CN115702952A - 基于可注射型水凝胶支架材料构建的可注射骨及其应用 - Google Patents
基于可注射型水凝胶支架材料构建的可注射骨及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115702952A CN115702952A CN202110911484.5A CN202110911484A CN115702952A CN 115702952 A CN115702952 A CN 115702952A CN 202110911484 A CN202110911484 A CN 202110911484A CN 115702952 A CN115702952 A CN 115702952A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- injectable
- hydrogel
- bone
- cells
- injectable hydrogel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 137
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 118
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims abstract description 16
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 28
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 28
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 28
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 26
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 24
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 24
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 24
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 24
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 13
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 11
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 claims description 10
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 10
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 claims description 10
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 claims description 10
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 9
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 9
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims description 8
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 5
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 5
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 5
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 102000015775 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Human genes 0.000 claims description 4
- 108010024682 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 claims description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 4
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 claims description 4
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 3
- 101710189683 Alkaline protease 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710154562 Alkaline proteinase Proteins 0.000 claims description 2
- 101710170876 Antileukoproteinase Proteins 0.000 claims description 2
- 101100328883 Arabidopsis thaliana COL1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 101710112538 C-C motif chemokine 27 Proteins 0.000 claims description 2
- 208000024779 Comminuted Fractures Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015371 Mandibular injury Diseases 0.000 claims description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 239000005312 bioglass Substances 0.000 claims description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 claims description 2
- 229920003172 poly (isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 claims description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- -1 boric acid ester Chemical class 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 abstract description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 abstract description 3
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 8
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 5
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 5
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 5
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M methacrylate group Chemical group C(C(=C)C)(=O)[O-] CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 3
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 3
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- OQILSTRGJVCFAG-UHFFFAOYSA-N 1-(oxiran-2-ylmethoxy)butan-1-ol Chemical compound CCCC(O)OCC1CO1 OQILSTRGJVCFAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Chemical compound CC(C)(O)C(=O)C1=CC=C(OCCO)C=C1 GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101100328884 Caenorhabditis elegans sqt-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L Fast green FCF Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC(O)=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001086210 Homo sapiens Osteocalcin Proteins 0.000 description 2
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000436 Poly(lactide-co-glycolide)-block-poly(ethylene glycol)-block-poly(lactide-co-glycolide) Polymers 0.000 description 2
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- SWRGUMCEJHQWEE-UHFFFAOYSA-N ethanedihydrazide Chemical compound NNC(=O)C(=O)NN SWRGUMCEJHQWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940093476 ethylene glycol Drugs 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229940071826 hydroxyethyl cellulose Drugs 0.000 description 2
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229940071676 hydroxypropylcellulose Drugs 0.000 description 2
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 2
- DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N methacrylic anhydride Chemical compound CC(=C)C(=O)OC(=O)C(C)=C DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229960002900 methylcellulose Drugs 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N phenylboronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=CC=C1 HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 2
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 description 2
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000002639 bone cement Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- OQORATGQIWQZBQ-UHFFFAOYSA-L dilithium phosphonato-(2,4,6-trimethyl-3-phenylphenyl)methanone Chemical compound C1(=CC=CC=C1)C=1C(=C(C(=O)P([O-])([O-])=O)C(=CC=1C)C)C.[Li+].[Li+] OQORATGQIWQZBQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000004821 effect on bone Effects 0.000 description 1
- 238000010556 emulsion polymerization method Methods 0.000 description 1
- 238000007720 emulsion polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 210000004373 mandible Anatomy 0.000 description 1
- 238000003701 mechanical milling Methods 0.000 description 1
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明涉及基于可注射型水凝胶支架材料构建的可注射骨及其应用。将成骨分化潜力的细胞包裹于可注射型水凝胶材料，在体外通过一定的培养方式培养一段时间，即可获得相对成熟的基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨。本发明还提供基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨在整形美容、骨缺损修复与再生领域的应用。本发明技术中，水凝胶材料给细胞提供了优异的三维培养环境，结合相应的组织培养技术，能够形成成熟、稳定的组织工程骨；可注射型水凝胶作为支架材料负载成骨细胞或干细胞，能够实现组织工程骨的可注射，用于骨缺损的微创修复；结合药物、生物活性物质制备的可注射型水凝胶支架材料，可以达到缓释效果，进一步促进骨组织再生与骨融合。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程领域，尤其是涉及一种基于可注射型水凝胶支架材料构建的可注射骨及其应用。
背景技术
当前，临床上骨缺损的传统治疗方案是自体骨或异体骨移植，因为自体骨或异体骨的骨诱导、骨生成作用被认为是植骨融合的金标准。但是，自体骨的供体十分有限，异体骨又面临免疫排异反应的问题。因此，临床上通常采用生物材料来替代治疗，例如骨水泥、生物陶瓷、生物可降解复合材料、组织工程骨等。目前，市场上的生物材料通常需要开放式手术进行材料的植入修复，这就大大增加了病人的痛苦以及手术难度。
随着微创技术的发展，结合可注射型支架材料的组织工程骨为骨缺损的微创修复与组织再生提供了技术可能。在众多可注射型支架材料中，水凝胶材料以其高度含水、合适的力学强度，是组织工程与再生医学领域最为理想的支架材料。简而言之，可注射型水凝胶是将具有一定流动性的水凝胶植入缺损部位，因此很容易填充满整个不规则形状的区域，并且手术创伤较小。另一方面，随着组织工程技术的发展，骨组织工程构建策略已经能够基本获得成熟、稳定的组织工程骨，并用于骨缺损的修复，但是还未能实现可注射骨的构建与临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于可注射型水凝胶支架材料构建的可注射骨及其应用。
具体而言，本发明基于可注射型水凝胶微创修复及组织工程骨构建的技术优势，具体提供基于可注射型水凝胶支架材料构建可注射骨的方法，及其制备的可注射骨及其应用
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供可注射型水凝胶支架材料的制备方法。
本发明中，所述可注射型水凝胶支架材料包括温敏性水凝胶、光敏性水凝胶、动态共价键交联水凝胶、微凝胶等各类水凝胶材料。
所述可注射型水凝胶支架材料可以负载细胞或生物活性物质，并可以通过注射的方式将负载细胞或生物活性物质的水凝胶递送至指定部位，并实现微创修复。
在本发明的一个实施方式中，所述温敏性水凝胶可以在人体温度37℃左右通过溶胶-凝胶的转变实现原位水凝胶的制备，从而可以将室温下的溶胶状水凝胶注射至指定部位，并在体内温度下实现凝胶化。
在本发明的一个实施方式中，所述温敏性水凝胶包括合成高分子材料或天然高分子材料构建的水凝胶。所述温敏性合成高分子材料包括聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)，普朗尼克F-127，聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的嵌段共聚物(PEO-PPO-PEO)、聚乳酸-羟基乙酸和聚乙二醇的嵌段共聚物(PLGA-PEG-PLGA)、聚乙二醇和聚乳酸的嵌段共聚物(PEG-PLLA-PEG)、聚己内酯和聚乙二醇的嵌段共聚物(PCL-PEG-PCL)。所述温敏性天然高分子材料包括透明质酸、壳聚糖、纤维素、海藻酸、胶原、明胶及其改性高分子材料。
在本发明的一个实施方式中，所述温敏性水凝胶优选为PNIPAAm、PLGA-PEG-PLGA、壳聚糖。
在本发明的一个实施方式中，所述光敏性水凝胶可以在光照下通过光化学反应交联实现凝胶化。具体操作方式可以在注射过程中边注射边光照，或者可以先注射后光照，或者也可以先光照后注射。在本发明的一个实施方式中，所述光敏性水凝胶优选为边注射边光照的操作方式。
在本发明的一个实施方式中，所述光敏性水凝胶是通过光引发聚合交联反应制备，即光引发剂在光源照射下生成的自由基，引发含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物上双键官能团的聚合反应，从而制备光敏性水凝胶。
在本发明的一个实施方式中，光敏性水凝胶可实现的实施方式：将含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物和光引发剂溶于生物相容性介质，配成一定浓度的水凝胶前体溶液，在254nm-450nm(优选为365nm或405nm)波长的光源照射下，即可获得光敏性水凝胶。
所述含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物的制备方法：将含羟基或胺基的水溶性高分子溶于去离子水，冷却至0-4℃，加入甲基丙烯酸酐，再缓慢滴加5M NaOH，反应24h，然后将反应液倒入透析袋中，用去离子水透析2-3d，然后冷冻干燥，即可得到所述的含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物。
上述含羟基或胺基的多糖类(如：透明质酸、海藻酸、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、葡聚糖、硫酸软骨素等)、含羟基或胺基的蛋白或多肽类(如：明胶等)，优选为透明质酸、明胶、海藻酸、羧甲基纤维素、硫酸软骨素，进一步优选为透明质酸、明胶。
上述光敏性水凝胶可实现的实施方式中，用于构建光敏性水凝胶材料的光引发剂可以选用I 2959(2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)或LAP(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)。
在本发明的一个实施方式中，所述动态共价键交联水凝胶是由水溶性高分子通过动态共价键交联形成水凝胶，由于动态共价键赋予水凝胶剪切变稀的特性，能够易于该类水凝胶注射使用。
在本发明的一个实施方式中，所述水溶性高分子选自天然多糖类高分子或天然蛋白类高分子。所述天然多糖类高分子包括透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐。所述天然蛋白类高分子包括各种亲水或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白、明胶、多肽。优选为透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、明胶、
在本发明的一个实施方式中，所述动态共价键交联水凝胶的交联方式包括硼酸酯键、席夫碱键、二硫键、巯基-醛基反应、狄尔斯-阿尔德反应等。
在本发明的一个实施方式中，所述动态共价键交联水凝胶优选为硼酸酯键、席夫碱键、巯基-醛基反应交联形成的水凝胶。
在本发明的一个实施方式中，所述微凝胶是指通过一定技术手段将水凝胶制备成微米尺寸范围内的凝胶。由于制备的微凝胶尺寸较小，往往小于注射器的内径，易于实现水凝胶的可注射。
在本发明的一个实施方式中，所述微凝胶构建的技术手段包括机械研磨法、乳液聚合法、微流控技术、自组装、喷雾法等。优选为机械研磨法、乳液聚合法、微流控技术。
在本发明的一个实施方式中，所述用于微凝胶构建的水凝胶材料，可以选自天然多糖类或天然蛋白类高分子构建的水凝胶材料。所述天然多糖类高分子包括透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐。所述天然蛋白类高分子包括各种亲水或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白、明胶、多肽。优选为透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、明胶。
在本发明的一个实施方式中，所述微凝胶的尺寸可以为1μm-1mm，优选为100μm-500μm。
在本发明的一个实施方式中，微凝胶制备可实现的实施方式：将透明质酸溶于去离子水，加入交联剂搅拌反应，然后将交联透明质酸倒入透析袋中，用去离子水透析2-3d，除去多余的交联剂，通过机械研磨的方式制备交联透明质酸的微凝胶，然后冷冻干燥，并筛选合适尺寸的微颗粒，即可得到所述的交联透明质酸微凝胶。
上述交联剂可以选用BDDE(丁二醇缩水甘油醚)，DVS(二乙烯基砜)，ADH(乙二酸二酰肼)，EDC(碳二亚胺)，GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)。进一步优选为BDDE或DVS交联剂。
在本发明的一个实施方式中，微凝胶制备可实现的实施方式：将水凝胶前体溶液作为连续相(水相)，以质量比为8:2的液体石蜡和司盘80的混合溶液作为分散相(油相)。利用注射泵将水相和油相从不同的通道注射到微流控芯片中，在两相交汇处，水相被油相剪切得到单乳液液滴，然后在管道中继续被向前推进，通过交联反应形成微凝胶，并收集至烧杯中。然后冷冻干燥，并筛选合适尺寸的微颗粒，即可得到所述的微凝胶。
上述水凝胶可以选用透明质酸、羧甲基纤维素、海藻酸、葡聚糖、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、羧甲基壳聚糖、胶原蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白、明胶、多肽。优选为透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、明胶。
上述交联反应可以选用化学交联或光交联，所述化学交联包括括叠氮-炔点击反应、巯基-迈克尔加成反应、酰胺缩合反应、席夫碱反应、狄尔斯-阿尔德反应等。所述光交联是指在光源照射下生成的自由基，引发含甲基丙烯酸酯基的高分子衍生物上双键官能团的聚合反应。
本发明中，所述可注射型水凝胶支架材料可以添加或不添加成骨活性成分。
在本发明的一个实施方式中，所述可注射型水凝胶支架材料添加有成骨活性成分。所述成骨活性成分能够有效促进水凝胶负载的成骨细胞或干细胞的成骨分化，或者刺激内源性干细胞的成骨分化，进一步提高再生骨组织的成熟度。
在本发明的一个实施方式中，所述成骨活性成分包括生物活性的无机材料或生物活性因子。
在本发明的一个实施方式中，所述生物活性的无机材料包括羟基磷灰石、磷酸钙、碳酸钙、生物玻璃、脱钙骨基质等。在本发明的一个实施方式中，所述生物活性因子包括BMP-2～BMP-9(骨形态发生蛋白)、VEGF、TGFβ等。
在本发明的一个实施方式中，所述成骨活性成分优选为羟基磷灰石、脱钙骨基质、BMP-2。
本发明还提供基于上述方法得到的可注射型水凝胶支架材料。
本发明的第二个目的是提供一种基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法。
在本发明的一个实施方式中，基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法包括：将成骨分化潜力的细胞包裹于本发明第一个目的提供的可注射型水凝胶材料，即可获得基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨。
在本发明的一个实施方式中，基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法包括：将成骨分化潜力的细胞包裹于本发明第一个目的提供的可注射型水凝胶材料，在体外通过一定的培养方式培养一段时间，即可获得相对成熟的基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨。
在本发明的一个实施方式中，所述成骨分化潜力的细胞选自成骨细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或胚胎干细胞等，优选为成骨细胞或间充质干细胞。
在本发明的一个实施方式中，体外培养方式为：体外诱导分化、培养方式。可选择静态培养或动态培养，静态培养方式即将包裹细胞的水凝胶放置于培养皿中培养，动态培养方式即将包裹细胞的水凝胶放置于生物反应器中搅拌或加压培养，以促进水凝胶中的营养物质交换。经过所述体外诱导分化、培养后得到相对成熟的基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨。
在本发明的一个实施方式中，所述培养时间为1周-24周，优选为4周-8周。
在本发明的一个实施方式中，所述相对成熟的基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨包括以下生物学与组织学特征：ALP，RUNX2，COL1基因达到正常骨组织基因水平的10％-30％。
在本发明的一个实施方式中，所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的可实现的实施方式：将温敏性壳聚糖溶于生物相容性介质，配置一定浓度的水凝胶前体溶液，并包裹成骨细胞，于37℃下制备壳聚糖水凝胶，通过静态培养的方式于培养皿中培养2周，即可获得相对成熟的可注射骨。
在本发明的一个实施方式中，所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的可实现的实施方式：将标记硼酸酯的透明质酸溶于生物相容性介质，配置一定浓度的水凝胶前体溶液，加入羟基磷灰石作为成骨活性成分，混合聚乙烯醇制备可注射型水凝胶材料，并包裹干细胞，通过生物反应器加压培养2周，即可获得相对成熟的可注射骨。
在本发明的一个实施方式中，所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的可实现的实施方式：通过机械研磨法制备BDDE交联的透明质酸微凝胶，加入BMP-2作为成骨活性成分，并包裹干细胞，即可获得即用型可注射骨。
在本发明的一个实施方式中，所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的可实现的实施方式：将标记双键官能团的明胶溶于生物相容性介质，配置一定浓度的水凝胶前体溶液，加入脱钙骨基质作为成骨活性成分，通过微流控技术在光照下(365nm)制备明胶微凝胶，并包裹干细胞，即可获得即用型可注射骨。
在本发明的一个实施方式中，所述生物相容性介质选自蒸馏水、生理盐水、缓冲液或细胞培养基溶液。根据不同的应用，可选取不同的生物相容性介质。
在本发明的一个实施方式中，所述一定浓度的水凝胶前体溶液可以为0.1％w/v-60％w/v，优选为1％w/v-20％w/v。
本发明基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的原理：水凝胶材料给细胞提供三维的培养环境，结合体外生物反应器培养，能够有效改善水凝胶内的营养物质交换，为细胞构建合适的三维培养体系。同时，水凝胶内负载的成骨活性成分能够诱导细胞向成骨方向分化、增殖，经过一段时间培养，成骨分化潜力的细胞逐渐分化为成熟的成骨细胞，并且分泌出丰富的细胞外基质，最终形成成熟的骨组织。另外，选用可注射型水凝胶材料能够实现组织工程骨的可注射使用，从而对于骨缺损实施微创填充(图1所示)。因此，运用本发明提供的方法基本可以通过可注射型水凝胶材料包裹成骨分化潜力的细胞构建可注射骨。
本发明的第三个目的是提供基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法获得的基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨。
本发明的第四个目的是提供基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨的应用。
本发明提供了基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨在整形美容、骨缺损修复与再生领域的应用。
具体而言，所述基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨在制备整形美容材料、骨缺损修复与再生材料上的应用。
其中，整形美容包括面部填充，如额部、下颌角、鼻基底。
骨缺损包括粉碎性骨折、骨不连、骨肿瘤、颅骨、下颌骨损伤。
相较于传统的骨组织工程修复策略，本发明提供的可注射骨具有如下优势：
1)水凝胶材料给细胞提供了优异的三维培养环境，结合相应的组织培养技术，能够形成成熟、稳定的组织工程骨；
2)可注射型水凝胶作为支架材料负载成骨细胞或干细胞，能够实现组织工程骨的可注射，用于骨缺损的微创修复；
3)结合药物、生物活性物质制备的可注射型水凝胶支架材料，可以达到缓释效果，进一步促进骨组织再生与骨融合。
附图说明
图1为基于微凝胶支架材料构建可注射骨的方法示意图。
图2为微流控技术制备微凝胶材料的原理图。
图3为明胶微凝胶材料的显微镜直观图和粒径分布图。
图4为明胶微凝胶材料负载细胞的活死细胞染色图。
图5为可注射骨体外诱导2周后的PCR图。
图6为可注射骨体内培养4周后的组织学图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例一：基于温敏性壳聚糖的可注射型水凝胶支架材料构建可注射骨
从兔子骨髓分离骨髓干细胞，常规分离培养扩增，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×106/mL，包裹于10％w/v壳聚糖水凝胶前体溶液，于37℃下制备壳聚糖水凝胶，并通过静态培养的方式，于成骨诱导培养基中，放入培养皿中培养2周，即可得到可注射骨。
实施例二：基于负载羟基磷灰石硼酸动态交联的可注射型水凝胶支架材料构建可注射骨
硼酸透明质酸(HA-BP)的合成：将透明质酸(2g，340kDa)溶于100mL蒸馏水中至完全溶解，将苯硼酸(BP，0.1g)溶于5mL蒸馏水中，然后缓慢滴加上述溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.1g)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.1g)，于室温下搅拌反应12h。反应结束后，将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到HA-BP(1.78g)。
负载羟基磷灰石硼酸动态交联水凝胶构建：分别配置10％w/v的HA-BP溶液和10％w/v聚乙烯醇(PVP)，并加入0.5％w/v的羟基磷灰石，然后等比例混合，即可制备负载羟基磷灰石硼酸动态交联水凝胶。
可注射骨构建：从兔子骨髓分离骨髓干细胞，常规分离培养扩增，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×106/mL，包裹于上述负载羟基磷灰石硼酸动态交联水凝胶支架材料，于离心管中孵育24小时后，细胞可以在水凝胶内生长。然后，转移至搅拌型生物反应器中，放入培养箱中，于成骨诱导培养基中，继续搅拌培养4周，即可得到可注射骨。
实施例三：基于负载BMP-2交联透明质酸的可注射型水凝胶支架材料构建可注射骨
负载BMP-2交联透明质酸微凝胶构建：将透明质酸(2g，340kDa)溶于100mL去离子水，加入0.1ng BMP-2生长因子，然后加入0.1g BDDE(丁二醇缩水甘油醚)，并缓慢滴加0.1mL 1M NaOH溶液，继续搅拌反应5h，然后将交联透明质酸倒入透析袋中，用去离子水透析2-3d，除去多余的交联剂，通过机械研磨的方式制备交联透明质酸的微凝胶，然后冷冻干燥，并筛选100μm微颗粒，即可得到交联透明质酸微凝胶支架材料。
可注射骨构建：从兔子骨髓分离骨髓干细胞，常规分离培养扩增，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×106/mL，接种于上述负载BMP-2交联透明质酸微凝胶支架材料，于离心管中孵育24小时后，细胞可以铺展于微凝胶表面。然后，转移至搅拌型生物反应器中，放入培养箱中，于成骨诱导培养基中，继续搅拌培养4周，即可得到可注射骨。
实施例四：基于负载脱钙骨基质光敏明胶微凝胶的可注射型水凝胶支架材料构建可注射骨
甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)的合成：将明胶(1g)溶于10mL PBS(pH＝7.4)中，加热至50℃搅拌至完全溶解，加入0.5mL甲基丙烯酸酐，反应2-3h，反应后用40mL PBS稀释反应液，然后倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酸酯化明胶(0.9g)。根据核磁氢谱图，可计算出双键的含量大约为75％。
负载脱钙骨基质光敏明胶微凝胶构建：配置10％w/v的GelMA溶液(含0.2％w/vLAP光引发剂)和0.5％w/v脱钙骨基质作为连续相(水相)，以质量比为8:2的液体石蜡和司盘80的混合溶液作为分散相(油相)。利用注射泵将水相和油相从不同的通道注射到微流控芯片中，在两相交汇处，水相被油相剪切得到单乳液液滴，然后在管道中继续被向前推进，通过光照(365nm)，交联形成微凝胶，并收集至烧杯中(图2所示)。然后冷冻干燥，并筛选100μm微颗粒，即可得到明胶微凝胶支架材料(图3所示)。
可注射骨构建：从兔子骨髓分离骨髓干细胞，常规分离培养扩增，传代培养至第二代或第三代，收集并调节细胞悬液终浓度为10×106/mL，接种于上述负载脱钙骨基质光敏明胶微凝胶支架材料，于离心管中孵育24小时后，细胞可以铺展于微凝胶表面(图4所示)。然后，转移至搅拌型生物反应器中，放入培养箱中，于成骨诱导培养基中，继续搅拌培养4周，即可得到可注射骨(图5所示)。
实施例五：可注射骨的生物学评价
体外培养4周后，取材，进行大体观、组织学、q-PCR定量等骨再生指标体外检测。实验结果表明，可注射骨经培养后呈现白色的外观，逐渐表现为骨样组织。组织学上可以观察到成骨细胞在支架材料上聚集，并分泌出细胞外基质，固绿、Masson和ALP组织学呈现特异性染色(图6所示)。q-PCR的基因定量数据表明Col1，RUNX2和OCN的表达达到正常软骨组织的60％。
实施例六：可注射骨应用于皮下骨再生
采用裸鼠，按实施例四构建成熟的可注射骨，将其注射至裸鼠背部皮下，在体内培养4周，通过静脉注射空气的方法处死实验中的裸鼠，并取样对实验修复效果进行评价。实验结果表明，经体内培养后，再生骨组织呈现白色的外观，逐渐表现为成熟的骨样组织。组织学上可以观察到支架材料逐渐降解，并逐渐被再生骨组织取代，固绿、Masson和ALP组织学呈现特异性染色，q-PCR的基因定量数据表明Col1，RUNX2和OCN的表达达到正常骨组织水平的90％。
实施例七：可注射骨应用于兔子颅骨缺损修复
采用新西兰雄性大白兔，每只兔子均在颅骨处制造直径为10mm的骨缺损。实验前按体重随机分组(每组4只)：1.可注射骨修复组；2.不做处理的空白组。手术过程中，首先按实施例四构建成熟的可注射骨，然后将其填充至缺损部位。在手术3月后，通过静脉注射空气的方法处死实验中的兔子，并取样对实验修复效果进行评价。实验结果表明，使用可注射骨处理的缺损部位取得了完全的骨修复，而对照组中骨缺损部位没有得到任何修复。因此，该类可注射骨对骨缺损有很好的骨修复效果。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法，其特征在于，将成骨分化潜力的细胞包裹于可注射型水凝胶材料，即获得基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨；
所述可注射型水凝胶支架材料包括温敏性水凝胶、光敏性水凝胶、动态共价键交联水凝胶、微凝胶；
所述温敏性水凝胶是能够通过溶胶-凝胶的转变实现原位水凝胶制备的水凝胶；
所述光敏性水凝胶是通过光引发聚合交联反应制备的水凝胶；
所述动态共价键交联水凝胶是由水溶性高分子通过动态共价键交联形成水凝胶；
所述微凝胶是指将水凝胶制备成微米尺寸范围内的凝胶。
2.根据权利要求1所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法，其特征在于，所述温敏性水凝胶包括合成高分子材料或天然高分子材料构建的水凝胶，所述温敏性合成高分子材料包括聚异丙基丙烯酰胺、普朗尼克F-127、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的嵌段共聚物、聚乳酸-羟基乙酸和聚乙二醇的嵌段共聚物、聚乙二醇和聚乳酸的嵌段共聚物、聚己内酯和聚乙二醇的嵌段共聚物；
所述温敏性天然高分子材料包括透明质酸、壳聚糖、纤维素、海藻酸、胶原、明胶及其改性高分子材料。
3.根据权利要求1所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法，其特征在于，所述动态共价键交联水凝胶是由水溶性高分子通过动态共价键交联形成水凝胶；
所述动态共价键交联水凝胶的交联方式包括硼酸酯键、席夫碱键、二硫键、巯基-醛基反应、狄尔斯-阿尔德反应。
4.根据权利要求1所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法，其特征在于，所述可注射型水凝胶支架材料添加有成骨活性成分；
所述成骨活性成分包括生物活性的无机材料或生物活性因子；
所述生物活性的无机材料包括羟基磷灰石、磷酸钙、碳酸钙、生物玻璃、脱钙骨基质；所述生物活性因子包括BMP-2～BMP-9、VEGF、TGFβ。
5.根据权利要求1所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法，其特征在于，所述成骨分化潜力的细胞选自成骨细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或胚胎干细胞等，优选为成骨细胞或间充质干细胞。
6.根据权利要求1所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法，其特征在于，将成骨分化潜力的细胞包裹于可注射型水凝胶材料，在体外培养一段时间，即获得相对成熟的基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨；
所述相对成熟的基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨包括以下生物学与组织学特征：ALP，RUNX2，COL1基因达到正常骨组织基因水平的10％-30％。
7.根据权利要求1所述基于可注射型水凝胶材料构建可注射骨的方法，其特征在于，选择以下方法中的一种：
将温敏性壳聚糖溶于生物相容性介质，配置一定浓度的水凝胶前体溶液，并包裹成骨细胞，制备壳聚糖水凝胶，通过静态培养的方式于培养皿中培养，即获得相对成熟的可注射骨；或，
将标记硼酸酯的透明质酸溶于生物相容性介质，配置水凝胶前体溶液，加入羟基磷灰石作为成骨活性成分，混合聚乙烯醇制备可注射型水凝胶材料，并包裹干细胞，通过生物反应器加压培养，即获得相对成熟的可注射骨；或，
通过机械研磨法制备BDDE交联的透明质酸微凝胶，加入BMP-2作为成骨活性成分，并包裹干细胞，即获得即用型可注射骨；或，
将标记双键官能团的明胶溶于生物相容性介质，配置水凝胶前体溶液，加入脱钙骨基质作为成骨活性成分，通过微流控技术在光照下制备明胶微凝胶，并包裹干细胞，即获得即用型可注射骨。
8.基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨，其特征在于，采用权利要求1-7中任一项所述方法制备得到。
9.权利要求8所述基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨的应用，其特征在于，所述基于可注射型水凝胶材料构建的可注射骨在制备整形美容材料、骨缺损修复与再生材料上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，整形美容包括面部填充，如额部、下颌角、鼻基底；骨缺损包括粉碎性骨折、骨不连、骨肿瘤、颅骨、下颌骨损伤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110911484.5A CN115702952A (zh) | 2021-08-10 | 2021-08-10 | 基于可注射型水凝胶支架材料构建的可注射骨及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110911484.5A CN115702952A (zh) | 2021-08-10 | 2021-08-10 | 基于可注射型水凝胶支架材料构建的可注射骨及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115702952A true CN115702952A (zh) | 2023-02-17 |
Family
ID=85180026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110911484.5A Pending CN115702952A (zh) | 2021-08-10 | 2021-08-10 | 基于可注射型水凝胶支架材料构建的可注射骨及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115702952A (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1923298A (zh) * | 2005-09-02 | 2007-03-07 | 南方医院 | 注射型组织工程骨修复材料及其构建方法 |
| US20120034271A1 (en) * | 2008-10-16 | 2012-02-09 | Bioregen Biomedical (Changzhou) Co., Ltd | Injectable in-situ crosslinked hydrogel and methods of making and using thereof |
| US20130236971A1 (en) * | 2011-06-23 | 2013-09-12 | Indian Institute Of Technology Kanpur | Hydrogel scaffolds for tissue engineering |
| CN110721340A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-01-24 | 南方医科大学 | 一种交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法和用途 |
| CN111303459A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-06-19 | 华南理工大学 | 一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法 |
| CN111588913A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-08-28 | 四川大学 | 一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂及其应用 |
| CN112062981A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-12-11 | 华南理工大学 | 一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法 |
| CN113024730A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-06-25 | 浙江大学 | 一种用于骨修复的可注射复合壳聚糖水凝胶的制备及使用方法 |
| WO2021127807A1 (en) * | 2019-12-23 | 2021-07-01 | Evonik Industries Ag | Dual-crosslinked hydrogel and preparation method thereof |
| CN113181434A (zh) * | 2021-04-07 | 2021-07-30 | 江南大学 | 一种修复骨缺损的水凝胶微球及其制备方法 |
-
2021
- 2021-08-10 CN CN202110911484.5A patent/CN115702952A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1923298A (zh) * | 2005-09-02 | 2007-03-07 | 南方医院 | 注射型组织工程骨修复材料及其构建方法 |
| US20120034271A1 (en) * | 2008-10-16 | 2012-02-09 | Bioregen Biomedical (Changzhou) Co., Ltd | Injectable in-situ crosslinked hydrogel and methods of making and using thereof |
| US20130236971A1 (en) * | 2011-06-23 | 2013-09-12 | Indian Institute Of Technology Kanpur | Hydrogel scaffolds for tissue engineering |
| CN110721340A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-01-24 | 南方医科大学 | 一种交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法和用途 |
| WO2021127807A1 (en) * | 2019-12-23 | 2021-07-01 | Evonik Industries Ag | Dual-crosslinked hydrogel and preparation method thereof |
| CN111303459A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-06-19 | 华南理工大学 | 一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法 |
| CN111588913A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-08-28 | 四川大学 | 一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂及其应用 |
| CN112062981A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-12-11 | 华南理工大学 | 一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法 |
| CN113024730A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-06-25 | 浙江大学 | 一种用于骨修复的可注射复合壳聚糖水凝胶的制备及使用方法 |
| CN113181434A (zh) * | 2021-04-07 | 2021-07-30 | 江南大学 | 一种修复骨缺损的水凝胶微球及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 伍津津主编: "《皮肤组织工程学》", vol. 1, 30 June 2009, 山东科学技术出版社, pages: 306 - 237 * |
| 王成焘等: "《数字骨科学基础》", 山东科学技术出版社, pages: 236 - 237 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bai et al. | Bioactive hydrogels for bone regeneration | |
| Xiao et al. | Gelatin methacrylate (GelMA)-based hydrogels for cell transplantation: an effective strategy for tissue engineering | |
| Peng et al. | Characterization of a novel polyvinyl alcohol/chitosan porous hydrogel combined with bone marrow mesenchymal stem cells and its application in articular cartilage repair | |
| Taghipour et al. | The application of hydrogels based on natural polymers for tissue engineering | |
| Lee et al. | Alginate: properties and biomedical applications | |
| Hao et al. | Large-sized bone defect repair by combining a decalcified bone matrix framework and bone regeneration units based on photo-crosslinkable osteogenic microgels | |
| Venkatesan et al. | Alginate composites for bone tissue engineering: A review | |
| US6991652B2 (en) | Tissue engineering composite | |
| Burdick et al. | Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering | |
| US8778333B2 (en) | Injectable microspheres for tissue construction | |
| US8137696B2 (en) | Biomimetic composition reinforced by a polyelectrolytic complex of hyaluronic acid and chitosan | |
| US20060149392A1 (en) | Biomaterials for guided tissue regeneration and drug delivery | |
| CN101084025A (zh) | 多孔生物材料－填充物复合物及其制造方法 | |
| CN101934095B (zh) | 一种可注射强化型磷石灰/水凝胶微囊组织工程骨及其制备方法和应用 | |
| CN110743038B (zh) | 一种双网络结构复合水凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN115475283B (zh) | 基于水凝胶材料构建的组织工程骨及其制备方法与应用 | |
| Deptuła et al. | Application of 3D-printed hydrogels in wound healing and regenerative medicine | |
| CN111407921A (zh) | 一种医用水凝胶敷料、其制备方法及应用 | |
| Kong et al. | Personalized hydrogels for individual health care: Preparation, features, and applications in tissue engineering | |
| CN113577381A (zh) | 基于微凝胶支架材料构建的可注射软骨及其应用 | |
| Kesharwani et al. | Tissue regeneration properties of hydrogels derived from biological macromolecules: A review | |
| EP1267955B1 (en) | Injectable microspheres for tissue construction | |
| CN115475281A (zh) | 组织工程软骨-骨复合体及其构建方法与应用 | |
| CN102327643B (zh) | 一种用于骨组织再生的生物支架 | |
| CN115282339B (zh) | 一种交联透明质酸/羟基磷灰石可注射材料、制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |