KR20060091350A - 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조된 조직공학용 고분자 지지체 및 그 콜라겐의 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조된 조직공학용 고분자 지지체 및 그 콜라겐의 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 콜라겐의 아미노산 조성에 있어 프롤린(proline)이 6 내지 10.5 몰%, 히드록시프롤린(hydroxyproline)이 3 내지 7 몰%인 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조되는 조직공학용 고분자 지지체 및 그 콜라겐의 추출방법에 관한 것이다.

본 발명의 조직공학용 고분자 지지체는 포유동물 유래 콜라겐에 비해 세포친화성이 우수하고, 세포독성 및 면역반응의 위험이 없는 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조됨으로써, 상처피복재료, 조직공학용 인공장기, 의료용 충진제, 또는 세포배양을 위한 지지체로 널리 활용할 수 있다. 또한, 본 발명의 추출방법에 의하면, 비교적 저가의 가격으로 광우병 등의 전염성 병원체의 감염 위험이 없는 콜라겐을 다량 생산할 수 있다.

해양생물, 콜라겐, 조직공학, 고분자 지지체

Description

해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조된 조직공학용 고분자 지지체 및 그 콜라겐의 추출방법{POLYMER SCAFFOLD FOR TISSUE ENGINEERING USING COLLAGEN EXTRACTED FROM MARINE LIFE AND EXTRACTION METHOD THEREOF}

도 1은 본 발명의 실시예 2에서 제조된 다공성 지지체의 표면과 단면을 촬영한 주사식 전자현미경(SEM) 사진이다.

도 2는 보바인 콜라겐, 해파리 유래 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 글루칸의 세포 생존력(cell viability)을 비교 % 수치로 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 실시예 2에서 제조된 다공성 지지체에 섬유아세포를 배양시킨 후 헤마토실린 및 에오신(hematoxylin-eosin, H&E) 염색을 통하여 주사식 전자현미경(SEM)으로 관찰한 것이다.

도 4는 본 발명의 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2에서 제조된 다공성 지지체의 장간막 림프절에서의 면역반응 결과 각 면역세포의 농도를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2에서 제조된 다공성 지지체의 비장에서의 면역반응 결과 각 면역세포의 농도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조된 조직공학용 고분자 지지체 및 그 콜라겐의 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포유동물 유래 콜라겐에 비해 세포친화성이 우수하고, 질병감염, 세포독성 및 면역반응의 위험이 없는 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조되는 조직공학용 고분자 지지체 및 그 콜라겐의 추출방법에 관한 것이다.

조직공학(tissue engineering)은 손상된 조직이나 장기를 복원, 재건, 재생, 또는 대체하여 정상적인 기능을 하게 하는데 그 목적이 있다. 이러한 조직공학에 있어서, 고분자재료의 주된 역할은 세포가 조직 또는 장기로 성장하는 동안 일정한 공간을 제공하여 주고, 세포의 증식과 분화를 물리 또는 화학적으로 제어할 수 있는 신호(signal)를 제공해주는 것으로 이러한 적절한 고분자 지지체의 설계의 중요성이 커지고 있다. 기술적인 면에서 살펴보면, 먼저 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고 그 조직편으로부터 필요한 세포를 분리한 다음 분리된 세포를 체외에서 배양하여 필요한 양만큼 증식시키고, 이를 고분자 지지체 내에 주입하여 일정기간 동안 배양한 뒤, 이 세포/고분자 지지체로 이루어진 구조물을 다시 인체에 이식하는 것이다. 따라서, 용도에 맞는 고분자재료의 설계가 조직공학에 있어서 매우 중요한 요소 중의 하나이다.

이러한 조직공학 기법으로 인공장기를 재생시키는데 사용되는 고분자 지지체 는 생분해성의 측면과 세포부착 및 증착에 의해 환자 조직을 재생시킬 수 있는 지지체의 개발에 초점이 맞추어지고 있으며, 특히 일정기간에 걸쳐 서서히 생분해됨으로써, 인체에 이식된 후 분해산물이 자연적으로 인체 밖으로 배출되어 환자들에게 끼치는 해를 최소화할 수 있고, 새로운 조직이 형성될 때까지 적절한 기계적인 강도를 가져야 하며, 세포와 지지체 간의 상호작용이 우수해 세포의 성장을 촉진시킬 수 있어야 한다.

따라서, 세포외 기질(extracellular matrix)의 주성분을 이루고 있는 천연고분자인 콜라겐(collagen)은 우수한 생분해성과 세포와의 상호작용을 촉진할 수 있는 여러 인자들을 포함하고 있어 이러한 조직공학적 응용을 위한 지지체로서 응용가능성에 대한 고찰이 이루어져 왔다.

콜라겐은 인간을 비롯한 동물의 체내에서 세포와 세포 사이를 메우고 있는 섬유상의 경단백질(albuminoid)로서, 피부, 뼈, 연골, 혈관벽, 치아, 근육 등 세포가 다수 집합되어 있는 부위에 다량으로 존재하고 있다. 특히, 콜라겐은 상피조직에서 세포외 기질(extracellular matrix)을 구성하는 주요성분으로 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 젤라틴 등의 형태로 식용으로도 이용되어 왔으며, 섭취된 콜라겐은 소화관 내에서 소화효소에 의해 분해되어 대부분 아미노산의 형태로 흡수되는데, 섭취된 콜라겐은 면역기능을 향상시키고, 세포의 재생작용을 촉진시켜 관절을 튼튼하게 해주며, 피부의 신진대사 활성화 및 보습력 유지를 통하여 피부미용에 탁월한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

이러한 콜라겐은 주로 가축의 가죽과 뼈, 소의 무릎관절 등에서 추출함으로써 생산하거나 특수한 목적을 위하여, 인간의 콜라겐을 필요로 할 경우에는 사체 또는 태반조직으로부터 추출하여 생산하고 있다. 그러나, 동물로부터 추출된 콜라겐을 식용으로 사용할 경우에는 아무런 문제점이 없으나, 사람의 피부주름 제거용 주사제 조성물이나 이식(implant)용으로 사용할 경우에는 면역거부 반응을 유발할 가능성이 있다. 특히, 콜라겐의 주된 공급원인 소의 경우 최근 전염성 뇌질환으로 인간에게 감염될 위험성이 높은 광우병의 문제가 크게 대두되고 있다. 이를 극복하기 위하여 인간의 콜라겐을 사용하는 방법이 이용되고 있으나, 추출이 용이하지 못하여 생산량이 부족하기 때문에, 높은 비용이 요구된다는 단점이 있다. 또한, 세포배양 방법을 이용하여 인간에게 면역거부반응을 일으키지 않는 콜라겐을 생산하려는 연구가 진행되고 있으나, 생산 수율이 낮고, 생산된 콜라겐은 천연콜라겐에 비하여 안정성이 저하되는 단점이 있어 상업적으로 이용되지 못하고 있는 실정이다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 저온에서 안정하고, 전염성 병원체, 세포독성, 면역반응의 위험이 없는 해양생물 유래의 콜라겐을 이용하여 제조되는 조직공학용 고분자 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전염으로 인한 오염 위험, 특히 프리온(prion) 타입의 전염성 병원체의 오염 위험이 없는 콜라겐을 비교적 저가의 가격으로 대량 생산 할 수 있는 추출방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜라겐의 아미노산 조성에 있어 프롤린(proline)이 6 내지 10.5 몰%, 히드록시프롤린(hydroxyproline)이 3 내지 7 몰%인 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조되는 조직공학용 고분자 지지체를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 해양생물을 물로 세척하는 제1단계; (2) 산성용매로 콜라겐을 용해시켜 산 가용성 콜라겐을 제조하는 제2단계; 및, (3) 효소로 콜라겐의 나선형 부분을 제거하여 아텔로콜라겐을 제조하는 제3단계를 포함하는 콜라겐 추출방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 저온에서 안정하고, 광우병 등의 질병 위험이 낮은 콜라겐을 이용하여 제조되는 조직공학용 고분자 지지체를 개발하고자 예의 연구한 결과, 해양생물로부터 추출된 콜라겐이 저온에서 안정하고, 세포친화성이 우수하며, 면역반응, 세포독성의 위험이 없음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 조직공학용 고분자 지지체는 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이 용하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

해양생물로부터 추출된 콜라겐은 전염으로 인한 오염 위험, 특히 프리온(prion) 타입의 전염성 병원체의 오염 위험이 매우 낮고, 아미노산 조성이 인간 콜라겐의 조성과 상대적으로 달라 특별한 항체에 의하여 상대적으로 쉽게 구별 되어질 수 있어 매우 효과적인 면역적 표지 역할을 할 수 있다. 또한, 세포친화성이 우수하여 세포독성, 면역반응의 위험이 낮다.

본 발명의 해양생물로부터 추출된 콜라겐의 아미노산 조성은, 프롤린(proline)이 6 내지 10.5 몰%이고, 히드록시프롤린(hydroxyproline)이 3 내지 7 몰%인 것이 바람직하다. 프롤린 및 히드록시프롤린의 함량이 상기 범위를 벗어나면, 콜라겐의 저온 안정도가 떨어지는 문제점이 있다. 이는 분자 내 수소결합에 관여하는 프롤린(proline)과 히드록시프롤린(hydroxyproline)의 함량이 높아지면 콜라겐의 열변성 온도가 높아져 저온에서의 안정성이 감소되기 때문이다.

콜라겐은 보통 분자량이 10만 정도의 폴리펩타이드 사슬 3개가 3중 나선구조를 이루며 이 사슬은 서로 수소결합으로 안정화되어 있고, 가열하면 이들 소수결합이 절단되어 랜덤 코일상의 젤라틴으로 되어 이때 용액의 점도, 광회전도 등의 물성이 크게 변화하게 된다. 이러한 열변성 온도는 콜라겐의 중요한 성질 중의 하나이다. 아세트산(acetic acid)에 용해시킨 해양생물 유래 콜라겐 5% 용액의 온도에 따른 점도를 측정하면, 15~20℃ 부근에서 점도가 크게 감소하며, 소로부터 추출한 콜라겐의 경우 37~39 ℃ 부근에서 점도가 감소하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 해양생물 유래 콜라겐의 경우 중성영역의 pH를 갖는 용액에서 4 ℃ 부근에서 급속하게 겔화되는 반면, 소에서 추출된 콜라겐의 경우 37 ℃ 부근에서야 겔화가 일어난다. 이는 해양생물 유래 콜라겐은 해양 생물의 생활환경의 온도에 영향을 받아 15 ℃ 정도의 저온에서도 안정한 콜라겐 섬유를 형성하기 때문이다.

본 발명의 조직공학용 고분자 지지체는 생분해성과 생체적합성이 우수하여 상처피복재료, 조직공학용 인공장기, 의료용 충진제, 또는 세포배양을 위한 지지체로서 널리 활용될 수 있다. 이러한 조직공학용 고분자 지지체는 다공성 스펀지, 다공성 필름, 하이드로겔, 마이크로/나노 화이버(fiber)의 형태를 가지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 조직공학용 고분자 지지체는 혈관 내피 세포 성장인자, 신경조직 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 뼈 형태 발생 단백질, 헤파린, 트롬빈, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 알부민 및 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약물을 포함한 약물전달체인 것이 바람직하다.

본 발명에서 원료로 사용하는 해양생물은 콜라겐을 포함하는 조직을 갖는 해양포유동물, 바다물고기, 경골어류를 포함하나, 특히 해삼, 해파리인 것이 바람직 하다.

이하, 본 발명의 콜라겐 추출방법을 각 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명한다.

(1) 해양생물을 물로 세척하는 제1단계

바다에서 수확 후에 바로 염화나트륨(NaCl)으로 염장처리되는 해양생물의 염을 제거하기 위하여, 해양생물을 물로 세척한다.

본 발명에서 원료로 사용하는 해양생물은 콜라겐을 포함하는 조직을 갖는 해양포유동물, 바다물고기, 경골어류를 포함하나, 특히 해삼, 해파리인 것이 바람직하다.

본 발명에서는 콜라겐을 해양생물로부터 추출함으로써, 비교적 저가의 가격으로 콜라겐의 대량 생산이 가능하고, 이러한 해양생물 유래 콜라겐은 포유동물로부터 제조된 콜라겐과 비교하여, 전염으로 인한 오염 위험, 특히 프리온(prion) 타입의 전염성 병원체의 오염 위험이 매우 낮고, 아미노산 조성이 인간 콜라겐의 조성과 상대적으로 비슷하지 않음으로써, 두 단백질이 특별한 항체에 의하여 상대적으로 쉽게 구별되어질 수 있는 장점이 있다.

(2) 산성용매로 콜라겐을 용해시켜 산 가용성 콜라겐을 제조하는 제2단계

산성용매로 콜라겐을 용해시켜 산 가용성(acid soluble) 콜라겐을 제조한다.

구체적으로, 세척된 해양생물을 분쇄하고 산성용매에 용해시켜 교반한다.

본 발명에서 사용할 수 있는 산성용매는 콜라겐을 용해시킬 수 있는 것이면 제한되지 않으나, 아세트산(acetic acid), PH 2 내지 3의 염산(hydrochloric acid), 시트레이트 완충액(citrate buffer)등이 바람직하며, 아세트산(acetic acid)인 것이 특히 바람직하다.

이어서, 교반물을 여과하고 투석한 후 원심분리하여 침전물을 얻는다. 투석은 잔류 염화나트륨(NaCl), 가용 단백질, 다당류(polysaccharide) 등을 제거하기 위해 수행한다. 이때, 투석은 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄)에서 수행되는 것이 바람직하다.

그 침전물을 산성용매에 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 취한 다음, 그 상등액에 염화나트륨(NaCl)을 첨가하고 산성용매에 용해시킨 후 투석하여 산 가용성(acid soluble) 콜라겐을 얻는다.

수득한 산 가용성 콜라겐을 고형화시키기 위해 냉동건조과정을 수행할 수 있다.

(3) 효소로 콜라겐의 나선형 부분을 제거하여 아텔로콜라겐을 제조하는 제3단계

효소로 콜라겐의 나선형 미세섬유 말단 부분을 제거하여 아텔로콜라겐 (atelocollagen)을 제조한다.

구체적으로, 제2단계에서 수득한 산 가용성 콜라겐을 산성용매와 효소의 혼합액에 용해시켜 교반한다.

본 발명에서 사용할 수 있는 효소는 콜라겐의 나선형 부분을 제거할 수 있는 것이면 제한되지 않으나, 펩신, 트립신, 파파인, 카뎁신 등이 바람직하며, 펩신이 특히 바람직하다.

그 교반물을 투석한 후 세척하여 효소를 불활성화시킨다. 투석은 잔류 염화나트륨(NaCl), 가용 단백질, 다당류(polysaccharide) 등을 제거하기 위해 수행한다. 이때, 투석은 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄)에서 수행되는 것이 바람직하다.

이어서, 산성용매에 용해시킨 후 염화나트륨(NaCl)을 첨가하여 콜라겐을 침전시키고, 침전된 콜라겐을 산성용매에 용해시켜 투석하여 아텔로콜라겐을 제조한다.

수득한 아텔로콜라겐을 고형화시키기 위해 냉동건조과정을 수행할 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예1)

(해파리로부터 천연 콜라겐의 추출)

1. 제1단계

바다에서 수확 후에 바로 30 중량% 염화나트륨(NaCl)으로 염장 처리되어 운반된 해파리의 염을 제거하기 위해, 4℃의 증류수로 세척하고, 하루에 두 번 증류수를 교체하면서 처리하여 냉동건조하였다.

2. 제2단계

상기 냉동건조된 해파리를 작은 조각으로 분쇄하고, 0.5M 아세트산(acetic acid) 용액에 용해시켜 3일 동안 교반하였다.

그 교반물을 여과한 후 0.02M 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄)에서 투석하고, 저속으로 원심분리하여 침전물을 얻었다.

그 침전물을 다시 0.5M 아세트산(acetic acid)에 용해시킨 후, 1시간 동안 저속으로 원심분리하여 상등액을 취하였다.

그 상등액에 염화나트륨(NaCl)을 첨가하여 최종 농도가 0.9M이 되도록 조정한 다음, 다시 0.5M 아세트산(acetic acid)에 용해시켜 0.1M 아세트산(acetic acid) 용액에서 투석한 후 냉동건조하여 산 가용성(acid-soluble) 해파리 유래 콜라겐을 수득하였다.

3. 제3단계

상기 제2단계에서 수득한 산 가용성 해파리 유래 콜라겐을 0.5M 아세트산(acetic acid)과 5 w/w% 펩신(pepsin) 혼합용액에 용해시켜 4℃에서 24시간 동안 교반하였다.

펩신(pepsin)을 불활성화시키기 위하여, 그 교반물을 0.02M 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄)에서 투석한 후 세척하였다.

그 세척물을 다시 0.5M 아세트산(acetic acid) 용액에 용해시킨 후, 염화나트륨(NaCl)을 첨가하여 최종 농도가 1.0 M이 되도록 조정하여 콜라겐을 침전시켰다.

그 콜라겐 침전물을 0.5M 아세트산(acetic acid) 용액에 다시 용해시킨 후 0.1M 아세트산(acetic acid) 용액에서 투석한 다음 냉동건조하여 수용성 해파리 유래 아텔로콜라겐을 제조하였다.

(실시예 2)

(해파리 유래 콜라겐을 이용한 다공성 지지체의 제조)

상기 실시예 1에서 추출한 해파리 유래 콜라겐을 0.5M 아세트산(acetic acid) 용액에 용해시켜 2 wt% 용액을 제조하였다.

그 콜라겐 용액을 페트리디쉬에 부어 -75℃에서 24시간 동안 냉동한 후, 냉동건조하여 스펀지 형태의 지지체를 제조하였다.

제조된 스펀지 형태의 지지체를 UV조사를 통해 가교결합시켜, 네트워크(network) 구조를 갖는 스펀지를 제조하였다. 제조된 스펀지를 증류수로 세척한 다음 -75℃에서 24시간 동안 냉동한 후, 냉동건조하여 불용성 해파리 유래 콜라겐 다 공성 지지체를 제조하였다.

(실시예 3)

(해파리 유래 콜라겐을 이용한 다공성 지지체의 제조)

상기 실시예 1에서 추출한 해파리 유래 콜라겐을 0.5M 아세트산(acetic acid) 용액에 용해시켜 2 wt% 용액을 제조하였다.

그 콜라겐 용액을 페트리디쉬에 부어 -75℃에서 24시간 동안 냉동한 후, 냉동건조하여 스펀지 형태의 지지체를 제조하였다.

제조된 스펀지 형태의 지지체를 EDC/NHS (N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide/N-hydroxysuccinimide)의 화학적 가교제를 사용하여 가교결합시켜 네트워크(network) 구조를 갖는 스펀지를 제조하였다. 제조된 스펀지를 증류수로 세척한 다음 -75℃에서 24시간 동안 냉동한 후, 냉동건조하여 불용성 해파리 유래 콜라겐 다공성 지지체를 제조하였다.

(실시예 4)

(해파리 유래 콜라겐을 이용한 마이크로/나노화이버 지지체의 제조)

상기 실시예 1에서 추출한 해파리 유래 콜라겐을 2,2,2-트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol)에 용해시켜 5 wt%의 콜라겐 용액을 제조하였다.

전기방사(electrospinning) 장치를 사용하여 5~20 kV의 전기장 하에서 0.2 ml/min의 유속(flow rate)으로 콜라겐 용액을 주사기의 바늘을 이용하여 collector plate에 방사하여, 마이크로/나노 화이버(micro/nano fiber)형태의 콜라겐 시트(sheet)를 제조하였다.

제조된 콜라겐 시트(sheet)를 EDC/NHS의 화학적 가교제로 처리하여 가교결합시킨 후 세척, 냉동건조의 과정을 통해 불용성 해파리 유래 콜라겐 마이크로/나노화이버 지지체를 제조하였다.

(실시예 5)

(해파리 유래 콜라겐을 이용한 하이드로겔 지지체의 제조)

상기 실시예 1에서 추출한 해파리 유래 콜라겐을 0.5M 아세트산(acetic acid) 용액에 용해시켜 5 wt% 용액을 제조하였다.

그 콜라겐 용액을 UV조사를 통해 가교결합시킨 후, 미반응물을 제거하는 세척과정을 거쳐 네트워크(network) 구조를 갖는 해파리 유래 콜라겐 하이드로겔을 제조하였다.

(비교예 1)

(보바인 콜라겐을 이용한 다공성 지지체의 제조)

의료용과 조직공학적 응용 분야에 많이 사용되는 소로부터 추출한 보바인(bovine) 콜라겐을 0.5M 아세트산(acetic acid) 용액에 용해시켜 2 wt% 용액을 제조하였다.

그 콜라겐 용액을 페트리디쉬에 넣어 -75℃에서 24시간 동안 냉동한 후, 냉 동건조하여 스펀지 형태의 지지체를 제조하였다.

제조된 스펀지 형태의 지지체를 UV조사를 통해 가교결합시켜 네트워크(network) 구조를 갖는 스펀지를 제조하였다. 제조된 스펀지를 증류수로 세척한 다음 -75℃에서 24시간 동안 냉동한 후, 냉동건조하여 불용성 보바인 콜라겐 다공성 지지체를 제조하였다.

(비교예 2)

(젤라틴(gelatin)을 이용한 다공성 지지체의 제조)

보바인 콜라겐의 가수분해에 의해 얻어진 젤라틴을 0.5M 아세트산(acetic acid) 용액에 용해시켜 2 wt% 용액을 제조하였다.

그 젤라틴 용액을 페트리디쉬에 넣어 -75℃에서 24시간 동안 냉동한 후, 냉동건조하여 스펀지 형태의 지지체를 제조하였다.

제조된 스펀지 형태의 지지체를 UV조사를 통해 가교결합시켜 네트워크(network) 구조를 갖는 스펀지를 제조하였다. 제조된 스펀지를 증류수로 세척한 다음 -75℃에서 24시간 동안 냉동한 후, 냉동건조하여 불용성 젤라틴 다공성 지지체를 제조하였다.

(실험예)

(실험예 1)

(해파리 유래 콜라겐을 이용하여 제조된 다공성 지지체의 주사식 전자 현미 경 사진)

상기 실시예 2에서 제조한 다공성 지지체의 표면과 단면을 주사식 전자현미경(SEM)으로 촬영하여 도 1에 나타내었다.

도 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 다공성 지지체의 표면과 단면 모두 균일한 기공(pore) 구조를 가져, 지지체 내로 세포의 접착과 침투 및 세포의 성장을 위한 여러 영양분과 인자들이 쉽게 투과할 수 있는 구조를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다.

(실험예 2)

(세포독성 시험)

해파리 유래 콜라겐의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT(3,4,5-dimathylthiozol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 에세이를 시행하였다.

의료용과 조직공학적 응용 분야에 많이 사용되는 시판 보바인(bovine) 콜라겐, 젤라틴(gelatin), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 글루칸(glucan)을 함께 시험하여 해파리 유래 콜라겐과의 세포 독성을 비교하였다.

상기 각각의 시료를 1 wt%의 농도로 용해시킨 후 시료의 30 중량% EDC를 첨가하여 조직배양판(96 well tissue culture plate)에 각각 400 ㎖를 첨가한 다음 60℃ 오븐에서 건조시켜 필름을 제조하였다. 제조된 필름을 증류수로 충분히 세척한 후 에틸렌옥사이드(ethylene oxide) 가스로 멸균하였다.

인간의 섬유아세포(Human fibroblast)를 1×10⁴개의 농도로 각각의 시료가 담긴 조직배양판(96 well plate)에 시딩(seeding)한 후 1, 3, 7일 동안 배양하였다. 배양된 조직배양판에 MTT시약을 첨가하여 4 시간 동안 반응시킨 다음 Elisa 리더로 540 ~ 590nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 2는 보바인 콜라겐, 해파리 유래 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 글루칸의 세포 생존력(cell viability)을 1일, 2일, 7일 후에 양성 대조군(positive control)인 다른 물질의 첨가 없이 조직배양판(96 well plate)에 자란 세포에 대한 비교 % 수치로 나타낸 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 해파리 유래 콜라겐의 경우, 보바인 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산 및 글루칸에 비해 더 높은 세포 생존력(cell viability)을 나타내었고, 특히 7일 후에는 140 % 정도의 가장 높은 세포 생존력(cell viability)을 나타내었다.

(실험예 3)

(In vitro 세포접착실험)

상기 실시예 2에서 제조한 해파리 유래 콜라겐 다공성 지지체를 1.5×1.5×0.3 cm³ 의 크기로 자른 후, 인간의 섬유아세포(human fibroblast)를 1×10⁶ 농도로 시딩(seeding)하였다.

배지(Cell media)를 2일 마다 교체하면서 배양하고, 각각 7일과 14일 후 일 반적인 조직제작방법으로 슬라이드 표본을 제작하였다.

도 3은 제작된 슬라이드 표본을 헤마토실린 및 에오신(hematoxylin-eosin, H&E) 염색을 통하여 주사식 전자현미경(SEM)으로 관찰한 것이다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 콜라겐의 높은 세포 친화성으로 인하여 해파리 유래 콜라겐 다공성 지지체의 표면 부위에서 많은 세포의 성장이 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다.

(실험예 4)

(생체 면역반응 시험)

상기 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2에서 제조한 각각의 해파리 유래 콜라겐, 보바인 콜라겐, 젤라틴으로 이루어진 지지체를 사용하여 생체 면역반응 정도를 비교 측정하였다.

마우스의 등 피부조직 밑에 각각의 멸균된 시료를 이식하여 이식된 부위의 염증반응과 특정항원에 대한 항체를 생산하여 혈액 내로 분비하는 역할을 하는 B 임파구와 항원제공세포 (antigen presenting cell, APC)에서 항원을 제공 받을 때 여러 가지 면역반응을 보이는 T임파구 및 수상돌기 세포(dendritic cell)와 대식세포(macrophage)의 농도를 측정하였다.

도 4는 장내막 림프절(mesenteric lymph node, MLN)에서의 각 면역세포 농도를 나타낸 것이고, 도 5는 비장(spleen)에서 각 면역세포의 농도를 나타낸 것이다. 도 4와 도 5에서 보듯이, 해파리 유래 콜라겐의 경우, 시판되어 널리 사용 되는 보바인 콜라겐이나 젤라틴에 비해서 장내막 림프절과 비장 모두에서 B 세포, T 세포, 수상돌기세포, 대식세포 등의 면역세포의 발현이 작음을 확인할 수 있었다. 이는 해파리 유래 콜라겐이 보바인 콜라겐이나 젤라틴에 비해 생체 내 면역반응이 현저히 낮아 안전한 생체재료로써의 응용이 가능함을 의미하는 것이다.

(실험예 5)

(콜라겐 아미노산 조성 분석)

표 1은 실시예 1에서 각 단계별로 추출한 콜라겐과 시판되는 보바인 콜라겐의 각각의 아미노산 조성분석을 나타낸 것이다.

[표 1]

아미노산 조성

종류 (단위: 몰%)	실시예 1(해파리 유래 콜라겐)			보바인 콜라겐
	제1단계	제2단계	제3단계
Hydroxyproline	4.3	4.24	4.12	9.7
Aspartic acid	8.5	7.74	7.68	4.5
Threonine	4.59	4.05	3.66	1.8
Serine	5.25	4.73	4.1	3.6
Glutamic acid	11.27	10.2	10.96	7.5
Proline	6.56	8.37	7.82	12.5
Glycine	28.17	30.98	33.44	33
Alanine	8.14	8.28	8.74	11.9
Valine	3.96	3.52	3.46	2.1
Methionine	0.61	0.65	0.01	0.6
Isoleucine	2.79	2.21	2.35	1.1
Leucine	4.43	3.57	3.07	2.3
Tyrosine	0.91	0.55	0.06	0.3
Phenylalanine	1.78	1.49	0.93	0.3
Hydroxylysine	0.45	0.5	0.41	0.7
Lysine	3.37	3.98	3.57	2.6
Histidine	0.2	0.21	0.19	0.5
Arginine	4.72	4.73	5.43	5
총(total)	100	100	100	100

상기 표 1에서 보듯이, 해파리 유래 콜라겐, 보바인 콜라겐 모두 글리신(glycine)의 함량이 가장 많았으며, 알라닌(alanine)과 프롤린(proline)의 양이 많은 부분을 차지하여 전형적인 콜라겐의 특징을 보여주었다. 또한, 본 발명의 실시예 1에서 추출된 해파리 유래 콜라겐의 경우 제3단계의 효소처리 과정을 거치면서 티로신(tyrosine)의 함량이 상당히 낮아지는 것으로 보아 제3단계의 효소처리 후 높은 순도의 아텔로콜라겐을 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.

특히, 본 발명의 해양생물 유래의 콜라겐의 경우, 포유류인 소에서 추출한 콜라겐과 비교하여 프롤린(proline)과 히드록시(hydroxyproline)의 함량이 낮음을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 조직공학용 고분자 지지체는, 포유동물 유래 콜라겐에 비해 저온에서 안정하고 세포친화성이 우수하며 세포독성 및 면역반응의 위험이 없는 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조됨으로써, 상처피복재료, 조직공학용 인공장기, 의료용 충진제, 또는 세포배양을 위한 지지체로 널리 활용할 수 있다. 또한, 본 발명의 추출방법에 의하면, 비교적 저가의 가격으로 광우병 등의 전염성 병원체의 감염 위험이 없는 콜라겐을 다량 생산할 수 있다.

Claims (9)

1. 콜라겐의 아미노산 조성에 있어 프롤린(proline)이 6 내지 10.5 몰%, 히드록시프롤린(hydroxyproline)이 3 내지 7 몰%인 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조되는 조직공학용 고분자 지지체.
2. 제1항에서, 상기 조직공학용 고분자 지지체의 형태는,

   다공성 스펀지, 다공성 필름, 하이드로겔(hydrogel), 또는 마이크로/나노 화이버(micro/nano fiber)인 것을 특징으로 하는 조직공학용 고분자 지지체.
3. 제1항에서, 상기 조직공학용 고분자 지지체는 혈관 내피 세포 성장인자, 신경조직 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 뼈 형태 발생 단백질, 헤파린, 트롬빈, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 알부민 및 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약물을 포함한 약물전달체인 것을 특징으로 하는 조직공학용 고분자 지지체.
4. 제1항에서, 상기 해양생물은,

   해삼 또는 해파리인 것을 특징으로 하는 조직공학용 고분자 지지체.
5. (1) 해양생물을 물로 세척하는 제1단계;

   (2) 산성용매로 콜라겐을 용해시켜 산 가용성 콜라겐을 제조하는 제2단계; 및,

   (3) 효소로 콜라겐의 나선형 부분을 제거하여 아텔로콜라겐을 제조하는 제3단계

   를 포함하는 콜라겐 추출방법.
6. 제5항에서, 상기 콜라겐의 아미노산 조성은,

   프롤린(proline)이 6 내지 10.5 몰%, 히드록시프롤린(hydroxyproline)이 3 내지 7 몰%인 것을 특징으로 하는 콜라겐 추출방법.
7. 제5항에서, 상기 제2단계는,

   ⅰ) 세척된 해양생물을 분쇄하고 산성용매에 용해시켜 교반하는 단계;

   ⅱ) 교반물을 여과하고 투석한 후 원심분리하는 단계;

   ⅲ) 침전물을 산성용매에 용해시킨 후 원심분리하는 단계; 및,

   ⅳ) 상등액에 염화나트륨(NaCl)을 첨가하고 산성용매에 용해시킨 후 투석하는 단계

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 추출방법.
8. 제5항에서, 상기 제3단계는,

   ⅰ) 산 가용성 콜라겐을 산성용매와 효소의 혼합액에 용해시켜 교반하는 단 계;

   ⅱ) 교반물을 투석한 후 세척하여 효소를 불활성화시키는 단계;

   ⅲ) 산성용매에 용해시킨 후 염화나트륨(NaCl)을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및,

   ⅳ) 침전된 콜라겐을 산성용매에 용해시킨 후 투석하는 단계

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 추출방법.
9. 제5항에서, 상기 해양생물은,

   해삼 또는 해파리인 것을 특징으로 하는 콜라겐 추출방법.

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