KR101095940B1 - 주사가능한 불용성 글로빈 이식체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 또는 동물의 몸에 주사 또는 이식될 수 있는, 주성분으로서, 생리적 pH에서 불용성이며, 생체사용에 적합하며 무균인 글로빈을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제에 관한 것이다.

글로빈, 콜라겐, 이식체

Description

주사가능한 불용성 글로빈 이식체 {INSOLUBLE GLOBIN INJECTABLE IMPLANT}

본 발명의 목적은 인간에게 투여하기에 유용한 글로빈 제제를 제공하는 것이다. 상기 제제는, 구체적으로 주사용 페이스트, 이식가능한 고형물질, 또는 이식체의 형태일 수 있다.

콜라겐의 의약에의 사용, 예를 들면 충진용 페이스트의 형태, 액상 또는 고형 제형, 예컨대, 필름 또는 습포의 형태, 또는 다양한 이식체 형태로서의 사용은 이미 많이 기술되어 있다. 그런데, 사실은 단지 동물 콜라겐만이 일반적으로 사용된다.

동물 콜라겐에 비해 바람직한 인간 콜라겐은 인간의 피부조직으로부터 제조하는 것을 생각할 수 있다. 그러나, 시신으로부터 인간 피부조직 시료의 채취는 심각한 도덕적 문제를 야기하며, 감염성 질병, 바이러스 질병 등과 같은 질병의 감염을 제거하기 위해 상당한 검사를 필요로 하기 때문에 상기 방법에 의한 제조는 매우 어렵다. 태반으로부터의 인간 콜라겐의 제조 또한 고가이며, 복잡하고 얻기가 매우 어렵다. 유전 공학적 방법 또는 세포배양과 같은 현대적 방법을 사용한 인간 콜라겐의 제조도 또한 매우 고가이며, 이는 이러한 제품의 상업화를 틀림없이 어렵게 할 것이다.

글로빈은 헤모글로빈을 구성하는 단백질로, 헤모글로빈은 4개의 펩타이드 사슬(두 개의 알파 사슬 및 두 개의 베타 사슬)을 포함하며, 각각은 헴과 회합되어 있다. 상기 헴은 하나의 양전하로 하전된 철원자를 포함하는 테트라피롤 구조로 구성된다. 분자당 4개의 헴이 있으며, 헤모글로빈의 붉은 색은 이 때문이다.

글로빈을 제조하는 방법은 매우 오래전부터 공지되었으며 식품에의 적용, 또는 주사용 약학적 용액의 제조를 목적으로 하여 개발되어 왔다.

생리적 pH에서 완전하게 가용성인 헤모글로빈과 달리, 글로빈은 동일한 조건하에서 주목할 만하게도 불용성이다. 상기 글로빈의 생리적 조건하에서의 불용적 특성은 현재까지 글로빈의 약학적 응용을 어렵게 만들었다. 이러한 이유로, 대부분의 연구는 생리적 pH에서 가용성인 글로빈 유도체의 제조, 특히, 글로빈의 음전하를 증가시키고 이의 등전점 pH를 감소시키는, 숙신산무수물을 사용한 숙시닐화 또는 아세트산 무수물을 사용한 아세틸화, 또는 알칼리성 pH에서 아미드기의 가수분해에 의한 유도체의 제조에 집중되었다. 인슐린과 가용성 산성 글로빈 제제를 조합한 주사용 제품이 계발되어, 특허되고 판매되었다: Reiner (1939) ; Reiner et al. (1939). 이는 주사 후, 상기 복합체로부터 인슐린이 점진적으로 전달될 수 있도록 한다: Rabinowitch et al. (1947); Berg et al. (1953). 그러나 글로빈은 상기 제품의 활성성분 또는 주성분이 아니다.

본 발명은 글로빈이 주 활성 성분이며, 예를 들면 콜라겐 등과 같이 공지 물질 및 제형이 갖는 결점이 없는, 신규한 물질 및 유기체에 이식할 수 있는 제제 또는 주사용 제제를 제공하고자 한다.

본 발명의 주제는 생리적 pH에서 불용성이며, 생체적합성이 있고, 무균이며, 바람직하게는 생분해성인 글로빈의 페이스트 또는 고형제제, 구체적으로 주사용 페이스트 형태, 고형물질 형태, 예를 들면 과립 또는 필름형태, 또는 불용성 이식체의 형태의, 글로빈의 페이스트 또는 고형제제이다.

본 발명은, 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 매체, 예를 들면 PBS 유형의 9 g/l NaC1을 포함하며 6.8 내지 7.5의 중성 pH로 완충된 생리적 수용액 중에 글로빈 침전물의 현탁에 의해 형성된 단백질 침전물을 수확하고, 원심분리하여 중성 pH에서 천연적으로 불용성인 글로빈의 특성을 보존하고자 한다. 이렇게 형성된 페이스트는 가는 주사바늘을 사용하여 균질화 한 후 주사가능하다. 이러한 페이스트는 증점제 및 윤활제 예컨대 트리글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루로네이트, 특히 히알루론산 나트륨, 히알루론산 용액 또는 기타 폴리사카리드 또는 뮤코폴리사카리드 용액 또는 산화 셀룰로스 용액의 존재 중에서 제조될 수 있다. 상기의 첨가제는 가장 가는 주사바늘(직경 30게이지)로 페이스트성 침전물이 용이하게 통과할 수 있게 하여, 피하 이식체로서 사용되는 이의 주사를 용이하게 한다.

본 제품의 독창성 및 장점은 본 발명의 단백질 페이스트가 주사될 주변 조직과 생물학적으로 완전히 적합한 단백질이라는 사실에 있다. 본 발명의 단백질은 변경 또는 화학적 변형을 거치지 않으며, 생리적 환경에 놓이게 되는 순간부터 천연적으로 불용성이다. 인간 글로빈 단백질 페이스트는 인간에 있어서, 피부의 공간, 주름 또는 흉터를 메꾸거나, 또는 특정 조직 (방광 또는 소화관 조임근, 성대 등)의 부피를 크게 하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 페이스트는 뼈 또는 연골의 결함을 메꾸고, 그 반흔형성 (cicatrization)을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 불용성 글로빈 입자는 또한 동물 또는 인간의 세포배양에 사용될 수 있다. 음전하를 갖는 세포는 양전하로 하전된 글로빈 입자의 표면에 부착하며, 그 표면에서 증식한다. 글로빈과 접착한 세포는 글로빈을 분해하기 때문에 글로빈 지지체의 점진적 분해는 부가적으로 세포의 영양을 공급할 수 있으며, 또는 현재까지 사용된 액체 배양 배지의 대안이 될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 글로빈에 의해 가능한 충진 응용분야는 매우 다양할 뿐만아니라, 글로빈에 대하여는 전혀 예기치 못한 응용이다.

상동성 인간 글로빈이 바람직하며 이는 치료될 환자에서 주사과정 중에 또는 주사후에 어떤 면역반응도 일어나지 않게 한다. 그러므로 본 제품은, 현재까지 동물 피부(소, 돼지 등)에서 제조되어, 환자에서의 면역반응을 피하기 위해 다수의 주의사항을 지켜야 하며, 다수의 조건을 요구하는, 동물성 콜라겐과 대비하여, 상당한 장점이 있다.

각 환자에 대해 동물성 콜라겐에 대한 엘러지 반응 검사의 필요성

엘러지를 보이는 환자의 치료 불가능성.

상기 글로빈은 그러나, 산성 또는 염기성 pH에서 가용성이며, 이러한 조건에서 다공성막을 통하여 무균적으로 여과될 수 있다. 20 내지 300 mg/ml의 적합한 농도의 경우, 상기 용액은 단백질 용액처럼 처리될 수 있어, 건조, 동결건조, 가교 및 침전 등의 기술을 단독으로 사용하거나 또는 이를 조합하여, 예컨대 스폰지, 필름 또는 과립과 같은 제품으로 제조하는 것이 가능하다. 개발된 일부 예를 하기에 기술한다.

글로빈은 인간 또는 동물 유래의 적혈구로부터 정제하기가 용이하다. 유효기간이 지나 혈액원에 보관되어 있으며, 헌혈시에 혈액에 대한 건강 검사를 마친 헌혈된 인간 혈액으로부터 충분한 양의 인간 적혈구 세포를 수득할 수 있다. 불용성의 주사가능한 글로빈 또는 기타 글로빈을 기본으로 하는 생체물질(biomaterial)은 따라서, 신규한 생물의학 응용분야를 대표하는 것으로서, 이는 사용되지 않은 혈액 또는 유효기간이 지난 헌혈된 혈액의 사용을 가능하게 하여, 이들이 폐기되는 것을 방지한다.

본 발명은, 치료될 환자로부터 채취한 약 5 내지 100 ml의 혈액시료를 사용하여, 많은 양의 혈액에 대해 사용하는 방법과 동일한 방법으로 상기 혈액을 자가성 글로빈으로 전환하고, 이어서 수득한 페이스트를 동일한 환자의 주름 교정 및 만성적 상처 치유와 같은 기타 치료용으로 주사하여 수행될 수 있다. 상기 환자유래의 시료를 사용하여 글로빈이 들어 있는 다수의 주사기를 제조하는 것도 가능하며, 이는 동일한 환자가 수년 동안 치료를 받게 할 수 있다.

유사하게, 출산 후에 배출되는 인간 태반은 일반적으로 소각하여 폐기하지만, 이도 또한 본 발명에 사용될 수 있다.

헌혈자 유래의 혈액은 공식적으로는 생화학, 박테리아 및 혈청 검사 및 각종 바이러스 및 기타 감염성원에 대한 스크리닝 검사를 위해 혈액원에서 관리한다. 태반 혈액의 경우에도, 수집하고 보관하여 이로부터 혈액을 추출하기 위해서는, 탯줄 또는 산모 유래의 혈액 시료에 대해서도 동일한 검사를 수행할 필요가 있다는 것은 명백할 것이다. 자가성 혈액의 경우, 상기와 같은 검사를 간단히 할 수도 있다.

본 발명의 실시를 위해, 우선, 공지의 간단한 방법에 의해 상기 혈액시료, 또는 혈액성 액체로부터 적혈구를 수집하고 정제하는 것이 필요하다. 상기 적혈구 세포를 저속도로 원심분리하여 회수한다. 혈장 상층액을 분리하여 내고, 9 g/l 의 NaCl를 포함하며, 중성 pH로 완충된 PBS 유형의 생리적 식염수로 대체한다.

수회 (3 내지 5) 세척하여, 적혈구 세포 현탁액으로부터 혈장 단백질을 제거한다. 증류수 1 또는 2 부피를 상기 정제된 적혈구 세포의 펠렛에 첨가하여, 삼투압 쇼크를 주어 적혈구 막을 파쇄하여, 적혈구 세포 안의 헤모글로빈을 용액으로 방출시켜, 농축하고, 정제한다. 고속도의 원심분리 (10 내지 20000 rpm)를 하면, 상기 펠렛 중의 세포막 및 세포파편을 제거할 수 있다. 마지막 단계는 상기 상층액을 구멍크기가 0.2 마이크론인 막을 통하여 여과하는 것으로 구성되며, 그 결과 조직, 세포 또는 세포막 유래의 물질 및 입자가 없는 정제된 무균의 헤모글로빈 용액을 제조할 수 있다.

산성 pH에서 알콜의 존재중에 헤모글로빈의 절단은 최초로 1898년에 Schulz 에 의해 기술되었다. 그 후, 1930년 Anson 및 Mirsky, 1958 년에 Rossi-Fanelli 등은 0℃에서 산의 존재 중에서 아세톤을 사용하였다. Teale (1957) 은 아세톤 대신에 메틸에틸케톤의 사용을 선호하였다. Autio 등 (1984)은 가용성 카르복시메틸셀룰로스에 헴을 부착하고 침전하여 산성 pH에서 글로빈을 분리하였다. 이렇게 제조된 글로빈은 산성 또는 알카리성 pH에서 가용성이지만, 수용액이 pH 6 내지 8 사이로 중성화되는 즉시 불용성이 된다.

Strumia 등은 1951 및 1952에, 장시간 알카리 처리를 하여, 중성 pH에서의 가용화 실험을 하였으며, 이는 아스파라긴 및 글루타민 잔기에서의 부분적 탈아미드화에 의해 이들 각각의 아스파르트산 및 글루탐산으로의 전환을 초래하였다 (Vars,1952). 1988년에 Volckmann 은 숙시닐화에 의한 다른 가용화 실험을 수행하였다.

생리적인 매질에서의 불용성 성질은, 특히, 충진 또는 조직 부피 증대의 응용분야에서와 같이 주사된 양이 많은 경우, 조직 이식 후의 글로빈의 지속성, 효소 분해 저항성을 설명한다.

반면, 대부분의 다른 단백질은 고농도의 염 또는 알콜에 의해서만 침전될 수 있으며, 이는 이들 침전물을 생체에 적합하지 않게 하여 조직 내 주사용으로 사용할 수 없게 만든다. 부가하여, 이러한 이식체는 침전제의 확산 및 조직의 생리적 매질과의 접촉시 침전물이 점진적으로 용해되어 빠르게 사라져 버릴 것이다.

본 발명의 장점은 토끼 글로빈의 제조를 통하여 용이하게 검증될 수 있다. 이렇게 제조된 생리적인, 침전된 글로빈 페이스트는 따라서 토끼의 등 또는 옆면의 다양한 위치에 피하 주사될 수 있다. 국소적 홍반의 부재로 무균성을 손쉽게 증명할 수 있다. 피부 밑에서 제품의 지속성은 시간의 경과에 따라서, 만져보면 알 수 있다. 본 발명의 제품의 항원성 부재는 토끼에게 프로인드 아쥬번트 없이 또는 이와 함께 근육 및 피하 주사를 하여 증명될 수 있다. 상기 주사 후 혈액을 취하여 이 혈액 시료에 대하여 공지의 대조군 검사를 사용하여 항-글로빈 또는 항-헤모글로빈 항체의 부재를 증명하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 제품의 제조

실시예 1 : 토끼 글로빈의 제조

5마리의 마취된 토끼의 심장을 찔러 혈액이 나오게 하였다. 상기 혈액을 헤파린 또는 시트르산 나트륨의 존재 중에서 회수하여 혈액의 응고를 방지하였다. 이렇게 수득한 210ml의 혈액을 2500rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 혈장을 포함하는 상층액을 파이펫으로 제거하고 펠렛을 9g/l NaC1을 포함하며 pH 7.2로 완충된, 3부피의 PBS 완충액으로 5회 세척한다. 상기 세척된 펠렛에, 교반을 하면서, 동부피의 증류수를 첨가하여 적혈구를 파쇄한다. 최종 현탁액을 12000rpm에서 원심분리하여 세포 및 세포막파편을 제거한다. 상층액을 0.22 마이크론 구멍크기의 셀룰로스 아세테이트 막을 통하여 여과한다. 97 g/l 의 헤모글로빈을 포함하는 82ml 용액을 수득하였다.

헤모글로빈을 Tayot 및 Veron (1983)에 기재된 기술에 따라서 글로빈으로 전환한다. 상기 헤모글로빈 용액을 교반하면서 1 ml의 농축된 HCl을 포함하는 275 ml의 96% 에탄올에 부어 넣는다. pH를 3으로 맞춘다. 최종 농도는 산성 pH의 에탄올 74% 및 헤모글로빈 22 g/l 이다. 3 g의 CECA L4S 활성탄을 넣고, 4℃에서 15 분 동안 강하게 교반한다.

상기 현탁액을 15000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 펠렛의 형태로 상기 활성탄을 제거한다. 색이 없어진 산성 글로빈을 포함하는 상층액을 최소의 구멍크기(0.2 micron) 까지 일련의 다공성 막을 통하여 여과하여, 미세한 활성탄 입자를 제거한다. 여과물을 동일 부피의 증류수로 희석하고 NaOH를 첨가하여 pH를 7.4로 맞추면, 글로빈이 덩어리로 침전한다. 15시간 후에, 글로빈 침전물을 원심분리하여 회수하고, 이어서, 9g/l NaC1을 포함하며 pH 7.4로 완충된, 3부피의 PBS로 2회 세척한다. pH 7.4에서 58.2 g 의 글로빈 침전물을 수확한다. 상기 침전물을 내부 직경이 1 내지 0.2mm인 연결관을 통하여 연결된 5ml 부피의 두 개의 주사기 사이에서, 각각 주사기의 피스톤을 밀어서 한 주사기의 침전물을 다른 주사기로 옮기는 방식으로 한 주사기에서 다른 주사기로 연속적으로 침전물을 옮겨 균질화한다.

최종적으로, 균질환된 침전물을 1ml의 주사기로 분배하여 넣는다. 침전된 글로빈 페이스트를 직경 24 또는 27 게이지의 가는 주사바늘을 통하여 방출시키는 것도 가능하다. 페이스트의 글로빈의 농도는 30 내지 150 mg/g의 값으로 맞출 수 있다.

실시예 2: 인간 글로빈의 제조

시트르산 나트륨을 포함하는 유효기간이 지난 200 ml의 인간 혈액을 2500 rpm에서 30분간 원심분리한다. 혈장을 포함하는 상층액을 파이펫으로 제거하고, 백혈구에 해당하는 표면의 흰 빛깔 세포층을 흡입하여 제거한다. 적혈구 펠렛을 9g/l NaC1을 포함하며 pH 7.2로 완충된, 3부피의 생리적 식염수인 PBS로 연속적으 로 원심분리를 하여 5회 세척한다. 상기 펠렛에 2부피의 증류수를 첨가하여 적혈구세포를 파쇄한다. 용혈된 현탁액을 12000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 가라앉히고, 상층액을 0.2 마이크론 구멍크기의 막을 통하여 여과한다. 52g/l 의 헤모글로빈을 포함하는 210ml 용액을 수득하여 4℃에서 보관하였다.

4℃의 동일한 부피의 210 ml의 0.1 N HC1을 첨가하고, 혼합물 전부를 40 ml의 1N HCl을 포함하는 4L의 아세톤에 부어 넣는다. 화학약품 후드 아래에서 현탁액을 강하게 교반하면서 실온에 1시간 동안 정치한다. 아세톤에 용해된 헴을 다공성 천을 통과시켜 제거하고, 글로빈 침전물을 회수하고 산성 아세톤에서 세척하고 기류하에서 건조한다.

변형된 구현예에서, 다양한 무기산(황산, 인산 등) 또는 카르복실산, 예컨대 아세트산, 옥살산 또는 시트르산을 염산 대신에 사용하여 헤모글로빈 용액이 변색하기 전에 헤모글로빈 용액을 산성화할 수 있다.

상기 방법의 다른 변형된 구현예는 헤모글로빈을 탈색하기 전에 산성 헤모글로빈 용액을 침전시키는 것을 포함한다. 이러한 침전은 40 내지 60 g/1 농도의 NaCl을 첨가하여 달성될 수 있다. 상기 산성 헤모글로빈 침전물을 이어서 충분한 부피의 에탄올 및/또는 아세톤 중에서 현탁하여 탈색한다. 색소가 에탄올 및/또는 아세톤 중에 용해된다; 글로빈은 침전된 상태로 남아있으며 다공성 천을 통과시켜 여과하여 취합한다. 어떤 수성 상도 사용하지 않기 때문에, 변형된 본 방법은 필요한 에탄올 및/또는 아세톤 부피를 적어도 5배 정도 줄일 수 있다.

글로빈을 pH 2 내지 3 사이의 수용액 중에 재용해한다. 산성 글로빈 수용액 을 구멍크기 0.2 마이크론의 막을 통과시켜 무균적으로 여과한 후, pH 7.4가 될 때까지 NaOH를 첨가하여 중성화시켜 침전시킨다. 중성 pH의 침전된 글로빈 페이스트가 들어있는 주사기는 앞선 실시예에서와 같이 제조될 수 있다. 산성의 글로빈 수용액을 중성화하는 작업은 알카리성 pH의 히알루론산 나트륨을 첨가하여 수행할 수 있다. 이 경우, 히알루론산과 복합체를 형성하고, 이로 포화된 불용성 글로빈 페이스트가 형성되며, 이는 주사하는 경우, 매우 가는 주사바늘(직경 30게이지)로의 통과를 용이하게 하는 윤활제 기능을 한다.

실시예 3: 기타 인간 글로빈의 제조

혈액기관으로부터 수득한 유효기간이 경과한 규제되는 혈액세포 펠렛을 사용하여 실시예 1의 방법을 수행한다. 생체 적합성이 있으며 주사로 이식가능한 침전된 인간 글로빈 페이스트를 포함하는 주사기를 수득한다.

실시예 4: 0.1 또는 1 M 수산화나트륨으로 20℃에서 1시간 동안 알카리 처리된 인간 글로빈의 제조

pH 7.4에서 글로빈 침전물을 수득할 때까지, 세척 전까지의 실시예 1 또는 2의 방법을 수행한다. 상기 침전물을 다시 20℃에서 1시간 동안 교반하면서 3 부피의 0.1 M 내지 1 M NaOH 중에 용해하였다.

상기 용액을 이어서 동일한 부피의 동일 몰양(molarity)의 HCl을 첨가하여 중화하고, 상기 현탁액의 pH를 7 내지 7.4로 맞추었다. 상기 글로빈 침전물을 이 어서 원심분리하여 수집한 후, 앞선 실시예에서와 같이 생리적 식염수 PBS에서 세척하였다. 히알루론산, 또는 기타 생체적합성 있는 증점제 및 윤활제: 트리글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 산화셀룰로스, 키토산 등을 첨가할 수 있는 상기 글로빈 침전물을 주사기에 나누어 넣고, 상기 제품을 진피 용의 가는 주사바늘을 통과시켜 상기 제품의 주사가능한 특성을 다시 증명한다. 상기와 같이 글로빈의 알카리 처리에 의해, 실질적으로 중성 pH에서의 글로빈의 불용성 특성을 변형시키지 않으면서 제품의, 건강에 대한 안전성 보증을 향상시키는 것이 가능하다.

실시예 5. 침전되고 글루타르알데히드 - 가교된 글로빈 페이스트의 제조

본 처리로 이식체의 흡수시간을 증가시키는 것이 가능하다. 최종 글로빈 침전물을 PBS 중에 2% 농도로 현탁한다. 교반하면서, 글루타르알데히드를 침전물의 농도가 1 mg/g가 되게 첨가한다. 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 상기 글로빈 침전물을 세척하고 앞선 실시예에서와 같이 주사기에 넣는다.

디알데히드 또는 폴리알데히드와 같은 다른 가교제, 특히, 과요오드산으로 산화된 폴리사카리드, 예컨대 산화덱스트란, 산화 녹말, 또는 산화 히알루론산을 사용할 수 있다.

실시예 6: 무균의 침전된 글로빈 페이스트 주사기의 제조

무균의 주사기를 제조하기 위하여, 0.2 마이크론 구멍크기의 막을 통과한 산성 글로빈 용액의 무균 여과 즉시 무균조건하에서 작업을 하는 것이 필요하다. 이 는 class 100 또는 1000 무균 지역내의 라미나 기류 후드 하에서 또는 유연한 라텍스 장갑을 끼고 외부로부터 접근할 수 있는 무균 챔버에서 할 수 있다. 침전, 침강에 의한 분리 또는 상기 침전물의 원심분리는 적당한 필름으로 포장된 무균 용기에서 수행하여야만 한다.

다른 방법은 무균적으로 여과된 산성 글로빈 수용액을 제1 주사기에 넣고, 무균적으로 여과된 알칼리 용액을 제2 주사기에 넣는 것을 포함한다. 각 주사기의 pH는 이들의 후속적 혼합물의 pH가 중성이 되도록 맞춘다. 이들 두 개의 주사기를 무균의 연결관을 사용하여 연결하여, 한 주사기에서 다른 주사기로의 연속적 전달에 의해 중성 pH의 무균 균질화 혼합물을 만드는 것이 가능하다. 무균 침전물은 글로빈의 자연적 침전에 의해 수득된다. 수득한 현탁액을 액체만 통과할 수 있는 가는 주사바늘에 통과시켜 농축한다. 상기 농축된 글로빈 주사기에 히알루론산나트륨 또는 기타 임의의 증점제 및 윤활제를 선택적 첨가하여 최종 글로빈에 혼입시킬 수 있다. 변형 구현예에서, 두 개의 초기 주사기를 사용하여 혼합할 당시에 가교제를 첨가하여 생체내에서 글로빈의 흡수시간을 늘리는 것이 가능하다.

실시예 7: 침전된 글로빈 페이스트 주사기의 최종 무균화

5 내지 30 킬로그레이의 방사선을 상기 실시예 중 어느 하나에 따라 제조된 주사기에 조사하여 무균화 할 수 있다. 다양한 글로빈 제제는 방사선 조사에 의한 무균화 전 및 후에 불용성이다. 두 경우 모두에서, 중성 pH의 불용성 글로빈은 임의의 산성 수용액을 사용하여 pH 3으로 산성화를 하면 가용성이 된다.

실시예 8: 비변형된 가용성 글로빈 유래의 불용성 젤 또는 필름의 제조

가용성 글로빈 용액을 20 내지 120 mg/ml의 농도로 pH 3의 아세톤 기재의 글로빈 분말을 수용액에서 용해하여 가용성 글로빈 용액을 제조한다. 상기 용액을 구멍크기 0.2 마이크론의 막을 통과시켜 무균화한 후, 무균의 1N NaOH를 교반하면서 첨가하여 pH를 5로 맞춘다.

pH 3.5의 산화 녹말 또는 분자당 최소 5개의 탄소원자를 포함하는, 기타 알데히드, 또는 가교성 폴리알데히드를 상기 혼합물에, 0.5%의 농도로 첨가하고, 5분간 교반한다. 상기 무균 혼합물을 라미나 기류 하에서, 20 내지 37℃에서, 평편한 표면에 액체 두께가 1 내지 3 mm 되도록 부어 넣는다.

상기 액체는 산화 녹말에 의해 유도된 글로빈 사슬의 가교에 의해 점진적으로 젤로 변화되고, 이어서, 필요에 따라 기류하에서 건조하여 필름을 수득한다.

물질의 초기 농도에 따른 두께 20 내지 200μ의 최종 필름을 베타- 또는 감마-선을 조사하거나 또는 산화에틸렌으로 무균화 할 수 있다. 주지의 필름-형성제, 예컨대 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 산화셀룰로스 또는 기타 폴리사카리드 또는 뮤코폴리사카리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등을 첨가할 수 있다. 상기의 첨가제로 필름에 유연성 및/또는 강도를 주는 것이 가능하다. 상기의 필름은 단독으로 피부 또는 수술상처의 보호, 또는 치유를 촉진하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 다른 제품에서 사용된 공지의 기술에 따라, 다양한 의용물질(prostheses)(인공혈관, 강화성 격자, 다공성 메트릭스)과 함께 사용되어 의용물질을 보다 불투과 성 있게 만들 수 있으며, 또는 이들의 생체적합성을 향상시킬 수 있거나 또는 부착성 성질의 항-부착성 특성을 부여할 수 있거나, 또는 이들 의용물질의 콜로니화를 촉진시킬 수 있다.

한 구현예에서, 앞선 경우와 같이, pH 5에서 가용성이나 어떤 가교제도 첨가하지 않은 글로빈 유래의 필름을 제조하는 것이 가능하다. 건조된 필름의 최종 가교는 글로빈 사슬 간의 공유결합을 생성하는 최종 조사에 의해 수행된다. 상기 필름은 이어서 글로빈의 아미노기와 반응성이 있는 생체 적합성 접착물질로 조직에 결합될 수 있다. 바람직하게, 폴리사카리드의 과요오드 산화에 의해 수득한 폴리알데히드를 사용할 수 있다. 예로서, 산화덱스트란 또는 산화녹말이 바람직하다.

실시예 9: 세포배양 지지체로서의 불용성 글로빈 입자의 생물의약분야에의 응용

앞선 실시예 중 어느 하나에 의해 수득한 중성 pH의 침전된 무균 글로빈 페이스트를 예를 들면 세포배양용 DMEM 배지와 37℃에서 배양하였다. 상기 배지에 세포를 10 000 내지 100 000 세포/ml의 농도로 현탁하여, 현탁액을 수득한다. 30분간의 교반 및 1시간 내지 15시간 동안 침강하도록 두어 분리한 후, 세포는 글로빈 입자에 부착하여, 3 내지 12일 기간의 배양하는 동안 이의 표면에 부착하여 증식한다. 세포배양 배지는 현재 공지된 기술에 따라 세포 유형에 따라 선택된다.

증식 종료시, 글로빈 입자에 부착된 세포현탁액을 침강하도록 두어 자연적으로 분리하여 농축할 수 있다. 수득한 세포 페이스트를 주사기에 넣어 생체적합성 세포를 포함하는 주사용 이식체로서 주사되어 현재 알려진 다양한 치료적 응용분야에서 사용될 수 있다.

본 방법에 따른 피부 섬유아세포의 배양은 피부치료분야 또는 결합성 조직 충진으로 구성되는 분야에서 응용되는 세포-함유 이식체의 제조를 가능하게 할 수 있다.

본 방법에 따른 연골세포의 배양은 충진 및 표면 연골 손상의 치료로 구성되는 분야에서 응용되는 세포-함유 이식체의 제조를 가능하게 할 수 있다.

본 방법에 따른 골형성세포의 세포의 배양은 충진 및 골절 또는 골손실의 치료로 구성되는 분야에서 응용되는 세포-함유 이식체의 제조를 가능하게 할 수 있다.

유사하게, 줄기세포, 특히, 배아유래, 또는 탯줄혈액 유래 또는 골수 유래, 또는 각종 성인 조직으로부터 분리된 줄기세포를 이들 글로빈 입자상에서 배양하여, 세포-함유 페이스트를 주사 또는 이식한 후 목적하는 기능을 수행할 수 있다.

예컨대 바이러스의 생산 또는 유도된 백신의 제조과 같은 생물의약 분야에서의 응용의 경우, 글로빈 상에서 배양한 후, 글로빈 지지체로부터 세포를 분리할 수 있으며, 트립신 방법을 사용할 수 있다. 분해되지 않은 글로빈 입자는 플라스크의 바닥에 가라앉아 자연적으로 침강되어 침강에 의해 세포로부터 분리할 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 글로빈 입자를 불용성 글로빈을 포함하는 필름으로 대체할 수 있다. 상기 세포배양은 이어서, 현재 공지된 막 또는 필름상에서의 임의의 세포배양과 같이, 상기 필름에 배양 배지를 연속적으로 순환시켜 수행할 수 있다. 이러한 방법으로 또한 특정 의약분야에의 응용을 위한 세포-함유 필름의 제조가 가능하다.

실시예 10: 주사가능한 불용성 글로빈 이식체의 의약분야에의 응용

본 발명에 따른 제제, 특히 실시예 1 내지 7 중 어느 하나에 따라 제조된 불용성 글로빈을 포함하는 주사기를 하기의 비제한적 응용분야에 사용할 수 있다:

- 피부의 주름 또는 결함 충진

- 비뇨기과에 응용될 수 있는 조임근 또는 결합조직의 충진: 어린이의 방광요관역류, 여성 요실금; ENT: 성대 부피의 교정.

- 경피 동맥 손상용 지혈 플러그.

- 글로빈 페이스트 단독 또는 다른 치료제 또는 성장인자와 조합으로 사용하여, 피부반흔 형성.

- 글로빈 단독 또는 다른 치료제; 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 하이드록시애파타이트, BMP 유형의 성장인자와 조합으로 사용하여, 연골 또는 골 반흔형성.

- 이식체의 분해 또는 콜로니화 기간 동안의 박테리아 발생의 억제를 위한 항생제와 조합.

본 발명의 주제는 또한 치료적으로 유효한 양의 주사가능한 또는 이식가능한 본 발명의 제제를 이러한 제제가 필요한 환자에게 투여하는 하나 이상의 단계를 포함하는, 인간 또는 동물 치료방법이다.

상기 방법은 특히 상기 언급한 응용분야에서의 비경구 또는 주사 또는 이식에 의한 수술, 또는 피하 투여를 포함한다.

참조문헌

Claims (32)

1. 생리적 pH에서 불용성이고, 생체적합성이며 무균인 글로빈을 주성분으로서 포함하며, 인간 또는 동물의 몸에 주사 및 이식될 수 있는 제제로서, 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과를 갖는 제제:

   피부 주름, 결함 또는 흉터, 뼈 또는 연골의 공간, 결함, 또는 골절의 충진;

   요도 또는 소화관 조임근을 포함하는 조임근의 확대, 또는 성대의 확대;

   피부, 뼈, 또는 연골의 반흔 형성;

   피부 또는 수술 상처의 치료를 촉진하기 위한, 피부 또는 수술 상처의 보호;

   수술 또는 비수술 상처 또는 흉터의 보호, 분리, 또는 보호 및 분리; 및

   경피 동맥 손상용 지혈 플러그의 형성.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 글로빈은 인간 유래의 글로빈인 제제.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 제제 중의 글로빈은 침전된 상태인 제제.
4. 제 1 항에 있어서, 균질화된 글로빈을 포함하는 제제.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 글로빈은 주사가능한 균질화된 페이스트 형태인 제제.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 균질화된 페이스트는 피하용 주사 바늘을 통해 주사될 수 있는 것인 제제.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 주사가능한 제제 중의 글로빈의 농도는 30 내지 150 mg/g 인 제제.
8. 제 4 항에 있어서, 상기 제제의 pH는 6 내지 8인 제제.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 글로빈은 현탁 상태에 있는 제제.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 글로빈은, 약학적으로 허용가능한 액체 부형제 내에서, pH 6 미만, 또는 pH 8 초과에서, 용액 상태인 제제.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 글로빈은 제제 내에서 젤 형태로 존재하는 제제.
12. 제 1 항에 있어서, 윤활제를 추가로 포함하는 제제.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 윤활제는 트리글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루로네이트, 히알루론산, 산화 셀룰로스, 또는 폴리사카라이드 또는 뮤코폴리사카리드의 용액으로부터 선택되는 제제.
14. 제 1 항에 있어서, 가교제를 포함하는 제제.
15. 제 1 항에 있어서, 상기 제제는 글로빈 필름을 포함하거나 또는 글로빈 필름으로 구성되며, 또한 상기 제제는 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 산화 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세롤을 포함하는 필름 형성제를 추가로 함유할 수 있는 제제.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 필름은 젤 또는 용액을 탈수하여 수득되는 제제.
17. 제 1 항에 있어서, 고형 이식체의 형태로 제조되는 제제.
18. 제 1 항에 있어서, 스폰지 또는 과립 형태로 제조되는 제제.
19. 제 14 항에 있어서, 가교된 것인 제제.
20. 제 15 항에 있어서, 가교제의 첨가, 조사(irradiation), 또는 가교제의 첨가 및 조사에 의해 가교되는 제제.
21. 제 14 항에 있어서, 상기 가교제는 글루타르알데히드, 디알데히드, 및 폴리알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되며, 상기 폴리알데하이드는, 덱스트란, 산화녹말, 또는 산화 히알루론산을 포함하는, 과요오드산으로 산화된 폴리사카라이드를 포함하는 것인 제제.
22. 제 1 항에 있어서, 활성성분으로서, 치료제, 성장인자, 또는 항생제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 제제.
23. 제 1 항에 있어서, 주사 또는 이식 전에, 배양 지지체로서 상기 글로빈 제제를 사용하여 배양된 세포를 포함하는 제제.
24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 충진용 물질의 제조에 사용되는 제제.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 제제는 피부의 공간, 주름 또는 흉터, 및 뼈 또는 연골의 공간 및 골절을 충진하기 위한 물질의 제조에 사용되는 제제.
26. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 조직의 부피를 증대시키기 위해 사용되는 제제.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 조직의 부피 증대는, 요도 또는 소화관 조임근을 포함하는 조임근의 확대, 또는 성대의 확대인 제제.
28. 제 24 항에 있어서, 상기 충진용 물질은 페이스트의 형태인 제제.
29. 제 15 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 필름, 또는 수술 또는 비수술, 외부 또는 내부의 상처 또는 흉터의 보호 또는 분리용 습포의 제조에 사용되는 제제.
30. 제 29 항에 있어서, 필름, 및 인공혈관, 강화성 격자, 또는 다공성 매트릭스를 포함하는 의용 관련 물질의 제조에 사용되는 제제.
31. 제 15 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 또는 수술 상처의 보호, 또는 치료 촉진용 필름의 제조에 사용되는 제제.
32. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 경피 동맥 상처용 지혈 플러그, 피부 반흔 형성용 페이스트, 또는 연골 또는 골 반흔 형성용 물질의 제조에 사용되는 제제.