联剂，通过机械研磨的方式制备交联透明质酸的微凝胶，然后冷冻干燥，并筛选合适尺寸的微颗粒，即可得到所述的交联透明质酸微凝胶。

在本发明的一个实施方式中，所述微凝胶支架材料的制备方法，可实现的实施方式之二为：将水凝胶前体溶液作为连续相(水相)，并准备分散相(油相)，将水相和油相从不同的通道注射到微流控芯片中，在两相交汇处，水相被油相剪切得到单乳液液滴，然后在管道中继续被向前推进，通过交联反应形成微凝胶，并收集，然后冷冻干燥，并筛选合适尺寸的微颗粒，即可得到所述微凝胶支架材料。

在本发明的一个实施方式中，所述微凝胶支架材料的制备方法，可实现的实施方式之二为：将水凝胶前体溶液作为连续相(水相)，并准备分散相(油相)，利用注射泵将水相和油相从不同的通道注射到微流控芯片中，在两相交汇处，水相被油相剪切得到单乳液液滴，然后在管道中继续被向前推进，通过交联反应形成微凝胶，并收集，然后冷冻干燥，并筛选合适尺寸的微颗粒，即可得到所述微凝胶支架材料。

在本发明的一个实施方式中，所述分散相(油相)选择液体石蜡和司盘80的混合溶液。

在本发明的一个实施方式中，所述分散相(油相)选择质量比为8:2的液体石蜡和司盘80的混合溶液。

在本发明的一个实施方式中，用于获得水凝胶前体溶液的水凝胶选自透明质酸、羧甲基纤维素、海藻酸、葡聚糖、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、羧甲基壳聚糖、胶原蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白、明胶、多肽。优选为透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖或明胶中的一种或几种。

在本发明的一个实施方式中，所述交联反应可以选用化学交联或光交联，所述化学交联包括括叠氮-炔点击反应、巯基-迈克尔加成反应、酰胺缩合反应、席夫碱反应、狄尔斯-阿尔德反应等。所述光交联是指在光源照射下生成的自由基，引发含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物上双键官能团的聚合反应。

本发明中，所述微凝胶支架材料可以添加或不添加成骨活性成分。

在本发明的一个实施方式中，所述微凝胶支架材料中添加有成骨活性成分。所述成骨活性成分是在制备过程中与水凝胶材料一起添加的。

所述成骨活性成分能够有效促进微凝胶负载的成骨细胞或干细胞的成骨分化，或者刺激内源性干细胞的成骨分化，进一步提高再生骨组织的成熟度。

在本发明的一个实施方式中，所述成骨活性成分包括生物活性的无机材料或生物活性因子。

在本发明的一个实施方式中，所述生物活性的无机材料包括羟基磷灰石、磷酸钙、碳酸钙、生物玻璃、脱钙骨基质等。

在本发明的一个实施方式中，所述生物活性因子包括BMP-2～BMP-9(骨形态发生蛋白)、VEGF、TGFβ等。

在本发明的一个实施方式中，所述成骨活性成分优选为羟基磷灰石、脱钙骨基质、BMP-2。

本发明还提供上述方法得到的微凝胶支架材料。

本发明的第二个目的是提供骨组织单元的构建方法。

本发明中，骨组织单元的构建方法包括：将具有成骨分化潜力的细胞接种或包裹于本发明第一个目的提供的微凝胶支架材料中，在体外诱导分化、培养一段时间，即可获得相对成熟的基于微凝胶材料构建的骨组织单元。

在本发明的一个实施方式中，所述成骨分化潜力的细胞选自成骨细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或胚胎干细胞等，优选为成骨细胞或间充质干细胞。

在本发明的一个实施方式中，所述体外诱导分化、培养方式可以为静态培养或动态培养，静态培养方式即将接种或包裹细胞的微凝胶放置于培养皿中培养，动态培养方式即将包裹细胞的微凝胶放置于生物反应器中搅拌或加压培养，以促进水凝胶中的营养物质交换。经过所述体外诱导分化、培养后得到相对成熟的基于微凝胶材料构建的骨组织单元。

在本发明的一个实施方式中，所述培养时间为1周-24周，优选为4周-8周。

在本发明的一个实施方式中，所述相对成熟的基于微凝胶材料构建的骨组织单元包括以下生物学与组织学特征：ALP，RUNX2，COL1基因达到正常骨组织基因水平的10％-30％。

在本发明的一个实施方式中，所述基于微凝胶材料构建的骨组织单元的可实现的实施方式：通过机械研磨法制备BDDE交联的透明质酸微凝胶，加入羟基磷灰石作为成骨活性成分，并接种成骨细胞，通过静态培养方式将其置于培养皿中培养2周，即可获得相对成熟的骨组织单元。

在本发明的一个实施方式中，所述基于微凝胶材料构建的骨组织单元的可实现的实施方式：将标记双键官能团的明胶溶于生物相容性介质，配置一定浓度的水凝胶前体溶液，加入脱钙骨基质作为成骨活性成分，通过微流控技术在光照下(365nm)制备明胶微凝胶，并包裹干细胞，在体外生物反应器加压培养2周，即可获得相对成熟的骨组织单元。

在本发明的一个实施方式中，所述生物相容性介质选自蒸馏水、生理盐水、缓冲液或细胞培养基溶液。根据不同的应用，可选取不同的生物相容性介质。

在本发明的一个实施方式中，所述一定浓度的水凝胶前体溶液可以为0.1％w/v-60％w/v，优选为1％w/v-20％w/v。

本发明还提供基于上述方法得到的骨组织单元。

本发明的第三个目的是提供一种骨组织单元-支架材料复合体的构建方法。

本发明中，基于骨组织单元-支架材料复合体的构建方法包括：将本发明第二个目的提供的骨组织单元接种于生物相容性支架材料，即可制备骨组织单元-支架材料复合体，即为一种组织工程骨。

在本发明的一个实施方式中，所述生物相容性支架材料包括多孔骨水泥、多孔生物陶瓷、脱钙骨基质、生物可降解复合材料。

在本发明的一个实施方式中，所述生物可降解复合材料包括聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸)等。优选为脱钙骨基质、PCL、PLGA。

本发明基于骨组织单元-支架材料复合体构建组织工程骨的原理：微凝胶材料给细胞提供三维的培养环境，结合体外生物反应器培养，能够有效改善凝胶内的营养物质交换，为细胞构建合适的三维培养体系。同时，微凝胶内负载的成骨活性成分能够诱导细胞向成骨方向分化、增殖，经过一段时间培养，成骨分化潜力的细胞逐渐分化为成熟的成骨细胞，并且分泌出丰富的细胞外基质，最终形成相对成熟的骨组织单元。另外，选用生物相容性支架材料负载骨组织单元，能够为构建的组织工程骨提供一定的力学支撑，并维持稳定的三维形态(图1所示)。因此，运用本发明提供的方法基本可以通过骨组织单元-支架材料复合体的理念构建组织工程骨。

本发明的第四个目的是提供一种组织工程骨，其为基于骨组织单元-支架材料复合体构建的组织工程骨。

本发明的第五个目的是提供基于骨组织单元-支架材料复合体构建的组织工程骨的应用。

本发明提供了基于骨组织单元-支架材料复合体构建的组织工程骨在整形美容、骨缺损修复与再生领域的应用。

具体而言，所述基于骨组织单元-支架材料复合体构建的组织工程骨在制备整形美容材料、骨缺损修复与再生材料上的应用。

其中，整形美容包括面部填充，如额部、下颌角、鼻基底。

骨缺损包括粉碎性骨折、骨不连、骨肿瘤、颅骨、下颌骨损伤。

本发明结合微凝胶支架材料负载成骨细胞或干细胞，经体外诱导分化、培养后，构建相对成熟的骨组织单元，再将骨组织单元接种于生物支架材料，即可成功构建成熟的组织工程骨。相对于传统的组织工程骨的构建方式，该类基于骨组织单元-支架材料复合体构建组织工程骨的方式具有如下优势：

1)可以根据支架材料的孔径大小制备合适尺寸大小的微凝胶负载细胞，从而有效提高细胞的接种效率；

2)负载细胞的微凝胶在接种支架材料后仍然存在较大的间隙，有利于营养物质渗透，结合相应的组织培养技术，能够实现大尺寸组织工程骨的构建；

3)结合生物活性成分制备的微凝胶，可达到缓释效果，进一步促进骨组织再生。

本发明提供的基于骨组织单元-支架材料复合体构建的组织工程骨可以应用于整形美容、骨组织修复与再生领域。

附图说明

图1为骨组织单元-支架材料复合体修复胫骨缺损的示意图。

图2为骨组织单元培养2周后的活死细胞染色图。

图3为组织工程骨体内培养8周后的组织学图。

图4为组织工程骨修复兔子胫骨缺损的效果直观图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例一：基于骨组织单元-支架材料复合体构建组织工程骨

负载BMP-2壳聚糖微凝胶构建：称取0.05g壳聚糖(CS)，0.2ng BMP-2溶于1mL PBS溶液(pH＝7.4)中，并加入10mg磷酸盐，混合后交联形成水凝胶，然后通过机械研磨的方式制备微凝胶，然后冷冻干燥，并筛选100μm微颗粒，即可得到负载BMP-2壳聚糖微凝胶支架材料。

骨组织单元-支架材料复合体构建：从兔子骨髓分离骨髓干细胞，常规分离培养扩增，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×10⁶/mL，接种于上述负载BMP-2壳聚糖微凝胶支架材料，于离心管中孵育24小时后，转移至搅拌型生物反应器中，放入培养箱中，于成骨诱导培养基中，继续搅拌培养2周，即可得到相对成熟的骨组织单元。接着，将骨组织单元接种于聚己内酯(PCL)的支架材料，即可得到骨组织单元-支架材料复合体。

实施例二：基于骨组织单元-支架材料复合体构建组织工程骨

负载羟基磷灰石交联透明质酸微凝胶构建：将透明质酸(2g，340kDa)溶于100mL去离子水，加入0.1g羟基磷灰石，然后加入0.1g BDDE(丁二醇缩水甘油醚)，并缓慢滴加0.1mL1M NaOH溶液，继续搅拌反应5h，然后将交联透明质酸倒入透析袋中，用去离子水透析2-3d，除去多余的交联剂，通过机械研磨的方式制备交联透明质酸的微凝胶，然后冷冻干燥，并筛选100μm微颗粒，即可得到负载羟基磷灰石交联透明质酸微凝胶支架材料。

骨组织单元-支架材料复合体构建：从兔子骨髓分离骨髓干细胞，常规分离培养扩增，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×10⁶/mL，接种于上述负载羟基磷灰石交联透明质酸微凝胶支架材料，于离心管中孵育24小时后，转移至搅拌型生物反应器中，放入培养箱中，于成骨诱导培养基中，继续搅拌培养2周，即可得到相对成熟的骨组织单元。接着，将骨组织单元接种于脱钙骨基质的支架材料，即可得到骨组织单元-支架材料复合体。

实施例三：基于骨组织单元-支架材料复合体构建组织工程骨

甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)的合成：将明胶(1g)溶于10mL PBS(pH＝7.4)中，加热至50℃搅拌至完全溶解，加入0.5mL甲基丙烯酸酐，反应2-3h，反应后用40mL PBS稀释反应液，然后倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酸酯化明胶(0.9g)。根据核磁氢谱图，可计算出双键的含量大约为75％。

负载脱钙骨基质光敏明胶微凝胶构建：配置10％w/v的GelMA溶液(含0.2％w/vLAP光引发剂)和0.5％w/v脱钙骨基质作为连续相(水相)，以质量比为8:2的液体石蜡和司盘80的混合溶液作为分散相(油相)。利用注射泵将水相和油相从不同的通道注射到微流控芯片中，在两相交汇处，水相被油相剪切得到单乳液液滴，然后在管道中继续被向前推进，通过光照(365nm)，交联形成微凝胶，并收集至烧杯中。然后冷冻干燥，并筛选100μm微颗粒，即可得到光敏明胶微凝胶支架材料。

骨组织单元-支架材料复合体构建：从兔子骨髓分离骨髓干细胞，常规分离培养扩增，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×10⁶/mL，接种于上述负载脱钙骨基质光敏明胶微凝胶支架材料，于离心管中孵育24小时后，转移至搅拌型生物反应器中，放入培养箱中，于成骨诱导培养基中，继续搅拌培养2周，即可得到相对成熟的骨组织单元(图2所示)。接着，将骨组织单元接种于聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)的支架材料，即可得到骨组织单元-支架材料复合体。

实施例四：基于骨组织单元-支架材料复合体构建的组织工程骨的生物学评价

体外培养4周后，取材，进行大体观、组织学、q-PCR定量等骨再生指标体外检测。实验结果表明，组织工程骨经培养后呈现白色的外观，逐渐表现为骨样组织。组织学上可以观察到成骨细胞在支架材料上聚集，并分泌出细胞外基质，固绿、Masson和ALP组织学呈现特异性染色(图3所示)。q-PCR的基因定量数据表明Col1，RUNX2和OCN的表达达到正常软骨组织的60％。

实施例五：基于骨组织单元-支架材料复合体构建的组织工程骨应用于兔子胫骨缺损修复

采用新西兰雄性大白兔，每只兔子均在胫骨处制造直径为15mm的骨缺损。实验前按体重随机分组(每组4只)：1.组织工程骨修复组；2.不做处理的空白组。手术过程中，首先按实施例三构建成熟的组织工程骨，然后将其填充至缺损部位(图4所示)。在手术3月后，通过静脉注射空气的方法处死实验中的兔子，并取样对实验修复效果进行评价。实验结果表明，使用组织工程骨处理的缺损部位取得了完全的骨修复，而对照组中骨缺损部位没有得到任何修复。因此，该类可注射骨对骨缺损有很好的骨修复效果。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种骨组织单元-支架材料复合体的构建方法，其特征在于，将骨组织单元接种于生物相容性支架材料，即制备得到骨组织单元-支架材料复合体；

所述骨组织单元的构建方法为：将具有成骨分化潜力的细胞接种或包裹于微凝胶支架材料中，在体外诱导分化、培养，即获得相对成熟的基于微凝胶材料构建的骨组织单元；

所述微凝胶支架材料是将水凝胶材料利用机械研磨法、乳液聚合法、微流控技术、自组装或喷雾法中的一种或几种制备得到。

2.根据权利要求1所述的一种骨组织单元-支架材料复合体的构建方法，其特征在于，所述生物相容性支架材料选自多孔骨水泥、多孔生物陶瓷、脱钙骨基质或生物可降解复合材料；

所述生物可降解复合材料选自聚己内酯、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种骨组织单元-支架材料复合体的构建方法，其特征在于，所述成骨分化潜力的细胞选自成骨细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或胚胎干细胞。

4.根据权利要求1所述的一种骨组织单元-支架材料复合体的构建方法，其特征在于，所述体外诱导分化、培养方式选择为静态培养或动态培养，

静态培养方式为将接种或包裹细胞的微凝胶放置于培养皿中培养，

动态培养方式即将包裹细胞的微凝胶放置于生物反应器中搅拌或加压培养，以促进水凝胶中的营养物质交换。

5.根据权利要求1所述的一种骨组织单元-支架材料复合体的构建方法，其特征在于，所述相对成熟的基于微凝胶材料构建的骨组织单元包括以下生物学与组织学特征：ALP，RUNX2，COL1基因达到正常骨组织基因水平的10％-30％。

6.根据权利要求1所述的一种骨组织单元-支架材料复合体的构建方法，其特征在于，所述微凝胶支架材料的制备方法包括：

将用于制备水凝胶的高分子溶于去离子水，加入交联剂搅拌反应，得到交联水凝胶材料，然后将交联水凝胶材料倒入透析袋中，用去离子水透析2-3d，除去多余的交联剂，通过机械研磨的方式制备交联水凝胶材料的微凝胶，然后冷冻干燥，并筛选合适尺寸的微颗粒，即得到所述微凝胶支架材料；或，

将水凝胶前体溶液作为水相，并准备油相，将水相和油相从不同的通道注射到微流控芯片中，在两相交汇处，水相被油相剪切得到单乳液液滴，然后在管道中继续被向前推进，通过交联反应形成微凝胶，并收集，然后冷冻干燥，并筛选合适尺寸的微颗粒，即得到所述微凝胶支架材料。

7.根据权利要求1所述的一种骨组织单元-支架材料复合体的构建方法，其特征在于，所述微凝胶支架材料的尺寸为1μm-1mm，优选为100μm-500μm。

8.根据权利要求1所述的一种骨组织单元-支架材料复合体的构建方法，其特征在于，所述微凝胶支架材料中添加有成骨活性成分；

所述成骨活性成分包括生物活性的无机材料或生物活性因子，

所述生物活性的无机材料包括羟基磷灰石、磷酸钙、碳酸钙、生物玻璃或脱钙骨基质；

所述生物活性因子包括BMP-2～BMP-9、VEGF或TGFβ。

9.一种组织工程骨，其特征在于，其为基于权利要求1-8中任一项所述骨组织单元-支架材料复合体构建方法得到的骨组织单元-支架材料复合体。

10.一种如权利要求9所述组织工程骨的应用，其特征在于，所述组织工程骨在制备整形美容材料、骨缺损修复与再生材料上的应用；

其中，整形美容包括面部填充，如额部、下颌角、鼻基底；

骨缺损包括粉碎性骨折、骨不连、骨肿瘤、颅骨、下颌骨损伤。

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