CN115569229A - 搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于皮肤微生态、皮肤保护与创面修复技术领域，公开了一种搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料及其制备方法，所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法包括：根据维持皮肤微生态稳态的原理，利用多种后生元成分的优点，通过脂质体封包后生元成分制成类细胞结构，以脱细胞羊膜为载体进行搭载，通过脂质体封包多种后生元成分负载至羊膜上，得到一种皮肤保护和创伤修复的皮肤软组织保护材料，以达到修复并维持皮肤微生态稳态的目的。本发明具有锁水保湿、去皱嫩肤、增加皮肤弹性、美白祛斑、抑菌抗炎、修复肌肤损伤、修复并维持皮肤微生态稳态的功效。
Description
技术领域
本发明属于皮肤微生态、皮肤保护与创面修复技术领域，尤其涉及一种搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料及其制备方法。
背景技术
目前，皮肤是人体最大的器官，常将皮肤的表皮层由外向内划分为角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底层。但是现在越来越多的研究指明皮肤表面的微生物层有其独特的动态平衡机制，在这五层结构之外应该再加上一层微生物层。皮肤表面的常驻菌群主要有表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌等，除去这些常驻菌群之外，还有很多的暂住菌群。由于常驻菌群的占位保护效应，以及常驻菌群可以分解皮肤甘油三酯为脂肪酸形成皮脂保护膜，还可以分泌一些抑制其他杂菌生长的物质，从而维持皮肤微生态的稳态平衡。但是，一旦当皮肤的微生态稳态被打破，那么皮肤的健康状况必将遭到影响，皮肤的健康质量也会下降，唯有重建皮肤微生态稳态才能重新焕发皮肤的生机与活力。后生元主要成分就是益生菌的裂解产物及其代谢产物的总和，后生元具备多种优异的特性，后生元中所包含的益生菌裂解产物可以激活人体的免疫系统，其代谢产物能够抑制杂菌的生长，从而在皮肤表面形成一个皮肤保护膜。后生元的安全性高，由于里面所含有的细菌已经失去了分裂的能力，所以使用时不用担心微生物过量而引起的菌血症等危险并发症的发生。由于后生元是用益生菌制备的，所以在制备的过程当中，可以控制并检测益生菌的状态和产物的量和性质，从而判断益生菌是否是健康状态的益生菌，其代谢产物的量有多少，是否因为菌体在分裂的过程当中发生变异而导致有毒性物质的产生。这些都可以控制，从而可以定量去供给皮肤所需要的合适的后生元成分。无论是从提高利用率方面，还是从健康安全的角度，后生元都是要优于益生元成分的，并且从物品存储方面来说的话，后生元可以有更长更稳定的保存期。表皮葡萄球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、纳豆芽孢杆菌含有多种益生元成分，通过培养这些益生菌到一定阶段后裂解之，从而获得相应的后生元成分。脱细胞羊膜是对羊膜组织进行一系列脱细胞处理而制成的天然生物支架，主要成分包含胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白，脱细胞羊膜具有抗微生物、抗炎和非抗原性等优良特性。目前已经发现脱细胞羊膜能有效愈合创面，可诱导上皮细胞的生长，通过促进血管和平滑肌细胞的生长来促进创伤修复，已有相关产品被广泛应用于构建组织和器官的工程支架。脂质体具有的双分子层结构与皮肤细胞膜结构相同，脂质体所包裹的成分能够与皮肤有更好的亲和性，有利于皮肤更好的吸收。脂质体是一种类细胞结构，将脂质体包裹后生元成分后搭载到脱细胞羊膜上，类似与还原了羊膜的有细胞状态，更加还原了羊膜的生理结构，与人体皮肤的亲和性将更佳。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中一旦当皮肤的微生态稳态被打破，皮肤的健康状况必将遭到影响，皮肤的健康质量也会下降。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法包括：
根据维持皮肤微生态稳态的原理，利用多种后生元成分的优点，通过脂质体封包后生元成分制成类细胞结构，以脱细胞羊膜为载体进行搭载，通过脂质体封包多种后生元成分负载至脱细胞羊膜上，得到一种用于皮肤保护和创伤修复的皮肤软组织保护材料，以达到修复并维持皮肤微生态稳态的目的。
进一步，所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法具体包括：
步骤一，从养殖场或牧场选择健康妊娠的绵阳或山羊，在分娩后获取胎羊的羊膜组织，并对羊膜组织进行处理，获得脱细胞羊膜；同时将所获得的脱细胞羊膜置于冰箱保存；从养殖场或者牧场收集分娩后胎羊的羊膜从而获取原材料，对羊膜进行脱细胞处理后获得的脱细胞羊膜将作为我们所发明的基质载体材料；
步骤二，多种后生元的制备，通过培养表皮葡萄球菌制备表皮葡萄球菌后生元，通过培养乳酸菌制备乳酸菌后生元，通过培养双歧杆菌制备双歧杆菌后生元，通过培养复苏菌种制备纳豆芽孢杆菌后生元；制备多种后生元，后生元可用于修复并维持皮肤微生态稳态；
步骤三，制备包裹后生元成分的脂质体，将表皮葡萄球菌后生元、乳酸菌后生元、双歧杆菌后生元、纳豆芽孢杆菌后生元加入到PBS溶液中搅拌均匀，得到混合溶液A；大豆磷脂和胆固醇通过水浴滴加的方式溶解到乙醚溶液中，得到混合溶液B；将上述制备的混合溶液A和混合溶液B混合在一起搅拌和超声处理，蒸发除去溶剂乙醚，并进行过滤；是一种利用超声制备脂质体的方法，可以将后生元成分均匀的包裹到脂质体当中；
步骤四，制备皮肤软组织保护材料，将保湿剂、螯合剂、白芷粉加入到无菌去离子水中，得到混合溶液，对上述得到的混合溶液进行搅拌；同时将保存的脱细胞羊膜取出修剪成面膜的形状浸泡在上述得到的混合溶液中；将脱细胞羊膜捞起，通过钴60辐照灭菌；将所获得的封包有后生元成分的脂质体种植到上述脱细胞羊膜上，获得所要制备的皮肤软组织保护材料。保湿剂、螯合剂、白芷粉加入到无菌去离子水中，得到混合溶液是本发明所创造的一种修护液，其中白芷具有抗炎、解热镇痛、解痉、抗菌、防紫外线、抗辐射和治疗瘙痒的功效。钴60的灭菌方式可以更好的保持脱细胞羊膜的性质。
羊膜组织本来是有细胞的，是因为我们想把它作为一种支撑材料使用，所以做了脱细胞处理。脂质体具有类细胞结构，脂质体包裹后生元成分，相当于我们自己造了类细胞种植到脱细胞羊膜上，相当于还原了羊膜的有细胞状态。
后生元是菌体裂解之后所获得的菌体组织和菌体的代谢产物，之所以说后生元优于益生元就是因为后生元里面不含有活菌，使用起来更加的安全，那么通过脂质体去包裹这些后生元成分相当于造了“人造细菌”这种类细胞结构，既没有细菌不受控制繁殖的危险性，又起到了类似活菌起的作用。
脂质体双分子层类细胞结构更加亲和皮肤，可以透皮，可以缓释，功能上相对会多样。
进一步，所述步骤一具体过程为：
从养殖场或牧场选择健康妊娠的绵阳或山羊，在分娩后立刻将胎羊的羊膜小心翼翼的剥离，只取羊膜组织，其余的不取，保证羊膜的洁净；将所获得的羊膜组织经PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓以使得充分洗净，之后再用流动的PBS冲洗，同样轻轻揉搓；
将洗净的羊膜组织置于-80℃冰箱中放置6-7小时，之后取出置于室温下放置1-2小时，重复冻融步骤3次；将反复冻融的羊膜组织再次用PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓，之后再用流动的PBS溶液冲洗，轻轻揉搓；
取上羊膜组织浸泡在含有0.3％胰蛋白酶/EDTA溶液中，反应1小时后取出，再浸入Triton114溶液中，反应1小时后取出，重复3次；将获得的羊膜组织再次用PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓，之后再用流动的PBS溶液冲洗，轻轻揉搓；
取羊膜组织浸泡在脱氧胆酸钠溶液中，反应1小时后取出，再浸入0.1％对乙酸/4％乙醇混合溶液中，4小时后取出；将获得的羊膜组织再次用PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓，之后再用流动的PBS溶液冲洗，轻轻揉搓；将获得的羊膜组织用无菌去离子水冲洗10-15分钟，获得脱细胞羊膜；将所获得的脱细胞羊膜置于4℃冰箱保存。
进一步，所述步骤二中，多种后生元的制备具体过程为：
第一步，制备表皮葡萄球菌后生元，在健康人体的皮肤表面分离一株表皮葡萄球菌，并对表皮葡萄球菌进行培养，得到培养液；对培养液进行离心，弃去上清液，并加入溶菌酶进行超声处理，获得菌体的裂解液，将菌体的裂解液冻干；
第二步，制备乳酸菌后生元，通过MRS液体培养基培养乳酸菌，将所获得的培养液进行离心，弃去上清液，加入溶菌酶进行超声处理；获得菌体的裂解液，将菌体的裂解液进行冻干；
第三步，制备双歧杆菌后生元，通过MRS液体培养基培养双歧杆菌，获得培养液；对培养液进行离心，弃去上清液，加入溶菌酶并进行超声处理，得到菌体的裂解液，将获得的细菌裂解液冻干；
第四步，制备纳豆芽孢杆菌后生元，通过无菌生理盐水浸泡复苏菌种，并利用培养基进行培养；将获得的培养液进行离心，弃去上清液，加入溶菌酶并进行超声处理，得到获得菌体的裂解液，将获得的细菌裂解液冻干。
进一步，所述第一步中，制备表皮葡萄球菌后生元具体过程为：
从健康人体的皮肤表面分离一株表皮葡萄球菌；将表皮葡萄球菌接种到肉汤培养基中，待培养基肉眼可见较为浑浊之后停止培养；取培养液置于离心管内，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液；将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟；通过1000W 30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔；如此重复处理大于100分钟，获得菌体的裂解液；将获得的裂解液冻干，获得的粉末为表皮葡萄球菌后生元；
所述第二步中，制备乳酸菌后生元具体过程为：
取适量纯净的乳酸菌干菌种，菌种复苏后，通过MRS液体培养基培养乳酸菌；培养基中的养料差不多利用完全之后，取所获得的培养液置于离心管内，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液；将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟；
通过1000W 30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔；如此重复处理大于100分钟，获得菌体的裂解液；将获得的裂解液冻干，获得的粉末为乳酸菌后生元。
进一步，所述第三步中，制备双歧杆菌后生元具体过程为：
取适量纯净的双歧杆菌干菌种，菌种复苏后，使用MRS液体培养基培养双歧杆菌；培养基中的养料差不多利用完全之后，将培养液置于离心管中，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液；将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟；通过1000W30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔；如此重复处理大于100分钟，获得菌体的裂解液；将获得的细菌裂解液冻干，获得的粉末为双歧杆菌后生元。
进一步，所述第四步中，制备纳豆芽孢杆菌后生元具体过程为：
取适量纯净的纳豆芽孢杆菌干菌种，使用无菌生理盐水浸泡复苏菌种；将复苏的纳豆芽孢杆菌接种在含有葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨15g/L，NaCl 5g/L的培养基中进行培养；
培养基中的营养物质耗尽后，将培养液置于离心管中，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液；将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟；通过1000W 30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔；如此重复处理大于100分钟，获得菌体的裂解液；将获得的细菌裂解液冻干，获得的粉末为纳豆芽孢杆菌后生元。
进一步，所述步骤三中，制备包裹后生元成分的脂质体具体过程为：
取所获得的表皮葡萄球菌后生元300-400mg，取所获得的乳酸菌后生元100-200mg，取所获得的双歧杆菌后生元100-200mg，加入所获得的纳豆芽孢杆菌后生元100-200mg，加入到100mL PH＝5的PBS溶液中搅拌均匀，得到混合溶液A；取800mg大豆磷脂，200mg胆固醇，通过水浴滴加的方式溶解到300mL乙醚溶液中，水浴温度控制在10℃以下；将上述制备的混合溶液A和混合溶液B混合在一起搅拌成乳浊液；将超声探头插入到所获得的液体中，控制温度为25℃，调整功率为200W，超声3秒，停7秒，重复3分钟；蒸发除去溶剂乙醚，然后用PH＝5的PBS溶液水化1小时；通过400nm的滤膜滤过，再使用250nm的滤膜滤过，获得封包有后生元成分的脂质体。
进一步，所述步骤四中，制备皮肤软组织保护材料具体过程为：
取1L无菌去离子水；加入保湿剂：加入5-6mL甘油，加入3-4mL1，3-丁二醇，加入1-2mL1，2己二醇，加入0.5-0.8g透明质酸钠；加入螯合剂：添加0.2mgEDTA二钠盐；加入600-800mg丁香油；加入白芷粉2-5g，添加100mg维生素E；将上述混合液体在4℃，100rpm搅拌速度下充分搅拌混匀15分钟；
将在4℃冰箱内保存的脱细胞羊膜取出修剪成面膜的形状，浸泡在上述混合液体中，置于摇床上20-30分钟，之后将脱细胞羊膜捞起，通过钴60辐照灭菌，辐照剂量为20-25kGy；将所获得的封包有后生元成分的脂质体种植到脱细胞羊膜上，获得所要制备的皮肤软组织保护材料；装袋密封，置于4℃冰箱冷藏保存。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法制备的搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料，所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料包括：脱细胞羊膜组织和脂质体封包的多种后生元、无菌去离子水、甘油、1，3-丁二醇、1，2己二醇、透明质酸钠、EDTA二钠盐、丁香油、白芷粉、维生素E。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明采用后生元稳定皮肤微生态环境。本发明借助于脱细胞羊膜的抗微生物、抗炎和非抗原性等优良特性，使用其作为载体可以应用于各种人群，敏感性肌肤也都适用。鉴于后生元对皮肤的益处及对皮肤微生态稳态的重要性，将后生元作为添加成分使用，从而发明一种搭载多种后生元成分，以脱细胞羊膜为载体的皮肤软组织保护材料及其制备方法。本发明的皮肤软组织保护材料采用纯天然原材料，取自本要丢弃的动物羊膜组织，并且搭载了多种后生元成分脂质体具有类细胞结构，与皮肤的亲和性好，还有缓释的效果，其中所含有的活性成分对于维持皮肤微生态稳态有着良好的效果，具有锁水保湿、去皱嫩肤、增加皮肤弹性、美白祛斑、抑菌抗炎、修复肌肤损伤、修复并维持皮肤微生态稳态的功效。本发明贴皮使用，使用方式简便安全。基于以上的特点，本发明适用人群广泛，成本低廉，制作工艺简便，功效强大，具备巨大的应用价值和社会经济效益。本发明中脂质体包裹后生元成分制成的类细胞结构，可以更好的负载到脱细胞羊膜上，与皮肤的亲和性更佳。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明利用多种后生元成分的优点，以脱细胞羊膜为载体进行搭载，所制备的皮肤软组织保护材料有着锁水保湿、去皱嫩肤、增加皮肤弹性、抑菌抗炎、修复肌肤损伤、修复并维持皮肤微生态稳态的功效。本发明使用简便，保存方便，安全性高，适用于各类人群，包括敏感肌肤。在日常生活及医疗卫生行业中有着广泛的使用需求和广阔的市场前景。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
银离子敷料等含有重金属离子的敷料正在逐渐被淘汰和禁用，本发明投产后有望取代银离子敷料，填补这一空白，带来巨大的经济效益。
(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
目前，尚未有研究人员制备过搭载后生元成分的脱细胞羊膜基质皮肤软组织保护材料。本发明提供了后生元制备的方式，提供了脂质体封包后生元的技术，还提供了一种皮肤修护液的配方，首次创新性的将后生元与脱细胞羊膜稳定结合在一起。
(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
羊膜组织本来是有细胞的，为了将其作为一种支撑材料使用，所以做了脱细胞处理。脂质体具有类细胞结构，脂质体包裹后生元成分，相当于制造了类细胞种植到脱细胞羊膜上，脂质体可以稳定存在于羊膜组织的纤维结构中。
后生元是菌体裂解之后所获得的菌体组织和菌体的代谢产物，因为后生元里面不含有活菌，所以使用起来更加的安全，通过脂质体去包裹这些后生元成分制作成类细胞结构，既没有细菌不受控制繁殖的危险性，又起到了类似活菌起的作用。脂质体双分子层类细胞结构更加亲和皮肤，可以透皮，可以缓释，功能上相对更多样。
附图说明
图1是本发明实施例提供的搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供的搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料包括：脱细胞羊膜组织和脂质体封包的多种后生元、无菌去离子水、甘油、1，3-丁二醇、1，2己二醇、透明质酸钠、EDTA二钠盐、丁香油、白芷粉、维生素E。
如图1所示，本发明实施例提供的搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法包括：
S101：从养殖场或牧场选择健康妊娠的绵阳或山羊，在分娩后获取胎羊的羊膜组织，并对羊膜组织进行处理，获得脱细胞羊膜；同时将所获得的脱细胞羊膜置于冰箱保存。
S102：多种后生元的制备，通过培养表皮葡萄球菌制备表皮葡萄球菌后生元，通过培养乳酸菌制备乳酸菌后生元，通过培养双歧杆菌制备双歧杆菌后生元，通过培养复苏菌种制备纳豆芽孢杆菌后生元。
S103：制备包裹后生元成分的脂质体，将表皮葡萄球菌后生元、乳酸菌后生元、双歧杆菌后生元、纳豆芽孢杆菌后生元加入到PBS溶液中搅拌均匀，得到混合溶液A；大豆磷脂和胆固醇通过水浴滴加的方式溶解到乙醚溶液中，得到混合溶液B；将上述制备的混合溶液A和混合溶液B混合在一起搅拌和超声处理，蒸发除去溶剂乙醚，并进行过滤。
S104：制备皮肤软组织保护材料，将保湿剂、螯合剂、白芷粉加入到无菌去离子水中，得到混合溶液，对上述得到的混合溶液进行搅拌；同时将保存的脱细胞羊膜取出修剪成面膜的形状浸泡在上述得到的混合溶液中；将脱细胞羊膜捞起，通过钴60辐照灭菌；将所获得的封包有后生元成分的脂质体种植到上述脱细胞羊膜上，获得所要制备的皮肤软组织保护材料。
本发明实施例提供的S101具体过程为：
从养殖场或牧场选择健康妊娠的绵阳或山羊，在分娩后立刻将胎羊的羊膜小心翼翼的剥离，只取羊膜组织，其余的不取，一定要保证羊膜的洁净。
将所获得的羊膜组织经PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓以使得充分洗净，之后再用流动的PBS冲洗，同样也可以轻轻揉搓。
将洗净的羊膜组织置于-80℃冰箱中放置6-7小时，之后取出置于室温下放置1-2小时，重复这一冻融步骤3次。
将反复冻融的羊膜组织再次用PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓，之后再用流动的PBS溶液冲洗，可以轻轻揉搓。
取上羊膜组织浸泡在含有0.3％胰蛋白酶/EDTA溶液中，反应1小时后取出，再浸入Triton114溶液中，反应1小时后取出，重复这一步骤3次。
将获得的羊膜组织再次用PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓，之后再用流动的PBS溶液冲洗，可以轻轻揉搓。
取羊膜组织浸泡在脱氧胆酸钠溶液中，反应1小时后取出，再浸入0.1％对乙酸/4％乙醇混合溶液中，4小时后取出。
将获得的羊膜组织再次用PBS溶液反复洗涤3次，可以轻轻揉搓，之后再用流动的PBS溶液冲洗，可以轻轻揉搓。将获得的羊膜组织用无菌去离子水冲洗10-15分钟，获得脱细胞羊膜。将所获得的脱细胞羊膜置于4℃冰箱保存。
本发明实施例提供的S102中，多种后生元的制备具体过程为：
第一步，制备表皮葡萄球菌后生元，在健康人体的皮肤表面分离一株表皮葡萄球菌，并对表皮葡萄球菌进行培养，得到培养液；对培养液进行离心，弃去上清液，并加入溶菌酶进行超声处理，获得菌体的裂解液，将菌体的裂解液冻干。
第二步，制备乳酸菌后生元，通过MRS液体培养基培养乳酸菌，将所获得的培养液进行离心，弃去上清液，加入溶菌酶进行超声处理；获得菌体的裂解液，将菌体的裂解液冻干。
第三步，制备双歧杆菌后生元，通过MRS液体培养基培养双歧杆菌，获得培养液；对培养液进行离心，弃去上清液，加入溶菌酶并进行超声处理，得到菌体的裂解液，将获得的细菌裂解液冻干。
第四步，制备纳豆芽孢杆菌后生元，通过无菌生理盐水浸泡复苏菌种，并利用培养基进行培养；将获得的培养液进行离心，弃去上清液，加入溶菌酶并进行超声处理，得到获得菌体的裂解液，将获得的细菌裂解液冻干。
本发明实施例提供的第一步中，制备表皮葡萄球菌后生元具体过程为：
从健康人体的皮肤表面分离一株表皮葡萄球菌；将表皮葡萄球菌接种到肉汤培养基中，待培养基肉眼可见较为浑浊之后停止培养。取培养液置于离心管内，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液。将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟。使用1000W 30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔。如此重复处理大于100分钟。由此可以获得菌体的裂解液。将获得的裂解液冻干，获得的粉末即为表皮葡萄球菌后生元。
本发明实施例提供的第二步中，制备乳酸菌后生元具体过程为：
取适量纯净的乳酸菌干菌种，菌种复苏后，使用MRS液体培养基培养乳酸菌。估计培养基中的养料差不多利用完全之后，取所获得的培养液置于离心管内，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液。将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟。
使用1000W 30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔。如此重复处理大于100分钟。由此可以获得菌体的裂解液。将获得的裂解液冻干，获得的粉末即为乳酸菌后生元。
本发明实施例提供的第三步中，制备双歧杆菌后生元具体过程为：
取适量纯净的双歧杆菌干菌种，菌种复苏后，使用MRS液体培养基培养双歧杆菌。估计培养基中的养料差不多利用完全之后，将培养液置于离心管中，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液。将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟。使用1000W30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔。如此重复处理大于100分钟。由此可以获得菌体的裂解液。将获得的细菌裂解液冻干，获得的粉末即为双歧杆菌后生元。
本发明实施例提供的第四步中，制备纳豆芽孢杆菌后生元具体过程为：
取适量纯净的纳豆芽孢杆菌干菌种，使用无菌生理盐水浸泡复苏菌种。将复苏的纳豆芽孢杆菌接种在含有葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨15g/L，NaCl 5g/L的培养基中进行培养。
估计培养基中的营养物质耗尽后，将培养液置于离心管中，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液。将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟。使用1000W 30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔。如此重复处理大于100分钟。由此可以获得菌体的裂解液。将获得的细菌裂解液冻干，获得的粉末即为纳豆芽孢杆菌后生元。
本发明实施例提供的S103中，制备包裹后生元成分的脂质体具体过程为：
取所获得的表皮葡萄球菌后生元300-400mg，取所获得的乳酸菌后生元100-200mg，取所获得的双歧杆菌后生元100-200mg，加入所获得的纳豆芽孢杆菌后生元100-200mg，加入到100mL PH＝5的PBS溶液中搅拌均匀，得到混合溶液A；取800mg大豆磷脂，200mg胆固醇，通过水浴滴加的方式溶解到300mL乙醚溶液中，水浴温度控制在10℃以下。将上述制备的混合溶液A和混合溶液B混合在一起搅拌成乳浊液；将超声探头插入到所获得的液体中，控制温度为25℃，调整功率为200W，超声3秒，停7秒，重复这一步骤3分钟。蒸发除去溶剂乙醚，然后用PH＝5的PBS溶液水化约1小时。使用400nm的滤膜滤过，再使用250nm的滤膜滤过，获得封包有后生元成分的脂质体。
本发明实施例提供的S104中，制备皮肤软组织保护材料具体过程为：
取1L无菌去离子水；加入保湿剂：加入5-6mL甘油，加入3-4mL1，3-丁二醇，加入1-2mL1，2己二醇，加入0.5-0.8g透明质酸钠。
加入螯合剂：添加0.2mgEDTA二钠盐；加入600-800mg丁香油。
加入白芷粉2-5g，白芷粉可以起到美白祛斑，抑菌消炎之功效；添加100mg维生素E。
将上述混合液体在4℃，100rpm搅拌速度下充分搅拌混匀15分钟。
将在4℃冰箱内保存的脱细胞羊膜取出修剪成面膜的形状，浸泡在上述液体中，置于摇床上20-30分钟，之后将脱细胞羊膜捞起，选用钴60辐照灭菌，辐照剂量为20-25kGy。
将所获得的封包有后生元成分的脂质体种植到上述脱细胞羊膜上，获得所要制备的皮肤软组织保护材料。装袋密封，置于4℃冰箱冷藏保存。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
将本发明实施例提供的封包有后生元成分的脂质体种植到脱细胞羊膜上应用于制备皮肤伤口的敷料。
将本发明实施例提供的搭载多种后生元成分的脱细胞羊膜基质材料用于制备美容修复面膜。
本发明实施例提供的皮肤软组织保护材料还可以用做大面积烧伤或创伤皮源不足时的短期替代品。
本发明的皮肤软组织保护材料采用纯天然原材料，取自本要丢弃的动物羊膜组织，并且搭载了多种后生元成分脂质体具有类细胞结构，与皮肤的亲和性好，还有缓释的效果，其中所含有的活性成分对于维持皮肤微生态稳态有着良好的效果，具有锁水保湿、去皱嫩肤、增加皮肤弹性、美白祛斑、抑菌抗炎、修复肌肤损伤、修复并维持皮肤微生态稳态的功效。
本发明实施例提供的皮肤软组织保护材料通过脂质体封包多种不同的成分还可以调整其功能，扩大其应用范围。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
对本发明的实施例进行了生物相容性检测：
溶血试验，按照《GB/T16886.4-2003医疗器械生物学评价第4部分:与血液相互作用试验》；
体外细胞毒性测试，按照《GB/T16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验》测试方法进行测试；
皮肤刺激测试，按照《GB/T16886.10-2017医疗器械生物学评价第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验》测试方法进行测试；
皮肤致敏测试，按照《GB/T16886.10-2017医疗器械生物学评价第10部分:刺激与皮肤致敏试验》测试方法进行测试。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，其特征在于，所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法包括：
根据维持皮肤微生态稳态的原理，利用多种后生元成分的优点，通过脂质体封包后生元成分制成类细胞结构，以脱细胞羊膜为载体进行搭载，通过脂质体封包多种后生元成分负载至羊膜上，得到一种皮肤保护和创伤修复的皮肤软组织保护材料，以达到修复并维持皮肤微生态稳态的目的。
2.如权利要求1所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，其特征在于，所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法具体包括：
步骤一，从养殖场或牧场选择健康妊娠的绵阳或山羊，在分娩后获取胎羊的羊膜组织，并对羊膜组织进行处理，获得脱细胞羊膜；同时将所获得的脱细胞羊膜置于冰箱保存；
步骤二，多种后生元的制备，通过培养表皮葡萄球菌制备表皮葡萄球菌后生元，通过培养乳酸菌制备乳酸菌后生元，通过培养双歧杆菌制备双歧杆菌后生元，通过培养复苏菌种制备纳豆芽孢杆菌后生元；
步骤三，制备包裹后生元成分的脂质体，将表皮葡萄球菌后生元、乳酸菌后生元、双歧杆菌后生元、纳豆芽孢杆菌后生元加入到PBS溶液中搅拌均匀，得到混合溶液A；大豆磷脂和胆固醇通过水浴滴加的方式溶解到乙醚溶液中，得到混合溶液B；将上述制备的混合溶液A和混合溶液B混合在一起搅拌和超声处理，蒸发除去溶剂乙醚，并进行过滤；
步骤四，制备皮肤软组织保护材料，将保湿剂、螯合剂、白芷粉加入到无菌去离子水中，得到混合溶液，对上述得到的混合溶液进行搅拌；同时将保存的脱细胞羊膜取出修剪成面膜的形状浸泡在上述得到的混合溶液中；将脱细胞羊膜捞起，通过钴60辐照灭菌；将所获得的封包有后生元成分的脂质体种植到上述脱细胞羊膜上，获得所要制备的皮肤软组织保护材料。
3.如权利要求2所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，其特征在于，所述步骤一具体过程为：
从养殖场或牧场选择健康妊娠的绵阳或山羊，在分娩后立刻将胎羊的羊膜小心翼翼的剥离，只取羊膜组织，其余的不取，保证羊膜的洁净；将所获得的羊膜组织经PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓以使得充分洗净，之后再用流动的PBS冲洗，同样轻轻揉搓；
将洗净的羊膜组织置于-80℃冰箱中放置6-7小时，之后取出置于室温下放置1-2小时，重复冻融步骤3次；将反复冻融的羊膜组织再次用PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓，之后再用流动的PBS溶液冲洗，轻轻揉搓；
取上羊膜组织浸泡在含有0.3％胰蛋白酶/EDTA溶液中，反应1小时后取出，再浸入Triton114溶液中，反应1小时后取出，重复3次；将获得的羊膜组织再次用PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓，之后再用流动的PBS溶液冲洗，轻轻揉搓；
取羊膜组织浸泡在脱氧胆酸钠溶液中，反应1小时后取出，再浸入0.1％对乙酸/4％乙醇混合溶液中，4小时后取出；将获得的羊膜组织再次用PBS溶液反复洗涤3次，轻轻揉搓，之后再用流动的PBS溶液冲洗，轻轻揉搓；将获得的羊膜组织用无菌去离子水冲洗10-15分钟，获得脱细胞羊膜；将所获得的脱细胞羊膜置于4℃冰箱保存。
4.如权利要求2所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，其特征在于，所述步骤二中，多种后生元的制备具体过程为：
第一步，制备表皮葡萄球菌后生元，在健康人体的皮肤表面分离一株表皮葡萄球菌，并对表皮葡萄球菌进行培养，得到培养液；对培养液进行离心，弃去上清液，并加入溶菌酶进行超声处理，获得菌体的裂解液，将菌体的裂解液冻干；
第二步，制备乳酸菌后生元，通过MRS液体培养基培养乳酸菌，将所获得的培养液进行离心，弃去上清液，加入溶菌酶进行超声处理；获得菌体的裂解液，将菌体的裂解液进行冻干；
第三步，制备双歧杆菌后生元，通过MRS液体培养基培养双歧杆菌，获得培养液；对培养液进行离心，弃去上清液，加入溶菌酶并进行超声处理，得到菌体的裂解液，将获得的细菌裂解液冻干；
第四步，制备纳豆芽孢杆菌后生元，通过无菌生理盐水浸泡复苏菌种，并利用培养基进行培养；将获得的培养液进行离心，弃去上清液，加入溶菌酶并进行超声处理，得到获得菌体的裂解液，将获得的细菌裂解液冻干。
5.如权利要求4所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，其特征在于，所述第一步中，制备表皮葡萄球菌后生元具体过程为：
从健康人体的皮肤表面分离一株表皮葡萄球菌；将表皮葡萄球菌接种到肉汤培养基中，待培养基肉眼可见较为浑浊之后停止培养；取培养液置于离心管内，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液；将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟；通过1000W 30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔；如此重复处理大于100分钟，获得菌体的裂解液；将获得的裂解液冻干，获得的粉末为表皮葡萄球菌后生元；
所述第二步中，制备乳酸菌后生元具体过程为：
取适量纯净的乳酸菌干菌种，菌种复苏后，通过MRS液体培养基培养乳酸菌；培养基中的养料差不多利用完全之后，取所获得的培养液置于离心管内，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液；将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟；
通过1000W 30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔；如此重复处理大于100分钟，获得菌体的裂解液；将获得的裂解液冻干，获得的粉末为乳酸菌后生元。
6.如权利要求4所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，其特征在于，所述第三步中，制备双歧杆菌后生元具体过程为：
取适量纯净的双歧杆菌干菌种，菌种复苏后，使用MRS液体培养基培养双歧杆菌；培养基中的养料差不多利用完全之后，将培养液置于离心管中，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液；将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟；通过1000W30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔；如此重复处理大于100分钟，获得菌体的裂解液；将获得的细菌裂解液冻干，获得的粉末为双歧杆菌后生元。
7.如权利要求4所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，其特征在于，所述第四步中，制备纳豆芽孢杆菌后生元具体过程为：
取适量纯净的纳豆芽孢杆菌干菌种，使用无菌生理盐水浸泡复苏菌种；将复苏的纳豆芽孢杆菌接种在含有葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨15g/L，NaCl 5g/L的培养基中进行培养；
培养基中的营养物质耗尽后，将培养液置于离心管中，4℃低温离心，3000rpm，离心5分钟，弃去上清液；将获得的沉渣用无菌去离子水重悬，加入少量的溶菌酶，置于无菌通风厨内常温下反应20-30分钟；通过1000W 30％功率的超声设备对菌悬液进行超声处理，先发射5秒超声，再停顿10秒间隔；如此重复处理大于100分钟，获得菌体的裂解液；将获得的细菌裂解液冻干，获得的粉末为纳豆芽孢杆菌后生元。
8.如权利要求1所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，其特征在于，所述步骤三中，制备包裹后生元成分的脂质体具体过程为：
取所获得的表皮葡萄球菌后生元300-400mg，取所获得的乳酸菌后生元100-200mg，取所获得的双歧杆菌后生元100-200mg，加入所获得的纳豆芽孢杆菌后生元100-200mg，加入到100mL PH＝5的PBS溶液中搅拌均匀，得到混合溶液A；取800mg大豆磷脂，200mg胆固醇，通过水浴滴加的方式溶解到300mL乙醚溶液中，水浴温度控制在10℃以下；将上述制备的混合溶液A和混合溶液B混合在一起搅拌成乳浊液；将超声探头插入到所获得的液体中，控制温度为25℃，调整功率为200W，超声3秒，停7秒，重复3分钟；蒸发除去溶剂乙醚，然后用PH＝5的PBS溶液水化1小时；通过400nm的滤膜滤过，再使用250nm的滤膜滤过，获得封包有后生元成分的脂质体。
9.如权利要求1所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法，其特征在于，所述步骤四中，制备皮肤软组织保护材料具体过程为：
取1L无菌去离子水；加入保湿剂：加入5-6mL甘油，加入3-4mL1，3-丁二醇，加入1-2mL1，2己二醇，加入0.5-0.8g透明质酸钠；加入螯合剂：添加0.2mgEDTA二钠盐；加入600-800mg丁香油；加入白芷粉2-5g，添加100mg维生素E；将上述混合液体在4℃，100rpm搅拌速度下充分搅拌混匀15分钟；
将在4℃冰箱内保存的脱细胞羊膜取出修剪成面膜的形状，浸泡在上述混合液体中，置于摇床上20-30分钟，之后将脱细胞羊膜捞起，通过钴60辐照灭菌，辐照剂量为20-25kGy；将所获得的封包有后生元成分的脂质体种植到脱细胞羊膜上，获得所要制备的皮肤软组织保护材料；装袋密封，置于4℃冰箱冷藏保存。
10.一种利用如权利要求1～9任意一项所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料制备方法制备的搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料，其特征在于，所述搭载多种后生元成分的皮肤软组织保护材料包括：脱细胞羊膜组织和脂质体封包的多种后生元、无菌去离子水、甘油、1，3-丁二醇、1，2己二醇、透明质酸钠、EDTA二钠盐、丁香油、白芷粉、维生素E。
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