CN116510065A - 重组人源化iii型胶原蛋白止血海绵及其应用 - Google Patents

重组人源化iii型胶原蛋白止血海绵及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116510065A
CN116510065A CN202310056951.XA CN202310056951A CN116510065A CN 116510065 A CN116510065 A CN 116510065A CN 202310056951 A CN202310056951 A CN 202310056951A CN 116510065 A CN116510065 A CN 116510065A
Authority
CN
China
Prior art keywords
collagen
recombinant
hemostatic sponge
hemostatic
humanized
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310056951.XA
Other languages
English (en)
Inventor
马永
袁佳昀
赵百学
陆静波
杨丽嫔
江辰阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Jingsen Biomedical New Material Technology Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Jingsen Biomedical New Material Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Jingsen Biomedical New Material Technology Co ltd filed Critical Jiangsu Jingsen Biomedical New Material Technology Co ltd
Publication of CN116510065A publication Critical patent/CN116510065A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10—Polypeptides; Proteins
    • A61L24/102—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0036—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/04—Materials for stopping bleeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/34—Materials or treatment for tissue regeneration for soft tissue reconstruction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明涉及一种重组人源化III型胶原止血海绵及其制备方法和应用。目前，业内一直期望实现大分子人源化胶原蛋白或者全人胶原蛋白的生产，一直都是一个难以完全突破的技术难点。本发明的重组人源化III型胶原蛋白分子量更接近于天然胶原蛋白；同时对其编码基因进行优化，实现了重组胶原蛋白的高效、分泌表达，产量较高。而以本发明胶原蛋白制备的止血海绵，相比于市售的同类产品或市售III型类人胶原，不管是体内还是体表都具有更优的止血、凝血效果，且在细胞毒性或溶血方面也具有更高的安全性，有利于产业化推广。因此，本发明的胶原蛋白止血海绵在临床上更利于外科、妇产科、整形科、口腔科等手术中创面止血的应用，使更多的患者从中受益。

Description

重组人源化III型胶原蛋白止血海绵及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域及生物材料领域，具体涉及一种重组人源化III型胶原止血海绵及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是动物体中含量最丰富的一类蛋白质家族，其生物活性使其能参与细胞迁移、分化和繁殖，使结缔组织具有机械强度，此外还能促进细胞生长，具有止血、生物相容性、生物降解性等性质。基于这些特性，胶原蛋白在烧伤、创伤、眼角膜疾病、创伤面止血、药物传递、缓释技术等医药领域均有广泛应用。
至今已发现30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上胶原蛋白分子，常见类型为I、II、III、V和XI型。其中I型胶原蛋白是动物体内含量最多的，占全部胶原蛋白含量的80-90％，其对机体功能作用最强，因此在临床上I型胶原蛋白的应用最广。I型胶原蛋白主要存在于成人皮肤、肌腱及骨组织上，III型胶原蛋白主要存在于婴儿的皮肤或血管内膜、肠道上及成人软骨、玻璃体、椎间盘上等。其中，III型胶原蛋白(CLO3A1)的合成能力很强，能够在创伤修复中将来源于骨髓的干细胞分化成帮助修复的纤维细胞。因此，在生物医药工程中，III型胶原蛋白在修复组织创伤、支撑细胞再组、改善皮肤状态、提升皮肤弹性与柔嫩度等方面应用更为广泛。
传统的胶原蛋白生产工艺主要是通过酸碱水解法从动物组织中提取，但该工艺获得的产品成分复杂，纯度较差，而且在提取过程中极易丧失部分生物活性，临床表现出排斥反应，存在极大的病毒隐患。此外，由于动物组织中III型胶原蛋白含量较少，也限制了其天然提取的可能性。
近年来，随着DNA重组技术的发展，为了能充分利用胶原蛋白的优良特性，研究者们选用各种宿主细胞(如大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物等)，希望生产出安全性好、重现性高、质量稳定的重组人胶原蛋白。大肠杆菌表达系统虽然具有表达量高的特点，但是其存在产生热源、包涵体表达难以纯化、原核系统无翻译后修饰、产物生物活性低等不足；而哺乳动物细胞和昆虫细胞等表达系统虽然具有翻译后修饰功能，但生产周期长、培养难度大、成本高表达量低的缺点限制了应用。毕赤酵母表达系统作为微生物系统兼顾了产物表达量高、容易纯化和具有翻译后修饰的功能，在表达胶原蛋白中具有非常突出的优势。而胶原蛋白亚基的分子量一般都在120kDa左右，远大于一般的生物活性蛋白，且其氨基酸序列中含有大量Gly-X-Y(X、Y代表氨基酸，其中Y多为脯氨酸)重复，因此对于依靠基因工程技术通过生物发酵法获取的重组胶原蛋白或者类似物来说，在表达产物长度与表达水平上都有很大的难度。
因此，目前已有的重组人(类人)III胶原蛋白的公开报道中，主要都是以天然人III型胶原蛋白的部分片段或者部分人III型胶原蛋白片段拼接其他类型人胶原蛋白片段进行重组表达。例如中国专利CN111363029A中公开了一种通过毕赤酵母表达重组人III型胶原蛋白成熟肽的方法，其中所表达的胶原蛋白仅是498个氨基酸。再如中国专利CN103122027B公开的一种重组人源胶原蛋白，其中所表达的蛋白即为人胶原蛋白III型肽段及人胶原蛋白II型肽段所构成的257～501个氨基酸的拼接肽段。再如中国专利CN103725623A中公开了一种分泌表达人III型胶原α链蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用，其中虽然宣称可以分泌表达有1069个氨基酸的人III胶原蛋白成熟肽，但是并未提供详细的表达方面的证据，并且，众所周知常用的大肠杆菌和酵母表达体系中不含脯氨酸羟化酶，因此在不引入外部的例如脯氨酸羟化酶(如P4H)共表达的情况下，由酵母直接表达的胶原蛋白，其中是不可能有羟脯氨酸的，因此，该专利中通过羟脯氨酸含量来计算胶原蛋白表达量也是不可能实现，并且其表达量也仅有1g/L，对于产业化生产仍然较低。而另一方面，分子量大的人源化胶原蛋白相比较于小分子人源化胶原蛋白或者类人胶原蛋白主要有以下优点：(1)小分子人源化胶原或者类人胶原分子量小，所能提供的交联反应的位点基团比较少，因此在同样交联条件下，大分子人源化胶原更容易被交联固定。所制备的生物材料，具有更长的降解时间上限(该时间可以通过交联工艺调节)。尤其对于体内修复的生物材料应用场景时，较长的降解时间才有可能伴随伤口的修复而发挥作用，而小分子胶原生物材料很可能在创伤未完成修复的时候就完全降解吸收，导致材料崩解与伤口修复无法同步。(2)小分子人源化胶原或者人为设计的类人胶原从分子量上来讲更像是大分子胶原蛋白的降解产物明胶，由于较大程度上丧失了分子的完整性，因此在生物体内，依赖于大分子胶原发挥的胶原活性性质就减弱或者很大程度丧失。因此，更大的分子量和更接近天然胶原的结构具有更大的优势。
目前，业内一直期望实现大分子人源化胶原蛋白或者全人胶原蛋白的生产，但是受限于现有的重组表达技术，一直都是一个难以完全突破的技术难点。
本发明的重组人源化III胶原蛋白是以人III型胶原蛋白α1(COL3A1)链氨基酸序列为基础对氨基酸序列进行有效筛选，不仅保留胶原蛋白的核心功能序列，而且分子量更接近于天然胶原蛋白；同时对其编码基因进行优化，以实现重组胶原蛋白的高效、分泌表达，提高产量。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用毕赤酵母进行表达的重组人源化胶原蛋白，其分子量接近于人的天然蛋白，不仅表达量高，也具有优良的生物功能。
本发明的目的之一是提供一种重组人源化III型胶原蛋白，其通过毕赤酵母分泌表达，且氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的所述重组人源化III型胶原蛋白，其编码基因如SEQ ID NO.5所示。
本发明的另一目的是提供一种重组人源化III型胶原蛋白的制备方法，其包含以下步骤
(1)将上述基因序列克隆至表达载体中，转化毕赤酵母工程菌，筛选获得能够高效表达重组人源化胶原蛋白的工程菌；
(2)对基因工程菌进行发酵培养，诱导表达重组人源化胶原蛋白，获得含目标蛋白的发酵液；
(3)对发酵液进行纯化，获得重组人源化III型胶原蛋白。
优选的，所述表达载体为pGAPZαA，所述毕赤酵母工程菌为毕赤酵母GS115。
本发明的另一目的是提供一种重组人源化III型胶原蛋白在制备止血海绵、骨修复材料、医疗或医美用填充材料、化妆品中的应用。
本发明的另一目的是提供一种重组人源化III型胶原止血海绵，所述重组人源化III型胶原止血海绵，含有上述重组人源化III型胶原蛋白。
优选的，所述重组人源化III型胶原止血海绵，按以下方法制备：
(1)在酸性溶液中添加重组III型人源化胶原蛋白，制得胶原蛋白溶液；
(2)将胶原蛋白溶液进行冷冻干燥，再进行交联，即得。
优选的，所述酸性溶液可以是乙酸或稀盐酸。更优选的，所述酸性溶液是乙酸，
优选的，所述交联是真空热交联或化学交联。更优选的，所述交联是真空热交联。
优选的，所述重组人源化III型胶原止血海绵，按以下方法制备：
(1)在1％～3％(vol/vol)乙酸溶液中添加1％～3％(wt/vol)的上述的重组III型人源化胶原蛋白，在常温下磁力搅拌至蛋白完全溶解，制得胶原蛋白溶液；
(2)将胶原蛋白溶液注入适当的模具，进行冷冻干燥，冷冻干燥完成的样品真空干燥箱中真空热交联，制得胶原蛋白止血海绵样品。
本发明的另一目的止血海绵在外科、妇产科、整形科、口腔科等手术中创面止血的应用。
上述止血海绵主要是通过以胶原蛋白溶液直接冻干获得的，其中并未添加其他原料，因此申请人也在此基础上尝试添加其他原料(例如羟基磷灰石)制备成复合材料，令申请人意外的是，相较于天然胶原，本发明胶原蛋白的溶液中羟基磷灰石粉末分散有极大的提高，更有利于模拟天然骨的结构，且以本工艺制备的骨修复复合材料实际修复功效也远高于天然胶原或其他重组胶原蛋白。本发明胶原蛋白在骨修复等复合材料制备中也更具优势。
因此，本发明的另一目的是提供一种人源化III型胶原-羟基磷灰石复合骨修复材料，所述人源化III型胶原-羟基磷灰石复合骨修复材料含有上述重组人源化III型胶原蛋白。
优选的，所述骨修复材料，还含有羟基磷灰石。
优选的，所述骨修复材料，按以下方法制备：
(1)在酸性溶液中添加重组人源化III型胶原蛋白，制得胶原蛋白溶液；
(2)在上述胶原蛋白溶液中分别添加羟基磷灰石粉末，制得含有羟基磷灰石的浆体；
(3)将上述浆体进行冷冻干燥，再进行交联，即得。
优选的，所述酸性溶液可以是乙酸或稀盐酸。更优选的，所述酸性溶液是乙酸，
优选的，所述交联是真空热交联或化学交联。更优选的，所述交联是真空热交联。
优选的，上述人源化胶原-羟基磷灰石复合骨修复材料的制备方法具体如下：
(1)在1％～3％(vol/vol)乙酸溶液中添加1％～3％(wt/vol)的上述的重组III型人源化胶原蛋白，在常温下磁力搅拌至蛋白完全溶解，制得胶原蛋白溶液；
(2)在上述胶原蛋白溶液中添加1％～5％(wt/vol)的200nm羟基磷灰石粉末，在冰水浴中搅拌，制得含有羟基磷灰石的浆体；
(3)将上述浆体分别注入适当的模具，进行冷冻干燥，冷冻干燥完成的样品真空干燥箱中真空热交联，制得胶原蛋白-羟基磷灰石复合骨修复材料样品。
本发明的另一目的是提供一种重组人源化III型胶原-羟基磷灰石复合骨修复材料在牙(颌)骨缺损的填充和修复；各种原因所致的骨缺损、骨不连、骨延迟愈合或不愈合的填充修复中的应用。
与现有技术相比，本发明的显著优点在于：(1)设计的类人胶原蛋白基因是以天然III型人胶原蛋白氨基酸序列为基础，筛选得到第154～1232位残基，保留胶原蛋白的核心功能序列，这样分子量更接近于天然胶原蛋白，在实现重组胶原蛋白分泌表达的同时，更利于增加产量，易于纯化，且具有优良的生物功能；(2)使用pGAPZαA载体可实现重组人源化胶原蛋白基因在毕赤酵母中的高水平表达，而且发酵过程中不需要甲醇诱导，发酵周期短，成本低，生产过程相对安全；(3)通过诱导毕赤酵母工程菌可实现重组人源化胶原蛋白的分泌表达，分泌表达有利于目的蛋白的分离纯化，而且能够减少生产周期和降低生产成本；(4)仅使用一步盐析粗纯化和一步疏水层析纯化即可获得纯度97％以上的目的蛋白，操作简单，生产周期短，具有显著的经济效益。(5)采用本发明重组人源化III型胶原蛋白制备的止血海绵相比于市售的III型类人胶原制备的止血海绵，以及市售的止血海绵具有更优的止血效果。(6)采用本发明重组人源化III型胶原蛋白制备的骨修复材料相比于市售的III型类人胶原或天然I型胶原制备的骨修复材料，具有更好促进成骨细胞生长的功能。
附图说明
图1是重组人源化胶原蛋白A表达载体线性化核酸电泳图。
图2是重组人源化胶原蛋白B(优化前)表达载体线性化核酸电泳图。
图3是重组人源化胶原蛋白B(优化后)表达载体线性化核酸电泳图。
图4是重组人源化胶原蛋白C表达载体线性化核酸电泳图。
图5是重组人源化胶原蛋白A诱导表达鉴定的SDS-PAGE检测图。其中，泳道1为GS115感受态诱导表达上清(阴性对照)；泳道2为重组人源化胶原蛋白A。
图6是重组人源化胶原蛋白B(优化前)诱导表达鉴定的SDS-PAGE检测图。其中，泳道1为GS115感受态诱导表达上清(阴性对照)；泳道2为重组人源化胶原蛋白B(优化前)。
图7是重组人源化胶原蛋白B(优化后)诱导表达鉴定的SDS-PAGE检测图。泳道1为重组人源化胶原蛋白B(优化前)；泳道2为重组人源化胶原蛋白B(优化后)。
图8是重组人源化胶原蛋白C诱导表达鉴定的SDS-PAGE检测图。其中，泳道1为GS115感受态诱导表达上清(阴性对照)；泳道2为重组人源化胶原蛋白C。
图9是重组人源化胶原蛋白发酵液的SDS-PAGE检测图。
图10是重组人源化胶原蛋白粗纯化的SDS-PAGE检测图。
图11是重组人源化胶原蛋白层析纯化色谱图。
图12是重组人源化胶原蛋白纯化后的SDS-PAGE检测图
图13是体外止血模型评相关装置及血液上升情况。左侧第一张照片为参照行业标准YY1477.5-2020制定的评价装置，右侧三张照片血液进入带有供试品的注射器的位置照片。
图14止血海绵植入部位示意图
图15 20G05 VS“艾微停”植入部位肌肉组织镜检结果
图16家兔刺激或皮内反应试验应用部位示意图，图中1—头部；2—试验部位；3—对照部位；4—去毛的背部区域；5—尾部
图17胶原蛋白海绵ICR小鼠急性毒性实验结果
图18 20G05-HA骨修复材料的微观结构
图19 19G291-HA骨修复材料的微观结构
图20COL-HA骨修复材料的微观结构
图21 20G05-HA接种细胞培养2、5、7d
图22 19G291-HA接种细胞培养2d
图23COL-HA接种细胞培养2、5、7d
图24 20G05-HA骨修复材料刺激或皮内反应实验应用部位示意图
图25 20G05-HA骨修复材料进行ICR小鼠急性毒性实验结果
图26 20G05-HA-1接种MC3T3-E1细胞培养7d样品表面和侧面细胞生长情况
图27 20G05-HA-2接种MC3T3-E1细胞培养7d样品表面和侧面部细胞生长情况
图28 20G05-HA-3接种MC3T3-E1细胞培养7d样品表面和侧面部细胞生长情况
图29 20G05-HA-1接种MC3T3-E1细胞培养14d样品表面和侧面部细胞生长情况
图30 20G05-HA-2接种MC3T3-E1细胞培养14d样品表面和侧面部细胞生长情况
图31 20G05-HA-3接种MC3T3-E1细胞培养14d样品表面和侧面部细胞生长情况
具体实施方式
下面将结合实施例及附图对本发明作进一步详细描述。
实施例1含有III型胶原蛋白基因的毕赤酵母表达系统的构建
(1)重组表达载体的构建
1)基因设计
依据蛋白质资源数据库UniProt(网址：http://www.uniprot.org/)公布的人III型胶原蛋白α1链氨基酸序列(P02461-1)为基础，保留胶原蛋白核心功能氨基酸，针对毕赤酵母密码子偏好性对氨基酸序列进行基因的优化设计，主要设计方案为：(1)去除N端前肽第1～153位残基和C端前肽第1233～1466位残基，保留154～1232位氨基酸；(2)去除N端前肽第1～153位残基，保留154～1466位氨基酸；(3)选取第154～615位氨基酸。然后分别在其5’端引入EcoRI酶切位点，3’端携带NotI酶切位点，并且在3’NotI酶切位点前引入终止密码子。所有基因针对毕赤酵母表达体系进行密码子优化，然后委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成相关基因序列，对应的氨基酸序列及核苷酸序列分别如下表所示：
表1不同人III型胶原蛋白序列设计
2)连接转化
将pGAPZαA表达载体和各个COL3A1基因分别使用EcoRI、NotI进行双酶切，37℃酶切4h，分别切胶回收pGAPZαA载体骨架和COL3A1基因，将两者进行连接，连接体系为：载体片段2μl，目的基因6μl，T4 DNA连接酶1μl，T4 DNA连接酶Buffer 1μl，22℃酶连1h。将连接产物转化至大肠杆菌TOP10克隆宿主中，涂布25ug/ml博来霉素的LB平板；挑取单克隆至2ml含300μl LB液体培养基的无菌管中，37℃，220rpm培养4h后，分别取1μl菌液进行PCR鉴定，获得的阳性单克隆即为含目的基因的重组大肠杆菌。分别接种阳性单克隆于200ml液体LB培养基中37℃，220rpm过夜培养，使用天根无内毒素质粒大提试剂盒分别提取质粒，即可获得大量可用于转化毕赤酵母的重组表达质粒。
(2)转化毕赤酵母
使用AvrII内切酶对上述重组表达质粒进行线性化(图1-4)，线性化体系为：AvrII酶3μl，重组表达质粒100μg，10×Cutsmart Buffer 100μl，ddH2O补足1ml，37℃酶切8～12h；首先将线性化体系65℃处理5min，使酶失活，然后加入900μl异丙醇，置于-20℃10min，14000rpm，4℃离心收集沉淀，使用70％乙醇洗涤两次，置于超净工作台中吹干后，加入80μlddH2O，即得线性化产物；然后将线性化产物转化毕赤酵母GS115感受态，在含0.1mg/ml博来霉素的YPD平板上获得重组酵母菌株。从电转化的平板上挑取单克隆，影印到含不同浓度博来霉素的YPD平板上，从而分别获得抗博来霉素浓度为2mg/ml的多拷贝重组酵母菌株。
(3)表达鉴定
接种上述多拷贝酵母菌株以及GS115感受态于5ml BMGY培养基中(GS115感受态作为阴性对照，同时进行诱导)，30℃，200rpm培养3天，每隔24h补加1％甘油，收集诱导表达上清进行SDS-PAGE检测(图5-8)，根据SDS-PAGE检测结果显示设计的4个片段均能有效表达重组人源化胶原蛋白，但是各个蛋白的表达量有较为明显的差异，结果如下表所示：
表2不同设计胶原蛋白表达情况
根据表达蛋白的分子量及表达量，最终确定表达重组人源化胶原蛋白B(优化后)的菌株作为表达类人胶原蛋白的基因工程菌，后续以此为工程菌株进行发明描述，其他片段的表达都没有取得理想效果。
实施例2重组人源化胶原蛋白的诱导表达
对基因工程菌进行发酵培养，从而获得含重组人源化胶原蛋白的发酵液。
发酵所用培养基为：
(1)种子培养基(YPD)：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L；
(2)发酵培养基(BSM)：磷酸26.7ml/L，CaSO4·2H2O 0.93g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·2H2O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40g/L，PTM1 4.0ml/L。
PTM1：CuSO4·5H2O 6.0g/L，KI 0.088g/L，MnSO4·2H2O 3.0g/L，Na2MOO4·2H2O0.2g/L，H3BO3 0.02g/L，CoCl2·6H2O 0.5g/L，ZnCl2 20.0g/L，FeSO4·7H2O 65.0g/L，Biotin 0.2g/L，浓H2SO4 5.0ml，过滤除菌后，4℃保存。
(3)补料培养基：50％甘油(W/V)，每1L中含有12ml PTM1微量元素。
重组人源化胶原蛋白工程菌的发酵及诱导表达过程为：
首先将工程菌接种至YPD液体培养基中进行培养，培养温度为30℃。当OD600达到4-8时，可作为发酵种子。设定发酵罐参数为温度30℃，转速200-700rpm、通气量4L/min(发酵罐自动调节)，溶氧保持在30％以上，使用氨水调节pH至5.0。然后将上述发酵种子液打入无菌发酵罐中，开始发酵培养。当碳源耗尽后，开始补加补料培养基，当菌体湿重达220g/L时，结束发酵，离心收集发酵液。
SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况如图9所示，产量约为10g/L。
本发明利用毕赤酵母对重组人源化胶原蛋白进行生产，发酵过程中不需要添加甲醇，节省生产成本，简化操作流程，发酵周期短，同时保证重组人源化胶原蛋白的高水平表达。
实施例3重组人源化胶原蛋白的纯化
对上述发酵液进行纯化，获得重组人源化胶原蛋白，纯化步骤如下：
(1)向发酵液中加入硫酸铵，浓度为160g/L，然后8000rpm离心收集盐析沉淀，盐析沉淀使用纯化水复溶(图10)；
(2)向上述盐析沉淀复溶产物中加入0.8M硫酸铵，调节pH至7.4，经滤膜过滤后，使用疏水层析柱进行层析纯化，纯化结合缓冲液为10mM磷酸二氢钠，0.8M硫酸铵，pH7.4，洗脱缓冲液为10mM磷酸二氢钠，pH7.4，纯化过程中收集洗脱峰(图11)，SDS-PAGE检测结果表明经过本次纯化，重组人源化胶原蛋白纯度可达97％以上(图12)。
(3)经冷冻干燥，获得重组人源化胶原蛋白纯品。
本发明的纯化方法仅使用一步盐析及一步疏水层析纯化，纯化过程中无需换液，操作简单，生产周期短，且最终纯度可达97％以上，可满足生物材料开发要求。
实施例4胶原蛋白原料安全性实验
为了验证本发明表达的重组人源化胶原蛋白20G05是否符合生物安全性标准要求，进行了如下安全性评价，以天然牛I型胶原蛋白COL(购自河北考力森生物科技有限公司)作为对照品。
<细胞毒性检测>
实验方法简述：
表3
细胞名称 L929
培养基 MEM+10％FBS培养基
种板数量 5000个/孔
给药方式 蛋白溶液给药
共培养条件 24h，(37±1)℃
检测方法 CCK8法
判定方法 存活率＞70％，判定为无细胞毒性
将20G05和COL这两种胶原蛋白原料，按照1.25mg/mL的浓度溶解于培养基中，过滤后进行L929细胞毒性实验，完成了对胶原蛋白原料本身细胞毒性的评价。实验结果如下：
表4
从上述结果可以看出，20G05和COL原料不存在明显的细胞毒性，用于胶原蛋白止血海绵制备是相对安全的。基于此，可以推测本发明重组人源化III型胶原，可用于骨修复材料、止血海绵、医疗或医美用植入式填充材料、化妆品等多种产品的制备，不存在安全性问题。
实施例5止血海绵样品制备
在3％(vol/vol)乙酸溶液中分别添加1％(wt/vol)的①重组III型人源化胶原蛋白20G05、②重组III型人源化胶原蛋白19G291(购自江山聚源生物技术有限公司，或按中国专利CN102443057B制备)和③天然牛I型胶原蛋白COL(购自河北考力森生物科技有限公司)，分别在常温下磁力搅拌至蛋白完全溶解，使用滤膜进行过滤，制得三种胶原蛋白溶液。
将三种胶原蛋白溶液分别注入100*100mm的模具，在冻干机中按冻干曲线(-20℃保温5小时，在30小时内逐步升温至室温)进行冷冻干燥，制得胶原蛋白海绵样品。
将冷冻干燥完成的三种胶原蛋白海绵样品置于真空干燥箱中，150℃真空热交联10小时，制得胶原蛋白止血海绵样品，分别记为20G05-DHT，19G291-DHT，COL-DHT。
本实施例仅用于说明本发明，但不是用来限制本发明范围，相关制备条件也不局限于上述条件，例如：乙酸溶液可进一步用稀盐酸替代，真空热交联也可以换用化学交联法。
实施例6止血海绵吸水率评价
吸水率是止血海绵的重要理化性能指标，较高的吸水率(行业标准为>2000％)是实现止血功能的基本条件。进行三种胶原蛋白海绵的吸水率测试，具体方法如下：
取一定量的海绵，称量干重为m1，浸入纯化水中，用镊子轻压直至完全浸湿，放置2h，确保所有空气完全排除，保证样品完整性，待样品吸足水分后，用小镊子轻轻夹住一角将其从水中取出，注意不挤压样品，轻持镊子在水面上排水1min后再次称量样品湿重为m2，吸水率按下式计算。重复检测5次，取平均值。计算公式：吸水率(％)＝(m2-m1)/m1*100％分别进行三种样品和对照品“艾微停微纤维止血胶原(海绵)”(购自巴德医疗科技(上海)有限公司)的吸水率测试，结果如下表所示。
表5各样品吸水率
实验结果显示，三种样品和对照品吸水率均高于行业标准规定的2000％的吸水率要求，其中20G05-DHT和COL-DHT的样品吸水率更高，在实现止血功能方面具有一定的优势。
实施例7止血海绵体外凝血功效评价
止血功能是评价止血海绵功效的主要指标，采用体外凝血实验来对比胶原蛋白止血海绵的功效，具体方法如下：
实验动物：家兔
供试品：1)阴性对照组：纱布(10mg/样)；2)阳性对照品：艾微停微纤维止血胶原(海绵)(10mg/样)；3)试验样品：2种重组胶原止血海绵(10mg/样)
操作步骤：1)制备抗凝兔血：将15mg/mL EDTA抗凝剂按照1:9的比例与抽取的新鲜兔血进行充分混匀；2)将供试品(阴性对照、阳性对照、检测样品)置于50mL离心管内，并准备一组空50mL离心管作为空白对照组；3)将抗凝兔血、0.2M氯化钙溶液按照9:1的比例进行混合，每个离心管内加0.5mL混合兔血；4)将含有兔血的离心管置于37℃水浴5min，期间确认海绵与血液充分接触；5)向每个离心管内加入40mL蒸馏水，37℃、120rpm/min振摇20min(使得游离的红细胞破裂)；6)取离心管内上清液在540nm处检测吸光度。
数据处理方法：BCI是凝血效果的指标，其处理方式如下：
BCI(％)＝样品吸光度/空白对照组吸光度*100％(BCI值越小，表示止血材料的止血效果越好)
分别进行2种样品和对照品“艾微停微纤维止血胶原(海绵)”的体外凝血功能测试，结果如下表所示。
表6
通过体外凝血实验结果可以看出，与市售对照品“艾微停微纤维止血胶原(海绵)”和其他重组III型胶原制备止血海绵相比，20G05-DHT体现出明显的功效优势(BCI值越高，凝血作用越差)，因此，20G05胶原制备的止血海绵能实现更好的止血功能。
实施例8体外止血模型评价
实验动物：家兔
供试品：1)样品：20G05重组III型人源化胶原蛋白海绵；2)对照品：艾微停微纤维止血胶原(海绵)
操作步骤(参照行业标准YY1477.5-2020制定)：
1)实验装置搭建：
构建止血性能的体外模型的试验装置主要由试样夹持装置、负压系统及连接管路等组成，如图13所示：
选用1mL注射器套筒和0.3mm注射针(平针)，将供试品裁切成直径5mm，厚2mm的圆片，借助注射器的芯杆将各试样植入注射器的底部，再将橡胶固定件(将注射器的橡胶活塞的盲端切去制得一个带有通孔的固定件，未切割的平滑端与供试样品接触)推至样品上方，注射器尾端连接负压管路，即完成装置搭建；
2)制备抗凝兔血：将15mg/mL EDTA抗凝剂按照1:9的比例与抽取的新鲜兔血进行充分混匀；
3)将供试样品和对照品按照步骤1中的要求裁切好，制备三个平行样，并将裁切好的试样按步骤1的方法各装入一个1mL注射器备用；
4)依次进行实验，取0.9mL抗凝兔血、0.1mL 0.2M氯化钙溶液在2mL离心管中进行混合后将离心管置于夹持装置底部，将步骤3备好的装有供试品的注射器装在夹持装置上，连接好负压管路，开启恒定负压，将注射器下移，注射针进入兔血中，使兔血匀速上升，通过供试样品；
5)从血液接触供试样品下底面开始进行计时，观察60s内血液的上升情况。血液在接触供试品后，在样品止血作用的影响下，血液继续上升的速度会不同程度减缓，因此对比供试样品和对照品的血液上升情况，可以分析出止血作用的差异。
实验结果：
1)60s内血液的上升情况如图13所示；
2)20G05重组III型人源化胶原蛋白海绵组，血液在通过供试品后，均不再上升，取出供试品进行分析发现样品内部发生凝血，是阻挡血液不再上升的主要原因；对照品组，60s内血液上升到了明显更高的位置，且仍能够继续上升，说明对照品减缓血液上升速度的能力有限。因此，从供试样品和对照品的血液上升情况对比结果可以看出，20G05重组III型人源化胶原蛋白海绵在体外止血模型评价中表现出明显优于对照品的止血功能，在实现止血功能方面具有明显优势。
实施例9止血海绵肝脏止血试验
供试品：1)样品：20G05重组III型人源化胶原蛋白海绵；2)对照品：艾微停微纤维止血胶原(海绵)、博纳塞医用胶原海绵(购自博纳格科技(北京)有限公司)。
试验方法：
1)将止血海绵和无菌纱布剪裁成边长1.5cm大小，厚度相仿的方块若干，称重后置于手术托盘中，备用。
2)大鼠称重。按体重腹腔注射10％水合氯醛麻醉剂，使其全身麻醉，固定大鼠(背朝下)。剔去胸前4×4cm2面积毛发，75％医用酒精消毒，消毒后铺上消毒洞巾，整个实验过程均无菌操作。
3)在肋弓下沿着上腹部正中竖切口长约3cm左右，逐层开腹，切开肌肉层，暴露肝脏。在切口下侧放置无菌纱布，将肝脏中叶游离出腹腔至纱布上。
4)用纱布洗净肝脏表面以及腹腔周围的积液。用手术刀在肝叶表面进行部分肝脏切除，待创面明显出血，用纱布迅速蘸去血液后立即将止血材料覆盖到出血切口表面并轻轻按压。
5)覆盖止血材料1min后轻轻取下材料，观察创面出血情况，如有活动性出血则继续覆盖按压，若材料被血液完全浸透则更换新的相同材料，重复施压直至创面无血渗出。以去除海绵后30s内不再有活动性出血为止血标准，记录肝创面出血量。
结果评价
出血量(g)＝止血后(纱布和止血材料重量)-止血前(纱布和止血材料重量)
表7
止血前纱布和止血材料重量(g) 止血后纱布和止血材料重量(g) 出血量(g)
艾微停 19.2 20.7 1.5
20G05 19.5 19.7 0.2
博纳塞 126.4 127 0.6
艾微停：试验结束未能完成凝血，创口仍存在活动性出血。
20G05：创口大小与艾微停相似，试验结束已完成凝血，且止血过程无需按压，可自行贴附创口，无活动性出血后，轻松取下，无黏连现象。
博纳塞：创口大小与艾微停相似，试验结束创口仍存在轻微活动性出血，不能自行贴附创口，需进行按压。
实施例10止血海绵安全性评价
为了验证20G05重组人源化胶原蛋白制备的止血海绵符合生物安全性标准要求，进行了如下安全性评价，以市售“艾微停微纤维止血胶原(海绵)”作为对照品。
<细胞毒性评价>
浸提方法：浸提比：3cm2/mL，浸提溶液：MEM培养基+10％FBS，浸提时间(24±2)h，浸提温度：(37±1)℃。实验方法简述：
表8
细胞名称 L929
种板数量 5000个/孔
给药方式 浸提液给药
共培养时间 24h
检测方法 CCK8法
判定方法 存活率＞70％，判定为无细胞毒性
分别进行20G05海绵样品和对照品“艾微停微纤维止血胶原(海绵)”的细胞毒性评价测试，结果如下表所示。
从细胞毒性结果可以看出，与市售对照品“艾微停微纤维止血胶原(海绵)”相比，20G05胶原制备的止血海绵也不存在明显的细胞毒性。
<溶血实验>
浸提方法：浸提比：3cm2/mL，浸提溶液：生理盐水，浸提时间(72±2)h，浸提温度：(37±1)℃。
具体方法如下：
1)供试品配制：①样品浸提液配置：按照上述浸提方法进行配置；②阳性对照品：纯化水，无需配置；③阴性对照品：0.9％氯化钠注射液，无需配置。
2)红细胞悬液制备：取无菌脱纤维兔血，加10倍量0.9％氯化钠注射液，混匀。离心300g，15min后取沉淀，弃上清液，至上清液不显示红色为止。将所得的红细胞用0.9％氯化钠注射液稀释成2％红细胞悬液，备用。
3)加样、温育：
表10
样品浸提液/mL 0.9％氯化钠注射液/mL 纯化水/mL 2％红细胞悬液/mL
样品组 1 0 0 1
阳性对照品 0 0 1 1
阴性对照品 0 1 0 1
按照上表进行加样，混匀后，立即置于37℃水浴锅中温育3h。
4)结果观察与评价：①各管分别于水溶液中水浴15min、30min、45min、1h、2h、3h肉眼观察结果，倒出管内液体，800g，5min离心，取200μL上清液于96孔板内。将96孔板置于酶标仪中，540nm处测其吸光度。②溶血率小于5％符合本试验要求。
HR＝(A-B)/(C-B)×100％
式中：HR：试验样品溶血率％；A：试验样品组吸光度；B：阴性对照组吸光度；C：阳性对照组吸光度
制备的20G05胶原蛋白海绵和阴性对照品生理盐水、阳性对照品纯化水进行体外溶血实验评价，实验结果如下表所示：
表11
通过体外溶血实验可以看出，20G05重组III型人源化胶原蛋白海绵体外溶血评价的结果符合国家标准的要求(溶血率＜5％)，在溶血方面安全可靠。
实施例11止血海绵肌肉植入实验
具体方法如下：
实验动物家兔(新西兰兔，2.0-3.0kg，雄性)
操作步骤：1)采用套针植入法，将植入物沿肌纤维长轴平行植入肌内。2)采用家兔脊柱旁肌时，将4个试验材料样品植入每只家兔脊柱一侧肌内，应平行于脊柱，离中线25～50mm，各植入物间隔约25mm。同法在脊柱另一侧植入4个对照材料样品。植入部位如图14所示。
植入规格：参照GB16886.6-2015医疗器械生物学评价第6部分：植入后局部反应试验中对块状材料的要求，制成直径1～3mm、长10mm、两端为圆头的试验样品。
临床观察：应检查每一植入部位正常组织结构的改变，宜包括局部引流淋巴结的评定，推荐采用低倍放大镜。记录观察到的任何组织反应的性质和程度，比如血肿、水肿、囊腔和/或其他大体发现。并记录植入物的存在、形态和位置，包括可解决材料可能的残留物。大体照片应形成文件。
此外对植入部位的检查中，一旦动物显示不健康或对植入物的反应迹象时，如适用应进行大体尸检。
植入样本采集与评定：采集植入部位组织，进行固定、脱水、包埋等操作制成蜡块，将蜡块进行切片，HE染色，通过光学显微镜观察对样品进行组织学评价。
评价指标：1)炎症程度；2)材料参数，如破裂、和/或碎片存在、可降解材料残留物的形状和位置。
20G05胶原蛋白海绵和阳性对照品“艾微停微纤维止血胶原(海绵)”进行家兔肌内植入后局部反应试验，实验结果如下：
临床观察评价：植入1天后，一只家兔死亡(术后感染所致)，其余家兔植入1、3、5天植入点皮肤无出血、红肿和样品排除现象。植入周期内，动物一般状态观察，未见异常情况。
解剖观察评价：植入1、2、4、8周后，植入部位肌肉组织未见炎症反应及其他异常情况。
镜检评价：镜检结果如图15所示。
20G05海绵样品与阳性对照品“艾微停”在家兔肌肉内均呈现正常降解状态，初步判断20G05样品在家兔肌肉内的降解周期为4-8周。
通过家兔肌内植入后局部反应试验结果表明20G05胶原蛋白海绵符合国家标准的要求。
实施例12止血海绵刺激或皮内反应实验
浸提方法：浸提比：3cm2/mL，浸提溶液：生理盐水，浸提时间(72±2)h，浸提温度：(37±1)℃。
固定方法：使用透气性胶带进行固定(固定后时有胶带、纱布掉落现象，需时常进行观察)。
给药动物：家兔
具体方法如下：
1)供试品配制：①试验品：样品浸提液。②阳性对照品：20％SDS生理盐水溶液(现配现用)。③阴性对照组：生理盐水。
2)给药方法：①将吸水性纱布裁剪成2.5cm×2.5cm大小，堆叠5-6层适宜。②将相应的浸提液滴到纱布块上，浸提液的用量以能浸透纱布块为宜，一般每块纱布滴0.5mL，按图16所示部位敷贴于动物背部两侧。③用绷带(半封闭性或封闭性)固定敷贴片至少4h。④接触期结束后取下敷贴片，用持久性墨水对接触部位进行标记。⑤用适当的方法除去残留试验材料，如用温水或其他适宜的无刺激性溶剂清洗并拭干。⑥给药途径：皮肤接触。⑦给药频率和速率：单次接触试验，固定敷贴片至少4h。
3)观察与评分：①观察频率及时间：单次接触试验时，分别在除去敷贴片后(1±0.1)h、(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h记录接触部位情况。②观察内容：观察动物皮肤在规定时间内试验材料引起的红斑与水肿情况并评分。③动物反应观察判定：根据下表记录每个试验部位的评分。
表12皮肤反应记分系统
4)结果评价:
①计算原发性刺激指数(PII)
在72h评分后，将每只动物由试验材料在(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h引起的全部红斑与水肿的原发性刺激记分相加，再将所有记分之和除以6(两个试验/观察部位，3个时间点)，即得PII。
注：仅使用(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h的观察数据进行计算。
②报告相应的反应类型
根据原发性刺激指数，对照下表报告各组试验样品的反应类型，即可对止血海绵样品在试验条件下产生皮肤刺激反应的潜在性做出评价。
表13兔原发性或累积刺激指数类型
平均记分 反应类型
0～0.4 极轻微
0.5～1.9 轻度
2～4.9 中毒
5～8 重度
样品20G05胶原蛋白海绵和阴性对照品生理盐水、阳性对照品20％SDS进行家兔刺激或皮内反应试验，实验结果如下表所示：
表14家兔刺激或皮内反应试验实验结果1
表15家兔刺激或皮内反应试验实验结果2
家兔刺激或皮内反应试验结果表明：20G05-DHT样品浸提液对家兔皮肤刺激指数与阴性对照品生理盐水一致，因此20G05胶原蛋白海绵家兔刺激或皮内反应试验评价的结果符合国家标准的要求。
实施例13止血海绵急性毒性实验
浸提方法：浸提比：3cm2/mL，浸提溶液：生理盐水/植物油，浸提时间(72±2)h，浸提温度：(37±1)℃。
实验动物：①种属/品系：ICR小鼠；②性别：雄性；动物等级：③SPF级；④实验动物规格：17-23g
具体方法如下：1)给药频率和速率：依据动物体重进行给药，单次给药，注射速度恒定且不超过0.1mL/s。
表16分组与给药信息表
2)临床观察：①检测动物：1～4组动物；②观察频率及时间：浸提液注射完毕后，观察动物及时反应，并于4h、24h、48h和72h观察和记录各组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数。③观察内容：包括但不限于动物死亡或濒死，以及精神状态、行为活动、进食情况、粪便性状、呼吸状态、眼睑状态等情况。
3)体重：①检测动物：1～4组动物；②检测时间：D1～D4，每日固定时间测量体重。濒死动物不称重；③检测周期：计划至D4结束，在未知情况下制定的计划可根据实际情况做适当调整，做好方案更改记录。
4)结果评价：①在72h观察期内，试验组动物的反应不大于溶剂对照组动物，则判定试验样品无急性全身毒性反应。②试验组动物有2只或者2只以上出现中度毒性症状或死亡，3只或3只以上出现体重下降超过10％，则判定试验样品有急性全身毒性反应。③试验动物出现轻微毒性症状，或不超过1只动物出现中度毒性症状或死亡，或虽无毒性症状但组内动物体重普遍下降，则另取小鼠10只进行复试。
样品20G05胶原蛋白海绵进行ICR小鼠急性毒性实验，实验结果如下表和图17所示：
表17小鼠急性毒性实验结果
表18
ICR小鼠急性毒性实验结果表明：20G05生理盐水/植物油浸提液组小鼠体重与溶剂对照组体重无差异，且一般行为学观察发现，各组小鼠均处于正常状态。样品20G05胶原蛋白海绵ICR小鼠急性毒性实验评价的结果符合国家标准的要求。
实施例14不同胶原浓度止血海绵的制备及其吸水率评价
<样品制备>
在1％(vol/vol)乙酸溶液中分别添加3％、5％、10％(wt/vol)的重组III型人源化胶原蛋白20G05，分别在常温下磁力搅拌至蛋白完全溶解，使用滤膜进行过滤，制得三种胶原蛋白溶液。
将三种胶原蛋白溶液分别注入100*100mm的模具，在冻干机中按冻干曲线(-20℃保温5小时，在30小时内逐步升温至室温)进行冷冻干燥，制得胶原蛋白海绵样品。
将冷冻干燥完成的三种重组III型人源化胶原蛋白海绵样品置于真空干燥箱中，150℃真空热交联10小时，制得重组III型人源化胶原蛋白海绵样品，分别记为20G05-1，20G05-2，20G05-3。
<吸水率评价>
具体实验方法参照实施例6执行。
分别进行三种样品的吸水率测试，并与对照品进行对比，结果如下表所示。
表19
实验结果显示，三种样品的吸水率均高于行业标准规定的2000％的吸水率要求，其中20G05-1的吸水率最高，另两种样品也具有较高的吸水率，均高于对照品，在实现止血功能方面具有一定的优势。
实施例15不同交联条件止血海绵的制备及吸水率评价
在3％(vol/vol)乙酸溶液中分别添加1％(wt/vol)的重组III型人源化胶原蛋白20G05，分别在常温下磁力搅拌至蛋白完全溶解，使用滤膜进行过滤，制得胶原蛋白溶液。
将胶原蛋白溶液分别注入100*100mm的模具，在冻干机中按冻干曲线(-20℃保温5小时，在30小时内逐步升温至室温)进行冷冻干燥，制得胶原蛋白海绵样品。
将冷冻干燥完成的胶原蛋白海绵样品置于真空干燥箱中，分别在140℃、150℃、160℃真空热交联10小时，制得三种重组III型人源化胶原蛋白海绵样品，分别记为20G05-140，20G05-150，20G05-160。
吸水率是止血海绵的重要理化性能指标，较高的吸水率(行业标准为>2000％)是实现止血功能的基本条件。进行三种胶原蛋白海绵的吸水率测试，具体方法如下：
取一定量的海绵，称量干重为m1，浸入纯化水中，用镊子轻压直至完全浸湿，放置2h，确保所有空气完全排除，保证样品完整性，待样品吸足水分后，用小镊子轻轻夹住一角将其从水中取出，注意不挤压样品，轻持镊子在水面上排水1min后再次称量样品湿重为m2，吸水率按下式计算。重复检测5次，取平均值。计算公式：吸水率(％)＝(m2-m1)/m1*100％分别进行三种样品的吸水率测试，并与对照品进行对比，结果如下表所示。
表20
实验结果显示，三种样品的吸水率均高于行业标准规定的2000％的吸水率要求，其中20G05-150的吸水率最高，另两种样品也具有较高的吸水率，均高于对照品，在实现止血功能方面具有一定的优势。
实施例16骨修复材料制备
上述实施例相关的止血海绵主要是通过以胶原蛋白溶液直接冻干获得的，其中并未添加其他原料，因此申请人也在此基础上尝试添加其他原料(例如羟基磷灰石)制备成复合材料，令申请人意外的是，相较于天然胶原，本发明胶原蛋白的溶液中羟基磷灰石粉末分散较好，更有利于模拟天然骨的结构，且以本工艺制备的骨修复复合材料实际修复功效也更优。本发明胶原蛋白在骨修复等复合材料制备中更具优势。
具体样品制备及评价如下：
在3％(vol/vol)乙酸溶液中分别添加1％(wt/vol)的①重组III型人源化胶原蛋白20G05、②重组III型人源化胶原蛋白19G291(购自江山聚源生物技术有限公司，或按中国专利CN102443057B制备)和③天然牛I型胶原蛋白COL(购自河北考力森生物科技有限公司)，分别在常温下磁力搅拌至蛋白完全溶解，使用滤膜进行过滤，制得三种胶原蛋白溶液。
在上述三种胶原蛋白溶液中分别添加1％(wt/vol)的200nm羟基磷灰石粉末(Macklin，货号：H875580，批号：C10963596)，分别在冰水浴中搅拌30分钟，制得三种含有羟基磷灰石的浆体。
将上述三种浆体分别注入100*100mm的模具，在冻干机中按冻干曲线(-20℃保温5小时，在30小时内逐步升温至室温)进行冷冻干燥，冷冻干燥完成的样品真空干燥箱中150℃真空热交联10小时，制得胶原蛋白-羟基磷灰石复合骨修复材料样品。制备的三种骨修复材料分别记为20G05-HA、19G291-HA和COL-HA。
本实施例仅用于说明本发明，但不是用来限制本发明范围，相关制备条件也不局限于上述条件，例如：乙酸溶液可进一步用稀盐酸替代，真空热交联也可以换用化学交联法。
实施例17骨修复材料微观形貌观察
自体骨修复是骨修复技术的金标准，但自体骨修复因来源有限而受到很多限制，因此开发理想的骨修复材料是实现更好骨修复技术的关键。理想的骨生物材料是尽量模拟天然骨的成分与结构，上述工艺制备的骨修复材料在成分方面与天然骨一致，因此需进一步评价上述样品的微观结构。
天然骨是由细胞外基质和其中包埋的细胞组合而成的天然复合材料。细胞外基质由矿化的胶原纤维构成，羟基磷灰石晶体在胶原纤维中紧密排布的纳米结构和精密的三维空间结构为生物体提供了坚强的支撑，胶原纤维的高张力强度与抗压的纳米晶体巧妙地结合决定了骨骼独特的负载性质。羟基磷灰石晶体因为胶原层与层的重叠，构成了骨盐的框架结构。这一取向结构的结合力强，不易产生位错及层错，有利于提高机体的稳定性和性能。从骨的结构分析来看，存在两个不同结构层次的复合，即羟基磷灰石增强胶原纤维构成3～7μm的同轴层环状结构和在毫米到微米尺度上骨小管增强间隙骨。骨基质这种微妙的结构与排列方式，既能满足结构的稳定，又能满足正常的生物吸收与交换。
使用扫描电镜观察三种骨修复材料的微观形貌，对比分析其微观结构在模拟天然骨方面的优劣，实验结果如图18～图20所示：
天然胶原溶解性差，溶液粘度很高，因此羟基磷灰石粉末分散较差，样品内部不均匀，较难模拟天然骨的结构，见图20；20G05和19G291两种重组胶原均具有较好的溶解性，能够较为均匀的结合，见图18、19。对比20G05-HA和19G291-HA两种骨修复材料的微观形貌，20G05-HA的微观结构更加均匀，且实现了羟基磷灰石晶粒和胶原纤维在纳米尺度结合，同时材料内部存在多尺度的孔隙结构，达到了更好地仿生天然骨复合材料制备的目的。实现多级结构仿生，进一步模仿天然骨结构，羟基磷灰石晶粒嵌于胶原纤维内部，结合紧密，羟基磷灰石晶体在胶原纤维中紧密排布的纳米结构和精密的三维空间结构。这主要源自20G05胶原的分子设计使其能与羟基磷灰石更好地复合模拟天然骨的组成与结构。
实施例18骨修复材料生物功能性评价
为了验证材料进行修复的有效性，进行MC3T3细胞进行细胞接种试验，采用扫描电镜观察细胞贴附生长情况。将三种骨修复材料样品裁切成6mm*6mm*3mm小块进行细胞接种试验，对比分析生物功能性，具体步骤如下：
材料上接种细胞：①细胞状态观察：取一瓶细胞，显微镜下观察细胞状态，目测细胞生长状态良好且生长融合至85％以上即可消化；②消化：吸去培养基，根据使用培养瓶大小加适量PBS清洗一遍，吸去PBS，加胰酶消化后(胰酶添加量以摇晃后能铺开培养瓶底面为准，不宜过量)，37℃孵育，显微镜下观察，细胞开始脱落立刻加两倍胰酶量的培养基终止消化，并反复吹打使得瓶内细胞脱落，将培养瓶内液体转移至离心管内，离心250g，5min(注意配平)，弃去上清液，吸培养基入离心管内，充分混匀成细胞悬液；③细胞计数：取10μl细胞悬液加10μl台盼蓝混匀，显微镜下计数；④制备细胞悬液：取步骤②中的细胞悬液加入到培养基中。⑤接种细胞：样品在接种前先用培养基润湿直至样品在培养基内平铺开。润湿完成后，使用无菌镊子加入孔板中，吸干培养基。在充分混匀的细胞悬液中，吸取细胞悬液滴加在样品膜表面，注意细胞悬液需均匀平铺在膜表面，避免过于集中，拍摄时难以找到接种点。⑥待细胞与材料充分黏附后，加培养基，培养2、5、7d。
固定：将培养好的材料取出。①2.5％戊二醛固定：吸弃原有培养基，加PBS，吹洗材料，吸弃PBS，3次，加入2.5％戊二醛固定过夜(室温)。②酒精梯度洗脱：吸弃固定细胞的戊二醛，使用梯度酒精对样品进行脱水。用30％、50％、70％、80％、90％、95％酒精各浸泡10～15min，100％酒精浸泡3次，10min/次。③样品干燥：60℃真空干燥，干燥后的样品存于干燥器中。
扫描电镜观察：使用表面扫描电镜对样品上细胞贴附生长和增殖的情况进行观察。
实验结果如图21～图23所示。
19G291-HA样品培养2d，表面几乎观察不到细胞的贴附生长，且样品崩解严重，难以维持较好的结构，5d、7d实验无法继续开展，其生物功能性较差。
20G05-HA和COL-HA进行对比，20G05-HA在细胞数量和增殖速度方面明显优于COL-HA样品。20G05-HA样品能够更好的贴附MC3T3细胞，细胞形态和生长情况均更好，可以体系体现出样品具有更好促进成骨细胞生长的功能性，20G05样品因其分子设计，实现更好的仿生制备，在生物学功能性方面也体现出明显的优势。
实施例19骨修复材料生物安全性评价
为了验证20G05-HA重组III人源化胶原蛋白-羟基磷灰石复合骨修复材料是否符合生物安全性标准要求，进行了如下安全性评价，以COL-HA作为对照品。
<细胞毒性评价>
具体实验方法参见实施例10执行。
分别进行20G05-HA和COL-HA样品的细胞毒性评价测试，结果如下表所示。
表21
细胞毒性结果表明：20G05-HA和COL-HA的细胞毒性均符合国家标准的要求，细胞毒性方面不存在明显的安全性问题。
<溶血实验>
具体实验方法参见实施例10执行。
20G05-HA与COL-HA两种样品和阴性对照品生理盐水、阳性对照品纯化水进行体外溶血实验评价，实验结果如下表所示：
表22
通过体外溶血实验可以看出，20G05-HA和COL-HA样品的体外溶血评价的结果符合国家标准的要求(溶血率＜5％)，在溶血方面安全可靠。
实施例20骨修复材料刺激或皮内反应实验
固定位置按图24执行，其他实验方法均参考实施例12执行。
样品20G05-HA骨修复材料和阴性对照品生理盐水、阳性对照品20％SDS进行家兔刺激或皮内反应试验，实验结果如下表所示：
表23家兔刺激或皮内反应试验实验结果1
表24家兔刺激或皮内反应试验实验结果2
家兔刺激或皮内反应试验结果表明：20G05-HA样品浸提液对家兔皮肤刺激指数与阴性对照品生理盐水一致，因此，20G05-HA骨修复材料家兔刺激或皮内反应试验评价的结果符合国家标准的要求。
实施例21骨修复材料急性毒性实验
分组与给药信息参考下表执行，其他实验方法参考实施例13执行。
表25分组与给药信息表
样品20G05-HA骨修复材料进行ICR小鼠急性毒性实验，实验结果如下表和图25所示：
表26小鼠急性毒性实验结果
/>
表27
ICR小鼠急性毒性实验结果表明：骨修复材料生理盐水/植物油浸提液组小鼠体重与溶剂对照组体重无差异，且一般行为学观察发现，各组小鼠均处于正常状态。样品骨修复材料ICR小鼠急性毒性实验评价的结果符合国家标准的要求。
实施例22不同胶原浓度骨修复材料样品制备及其生物功能性评价
<样品制备>
在1％(vol/vol)乙酸溶液中分别添加1％、2％、3％(wt/vol)的重组III型人源化胶原蛋白20G05，分别在常温下磁力搅拌至蛋白完全溶解，使用滤膜进行过滤，制得三种胶原蛋白溶液。
在上述三种胶原蛋白溶液中分别添加5％(wt/vol)的200nm羟基磷灰石粉末(Macklin，货号：H875580，批号：C10963596)，分别在冰水浴中搅拌30分钟，制得三种含有羟基磷灰石的浆体。
将上述三种浆体分别注入100*100mm的模具，在冻干机中按冻干曲线(-20℃保温5小时，在30小时内逐步升温至室温)进行冷冻干燥，冷冻干燥完成的样品真空干燥箱中150℃真空热交联10小时，制得胶原蛋白-羟基磷灰石复合骨修复材料样品。制备的三种骨修复材料分别记为20G05-HA-1、20G05-HA-2和20G05-HA-3。
<生物功能性评价>
为了验证材料进行修复的有效性，进行MC3T3细胞进行细胞接种试验，采用扫描电镜观察细胞贴附生长情况。将三种骨修复材料样品裁切成6mm*6mm*3mm小块进行细胞接种试验，对比分析生物功能性，具体步骤参见实施例18.
实验结果如图26～31所示。
从表面和侧面细胞贴附生长和增殖情况可以看出，20G05-HA-1/2/3样品能够很好的贴附MC3T3细胞，细胞形态和生长、增殖情况均很好，可以体系体现出样品具有更好促进成骨细胞生长的功能性，其中20G05-HA-2最优，可以作为优选工艺。

Claims (9)

1.一种重组人源化III型胶原蛋白止血海绵，其特征在于，其含有重组人源化III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的止血海绵，其中所述重组人源化III型胶原蛋白，其编码基因如SEQ ID NO.5所示。
3.如权利要求1所述的止血海绵，其中所述重组人源化III型胶原蛋白由以下方法制备：
(1)将如权利要求3所述的基因序列克隆至中表达载体，转化毕赤酵母工程菌，筛选获得能够高效表达重组人源化胶原蛋白的工程菌；
(2)对基因工程菌进行发酵培养，诱导表达重组人源化胶原蛋白，获得含目标蛋白的发酵液；
(3)对发酵液进行纯化，获得重组人源化胶原蛋白。
4.如权利要求3所述的制备方法，其中所述表达载体为pGAPZαA、所述毕赤酵母工程菌为毕赤酵母GS115。
5.一种止血海绵的制备方法，包含以下步骤：
(1)在酸性溶液中添加如权利要求1中所述的重组III型人源化胶原蛋白，制得胶原蛋白溶液；
(2)将胶原蛋白溶液进行冷冻干燥，再进行交联，即得。
6.如权利要求5所述的止血海绵的制备方法，所述酸性溶液是乙酸或稀盐酸。
7.如权利要求5所述的止血海绵的制备方法，所述交联是真空热交联或化学交联。
8.如权利要求5所述的止血海绵的制备方法，包含以下步骤：
(1)在1％～3％(vol/vol)乙酸溶液中添加1％～3％(wt/vol)的如权利要求1中所述的重组III型人源化胶原蛋白，在常温下磁力搅拌至蛋白完全溶解，制得胶原蛋白溶液；
(2)将胶原蛋白溶液注入适当的模具，进行冷冻干燥，冷冻干燥完成的样品真空干燥箱中140℃～160℃真空热交联，制得胶原蛋白止血海绵样品。
9.权利要求1至3任一项所述的止血海绵在外科、妇产科、整形科、口腔科等手术中创面止血的应用。
CN202310056951.XA 2022-01-28 2023-01-16 重组人源化iii型胶原蛋白止血海绵及其应用 Pending CN116510065A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210109344 2022-01-28
CN2022101093440 2022-01-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116510065A true CN116510065A (zh) 2023-08-01

Family

ID=87405309

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310056951.XA Pending CN116510065A (zh) 2022-01-28 2023-01-16 重组人源化iii型胶原蛋白止血海绵及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116510065A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101563450B (zh) 细胞衍生细胞外基质膜的制备方法
CN108653809B (zh) 一种基于黑磷和明胶的复合水凝胶及其在骨组织工程方面的应用
Fu et al. Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method
US6949625B2 (en) Injectable implant of insoluble globin
CN105233336B (zh) 丝胶蛋白神经导管及其制备方法与应用
CN110478528B (zh) 一种新型的促组织修复材料的制备方法及其应用
RU2483756C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО КОМПОЗИТНОГО МАТРИКСА НА ОСНОВЕ РЕГЕНЕРИРОВАННОГО ФИБРОИНА ШЕЛКА Bombyx mori И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
CN104771787A (zh) 一种含pga加强网的复合型支架、制备方法及应用
CN101062429A (zh) 一种组织工程化双层皮肤的构建方法与应用
CN112870445A (zh) 一种软组织修复材料的制备方法及应用
CN101063109A (zh) 一种可调节肤色的组织工程化皮肤的构建方法与应用
CN1258591C (zh) 组织工程化周围神经移植物
CN108042841A (zh) 一种生物敷料及其制备方法与用途
RU2715715C1 (ru) Стерильный прозрачный концентрированный раствор биосовместимого коллагена, способ его получения и применения
KR101697324B1 (ko) 생체적합성 콜라겐 및 이의 제조방법
CN110464877A (zh) 一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法
AU2004237992B2 (en) Insoluble globin injectable implant
CN116510065A (zh) 重组人源化iii型胶原蛋白止血海绵及其应用
JP2014524269A (ja) 自己移植システムの調製方法およびこれにより得られた移植システム
CN116510077A (zh) 重组人源化iii型胶原蛋白-羟基磷灰石复合骨修复材料及其应用
CN116514956A (zh) 重组人源化iii型胶原蛋白及其应用
CN114225113B (zh) 一种双层结构可降解的人工硬脑膜及其制备方法
KR20060091350A (ko) 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조된 조직공학용 고분자 지지체 및 그 콜라겐의 추출방법
CN113713175B (zh) 制备水凝胶支架的方法及由此得到的支架的用途
Xuemei et al. Biocompatibility studies of silk fibroin-based artificial nerve grafts in vitro and in vivo

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination