JP4642765B2 - 不溶性グロビンの注射可能埋め込み剤 - Google Patents
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Description
生理的pHにおいて完全に可溶性であるヘモグロビンとは異なり、グロビンは、同じ条件下において著しく不溶性である。生理的条件下におけるグロビンのこの不溶性の性状は、これまでのところ、その医薬用途の開発を損なってきた。この理由のために、大部分の実験は、生理的pHにおいて可溶性であるグロビン誘導体を製造することを探求してきた。具体的には、無水コハク酸を用いたスクシニル化によって、または無水酢酸を用いたアセチル化によって、またはグロビンの陰電荷を増加させ且つその等電点pHを低減させるアルカリ性pHにおけるアミド官能基の加水分解によって、生理的pHにおいて可溶性であるグロビン誘導体を製造することを探求してきた。酸グロビンの可溶性製剤をインスリンと組み合わせた注射可能製品は、開発され、特許化され、市販されてきた(Reiner (1939); Reiner et al. (1939))。それは、注射後、この複合体からのインスリンの漸次送達を可能にする(Rabinowitch et al. (1947); Berg et al. (1953))。グロビンは、この製品の活性要素でも主な要素でもない。
相同的ヒトグロビンは、好ましく、しかも処置される患者による注射中または注射後のいずれの免疫反応も免れることを可能にする。したがって、この製品は、これまでは動物皮膚(子ウシ、ブタ等)から製造されていて、そして患者の免疫反応を免れるために多数の予防措置および条件を必要とするコラーゲンに対して、かなりの利点を示す。
・アレルギー性個体を処置する不可能性。
ドナーからの血液バッグは、輸血機関により、種々のウイルスおよび他の伝染性物質についての生化学的、細菌学的および血清学的検査およびスクリーニング試験によって公式に管理される。胎盤血液の場合、臍帯からまたは母親からの血液試料について同じ検査を実施後、この出発物質から血液を集め、保存し、そして抽出することが明らかに必要であると考えられる。自己血液については、実施する試験を簡単にすることができる。
実施例1:ウサギグロビンの製造
5羽の麻酔したウサギから、心臓穿刺によって採血する。その血液を、それを凝固させないように、ヘパリンの存在下またはクエン酸ナトリウムの存在下で回収する。210mlの血液をこのように得、それを2500rpmで30分間遠心分離する。血漿を含有する上澄みをピペットで除去し、そしてペレットを、9g/lのNaClを含有し且つpH7.2で緩衝化された3容量のPBS緩衝液で5回洗浄する。洗浄された最終ペレットに、赤血球を溶解するために、等容量の蒸留水を撹拌しながら加える。その最終懸濁液を、細胞・膜破片を除去するために、12000rpmで遠心分離する。上澄みを、0.22ミクロンの多孔度を有する酢酸セルロースメンブランを介して濾過する。97g/lのヘモグロビンを含有する82mlを得る。
クエン酸ナトリウム上に得られた200mlの貯蔵寿命を過ぎたヒト血液を、2500rpmで30分間遠心分離する。血漿を含有する上澄みをピペットで除去し、更に、白血球に相当する表面の白っぽい細胞層を吸引によって取る。赤血球のペレットを、逐次的遠心分離により、9g/lのNaClを含有し且つpH7.2で緩衝化された3容量のPBS生理的食塩水で5回洗浄する。その最終ペレットに、赤血球を溶解するために、2容量の蒸留水を加える。溶血した懸濁液を、12000rpmで30分間の遠心分離によって透明にし、0.2ミクロンの多孔度を有するメンブランを介して濾過する。52g/lのヘモグロビンを含有する210mlを得、それを4℃で保存する。
実施例1の方法を、輸血センターより入手した、貯蔵寿命を過ぎた調製血球ペレットを用いて行う。生体適合性であり且つ注射によって埋め込み可能である沈殿したヒトグロビンのペースト剤を含有するシリンジを得る。
実施例1または2の方法を、グロビン沈殿物がpH7.4で得られるまで行った後、洗浄を行う。この沈殿物を、再度、3容量の0.1M〜1M NaOH中に20℃で撹拌しながら1時間溶解させる。
この処理は、埋め込み剤の再吸収時間を増加させることが可能である。最終グロビン沈殿物を、PBS中に2%で懸濁させる。グルタルアルデヒドを、沈殿物1g当たり1mgの濃度で撹拌しながら加える。20℃で1時間インキュベーション後、グロビン沈殿物を洗浄し、前の実施例の場合と同様にシリンジ中に入れる。
無菌シリンジを製造するには、0.2ミクロンの多孔度を有するメンブランを介する酸性グロビン溶液の滅菌濾過を行ったらすぐに、無菌条件下で作業する必要がある。これは、100または1000クラスの無菌ゾーンの層流フード下において、または軟質ラテックス手袋によって外側から利用できる無菌室で行うことができる。沈殿、沈降による分離、または沈殿物の遠心分離の操作は、保護膜で包まれた無菌容器中で行うべきである。
前の実施例のいずれか一つによって製造されるシリンジの滅菌は、5〜30キログレイの線量での照射によって行うことができる。種々のグロビン製剤は、照射によるそれらの滅菌の前後に不溶性である。どちらの場合も、中性pHで不溶性のグロビンは、いずれかの酸性水溶液でpH3への酸性化を行うならば、可溶性になる。
可溶性グロビンの溶液を、水溶液中にアセトン基剤グロビン粉末を、pH3、20〜120mg/mlの濃度で溶解させることによって調製する。この溶液を、0.2μの多孔度を有するメンブランを介して滅菌濾過した後、無菌の1N NaOHを撹拌しながら加えることによって、pH5に調整する。
材料の初期濃縮による20〜200μの厚みの最終薄膜は、βまたはγ照射によって、または酸化エチレンで滅菌することができる。コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、酸化セルロースまたは他の多糖類またはムコ多糖類、ポリエチレングリコール、グリセロール等のような周知の薄膜形成剤を加えることができる。このような添加剤は、薄膜に柔軟性および/または強度を与えることを可能にする。このような薄膜は、皮膚のまたは外科的な創傷を保護するのに、または治癒を促進するのに単独で用いることができるし、または種々のプロテーゼ(血管プロテーゼ、補強格子、多孔性マトリックス)に関連して、それらを不浸透性にする、またはそれらの生体適合性を改善する、または接着性状を抗付着性にする、または他の製品で既に用いられている既知の技法によるこれらプロテーゼの細胞定着を促進することができる。
前の実施例のいずれか一つによって得られる中性pHでのグロビン沈殿物の無菌ペースト剤を、例えば、細胞培養のためのDMEM培地と一緒に、約37℃の温度でインキュベートする。懸濁液を得、それに、細胞を10000〜100000個/mlの細胞密度で導入する。30分間撹拌し、そして1時間〜15時間沈降させることによって分離後、それら細胞は、グロビン粒子に付着し、そして3〜12日間でありうる培養時間にそれら表面において増殖する。細胞培地は、現在公表されている知識にしたがって、細胞タイプの機能によって選択される。
この方法による軟骨細胞の培養は、表在性の軟骨損傷に充填し且つそれを治癒することから成る用途のための細胞含有埋め込み剤の製造を可能にする。
同様に、具体的には胚由来の、または臍帯血または骨髄由来の、または種々の成人組織より単離される幹細胞は、これらグロビン粒子上で培養することができるし、しかも細胞含有ペースト剤の注射または埋め込み後に、所望の機能を果たすことができる。
本発明による製剤、具体的には、実施例1〜7のいずれか一つによって製造される不溶性グロビンのシリンジは、次の非制限用途で用いることができる。
−泌尿器科における小児の膀胱尿管逆流、女性の緊張性失禁;耳鼻咽喉科における声帯体積補正の用途のための、結合組織または括約筋の充填。
−グロビンペースト剤を単独でまたは他の治癒用製品または増殖因子と組合せて用いた、皮膚瘢痕形成。
本発明の主題は、更に、ヒトまたは動物の身体を処置する方法であって、本発明による注射可能なまたは埋め込み可能な製剤の治療的有効量を、このような製剤への要求を示している患者に投与する少なくとも一つの工程を含む方法である。
Claims (42)
- 組織を充填するため、または組織の体積を増加するための、ヒトまたは動物の体内に注射することができる、または埋め込むことができる製剤であって、生理的pHにおいて不溶性で、生体適合性で、そして無菌であるグロビンを含む製剤。
- 前記製剤がペースト状である、請求項1に記載の製剤。
- 前記製剤が固形である、請求項1に記載の製剤。
- 前記グロビンが、ヒト由来のグロビンである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記製剤中のグロビンが、沈殿した状態である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製剤。
- 均一化されたグロビンを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の注射可能製剤。
- 前記グロビンが、注射可能な均一化されたペースト剤の形である、請求項6に記載の製剤。
- 前記均一化されたペーストが、皮下注射針を介して注射することができる、請求項6または請求項7に記載の製剤。
- 前記注射可能製剤中のグロビンの濃度が、30mg/g〜150mg/gである、請求項6〜8のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記製剤のpHが中性である、請求項6〜9のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記製剤のpHが6.8〜7.5である、請求項5に記載の製剤。
- 前記グロビンが、薬学的に許容しうるビヒクル中の懸濁状態にある、請求項1〜11のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記グロビンが、薬学的に許容しうる液体ビヒクル中、酸性または塩基性のpHで溶液状態にある、請求項1に記載の製剤。
- 前記グロビンの濃度が20〜300mg/mlである、請求項13に記載の製剤。
- 前記グロビンが、ゲルの形の製剤中に存在している、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製剤。
- 潤滑剤を更に含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記潤滑剤が、トリグリセリド類、ポリエチレングリコール、酸化セルロース、または多糖類若しくはムコ多糖類、の溶液より選択される、請求項16に記載の製剤。
- 前記潤滑剤が、ヒアルロネートまたはヒアルロン酸の溶液である、請求項16に記載の製剤。
- グロビン薄膜を含むまたはグロビン薄膜から成る、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製剤であって、該製剤が、薄膜形成剤を含有していてもよい製剤。
- 前記薄膜形成剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロネート、ヒアルロン酸、酸化セルロース、ポリエチレングリコール及びグリセロールから選択される、請求項19に記載の製剤。
- 前記薄膜が、ゲルまたは溶液の脱水によって得られたものである、請求項19に記載の製剤。
- 前記製剤が薄膜であり、該薄膜が、血管プロテーゼ、補強格子、メッシュまたは多孔性マトリックスを含むプロテーゼに関連している、請求項19〜21のいずれか1項に記載の製剤。
- 固形埋め込み剤の形で製造されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製剤。
- スポンジまたは顆粒剤の形で製造されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製剤。
- 次の活性成分:治癒用製品、増殖因子、抗生物質、の少なくとも一つを更に含有する、請求項1〜24のいずれか1項に記載の製剤。
- リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト及び増殖因子からなる群から選択される成分を更に含有する、請求項1〜24のいずれか1項に記載の製剤。
- 細胞を含有する、請求項1〜26のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記細胞が、注射または埋め込みの前に、培養支持物質としての製剤のグロビンを用いて培養された細胞である、請求項27に記載の製剤。
- 前記細胞が、皮膚線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞または幹細胞から選択される、請求項27または請求項28に記載の製剤。
- 前記製剤が、シリンジ中で、5〜30キログレイの線量での照射によって滅菌される、請求項2〜9のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記薄膜が、照射による減菌を受けた、請求項19〜22のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記グロビンを主成分として含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載の製剤。
- 皮膚の腔、しわ、欠損または瘢痕、および骨または軟骨の小腔および破損を充填するための材料である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の製剤。
- 骨または軟骨の欠損を充填するための材料である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の製剤。
- 括約筋を増強するための材料である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の製剤。
- 皮膚瘢痕形成用または治癒用材料である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の製剤。
- 軟骨または骨の瘢痕形成用または治癒用材料である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の製剤。
- 外科的または非外科的な外部または内部の創傷または瘢痕の保護および/または隔離用の薄膜および/または圧定布である、請求項19〜31のいずれか1項に記載の製剤。
- プロテーゼへの関連のための薄膜である、請求項19〜31のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記プロテーゼが、血管プロテーゼ、補強格子、メッシュまたは多孔性マトリックスから選択される、請求項39に記載の製剤。
- 経皮的動脈創傷用の止血栓を形成することを意図した材料である、請求項1に記載の製剤。
- 患者のための材料である製剤であって、グロビンが該患者の血液試料から製造される、請求項1〜41のいずれか1項に記載の製剤。
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