CN110743038B - 一种双网络结构复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双网络结构复合水凝胶，明胶纳米胶体颗粒在静电相互作用和氢键作用下形成第一重胶体凝胶网络，iPRF中的纤维蛋白原在凝血酶作用下形成纤维蛋白第二重凝胶网络；本发明的双网络结构复合水凝胶，采用无抗凝药物加入新鲜血液样本，血液可来自受植入患者自体或异体，经低速离心操作，取顶层全部黄色液体，快速与明胶颗粒干粉共混，注射入模具成型或注射在组织缺损部位实现组织填充，在室温或体温下等待不超过2000秒而完全固化，得到双网络结构、增强、增韧的水凝胶生物医用材料。本发明制备方法简便，利于临床推广，双网络结构复合水凝胶是用于人体组织器官缺损重建的充填修复、再生的理想可注射、可塑形生物医用材料。

Description

一种双网络结构复合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体为一种双网络结构复合水凝胶医用材料及其制备方法和应用。
背景技术
实现人体组织/器官的损伤修复是临床医学中的关键难题。然而，目前临床上治疗人体组织/器官修复手段仍以自体组织、同种异体组织或异种组织为主。以骨修复为例，临床上骨修复的“黄金”治疗标准是患者自体骨移植填充。由于自体组织/器官无免疫排斥，且通常具有良好的血管化，因此修复效果显著。例如，对骨缺损最佳的临床骨修复方案是从患者自体的髂骨部位取骨移植到骨缺损病患部位；这一方案尽管临床修复效果好，但缺陷也显而易见：1)造成患者二次创伤、增加痛苦，2)供体有限、对于较大的骨缺损无法满足修复需求。因此，同种异体甚至异种异体的组织/器官移植成为临床组织修复治疗的次优选择。例如来自美国Stryker的
Figure BDA0002262613020000011
骨修复填充材料就是来源于小牛骨。然而，这类骨修复材料同样存在诸多问题难以解决：1)供体有限，2)异体组织/器官移植后受体自身免疫排斥显著，需要对患者免疫系统进行药物压制，存在造成患者多种并发症和其他器官损伤，3)同种、异种组织移植过程潜在疾病传播的问题，4)异种、异体组织/器官的去免疫原处理、储存、质量控制体系构建的难题。
近年来，以人工材料、生物工程技术、细胞治疗技术、药物控释技术为手段，以辅助、修复和替代人体受创伤或疾病导致的组织/器官缺损为目标的再生医学领域研究飞速发展，为人类组织器官修复再生开辟了新路径。其中，组织工程技术是再生医学领域的重要分支，其结合人工生物材料、生物活性因子(生长因子、细胞因子、多肽、siRNA等)、以及多分化功能的干细胞或特定组织分化的功能性细胞，通过工程方法结合并构建具有功能性的组织/器官，最终移植体内用于组织修复再生。然而经过三十年的发展，组织工程技术的实质性临床应用仍然凤毛麟角，其中关键挑战主要包括：1)缺乏全面替代人体组织细胞外基质的、仿生细胞外微环境的人工生物材料体系，2)生物活性因子的量化生产困难、缺乏可缓控释蛋白药物因子的载体材料、活性蛋白治疗效果以外的副作用(异位成骨、肿瘤等)难以克服，3)干细胞体内的分化难以控制、细胞来源有限、异体细胞的免疫排斥、细胞提取扩增到移植治疗周期和临床质量控制体系难建立。
生物材料是组织工程的基础，其功能是作为细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)，同时作为生物信号分子的载体，通过不断向生理组织环境中释放这些因子而控制和调节细胞的功能和行为，以最终实现组织的修复。然而，传统的组织工程支架材料在再生医学应用过程中远不能满足组织修复重建的需求。关键难题包括：1)支架材料缺乏可控的降解速度；2)无法可控释放生物因子药物，已有研究结果表明：直接将生长因子混入块体支架往往在植入初期产生爆释而对组织修复产生微弱的效果，或因释放过量而产生骨组织的增生；3)临床造作困难，缺乏可注射和可塑性、难以用于微创手术(Minimally invasivesurgery)；4)难以为加载的细胞提供理想的细胞外微环境、保证细胞的活性和功能性。
水凝胶是作为目前研究细胞微环境最广泛应用的基质材料，典型水凝胶由亲水性高分子组成，与天然ECM相似富含水，允许生物大分子通过多孔凝胶网络扩散传播，且水凝胶可通过交联度调控硬度，易于化学改性和修饰，因此在组织工程和药物控释领域也是最重要的生物材料之一。典型的水凝胶可通过高分子间键合形成稳定的宏观结构和强度，形成纳米多孔网络将细胞三维包裹其中，并为细胞提供可贴附、铺展、迁移和增殖的平台。并且对于化学交联水凝胶，细胞可通过与水凝胶预聚体(或单体)水溶液共混、再引发化学交联/聚合实现细胞三维固载。然而问题仍然存在：1)通常化学交联水凝胶需引入化学反应实现凝胶固化，而化学反应通常具有细胞毒性，造成包埋后细胞存活率降低；2)对于临床应用，尽管预聚体/细胞共混水溶液具有流动性、可注射，然而水凝胶固化过程的化学反应往往具有显著细胞毒性；3)而对于物理交联水凝胶(如胶原)，由于凝胶网络基于弱的物理键合形成，尽管生物相容性好，但形成的水凝胶力学性能差(例如，胶原水凝胶最大弹性模量Emax～1kPa)，难以进行临床应用；4)药物控释能力差，美敦力
Figure BDA0002262613020000021
是临床上骨科用于骨修复的常用的载生长因子(BMP-2)的胶原支架材料，但由于胶原支架缺乏对蛋白因子的控释能力，初期植入后因子暴释严重，因此需要加大蛋白药物的加载量来实现骨诱导作用，因此成本高、骨诱导性能也有限。因此，开发良好生物相容性、力学强度更优、可注射、可塑性、可实现蛋白因子药物的缓控释的新型水凝胶体系对临床组织器官修复再生具有革命性意义。
在组织修复过程中，组织修复再生过程经历血凝块形成、炎症期、组织再生几个复杂的生物过程，其中可诱导细胞聚集、增值、分化的生物活性信号因子在组织修复过程中的作用至关重要。尤其对于生长周期缓慢的骨、软骨组织而言，骨缺损部位周围生长因子的长期存在可加速催化骨缺损的修复再生。然而，骨缺损初期形成的血凝块，尽管富含多种成血管、成骨生长因子，但由于血凝块很快降解吸收，难以持续在缺损部位提供生物活性的因子药物诱导骨生长。
而活性蛋白因子在时间、空间的表达对组织再生有重要的诱导作用。因此，生长因子的可控递释是组织工程实现组织修复再生的重要技术挑战。例如，大量生长因子在骨再生过程中发挥着调控作用，且一些生长因子(如BMP-2,BMP-7,VEGF,FGF-2等)在临床前研究中呈现出了巨大的应用潜力。近年来，大量的工作是将生长因子与生物材料结合，期望通过生长因子的释放长期诱导骨组织生长。典型的例子包括美国Medtronic(美敦力)公司和Stryker公司分别开发的基于胶原海绵材料为载体的载BMP-2(骨形态发生蛋白-2，bonemorphogenic protein-2，一种骨诱导生长因子)和BMP-7的骨组织修复生物材料载体。尤其是Medtronic的
Figure BDA0002262613020000022
产品，尽管在骨修复再生领域取得巨大临床成功，但该产品技术是直接将生长因子快速水溶，然后与预成型的胶原支架材料共混，生长因子仅靠表面吸附加载在载体材料的表面，生长因子加载效率低，且蛋白因子随材料植入后快速暴释，无法在修复区域实现生长因子的上期缓释，因此该产品需用远高于生理水平的生长因子来刺激骨诱导，增加产品成本、且远大于生理水平的生长因子造成异位成骨等副作用。此外，生物活性蛋白类药物因子与材料共混时易发生构象变化失活，且在体内易被酶解，往往需要较大剂量来达到治疗效果，这往往又会引起毒副作用产生。
总之，生长因子在临床治疗过程中被证明仍存在诸多问题，包括其体内易失活，存在副作用和安全因素等，因此仍难以实现成功临床转化应用。例如，VEGF具有强力的促进血管新生的作用，但其也可能引起系统性低血压和水肿。BMP-2则存在血液内降解失活极快，并有报道异位成骨及肿瘤发生的风险。更重要的是，生长因子作为生物活性药物，其生产成本高，储存、使用过程中都存在诸多应用难题。目前，关于缓控释系统对生长因子释放这一治疗策略的瓶颈在于：1.载体不佳的缓控释能力及突释出超生理剂量生长因子的局部应用所带来的副作用；2.外源性生长因子高昂的价格和不稳定的治疗效果。因此，急需保持蛋白活性、实现蛋白药物缓控释的载体材料。
基于上述因素的考虑，有学者建议使用以富血小板血浆(PRP)、浓缩生长因子(PRF)或富血小板纤维蛋白(CGF)为代表的自体浓缩血液制品及其衍生物作为骨及其他组织修复的移植及替代材料。以上的血液制品通过高速离心从患者自身血液中分离，制备简单，成本低廉。同时含有多种高浓度的生长因子及趋化因子，利于组织修复，并且不会发生免疫排斥反应。然而单独应用血液制品及其衍生物作为骨缺损的填充及替代材料，其治疗效果尚存在争议。首先，血液制品机械性能较差，难以达到维持空间的效果；其次，凝胶类血液制品在体内降解吸收过快，难以在缺损部位稳定保持；此外，血液制品类凝胶的过快降解吸收带来生长因子突释的现象，从而导致难以预估的副作用。上述因素皆可能造成骨缺损充填修复后预后的不确定性。此外，有部分学者通过向血液制品及其衍生物，如PRP中加入其他生物材料，以期达到增强其机械性能并调控因子缓释而促进组织愈合的目的。以上策略确实增强了机械性能和加速了骨及软骨的愈合。然而上述材料依然存在以下缺陷：1、PRP中含有抗凝血剂等外源性添加剂，其再生潜能受到局限；2、所得材料力学强度较差，且不具有可注射性，操作复杂，难以精准量化。
近年，Choukroun J将低速离心概念引入到PRF配方中，而获得了可注射、浓缩生长因子(简称iPRF)的新型血液制品。这种新型血液制品同PRF一样不含有任何外源性添加剂，且含有大量血小板、纤维蛋白及各种生长因子和趋化因子等。iPRF由于其可注射性和富集的生长因子，已被用于骨及软骨组织的再生和修复。然而，该材料依然存在机械性能差、体内降解快等缺点。值得注意的是，在低速离心的情况下，iPRF中富含的血小板只有小部分被激活，因此可以保持溶胶态约15分钟，随着血小板脱颗粒和凝血酶的激活作用，其内的纤维蛋白原发生自交联，形成凝胶态的纤维蛋白－血小板复合物。这一溶胶－凝胶态的相转化特性使iPRF与其他生物材料的联合使用成为可能。然而，iPRF在植入后降解周期短，其中所含诱导再生的生长因子成分也很快降解失活，因此尽管iPRF具有良好的生物活性和诱导再生功能，但仍难以实现长期、可控的因子释放、诱导再生效果有限。综上所述，如果将iPRF中的生物活性因子与可控递释载体材料结合，必将对组织修复再生有推动作用。
发明内容
为解决上述现有技术中的缺陷，本发明提供一种高强度、可注射、可塑形、具有生物活性的双网络结构复合水凝胶医用材料及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶，所述复合水凝胶为基于明胶纳米胶体颗粒和血液提取物可注射血小板富集纤维蛋白iPRF形成的具有双重网络微观结构的水凝胶；其中，明胶纳米胶体颗粒在物理作用下形成具有自修复效应的第一重胶体水凝胶网络，可注射血小板富集纤维蛋白iPRF形成第二重纤维蛋白水凝胶网络，两重凝胶网络间以静电作用、氢键作用、疏水作用物理交联形成。
上述技术方案中，所述可注射血小板富集纤维蛋白iPRF为来自自体、同种异体或异种异体的血液提取物。
上述技术方案中，所述明胶纳米胶体颗粒尺寸在纳米到亚微米尺度，粒径为10nm-2μm。
上述技术方案中，所述明胶纳米胶体颗粒粒径为10nm-500nm。
上述技术方案中，所述明胶纳米胶体颗粒表面电荷为-40～40mV。
本发明第二方面提供了一种明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：
取新鲜血液样本离心1～10min，转速50～1000g，离心分层后的顶层黄色透明液体即为血液提取物可注射血小板富集纤维蛋白iPRF，迅速将上层黄色透明液体与明胶纳米胶体颗粒充分混匀，固化后即得所述明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶；或
将明胶纳米胶体颗粒加入新鲜血液样本中，并放入离心机中离心1～10min，转速50～1000g，离心分层后的顶层棕黄色胶体即为所述明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶；
其中，明胶胶体颗粒的体积分数φ为φ＝0.0.5～1；
明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶固化的时间为10～2000秒，其中，可注射、可塑形的时间窗口为<500秒。
上述技术方案中，所述明胶纳米胶体颗粒可以是明胶纳米颗粒的冻干粉或明胶纳米胶体在水溶液中的分散液中的一种或两种的组合。
本发明第三方面提供了一种明胶纳米颗粒-纤维蛋白双网络结构复合水凝胶，所述双网络结构复合水凝胶为基于明胶纳米胶体颗粒和纤维蛋白形成的具有双重网络微观结构的水凝胶；其中，明胶纳米胶体颗粒在物理作用下形成第一重胶体水凝胶网络，纤维蛋白原在凝血酶作用下形成第二重纤维蛋白水凝胶网络，两重凝胶网络间以静电作用、氢键作用和疏水作用物理交联形成。
本发明第四方面提供了一种明胶纳米颗粒-纤维蛋白双网络结构复合水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤；
将纤维蛋白原和凝血酶分别溶解于水性溶液得到纤维蛋白原水溶液或凝血酶水溶液，上述溶液与明胶纳米胶体颗粒充分混合均匀，固化后得到明胶纳米颗粒-纤维蛋白双网络水凝胶；其中，可以先将明胶纳米胶体颗粒与纤维蛋白原水溶液混合之后，再加入凝血酶；或明胶纳米胶体颗粒先与凝血酶混合后，再与纤维蛋白原混合；纤维蛋白原，凝血酶和明胶纳米胶体颗粒三者完全混合之后纤维蛋白原网络的凝胶化时间为5～20秒；
其中，纤维蛋白原的浓度为0.1-10wt％，凝血酶的浓度为5-500U/mL；明胶纳米胶体颗粒的体积分数为φ＝0.05～1；
以上技术方案中，所述明胶纳米胶体颗粒通过反溶剂法(相分离)或者乳液法制备明胶颗粒，并经过化学交联反应得到稳定的明胶胶体颗粒。
进一步地，所述明胶颗粒的交联度范围：当交联反应是基于明胶氨基基团时，交联反应体系中交联剂与明胶中氨基基团的摩尔比0.1～10；当交联反应是基于明胶羧基基团时，交联反应体系中交联剂与明胶中氨基基团的摩尔比0.1～10；当交联反应是基于明胶羟基基团时，交联反应体系中交联剂与明胶中氨基基团的摩尔比0.1～10；当交联反应是基于明胶中的氨基和羧基基团时，交联剂与氨基基团的摩尔比为0.1～10。
本发明第五方面提供了前述双网络结构复合水凝胶在组织工程支架材料中的应用，所述应用为用于组织修复填充。
具体的，用于牙周引导组织再生或骨组织、软骨组织、肌肉、血管组织缺损的修复填充。
进一步地，当用于人体组织创伤修复填充材料时，所述双网络结构复合水凝胶中可以混合有羟基磷灰石、磷酸钙、生物活性陶瓷、生物活性玻璃、脱细胞骨基质等颗粒性骨修复材料。
本发明第六方面提供了前述双网络结构复合水凝胶在止血制品中的应用，所述应用为用于体表组织、体腔内组织器官的有血创面的止血、防黏连、防感染、促进组织愈合和/或封闭伤口。
进一步地，上述止血制品的应用中，所述双网络水凝胶可以混合有促凝血成分的颗粒或药物分子。
进一步地，上述第五方面和第六方面的应用中，所述双网络水凝胶中可以混合有生物活性物质、生物活性蛋白药物、活细胞颗粒或药物分子中的一种或几种的组合。
本发明第七方面提供了前述双网络结构复合水凝胶在三维细胞培养支架或加在细胞的3D生物打印墨水材料中的应用，用于组织/器官的3D生物打印；所述双网络结构复合水凝胶中加入1～100mmol抗凝剂，打印之后浸泡于含Ca+水性溶液中。
本发明的明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶，明胶颗粒的粒径小于2μm，尤其优选10nm-500nm直径的胶体颗粒，颗粒间存在较强的非共价键作用(例如静电作用、氢键作用、疏水作用等)，因此可在水相溶液中自组装形成由明胶纳米颗粒组装而成的凝胶网络结构，并作为双网络水凝胶体系的第一重网络；双重网络水凝胶中的第二重网络是有血液提取物可注射血小板富集纤维蛋白(Injectable platelet-rich fibrin，简称iPRF)中的纤维蛋白形成的共价键交联的凝胶网络。
由于明胶纳米胶体颗粒间的非共价键作用具有“可逆性”，使得第一重胶体水凝胶网络在受剪切力作用时发生剪切变稀行为，而当外力取消后胶体凝胶网络可重新自组装恢复胶体网络结构，因此表现出快速自修复的效应。正是这些动态的“可逆键”构成的胶体网络，可在明胶纳米颗粒-iPRF双网络水凝胶体系受较高压力或者拉力作用时，通过“可逆键”动态的断裂和重建实现对外力产生的破坏能量的吸收和耗散，使得明胶纳米颗粒/iPRF双网络水凝胶的力学强度显著提高。
现有报道中记载了一种由纤维蛋白原，凝血酶，透明质酸和明胶微球和生长因子复合而成的水凝胶产物。在这一体系中，明胶微球尺寸在微米级初度的微米级颗粒，由于颗粒尺寸大、在重力作用下难以实现布朗运动且易沉淀，仅仅依靠颗粒间物理相互作用难以实现如此大尺寸明胶微球颗粒的自组装；因此明胶颗粒仅仅是不连续的分散在连续的水凝胶网络中，而无法形成连续相的胶体网络，也无法形成由胶体网络和高分子水凝胶网络形成的双网络结构。因此，不能显著提高所得复合水凝胶的力学强度。
本发明有益效果：
1.双网络的凝胶结构赋予水凝胶增强、增韧的效果：
本发明的明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构水凝胶体系中明胶纳米颗粒形成连续的胶体网络，而不是仅分散在连续相的纤维蛋白网络中，因此双网络水凝胶力学强度提高是呈数量级的增加。与单纯iPRF构成的水凝胶压缩弹性模量仅有0.9kPa相比，双网络水凝胶的压缩弹性模量大于30kPa，是iPRF形成的水凝胶的30倍；并且与单纯明胶纳米颗粒构成的胶体水凝胶相比，双网络水凝胶弹性模量是其3倍。同时，双网络水凝胶的拉伸屈服应变大于50％，与单纯iPRF类似，但是单纯明胶纳米颗粒构成的胶体水凝胶的5倍。
2.明胶纳米胶体颗粒构成的凝胶网络赋予双网络水凝胶可注射、可塑性的特点：
基于明胶胶体凝胶剪切变稀，自修复的力学特征，以及iPRF凝胶过程需要时间窗口的性质，本发明双网络水凝胶混合后，具有可注射，可打印、可塑形的优异性能，当到达时间窗口后，水凝胶中iPRF网络自动形成。这在临床应用上具有极大的便利性。双网络互穿结构使得明胶/iPRF复合水凝胶具有更加优异的机械性能，拓展此前基于iPRF和明胶体系生物材料的应用范围。
3.明胶纳米颗粒/iPRF双网络水凝胶具有生物活性，可诱导组织再生：
本发明双网络水凝胶较传统块体材料的水凝胶或多孔支架具有更优的蛋白药物加载和缓释效果，因为本发明的明胶胶体凝胶生物材料，因其微纳米尺度的粒径而具有高比表面积，且明胶高分子链有大量带电荷基团而易与蛋白药物形成静电吸附，同时明胶胶体颗粒是微纳米粒径的水凝胶多空网络，蛋白因子易渗透入凝胶网络中而实现缓释；同时，本发明中所述血液提取物iPRF与明胶微球所构建的双网络水凝胶，利用血液中富集的多种生长因子的特点，可直接提取自患者自身静脉血，因而可显著降低使用外源性或重组蛋白生长因子的高成本、及使用外源性蛋白药物潜在的免疫排斥问题；由动物实验也证实，明胶纳米颗粒/iPRF双网络水凝胶在骨再生和血管再生方面都具有显著的疗效。
4.本发明所得的双网络结构、增强、增韧水凝胶生物医用材料制备方法简便，利于临床推广，是用于人体组织器官缺损重建的充填修复、再生的理想可注射、可塑形生物医用材料，可作为可注射材料用于人体组织/器官修复填充、可注射止血凝胶、促血管修复再生材料、骨、软骨、脂肪、肌肉等组织修复再生的植入材料领域。
附图说明
图1是本发明双网络结构复合水凝胶形成的示意图；
图2是实施例2和对比例1，对比例2中的水凝胶储能模量随时间变化曲线；
图3是对比例1和实施例1中水凝胶内部结构的扫描电子显微镜图片；
图4是实施例11中明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶，对比例2中冻干明胶纳米颗粒粉末，对比例3中质量分数为2％的纤维蛋白网络的扫描电镜图片；
图5是实施例27中iPRF/明胶颗粒双网络水凝胶的可注射性和可塑性示意图；
图6a是实施例28和对比例4,5中水凝胶的压缩应力应变曲线，图6b是实施例29和对比例6,7中水凝胶的拉伸应力应变曲线；
图7是实施例30中水凝胶的共聚焦图片；
图8a是实施例31和对比例8,9中水凝胶的压缩应力应变曲线，图8b是实施例32和对比例10,11中水凝胶的拉伸应力应变曲线；
图9是实施例33和对比例12中水凝胶的生长因子释放曲线；
图10是实施例34和对比例13,14中上颌窦提升手术示意图；
图11是实施例34和对比例13,14中使用MicroCT对所做动物标本进行检测，对数据进行3d重建，4w其中浅灰色为种植体，深灰色为原始密质骨，绿色为新骨；
图12是实施例35中，裸鼠皮下植入大体图，并对成血管的数量，总面积和平均面积进行成血管性能的分析；
图13是实施例36中水凝胶的注射至小鼠股动脉的止血实验；图A是股动脉出血后图片，图B是注射水凝胶止血图片，图C是水凝胶注射之后损伤部位图片；
图14是实施例37中3D生物打印水凝胶支架的光学图片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
调控明胶纳米颗粒尺寸
实施例1
(1)明胶颗粒的制备
5g明胶溶解在100mL去离子水溶液中，并保持加热到40℃，得到澄清透明的明胶水溶液，滴加盐酸将溶液pH值调节至2.5，分别将200,300,350mL的丙酮溶液滴加至上述明胶水溶液中并保持加热40℃和持续搅拌(1000rpm)，滴加总时间为20min，向上述纳米颗粒悬液中加入74μL的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联时间12hrs，待反应结束后，向混合物中加入100mM浓度的甘氨酸，终止未反应完全的戊二醛的端基。将纳米颗粒悬浮液反复离心和在去离子水中重悬。将悬浊液在-60℃下冷冻干燥，得到明胶纳米颗粒干粉。
通过纳米粒度仪测试明胶颗粒的颗粒尺寸和表面电荷。可以发现通过调控丙酮的加入量可以控制明胶颗粒的表面电荷和颗粒尺寸。
表1
200mL丙酮 300mL丙酮 350mL丙酮
颗粒尺寸 200nm 500nm 1000nm
表面电荷 +8.5mV +8.7mV +8.1mV
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下：1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张；3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)放入离心机(300g，3分钟)中离心，抽取上清1ml得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF1 mL与0.1g明胶纳米颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，均得到双网络水凝胶；
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表2)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1Hz，应变为0.5％。在相同质量分数的条件下可以看到，明胶颗粒尺寸的增加导致双网络水凝胶的储能模量(即力学强度)降低。其中水凝胶结构通过扫描电镜观察，如图2所示：
表2
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 1.4kPa 1.2kPa 0.9kPa
损耗模量 0.24kPa 0.18kPa 0.12kPa
图1是本发明双网络结构复合水凝胶形成的示意图；图中粉色颗粒是明胶胶体网络，黄色线条为纤维蛋白网络，胶体网络与纤维蛋白网络间存在相互作用。
对比例1iPRF
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下。1)使用兔固定架固定新西兰兔。2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张。3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml。4)放入离心机(300g，3分钟)中离心，抽取上清1ml得到iPRF，将iPRF放置30min，得到iPRF凝胶。
iPRF的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到(表3)，其中频率为1HZ，应变为0.5％。其中其储能模量随时间变化的关系如图1所示，单纯的由iPRF形成的凝胶强度低，储能模量仅为0.11kPa，可注射的时间窗口在500sec。
表3
iPRF
储能模量 0.11kPa
损耗模量 0.01kPa
对比例2
将0.12，2g颗粒尺寸为200nm的A型明胶粉末，与1mL的去离子水溶液混合得到明胶胶体凝胶。
明胶胶体凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到(表4)，其中频率为1HZ，应变为0.5％，其中凝胶的储能模量随时间变化的图像如图2所示，明胶胶体凝胶的扫描电镜结构图片如图3所示。
表4
12％明胶粉末 20％明胶粉末
储能模量 0.8kPa 9.7kPa
损耗模量 0.09kPa 0.5kPa
通过对实施例1中的双网络水凝胶和对比例1，对比例3中明胶纳米颗粒胶体凝胶力学的储能模量对比发现，双网络水凝水凝胶的强度明显高于单纯的iPRF和明胶纳米颗粒水凝胶。
图2是实施例2和对比例1，对比例2中的水凝胶储能模量随时间变化曲线，由图可以看出通过储能模量的变化评估成胶过程发现，双网络水凝胶在500sec内具有可注射性，2000s凝胶过程趋于稳定。
对比例3
将0.005，2g纤维蛋白原溶于1mL水性溶液中得浓度为0.5,2wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶与上述水溶液充分混匀，得到纤维蛋白原水凝胶材料。
纤维蛋白原水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到(表5)，其中频率为1HZ，应变为0.5％。由表格可知，不同浓度的纤维蛋白原凝胶的力学强度均较弱。
表5
0.5％纤维蛋白原 2％纤维蛋白原
储能模量 0.04kPa 0.14kPa
损耗模量 0.064kPa 0.04kPa
实施例2
(1)使用实施例1中颗粒直径分别为200，500，1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下：1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张；3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)放入离心机(300g，3分钟)中离心，抽取上清1ml得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF 1mL与0.12g明胶纳米颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到双网络水凝胶；
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表6)其中双网络水凝胶模量随时间的变化如图2所示。
表6
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 9.4kPa 8.9kPa 8.1kPa
损耗模量 0.7kPa 0.7kPa 0.6kPa
实施例3
(1)使用实施例1中颗粒直径分别为200，500，1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下：1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张；3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)放入离心机(300g，3分钟)中离心，抽取上清1ml得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF1 mL与0.15g明胶纳米颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到双网络水凝胶；。
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表7)
表7
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 15.2kPa 14.5kPa 11.3kPa
损耗模量 0.9kPa 0.8kPa 0.8kPa
实施例4
(1)使用实施例1中颗粒直径分别为200，500，1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下；1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张；3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)放入离心机(300g，3分钟)中离心，抽取上清1ml得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF1 mL与0.2g明胶纳米颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到双网络水凝胶；
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表8)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。
表8
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 25.3kPa 21.6kPa 19.3kPa
损耗模量 1.7kPa 1.6kPa 1.5kPa
实施例5
(1)明胶颗粒的制备
5g明胶(B型)溶解在100mL去离子水溶液中，并保持加热到40℃，得到澄清透明的明胶水溶液，滴加盐酸将溶液pH值调节至2.5，分别将220，310，370mL的丙酮溶液滴加至上述明胶水溶液中并保持加热40℃和持续搅拌(1000rpm)，滴加总时间为20min，向上述纳米颗粒悬液中加入74μL的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联时间12hrs，待反应结束后，向混合物中加入100mM浓度的甘氨酸，终止未反应完全的戊二醛的端基。将纳米颗粒悬浮液反复离心和在去离子水中重悬。将悬浊液在-60℃下冷冻干燥，得到明胶纳米颗粒干粉。
通过纳米粒度仪测试明胶颗粒的颗粒尺寸和表面电荷。(表9)，通过使用B型明胶，并且调整丙酮加入量可以得到表面电荷为负的不同尺寸的明胶纳米颗粒。
表9
220mL丙酮 310mL丙酮 370mL丙酮
颗粒尺寸 200nm 500nm 1000nm
表面电荷 -15.5mV -14.1mV -16mV
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下：1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张；3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)放入离心机(300g，3分钟)中离心，抽取上清1ml得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF1 mL与0.1g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到双网络水凝胶；
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表10)
表10
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 1.6kPa 1.5kPa 1.1kPa
损耗模量 0.24kPa 0.13kPa 0.14kPa
实施例6
(1)使用实施例5中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的负电荷明胶颗粒粉末。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下：1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张；3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)放入离心机(300g，3分钟)中离心，抽取上清1ml得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF1 mL与0.12g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到双网络水凝胶；。
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表11)
表11
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 8.7kPa 9.6kPa 11.5kPa
损耗模量 1.7kPa 1.6kPa 1.5kPa
实施例7
(1)使用实施例5中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的负电荷明胶颗粒粉末。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下：1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张；3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)放入离心机(300g，3分钟)中离心，抽取上清1ml得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF1 mL与0.15g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到双网络水凝胶；。
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表12)
表12
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 15.7kPa 14.6kPa 12.5kPa
损耗模量 1.9kPa 1.8kPa 1.5kPa
实施例8
(1)使用实施例5中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的负电荷明胶颗粒粉末。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下：1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张；3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)放入离心机(300g，3分钟)中离心，抽取上清1ml得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF1 mL与0.2g明胶颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次，得到双网络水凝胶；
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表13)
表13
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 27.7kPa 24.6kPa 22.5kPa
损耗模量 2.9kPa 1.9kPa 2.1kPa
实施例9
(1)使用实施例1中尺寸为200nm，表面电荷为+8mV的A型明胶颗粒和实施例5中尺寸为200nm，表面电荷为-15mV的B型明胶颗粒。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下。1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张；3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)将0.1g明胶粉末加入含有全血的采血管中，并放入离心机(300g，3分钟)中离心，上层得到双网络水凝胶。
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表14)相同质量分数的正电荷微球形成的双网络水凝胶的力学强度略高于由负电荷组成的双网络水凝胶。
表14
明胶A型颗粒 明胶B型颗粒
储能模量 1.9kPa 1.6kPa
损耗模量 0.2kPa 0.2kPa
实施例10
(1)使用实施例1中尺寸为200nm，表面电荷为+8.5mV的A型明胶颗粒和实施例5中表面电荷为-15.5mV的B型明胶颗粒。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下：1)使用兔固定架固定新西兰兔；2)去除兔耳中动脉周围的兔毛，并揉搓使耳中动脉充分扩张。3)使用采血针及离心管从耳中动脉采血7ml；4)将0.2g明胶粉末加入含有全血的采血管中，并放入离心机(300g，3分钟)中离心，上层得到双网络水凝胶。
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表15)
表15
明胶A型颗粒 明胶B型颗粒
储能模量 29.6kPa 26.9kPa
损耗模量 3.2kPa 1.9kPa
实施例11
(1)明胶纳米颗粒制备
使用实施例1中颗粒直径分别为200，500，1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，50U/mL的凝血酶和0.1g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与1mL上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表16)
表16
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 1.7kPa 1.6kPa 1.5kPa
损耗模量 0.3kPa 0.2kPa 0.2kPa
纤维蛋白原双网络水凝胶的储能模量与对比例2，3中单独的纤维蛋白原水凝胶和明胶胶体凝胶相比，有明显的提高。由图4的扫描电镜图观察得到纤维蛋白网络显示出高度多孔但连接的结构。
实施例12
(1)明胶纳米颗粒制备
使用实施例1中颗粒直径分别为200，500，1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶和0.12g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表17)
表17
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 9.7kPa 8.6kPa 8.5kPa
损耗模量 1.7kPa 1.6kPa 1.5kPa
实施例13
(1)明胶纳米颗粒制备
使用实施例1中颗粒直径分别为200，500，1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶和0.15g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表18)
表18
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 11.7kPa 9.6kPa 8.8kPa
损耗模量 1.2kPa 1.0kPa 1.1kPa
实施例14
(1)明胶纳米颗粒制备
使用实施例1中颗粒直径分别为200，500，1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶和0.2g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表19)
表19
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 28.7kPa 24.6kPa 19.5kPa
损耗模量 1.9kPa 1.8kPa 1.6kPa
实施例15
(1)使用实施例5中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的负电荷B型明胶颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶和0.12g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表20)
表20
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 8.7kPa 9.6kPa 11.5kPa
损耗模量 1.7kPa 1.6kPa 1.5kPa
实施例16
(1)使用实施例5中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的负电荷明胶B型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶和0.12g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表21)
表21
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 8.4kPa 7.6kPa 7.5kPa
损耗模量 1.4kPa 1.3kPa 1.3kPa
实施例17
(1)使用实施例5中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的负电荷明胶B型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶和0.15g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表22)
表22
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 11.7kPa 10.6kPa 9.5kPa
损耗模量 1.7kPa 1.6kPa 1.5kPa
实施例18
(1)使用实施例1中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的负电荷明胶B型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶和0.2g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表23)
表23
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 23.7kPa 19.6kPa 16.5kPa
损耗模量 2.7kPa 2.6kPa 2.5kPa
实施例19
(1)使用实施例1中制备的颗粒直径分别为200,500,1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将100U/mL的凝血酶和0.12g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表24)
表24
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 9.7kPa 9.6kPa 9.0.kPa
损耗模量 1.7kPa 1.6kPa 1.5kPa
实施例20
(1)使用实施例7中制备的颗粒直径分别为200,500,1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将100U/mL的凝血酶和0.2g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表25)
表25
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 26.7kPa 26.0kPa 21.5kPa
损耗模量 1.9kPa 1.9kPa 1.8kPa
实施例21
(1)使用实施例7中制备的颗粒直径分别为200,500,1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为2wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶和0.12g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％(表26)
表26
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 8.0kPa 7.6kPa 7.5kPa
损耗模量 0.7kPa 0.6kPa 0.6kPa
实施例22
(1)使用实施例7中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的正电荷明胶A型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为2wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶加入上述水溶液，之后立即将0.2g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表27)
表27
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 25.9kPa 24.6kPa 22.5kPa
损耗模量 2.7kPa 2.6kPa 2.5kPa
实施例23
(1)使用实施例7中制备的颗粒直径分别为200,500,1000nm的负电荷明胶B型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将100U/mL的凝血酶和0.12g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表28)
表28
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 8.7kPa 9.6kPa 11.5kPa
损耗模量 1.7kPa 1.6kPa 1.5kPa
实施例24
(1)使用实施例7中制备的颗粒直径分别为200,500,1000nm的负电荷明胶B型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为0.5wt％的水溶液，将100U/mL的凝血酶和0.2g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表29)
表29
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 25,9.7kPa 24.8.6kPa 22.8.5kPa
损耗模量 1.9kPa 1.6kPa 1.5kPa
实施例25
(1)使用实施例7中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的负电荷明胶B型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为2wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶和0.12g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与1mL上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表30)
表30
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 7.9.7kPa 7.9.6 kPa 7.5kPa
损耗模量 1.2kPa 1.3kPa 1.0kPa
实施例26
(1)使用实施例7中制备的颗粒直径分别为200，500，1000nm的负电荷明胶B型颗粒粉末。
(2)双网络明胶纳米颗粒/纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白原溶于水性溶液中得浓度为2wt％的水溶液，将50U/mL的凝血酶加入上述水溶液，之后立即将0.2g明胶胶体颗粒干粉通过注射器与上述水溶液充分混匀，即得到可注射、增强、增韧、双网络的水凝胶材料；
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表31)
表31
200nm明胶颗粒 500nm明胶颗粒 1000nm明胶颗粒
储能模量 27.7kPa 25.6kPa 19.5kPa
损耗模量 2.7kPa 2.6kPa 2.5kPa
实施例27
使用实施例1-36中得到的双网络水凝胶混合后进行可注射和可塑性分析，双网络水凝胶加入注射器后，使用普通医用注射器进行注射实验，以实施例4为例，图5光学照片显示以上双网络水凝胶具有可注射的性能，并且能够成型成心型，三角型等任意形状显示出良好的可塑性。
实施例28
使用实施例1-16中制备的双网络水凝胶，通过三维打印模具中成胶得到标准圆柱样品(直径：12mm，高：8mm)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以1mm/min的变形速度对水凝胶进行压缩试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。以实施例4中的双网络水凝胶为例，图6a中粉色曲线表示压缩应力应变曲线。
对比例4
使用对比例1中制备的iPRF，通过三维打印模具中成胶得到标准圆柱样品(直径：12mm，高：8mm)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以1mm/min的变形速度对水凝胶进行压缩试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。图6a中绿曲线表示压缩应力应变曲线。
对比例5
使用实施例1中制备的尺寸为200nm的明胶A型颗粒(0.2g/mL)通过三维打印模具中成胶得到标准圆柱样品(直径：12mm，高：8mm)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以1mm/min的变形速度对水凝胶进行压缩试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。图6a中蓝色曲线表示压缩应力应变曲线。
图6a中粉色曲线表示压缩应力应变曲线。与对比例4,5中的绿色和蓝色曲线相比，双网络水凝胶比单组分的iPRF胶和明胶胶体凝胶具有更强的力学性能，以及具有更大的压缩断裂能，更适合植入在承力的组织，器官缺损中应用。
实施例29
使用实施例1-16中制备的双网络水凝胶，通过三维打印模具中成胶得到标准单轴拉伸测试样条(根据ISO 527-2标准的5B型设计)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以50mm/min的变形速度对水凝胶进行拉伸试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。以实施例4中的双网络水凝胶为例，图4b中粉色曲线表示压缩应力应变曲线。对于拉伸力学测试，与压缩测试具有类似现象，双网络水凝胶具有更大的压缩断裂能，表现出更好的力学性能。
对比例6
使用对比例1中制备的iPRF，通过三维打印模具中成胶得到标准单轴拉伸测试样条(根据ISO 527-2标准的5B型设计)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以50mm/min的变形速度对水凝胶进行拉伸试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。图6b中绿曲线表示压缩应力应变曲线。
对比例7
使用实施例4中的200nm粒径的明胶纳米颗粒(0.2g/mL)通过三维打印模具中成胶得到标准单轴拉伸测试样条(根据ISO 527-2标准的5B型设计)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以50mm/min的变形速度对水凝胶进行拉伸试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。图6b中蓝色曲线表示压缩应力应变曲线。
图6b中粉色曲线表示拉伸应力应变曲线。与对比例4,5中的绿色和蓝色曲线相比，双网络水凝胶比单组分的iPRF胶和明胶胶体凝胶具有更强的力学性能，以及具有更大的拉伸断裂能，更适合植入在承力的组织，器官缺损中应用。
实施例30
荧光共聚焦成像观察聚合过程
使用实施例1-36中制备的明胶颗粒0.1g溶解在10mL去离子水中，加入0.01g异氰酸酯基罗丹明粉末，并在40℃共混搅拌12小时。之后反复离心(8000rpm，10min)并用去离子水重悬，得到荧光标记的明胶颗粒，分散在pH＝6的Hepes缓冲液中。。
将0.5g纤维蛋白原溶解在20mL的生理盐水中，并加入0.05g异氰酸酯基荧光素后在37℃条件下搅拌12h。得到的反应溶液在截留分子量为3.5kDa的透析袋中透析1天。通过失重法计算荧光标记纤维蛋白原溶液的质量分数。
10mg/mL罗丹明标记明胶纳米颗粒和1mg/mL的荧光素标记标记纤维蛋白原与2U/mL的凝血酶共混1分钟之后，通过激光共聚焦显微镜实时监测纤维网络和胶体网络的组装最终结构。
以实施例1中表面电荷为+8.5mV，颗粒尺寸为200nm的明胶颗粒为例，网络组装之后结构如图7所示，可以看到清晰纤维蛋白网络(绿色)和明胶颗粒网络(红色)。与单一的明胶或者纤维蛋白原网络相比，形成的网络结构的链长和链厚度明显增加，两重网络具有重合性，这说明明胶纳米颗粒和纤维蛋白原之间存在静电作用和氢键作用为主的内聚相互作用，这也表明了双网络直接存在相互作用而不是简单两相共混。
实施例31
使用实施例17-36中制备的双网络水凝胶，通过三维打印模具中成胶得到标准圆柱样品(直径：12mm，高：8mm)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以1mm/min的变形速度对水凝胶进行压缩试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。以实施例20中的双网络水凝胶为例，图8a中粉色曲线表示压缩应力应变曲线。
对比例8
使用对比例4中制备的纤维蛋白原水凝胶，通过三维打印模具中成胶得到标准圆柱样品(直径：12mm，高：8mm)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以1mm/min的变形速度对水凝胶进行压缩试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。图8a中绿色曲线表示压缩应力应变曲线。
对比例9
使用200nm粒径的明胶纳米颗粒(0.2g/mL)通过三维打印模具中成胶得到标准圆柱样品(直径：12mm，高：8mm)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以1mm/min的变形速度对水凝胶进行压缩试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。图8a中蓝色曲线表示压缩应力应变曲线。
图8a中粉色曲线表示双网络水凝胶的压缩应力应变曲线。与对比例4,5中的绿色和蓝色曲线相比，双网络水凝胶比单组分的iPRF胶和明胶胶体凝胶具有更强的力学性能，以及具有更大的压缩断裂能，更适合植入在承力的组织，器官缺损中应用。
实施例32
使用实施例17-36中制备的双网络水凝胶，通过三维打印模具中成胶得到标准单轴拉伸测试样条(根据ISO 527-2标准的5B型设计)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以50mm/min的变形速度对水凝胶进行拉伸试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。以实施例20中的双网络水凝胶为例，图8b中粉色曲线表示压缩应力应变曲线。
对比例10
使用对比例4中制备的纤维蛋白原水凝胶，通过三维打印模具中成胶得到标准单轴拉伸测试样条(根据ISO 527-2标准的5B型设计)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以50mm/min的变形速度对水凝胶进行拉伸试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。图8b中绿曲线表示压缩应力应变曲线。
对比例11
使用实施例4中的200nm粒径的明胶纳米颗粒(0.2g/mL)通过三维打印模具中成胶得到标准单轴拉伸测试样条(根据ISO 527-2标准的5B型设计)。并使用配备有50N测力传感器的万能试验机以50mm/min的变形速度对水凝胶进行拉伸试验，测试过程环境湿度大于60％，以防止水凝胶干燥。图8b中蓝色曲线表示压缩应力应变曲线。
图8b中粉色曲线表示双网络水凝胶的拉伸应力应变曲线。与对比例4,5中的绿色和蓝色曲线相比，双网络水凝胶比单组分的纤维蛋白胶和明胶胶体凝胶具有更强的力学性能，以及具有更大的拉伸断裂能，更适合植入在承力的组织，器官缺损中应用。
实施例33
使用实施例1-36中的双网络水凝胶以确定其生长因子释放曲线。以实施例4为例，将两组样品浸泡在磷酸盐缓冲盐水溶液中(PBS，pH＝7.4)并保持37℃环境温度置于振荡器上(30转/分钟)，以模拟体内动态环境。分别在1d，3d，5d，7d，11d，14d和21d吸收1ml PBS上清液，然后加入等量的新鲜PBS。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒在每个时间点检查PDGF-BB，VEGF所有实验一式三份进行，每组三个样品。
如图9所示，经ELISA检测，可注射血小板丰富纤维蛋白凝胶和可注射血小板丰富纤维蛋白/明胶颗粒复合水凝胶中生长因子VEGF及PDGF-BB的释放检测结果显示，第一天iPRF凝胶释放了VEGF总有效载荷的近40％(爆发释放)，剩余的VEGF以浓度递减的方式自iPRF的纤维蛋白网络中释放，最终在第11d其释放完毕。iPRF-明胶双网络水凝胶中中VEGF以一个相对恒定的浓度进行释放，这种均匀的释放在第15天仍能被检测到。PDGF-BB释放趋势与VEGF近似；略有区别的是，iPRF-GNPs组中PDGF-BB持续释放时间(21d)要长于VEGF(11d)。
对比例12生长因子释放
使用对比例1中的iPRF凝胶以确定其生长因子释放曲线。将两组样品浸泡在磷酸盐缓冲盐水溶液中(PBS，pH＝7.4)并保持37℃环境温度置于振荡器上(30转/分钟)，以模拟体内动态环境。分别在1d，3d，5d，7d，11d，14d和21d吸收1ml PBS上清液，然后加入等量的新鲜PBS。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒在每个时间点检查PDGF-BB，VEGF所有实验一式三份进行，每组三个样品。
实施例34
使用3wv％戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉新西兰兔。待兔完全麻醉后，剃除手术区域的兔毛即兔鼻骨上方两侧区域，并使用碘伏与酒精交替清理术区。随后使用2％利多卡因注射于手术术区对其进行局部麻醉。待新西兰兔术区无痛觉后，沿着鼻骨背侧的矢状中线切开，包括皮肤和骨膜的全厚瓣。翻开全厚瓣，暴露出上颌窦的基底骨，随后使用5mm直径的环钻于基底骨上的矢状中线双边制备圆形窗口。小心去除圆形窗口的骨壁以避免损坏施耐德膜，并使用器械谨慎抬起施耐德膜。使用注射器注射0.5ml体积的实施例1中的双网络水凝胶随后小心将特制种植体旋入。待植体拧紧后，逐层缝合骨膜层和皮肤层。(图10)术后常规注射青霉素3天，7天后拆除缝线。分别于2w，4w，8w处死进行影响学分析及组织学分析。
如图11的micro-CT结果显示，实施例1中制备的双网络水凝胶，其中血液来源于兔子自体，骨效果明显好于对比例14中的单纯明胶胶体凝胶。4w时可以看到更致密的骨小梁结构。8w时，iPRF-GNPs组可以观察到板状骨的形成。上述实验结果说明IPRF-GNPs双网络水凝胶可以促进局部区域的骨生成以及骨改建。
对比例13(动物实验成骨，血管)
使用3wv％戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉新西兰兔。待兔完全麻醉后，剃除手术区域的兔毛即兔鼻骨上方两侧区域，并使用碘伏与酒精交替清理术区。随后使用2％利多卡因注射于手术术区对其进行局部麻醉。待新西兰兔术区无痛觉后，沿着鼻骨背侧的矢状中线切开，包括皮肤和骨膜的全厚瓣。翻开全厚瓣，暴露出上颌窦的基底骨，随后使用5mm直径的环钻于基底骨上的矢状中线双边制备圆形窗口。小心去除圆形窗口的骨壁以避免损坏施耐德膜，并使用器械谨慎抬起施耐德膜。其中，不注射任何材料的作为空白组，随后小心将特制种植体旋入。待植体拧紧后，逐层缝合骨膜层和皮肤层。术后常规注射青霉素3天，7天后拆除缝线。分别于2w，4w，8w处死进行影响学分析及组织学分析。
对比例14
使用3wv％戊巴比妥钠(1mL/kg)麻醉新西兰兔。待兔完全麻醉后，剃除手术区域的兔毛即兔鼻骨上方两侧区域，并使用碘伏与酒精交替清理术区。随后使用2％利多卡因注射于手术术区对其进行局部麻醉。待新西兰兔术区无痛觉后，沿着鼻骨背侧的矢状中线切开，包括皮肤和骨膜的全厚瓣。翻开全厚瓣，暴露出上颌窦的基底骨，随后使用5mm直径的环钻于基底骨上的矢状中线双边制备圆形窗口。小心去除圆形窗口的骨壁以避免损坏施耐德膜，并使用器械谨慎抬起施耐德膜。使用注射器注射0.5ml体积的对比例2中200nm的明胶凝胶，随后小心将特制种植体旋入。待植体拧紧后，逐层缝合骨膜层和皮肤层。术后常规注射青霉素3天，7天后拆除缝线。分别于2w，4w，8w处死进行影响学分析及组织学分析。
实施例35
使用四周龄无胸腺裸鼠(来自重庆医科大学动物中心)，使用10％水合氯醛完全麻醉裸鼠，待裸鼠完全麻醉后，使用组织剪剪开裸鼠皮肤，随后使用组织钳钝性分离筋膜层。将体积为50ml的实施例1得到的双网络水凝胶材料，其中血液来自于新西兰兔，并注射于裸鼠筋膜层下，肌肉层上方。使用缝线逐层缝合，注射青霉素。5天后拆线，并于第七天取材，并使用体式显微镜进行拍照。对标本进行如前所示的脱钙包埋切片，并进行H&E染色。对植入部位的组织切片经HE染色后发现，如图12所示相较对比例15,16，可注射血小板丰富纤维蛋白/明胶颗粒水复合凝胶组植入部位可见明显的血管形成。对上述组织进行HE染色切片并进行新生血管的组织计量统计发现新生血管数目、密度和血管直径，可注射血小板丰富纤维蛋白/明胶颗粒复合水凝胶凝胶都优于对比组。上述结果提示可注射血小板丰富纤维蛋白/明胶颗粒凝胶内的血小板源性因子会加速充填部位的早期血管化。
对比例15
使用四周龄无胸腺裸鼠(来自重庆医科大学动物中心)，使用10％水合氯醛完全麻醉裸鼠，待裸鼠完全麻醉后，使用组织剪剪开裸鼠皮肤，随后使用组织钳钝性分离筋膜层。不注射任何材料作为空白组，肌肉层上方。使用缝线逐层缝合，注射青霉素。5天后拆线，并于第七天取材，并使用体式显微镜进行拍照。对标本进行如前所示的脱钙包埋切片，并进行H&E染色。
对比例16
使用四周龄无胸腺裸鼠(来自重庆医科大学动物中心)，使用10％水合氯醛完全麻醉裸鼠，待裸鼠完全麻醉后，使用组织剪剪开裸鼠皮肤，随后使用组织钳钝性分离筋膜层。将体积为50ml的对比例2中颗粒尺寸为200nm的明胶凝胶注射于裸鼠筋膜层下，肌肉层上方。使用缝线逐层缝合，注射青霉素。5天后拆线，并于第七天取材，并使用体式显微镜进行拍照。对标本进行如前所示的脱钙包埋切片，并进行H&E染色。
实施例36
使用实施例1-36中得到的双网络水凝胶，以SD大鼠股动脉伤口缺损作为动物实验模型，制造出直径为10mm的圆形缺损区域，并用手术刀划破股动脉制造出血伤口，使用实施例1中得到的双网络水凝胶注射在出血创面，轻轻压迫30s后，出血点被封闭，止血时间为30s。动物实验过程如图13所示。本发明双网络水凝胶具有止血作用。
实施例37
使用实施例1-36中得到的双网络水凝胶1mL，以实施例11为例，通过加入0.295mg(1mM)的柠檬酸钠阻止纤维蛋白原网络的聚合，在水凝胶具有剪切变稀(即可打印)的条件下，使用三维生物打印机进行打印得到定制化支架，并通过浸泡在10mM的氯化钙溶液中，使纤维蛋白原聚合形成纤维蛋白网络，得到增强，增韧双网络水凝胶支架，支架结构如图14所示。
实施例38
使用实施例1-36中得到的0.1g明胶颗粒和0.1g的羟基磷灰石或者生物活性玻璃混合，再与离心得到的iPRF1mL通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次得到双网络水凝胶。
以实施例1中尺寸为200nm的明胶颗粒为例，上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1HZ，应变为0.5％。(表32)，加入具有促进骨愈合的无机颗粒后，双网络水凝胶的强度也具有提升。
表32
羟基磷灰石 生物活性玻璃
储能模量 4.5kPa 5.1kPa
损耗模量 0.8kPa 0.7kPa

Claims (13)

1.一种明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶为基于明胶纳米胶体颗粒和血液提取物可注射血小板富集纤维蛋白iPRF形成的具有双重网络微观结构的水凝胶；其中，明胶纳米胶体颗粒在物理作用下形成具有自修复效应的第一重胶体水凝胶网络，可注射血小板富集纤维蛋白iPRF形成第二重纤维蛋白水凝胶网络，两重凝胶网络间以静电作用、氢键作用、疏水作用物理交联形成；
所述可注射血小板富集纤维蛋白iPRF为来自自体、同种异体或异种异体的血液提取物；
所述明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶固化的时间为10~2000秒，其中，可注射、可塑形的时间窗口为<500秒；
所述明胶纳米胶体颗粒通过反溶剂法或者乳液法制备明胶颗粒，并经过化学交联反应得到稳定的明胶胶体颗粒；
所述明胶纳米胶体颗粒的体积分数φ为φ=0.05~1；
所述明胶纳米胶体颗粒粒径为10nm-1000nm。
2.根据权利要求1所述一种明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶，其特征在于，所述明胶纳米胶体颗粒表面电荷为-40~40 mV。
3.权利要求1所述的一种明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
取新鲜血液样本离心1~10 min，转速50~1000 g，离心分层后的顶层黄色透明液体即为血液提取物可注射血小板富集纤维蛋白iPRF，迅速将上层黄色透明液体与明胶纳米胶体颗粒充分混匀，固化后即得所述明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶；或
将明胶纳米胶体颗粒加入新鲜血液样本中，并放入离心机中离心1~10 min，转速50~1000 g，离心分层后的顶层棕黄色胶体即为所述明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶。
4.根据权利要求3所述的一种明胶纳米颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶纳米胶体颗粒是明胶纳米颗粒的冻干粉或明胶纳米胶体在水溶液中的分散液中的一种或两种的组合。
5.一种明胶纳米颗粒-纤维蛋白双网络结构复合水凝胶，其特征在于，所述双网络结构复合水凝胶为基于明胶纳米胶体颗粒和纤维蛋白形成的具有双重网络微观结构的水凝胶；其中，明胶纳米胶体颗粒在物理作用下形成第一重胶体水凝胶网络，纤维蛋白原在凝血酶作用下形成第二重纤维蛋白水凝胶网络，两重凝胶网络间以静电作用、氢键作用和疏水作用物理交联形成；
所述明胶纳米胶体颗粒的体积分数φ为φ=0.05~1；
所述纤维蛋白原，凝血酶和明胶纳米胶体颗粒三者完全混合之后纤维蛋白原网络的凝胶化时间为5~20秒；
所述明胶纳米胶体颗粒通过反溶剂法或者乳液法制备明胶颗粒，并经过化学交联反应得到稳定的明胶胶体颗粒；
所述明胶纳米胶体颗粒粒径为10nm-1000nm。
6.权利要求5所述的一种明胶纳米颗粒-纤维蛋白双网络结构复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将纤维蛋白原和凝血酶分别溶解于水性溶液得到纤维蛋白原水溶液或凝血酶水溶液，上述溶液与明胶纳米胶体颗粒充分混合均匀，固化后得到明胶纳米颗粒-纤维蛋白双网络水凝胶；其中，可以先将明胶纳米胶体颗粒与纤维蛋白原水溶液混合之后，再加入凝血酶；或明胶纳米胶体颗粒先与凝血酶混合后，再与纤维蛋白原混合；
其中，纤维蛋白原的浓度为0.1-10 wt%，凝血酶的浓度为5-500U/mL。
7.权利要求1或5所述的双网络结构复合水凝胶在制备组织工程支架材料中的应用，所述应用为用于组织修复填充，或用于体表组织、体腔内组织器官的有血创面的止血、防黏连、防感染、促进组织愈合和/或封闭伤口。
8.权利要求1或5所述的双网络结构复合水凝胶在制备人体组织创伤修复填充材料时的应用，所述双网络结构复合水凝胶中混合有生物活性陶瓷、生物活性玻璃、脱细胞骨基质颗粒性骨修复材料。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述双网络结构复合水凝胶中混合有羟基磷灰石、磷酸钙。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用中，双网络结构复合水凝胶混合有生物活性物质或药物分子中的一种或几种的组合。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述生物活性物质包括生物活性蛋白药物或活细胞颗粒中的一种或几种的组合。
12.权利要求1或5所述的双网络结构复合水凝胶在制备三维细胞培养支架或加在细胞的3D生物打印墨水材料中的应用，用于组织/器官的3D生物打印。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述双网络结构复合水凝胶在打印前加入1~100mmol抗凝剂，打印之后浸泡于氯化钙溶液中。
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