CN112870445A - 一种软组织修复材料的制备方法及应用 - Google Patents

一种软组织修复材料的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医疗材料技术领域，公开了一种软组织修复材料的制备方法，包括获取脐带和生物支架材料并检测、制备脱细胞生物支架、培养扩增脐带间充质干细胞球、干细胞球种植于脱细胞生物支架基底层；还包括软组织修复材料；还包括软组织修复材料在制备修复或替代软组织的材料中的应用。本发明将脐带间充质干细胞和脱细胞生物支架材料有机结合，不但可实现无创修复皮肤缺损，达到慢性难愈性大面积软组织重建的目的，还能充分发挥抗粘连作用、抑菌作用、伤口保护、止痛和启动上皮化的能力，其效果和效用持久性均高于传统方法，可缩短愈合时间，减少治疗费用，免手术创伤，在再生医学领域具有巨大的潜力及优势。

Description

一种软组织修复材料的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医疗材料技术领域，具体涉及一种软组织修复材料的制备方法及应用。
背景技术
脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是存在于脐带华通氏胶(Wharton’sjelly)和血管周围组织中的一种间充质干细胞。来源于脐带的间充质干细胞具有如下优势：其取材方便、无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子的总量也非常高，便于扩增和传代，同时又没有配型、排异等问题。因此，来源于脐带的间充质干细胞极其适合用于临床研究和应用，是间充质干细胞的理想来源。与经典的骨髓间充质干细胞相比，脐带源间充质干细胞的绝大多数生物学特征与骨髓源间充质干细胞相似，但其在增殖能力、CFU-F形成能力、CD106、HLA-I表达和神经诱导分化能力等方面要优于骨髓间充质干细胞。因此，脐带源间充质干细胞作为一种新型种子细胞，其在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。并且，目前在动物实验模型中，脐带源间充质干细胞已被证实在皮肤缺损修复中的运用效果非常理想，其能促进皮肤缺损部位的早期愈合，改善缺损部位血液循环，具有较高的临床应用价值。
脱细胞生物支架是来源于人或动物的天然细胞外基质，由于低免疫原性和良好的生物相容性，目前已成为广泛应用的生物支架材料。而脱细胞羊膜是其中一种较容易获取的同源异种材料，其不包含上皮细胞，主要成分是胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白，可为细胞的增值分化提供稳定的生长环境。基质中丰富的胶原纤维使得羊膜具有良好的抗拉力，又为细胞生长提供了足够的三维空间结构，有利于细胞的黏附和生长。此外，脱细胞羊膜的体外组织相容性好，能促进自体和异体细胞的生长，羊膜也是分娩后排出体外之物，不受伦理和道德限制。
软组织是指人体的皮肤、皮下组织、肌肉、肌腱、韧带、关节囊、滑膜囊、神经、血管等，软组织是比较重要的一个人体组织。软组织修复材料是用以修复和替代机体中发生病变或者损伤的软组织(软骨、气管等)，恢复或部分恢复原有组织形态和功能的材料。用于组织修复的理想支架材料需要为种植细胞或体内细胞的再生提供与自体组织细胞外基质相似的微环境(包括胞外基质的蛋白组成、结构和生物力学特性)。由于天然细胞外基质复杂精细的微观组织结构和现有技术的局限性，利用人工的方法制备替代天然细胞外基质的材料仍然是一个难题。
目前已经有文献报道，将干细胞接种到脱细胞羊膜上用于皮肤缺损的修复，但仍有脱细胞不彻底、干细胞数量少、存活率低等缺陷，因此，发明人创新性地引入3D结构的干细胞球，将两者有机的结合起来，远比单纯地2D培养法更有效，移植干细胞数量多，位置固定。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种软组织修复材料的制备方法及应用，本发明将脐带间充质干细胞球和脱细胞生物支架有机结合，可缩短愈合时间，减少治疗费用，免手术创伤，在再生医学领域具有巨大的潜力及优势。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种软组织修复材料的制备方法，包括如下步骤：
S1：获取脐带和生物支架材料并检测
取生物支架材料于无菌盒中，取下人脐带的两端并用碘酒消毒，随后对脐带的两端进行结扎，无菌条件下用生理盐水冲洗洗净生物支架材料及脐带上的血凝块，经检测乙肝病毒表面抗原、梅毒螺旋体抗体、HIV病毒抗体均为阴性后，将脐带转移至无菌实验室后用含双抗的PBS漂洗，备用；
S2：制备脱细胞生物支架材料
对生物支架材料进行脱细胞处理，处理方法如下：
A.将剥离的生物支架材料组织用PBS溶液洗涤后进行3次冻融循环实验；
B.将生物支架材料置于网格过滤器中，在流动的去离子水下进行适当力度的揉洗，搓洗10分钟，重复3次；
C.再将生物支架材料浸入胰蛋白酶/EDTA溶液中，并置于摇床冲洗1小时；
D.将生物支架材料浸入Triton溶液中，并置于摇床冲洗1小时，重复2次；
E.将生物支架材料置于网状过滤器中，并在流动的去离子水下进行适当力度的揉洗10分钟
F.将生物支架材料浸入Triton溶液中，并置于摇床冲洗1小时，重复2次；
G.生物支架材料浸入脱氧胆酸钠溶液中，并置于摇床冲洗1小时，重复2次；
H.生物支架材料浸入0.1％对乙酸/4％乙醇溶液中，并置于摇床冲洗4小时；
I.用无菌PBS冲刷生物支架材料15分钟后，再用无菌去离子水冲洗生物支架材料15分钟，重复2次后，将生物支架材料组织在-80℃液氮环境下密封储存；
S3：培养扩增脐带间充质干细胞球
A.脐带标本用磷酸盐缓冲液彻底清洗；
B.用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1mm3；
C.分别用I型胶原酶和消解酶进行顺序消化，组织用12.5U/mL I型胶原酶在37℃振荡水浴中孵育12h，孵育后，将2％的消解酶加入相同的混合物中，并将样品在37℃下再孵育2小时；
D.酶解后的组织样品通过250mm的金属筛，用含1％青霉素/链霉素、2.5mg/mL两性霉素的PBS彻底清洗；
E.放入DMEM/F12的10cm2培养板中，添加10％胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、α最低必需培养基、5％人血小板裂解物；
F.每隔3天，更换一半的培养基，当细胞融合度达到80～90％时，用0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液传代；
G.干细胞传代至第二代后，非胰蛋白酶消化液TrypLE Select消化成单细胞悬液，离心去除消化液，并重悬，经细胞计数后调整细胞密度至105cells/ml，按照3000～5000cells/ml接种至低吸附96孔3-D细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中静置培养并进行持续观察3天；
S4：干细胞球种植于脱细胞生物支架材料基底层
将步骤S2处理的人脱细胞生物支架材料在恒温37℃下复水60min，上皮层朝下、基底层朝上置入培养皿，待步骤S3中的第三代干细胞形成类圆形球体后，使用微量移液器将球体转移种植于基底层上，并均匀涂抹，并加入浓度为0.5mg/mL的层粘连蛋白溶液1～5ug；随后将负载有脐带间充质干细胞的人脱细胞生物支架材料至于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下静置1天，使脐带间充质干细胞球附着于人脱细胞生物支架材料上，最终得到干细胞球软组织修复材料。
进一步的，步骤S4中种植至生物支架材料的干细胞球为1滴/cm3，每滴细胞悬液中含有105个细胞。
进一步的，所述生物支架材料为动物羊膜或肠粘膜或真皮。
为解决以上技术问题，本发明还提供了软组织修复材料。
为解决以上技术问题，本发明还提供了干细胞球。
为解决以上技术问题，本发明还提供了软组织修复材料在制备修复或替代软组织的材料中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明将脐带间充质干细胞球和脱细胞羊膜有机结合，制备方法简单，克服了一些细胞数量少、位置不固定的问题，不但可实现无创修复皮肤缺损，达到慢性难愈性大面积软组织重建的目的，还能充分发挥抗粘连作用、抑菌作用、伤口保护、止痛和启动上皮化的能力，其效果和效用持久性均高于传统方法，可缩短愈合时间，减少治疗费用，免手术创伤，在再生医学领域具有巨大的潜力及优势。
附图说明
图1为本发明的实施例的间充质干细胞球形态D1图；
图2为本发明的实施例的间充质干细胞球形态D3图；
图3为本发明的实施例制备的软组织修复材料的应用前后康复图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
本实施例提供一种软组织修复材料的制备方法，以脱细胞羊膜支架为例说明，包括如下步骤：
S1：获取脐带和羊膜并检测
胎盘与胎儿分离后立即取胎盘置于无菌盒中，取下人脐带的两端并用碘酒消毒，随后对脐带的两端进行结扎，无菌条件下用生理盐水冲洗洗净胎盘及脐带上的血凝块，经检测乙肝病毒表面抗原、梅毒螺旋体抗体、HIV病毒抗体均为阴性后，将脐带转移至无菌实验室后用含双抗的PBS漂洗，备用；
S2：制备脱细胞羊膜支架
通过羊膜与绒毛膜间的潜在间隙钝性分离获取羊膜，随后对羊膜进行脱细胞处理，处理方法如下：
A.将剥离的羊膜组织用PBS溶液洗涤后进行3次冻融循环实验；
B.将羊膜置于网格过滤器中，在流动的去离子水下进行适当力度的揉洗，搓洗10分钟，重复3次；
C.再将羊膜浸入胰蛋白酶/EDTA溶液中，并置于摇床冲洗1小时；
D.将羊膜浸入Triton溶液中，并置于摇床冲洗1小时，重复2次；
E.将羊膜置于网状过滤器中，并在流动的去离子水下进行适当力度的揉洗10分钟
F.将羊膜浸入Triton溶液中，并置于摇床冲洗1小时，重复2次；
G.羊膜浸入脱氧胆酸钠溶液中，并置于摇床冲洗1小时，重复2次；
H.羊膜浸入0.1％对乙酸/4％乙醇溶液中，并置于摇床冲洗4小时；
I.用无菌PBS冲刷羊膜15分钟后，再用无菌去离子水冲洗羊膜15分钟，重复2次后，将羊膜组织在-80℃液氮环境下密封储存；
S3：培养扩增脐带间充质干细胞球
A.脐带标本用磷酸盐缓冲液(PBS)彻底清洗；
B.用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1mm3；
C.分别用I型胶原酶和消解酶进行顺序消化，组织用12.5U/mL I型胶原酶在37℃振荡水浴中孵育12h，孵育后，将2％的消解酶(w/v)加入相同的混合物中，并将样品在37℃下再孵育2小时；
D.酶解后的组织样品通过250mm的金属筛，用含1％青霉素/链霉素、2.5mg/mL两性霉素的PBS彻底清洗；
E.放入DMEM/F12的10cm2培养板中，添加10％胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、α最低必需培养基(α-MEM)、5％人血小板裂解物(HPL)；
F.每隔3天，更换一半的培养基，当细胞融合度达到80～90％时，用0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液传代；
G.干细胞传代至第二代后，非胰蛋白酶消化液TrypLE Select消化成单细胞悬液，离心去除消化液，并重悬，经细胞计数后调整细胞密度至105cells/ml，按照3000～5000cells/ml接种至低吸附96孔3-D细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中静置培养并进行持续观察3天；
S4：干细胞球种植于脱细胞羊膜基底层
将步骤S2处理的人脱细胞羊膜在恒温37℃下复水60min，上皮层朝下、基底层朝上置入培养皿，待步骤S3中的第三代干细胞形成类圆形球体后，使用微量移液器将球体转移种植于基底层上，并均匀涂抹，并加入浓度为0.5mg/mL的层粘连蛋白溶液1～5ug，本实施例种植至羊膜的干细胞球为1滴/cm3，每滴细胞悬液中含有105个细胞；随后将负载有脐带间充质干细胞的人脱细胞羊膜至于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下静置1天，使脐带间充质干细胞球附着于人脱细胞羊膜上，最终得到干细胞球软组织修复材料。
其他组织来源的间充质干细胞也能运用本实施例的上述方法制备软组织修复材料，不限于骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、表皮干细胞等；另外，由于种植干细胞球的密度可控制，在脱细胞羊膜上可均匀分布，最终成品可根据创面的具体大小和形状进行剪裁。见附图1和附图2，图1为本发明的实施例的间充质干细胞球形态D1图，图2为本发明的实施例的间充质干细胞球形态D3图。
见附图3，图3A1、图3A2为53岁男性患者，主患左下肢慢性溃疡，其中A1为术前外观，A2为术后外观；图3B1、图3B2为65岁女性患者，主患右下肢慢性静脉创伤，其中B1为术前外观，B2为术后外观；图3C1、图3C2为45岁男性患者，主患创伤后皮肤缺损，其中C1为术前外观，C2为术后外观。本实施例将上述患者的创面处理后，搭载干细胞球的脱细胞羊膜移植于创面，让细胞紧密贴合，排除气泡，然后用无菌纱布覆盖，加压包扎，贯穿应用后的愈合时间、排斥反应、局部炎症；10天后见创面良好，无明显局部排斥或炎症反应，创面变浅变小，达到愈合标准。
利用本实施例的制备方法制备的软组织修复材料可应用于制备修复或替代软组织的材料中，脱细胞羊膜支架中的原料羊膜可以是动物羊膜也可以是人羊膜，还可以由其他脱细胞生物支架材料取代，例如肠粘膜、真皮等，不论是哪一种生物支架材料，其制备方法均与上述羊膜的制备方法相同。
本实施例所用到的人脐带和人胎盘均经过了医院和产妇的同意，并且是在产房进行人脐带和人胎盘的取材。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种软组织修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：获取脐带和生物支架材料并检测
取生物支架材料于无菌盒中，取下人脐带的两端并用碘酒消毒，随后对脐带的两端进行结扎，无菌条件下用生理盐水冲洗洗净生物支架材料及脐带上的血凝块，经检测乙肝病毒表面抗原、梅毒螺旋体抗体、HIV病毒抗体均为阴性后，将脐带转移至无菌实验室后用含双抗的PBS漂洗，备用；
S2：制备脱细胞生物支架材料
对生物支架材料进行脱细胞处理，处理方法如下：
A.将剥离的生物支架材料组织用PBS溶液洗涤后进行3次冻融循环实验；
B.将生物支架材料置于网格过滤器中，在流动的去离子水下进行适当力度的揉洗，搓洗10分钟，重复3次；
C.再将生物支架材料浸入胰蛋白酶/EDTA溶液中，并置于摇床冲洗1小时；
D.将生物支架材料浸入Triton溶液中，并置于摇床冲洗1小时，重复2次；
E.将生物支架材料置于网状过滤器中，并在流动的去离子水下进行适当力度的揉洗10分钟
F.将生物支架材料浸入Triton溶液中，并置于摇床冲洗1小时，重复2次；
G.生物支架材料浸入脱氧胆酸钠溶液中，并置于摇床冲洗1小时，重复2次；
H.生物支架材料浸入0.1％对乙酸/4％乙醇溶液中，并置于摇床冲洗4小时；
I.用无菌PBS冲刷生物支架材料15分钟后，再用无菌去离子水冲洗生物支架材料15分钟，重复2次后，将生物支架材料组织在-80℃液氮环境下密封储存；
S3：培养扩增脐带间充质干细胞球
A.脐带标本用磷酸盐缓冲液彻底清洗；
B.用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1mm3；
C.分别用I型胶原酶和消解酶进行顺序消化，组织用12.5U/mL I型胶原酶在37℃振荡水浴中孵育12h，孵育后，将2％的消解酶加入相同的混合物中，并将样品在37℃下再孵育2小时；
D.酶解后的组织样品通过250mm的金属筛，用含1％青霉素/链霉素、2.5mg/mL两性霉素的PBS彻底清洗；
E.放入DMEM/F12的10cm2培养板中，添加10％胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、α最低必需培养基、5％人血小板裂解物；
F.每隔3天，更换一半的培养基，当细胞融合度达到80～90％时，用0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液传代；
G.干细胞传代至第二代后，非胰蛋白酶消化液TrypLE Select消化成单细胞悬液，离心去除消化液，并重悬，经细胞计数后调整细胞密度至105cells/ml，按照3000～5000cells/ml接种至低吸附96孔3-D细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中静置培养并进行持续观察3天；
S4：干细胞球种植于脱细胞生物支架材料基底层
将步骤S2处理的人脱细胞生物支架材料在恒温37℃下复水60min，上皮层朝下、基底层朝上置入培养皿，待步骤S3中的第三代干细胞形成类圆形球体后，使用微量移液器将球体转移种植于基底层上，并均匀涂抹，并加入浓度为0.5mg/mL的层粘连蛋白溶液1～5ug；随后将负载有脐带间充质干细胞的人脱细胞生物支架材料至于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下静置1天，使脐带间充质干细胞球附着于人脱细胞生物支架材料上，最终得到干细胞球软组织修复材料。
2.根据权利要求1所述的一种软组织修复材料的制备方法，其特征在于，步骤S4中种植至生物支架材料的干细胞球为1滴/cm3，每滴细胞悬液中含有105个细胞。
3.根据权利要求1所述的一种软组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述生物支架材料为动物羊膜或肠粘膜或真皮。
4.权利要求1-3中任意一项所述的制备方法制备的软组织修复材料。
5.权利要求1-3中任意一项所述的制备方法制备的干细胞球。
6.权利要求1-3中任意一项所述的制备方法制备的软组织修复材料在制备修复或替代软组织的材料中的应用。
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