CN106853263A - 一种人工皮肤及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工真皮及其制备方法,人工真皮包括相互粘合的上下两层膜,上层膜为表面修饰有纳米银的硅橡胶膜,下层膜为胶原复合物膜,所述胶原复合物包括胶原、粘多糖和负载VEGF的脂质体;上层膜通过等离子聚合+化学还原法在硅橡胶膜上修饰纳米银,使得上层膜具有抗菌抗感染的功能,而且纳米银颗粒不易从上层膜脱落,银直接与细胞接触具有毒性,上层膜和下层膜之间的粘合层可以作为障碍层,可防止银释放过多,还可防止银直接与细胞接触;下层膜引入了活性印子VEGF,具有促进血管生成和创面愈合的功能,制备得到的人工皮肤具有良好的生物相容性和降解性,而且兼具生物活性和抗菌性能。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械领域,具体涉及一种人工皮肤及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官,可保护身体免受外界有害物质的侵入,防止体内水分、电解质等丢失,维持人体内环境的稳定,并参与人体的免疫和代谢过程。全球每年皮肤缺损患者超过1亿人次,我国皮肤缺损患者达1500万人/年。皮肤受到损伤后,主要依靠血管内皮细胞和成纤维细胞的迁移、增殖、上皮组织和结蹄组织的形成完成自我修复。由于烧烫伤、皮肤溃疡等事故或疾病引起皮肤大面积或严重损伤时,皮肤无法自我修复,需通过皮片移植手术完成修复。治疗皮肤缺损的关键是促进创面的愈合,防止内环境的紊乱及微生物感染造成并发症的危险。
目前,国内外已经产业化的人工皮肤产品以及处于研发阶段的人工皮肤产品有很多。产品多为异体或异种天然真皮(脱细胞处理)、人工真皮或组织工程活性真皮。异体或异种天然真皮存在成本高,免疫排斥及病毒感染等问题。组织工程活性真皮存在制备成本高,周期相对较长及细胞来源等问题。而人工真皮易于保存运输,技术可靠,可成批生产,且生产、安全及质量控制趋于成熟,占据市场发展的主流。能否促进伤口快速愈合,防止创面感染,将影响人工真皮修复的成功率。但是目前现有的人工皮肤尚不能很好地防止创面感染、促进伤口愈合,所以需要提供一种新的人工皮肤。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有生物活性和抗菌功能的人工皮肤及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种人工皮肤,包括相互粘合的上下两层膜,上层膜为表面修饰有纳米银的硅橡胶膜,下层膜为胶原复合物膜,所述胶原复合物包括胶原、粘多糖和负载VEGF的脂质体。
在一些优选的实施方式中,所述上层膜和所述下层膜采用硅凝胶粘合在一起。
在一些优选的实施方式中,所述粘多糖为硫酸软骨素或透明质酸。
在一些优选的实施方式中,所述下层膜具有三维多孔结构。
在一些优选的实施方式中,所述下层膜的厚度为1-3 mm。
在一些优选的实施方式中,所述上层膜的厚度为0.2-0.3 mm。
本发明还提供了一种如上所述的人工皮肤的制备方法,包括以下步骤:
制备硅橡胶膜;
硅橡胶膜表面修饰纳米银:在所述硅橡胶膜上沉积一层聚丙烯酸薄膜,将其浸泡在硝酸银溶液中,再取出浸泡在还原剂溶液中,洗涤,得到表面修饰有纳米银的硅橡胶膜;
制备负载有VEGF的脂质体:制备脂质体膜,将其放入水溶液中,溶胀,水合,加入VEGF和冻干保护剂,搅拌,粉碎,得到负载有VEGF的脂质体;
制备胶原复合物膜:取粘多糖溶液加入胶原溶液中,搅拌,加入负载有VEGF的脂质体,搅拌,得到胶原复合液,将胶原复合液倒入模具中,预冻,冷冻干燥,得到胶原复合物膜;
采用硅凝胶将所述表面修饰有纳米银的硅橡胶膜和所述胶原复合物膜粘合,得到双层结构;
将所述双层结构进行交联反应,清洗,得到人工皮肤。
在一些优选的实施方式中,所述脂质体膜是通过下列步骤制备得到:取卵磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中,恒温水浴中蒸发去除有机溶剂,抽干,得到脂质体膜。
在一些优选的实施方式中,所述交联反应是将双层结构浸泡在戊二醇-醋酸溶液中进行交联反应。
在一些优选的实施方式中,所述硝酸银溶液的浓度为8-11 mmol/L。
在一些优选的实施方式中,所述还原剂溶液为浓度为0.8-1.1 mmol/L的NaBH4溶液。
在一些优选的实施方式中,所述VEGF的加入量为5-10 ng/mg脂质体。
在一些优选的实施方式中,所述冻干保护剂为蔗糖。所述蔗糖的加入量为3-4.5g/g脂质体。
在一些优选的实施方式中,所述预冻是在-50~-70℃下冷冻1.5~3 h。
在一些优选的实施方式中,所述戊二醇-醋酸溶液中戊二醇的质量分数为0.1-0.3%,醋酸的浓度为0.03-0.05 mol/L。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种人工真皮及其制备方法,人工真皮包括相互粘合的上下两层膜,上层膜为表面修饰有纳米银的硅橡胶膜,下层膜为胶原复合物膜,所述胶原复合物包括胶原、粘多糖和负载VEGF的脂质体;上层膜通过等离子聚合+化学还原法在硅橡胶膜上修饰纳米银,使得上层膜具有抗菌抗感染的功能,而且纳米银颗粒不易从上层膜脱落,银直接与细胞接触具有毒性,上层膜和下层膜之间的粘合层可以作为障碍层,可防止银释放过多,还可防止银直接与细胞接触;下层膜引入了活性印子VEGF,具有促进血管生成和创面愈合的功能,制备得到的人工皮肤具有良好的生物相容性和降解性,而且兼具生物活性和抗菌性能。
具体实施方式
实施例1:
制备硅橡胶膜:将硅橡胶的A、B组分按1:1的比例混合在一起,300 rpm下搅拌10 min,脱泡。倒入聚四氟乙烯模具中,流平,置于真空干燥箱中,150℃固化2 h,得到硅橡胶薄膜。
硅橡胶膜表面修饰纳米银:将所得硅橡胶膜表面采用等离子聚合技术沉积一层厚度约10 nm的聚丙烯酸薄膜。然后将其浸泡在浓度为8 mmol/L的AgNO3溶液中1h,使Ag+与聚丙烯酸分子链上的羧基结合。然后浸泡在0.8 mmol/L的NaBH4溶液中1 h,不断搅拌,使Ag+还原成纳米Ag粒子。再用纯化水清洗6次,得到表面修饰纳米银的硅橡胶膜。
负载VEGF的脂质体制备:称取0.2 g卵磷脂、0.1 g胆固醇溶于12 mL氯仿中,转移至茄形瓶中,30℃水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂,并抽干。加入10 mL磷酸盐缓冲液,使瓶内壁的脂质体膜转移入水相,放置2 h,使其充分溶胀、水合,在超声波清洗机中超声3min后,按5 ng/mg脂质体的投加量加入浓度为5 ng/mL的VEGF溶液,及0.6 mL浓度为1.5 g/mL的蔗糖溶液,搅拌5 min。然后采用超声波细胞粉碎机超声处理,得到粒径为300-500 nm负载VEGF的脂质体。
制备胶原复合物膜:称取胶原和硫酸软骨素分别溶于0.03mol/L的醋酸溶液中。将胶原溶液、硫酸软骨素溶液及负载VEGF的脂质体混合在一起,使胶原浓度为0.4%,硫酸软骨素浓度为0.05%,脂质体浓度为0.004%,搅拌均匀,得到胶原复合液。将胶原复合液倒入聚四氟乙烯模具中,-50℃下预冻1.5 h,冷冻干燥24 h,得到胶原复合海绵支架;
上层和下层粘合:在硅橡胶膜表面涂覆一层硅凝胶,将胶原海绵复合物膜粘结在硅橡胶膜表面,得到双层结构。
交联处理:将所得双层人工皮肤浸泡在戊二醛-醋酸溶液中,进行交联反应,所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的体积分数为0.1%,醋酸的浓度为0.03 moL/L。浸泡48 h后取出,用纯化水清洗7次,再用磷酸盐缓冲液清洗2次,保存在磷酸盐缓冲液中,即得双层人工皮肤。
实施例2:
制备硅橡胶膜:将硅橡胶的A、B组分按1:1的比例混合在一起,300 rpm下搅拌10 min,脱泡。倒入聚四氟乙烯模具中,流平,置于真空干燥箱中,150℃固化2 h,得到硅橡胶薄膜。
硅橡胶膜表面修饰纳米银:将所得硅橡胶膜表面采用等离子聚合技术沉积一层厚度约10 nm的聚丙烯酸薄膜。然后将其浸泡在浓度为10 mmol/L的AgNO3溶液中1 h,使Ag+与聚丙烯酸分子链上的羧基结合。然后浸泡在1 mmol/L的NaBH4溶液中1 h,不断搅拌,使Ag+还原成纳米Ag粒子。再用纯化水清洗6次,得到表面修饰纳米银的硅橡胶膜。
负载VEGF的脂质体制备:称取0.2 g卵磷脂、0.1g胆固醇溶于12 mL氯仿中,转移至茄形瓶中,30℃水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂,并抽干。加入10 mL磷酸盐缓冲液,使瓶内壁的脂质膜转移入水相,放置2.5 h,使其充分溶胀、水合,在超声波清洗机中超声5 min后,按8 ng/mg脂质体的投加量加入浓度为5 ng/mL的VEGF溶液,及0.8 mL浓度为1.5 g/mL的蔗糖溶液,搅拌5 min。然后采用超声波细胞粉碎机超声处理,得到粒径为300-500 nm负载VEGF的脂质体。
制备胶原复合物膜:称取胶原和硫酸软骨素分别溶于0.05 moL/L的醋酸溶液中。将胶原溶液、硫酸软骨素溶液及负载VEGF的脂质体混合在一起,使胶原浓度为0.6%,硫酸软骨素浓度为0.075%,脂质体浓度为0.006%,搅拌均匀,得到胶原复合液。将胶原复合液倒入聚四氟乙烯模具中,-60℃下预冻2 h,冷冻干燥24 h,得到胶原复合海绵支架;
上层和下层粘合:在硅橡胶膜表面涂覆一层硅凝胶,将胶原海绵复合物膜粘结在硅橡胶膜表面,得到双层结构。
交联处理:将所得双层人工皮肤浸泡在戊二醛-醋酸溶液中,进行交联反应,所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的体积分数为0.25%,醋酸的浓度为0.03 moL/L。浸泡48 h后取出,用纯化水清洗7次,再用磷酸盐缓冲液清洗2次,保存在磷酸盐缓冲液中,即得双层人工皮肤。实施例3:
制备硅橡胶膜:将硅橡胶的A、B组分按1:1的比例混合在一起,300 rpm下搅拌10 min,脱泡。倒入聚四氟乙烯模具中,流平,置于真空干燥箱中,150℃固化2 h,得到硅橡胶薄膜。
硅橡胶膜表面修饰纳米银:将所得硅橡胶膜表面采用等离子聚合技术沉积一层厚度约10 nm的聚丙烯酸薄膜。然后将其浸泡在浓度为11 mmol/L的AgNO3溶液中1 h,使Ag+与聚丙烯酸分子链上的羧基结合。然后浸泡在1.1 mmol/L的NaBH4溶液中1 h,不断搅拌,使Ag+还原成纳米Ag粒子。再用纯化水清洗6次,得到表面修饰纳米银的硅橡胶膜。
负载VEGF的脂质体制备:称取0.2 g卵磷脂、0.1g胆固醇溶于12 mL氯仿中,转移至茄形瓶中,30℃水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂,并抽干。加入10 mL磷酸盐缓冲液,使瓶内壁的脂质膜转移入水相,放置3 h,使其充分溶胀、水合,在超声波清洗机中超声5 min后,按10 ng/mg脂质体的投加量加入浓度为5 ng/mL的VEGF溶液,及0.9 mL浓度为1.5 g/mL的蔗糖溶液,搅拌10 min。然后采用超声波细胞粉碎机超声处理,得到粒径为300-500 nm负载VEGF的脂质体。
制备胶原复合物膜:称取胶原和透明质酸分别溶于0.05 mol/L的醋酸溶液中。将胶原溶液、硫酸软骨素溶液及负载VEGF的脂质体混合在一起,使胶原浓度为1%,硫酸软骨素浓度为0.15%,脂质体浓度为0.01%,搅拌均匀,得到胶原复合液。将胶原复合液倒入聚四氟乙烯模具中,-60℃下预冻3 h,冷冻干燥24 h,得到胶原复合海绵支架;
上层和下层粘合:在硅橡胶膜表面涂覆一层硅凝胶,将胶原海绵复合物膜粘结在硅橡胶膜表面,得到双层结构。
交联处理:将所得双层人工皮肤浸泡在戊二醛-醋酸溶液中,进行交联反应,所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的体积分数为0.3%,醋酸的浓度为0.05 moL/L。浸泡48 h后取出,用纯化水清洗7次,再用磷酸盐缓冲液清洗2次,保存在磷酸盐缓冲液中,即得双层人工皮肤。
Claims (10)
1.一种人工皮肤,包括相互粘合的上下两层膜,其特征在于,上层膜为表面修饰有纳米银的硅橡胶膜,下层膜为胶原复合物膜,所述胶原复合物包括胶原、粘多糖和负载VEGF的脂质体。
2.根据权利要求1所述的人工皮肤,其特征在于,所述上层膜和所述下层膜采用硅凝胶粘合在一起。
3.根据权利要求1所述的人工皮肤,其特征在于,所述粘多糖为硫酸软骨素或透明质酸。
4.根据权利要求1-3任一项所述的人工皮肤,其特征在于,所述下层膜具有三维多孔结构。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
制备硅橡胶膜;
硅橡胶膜表面修饰纳米银:在所述硅橡胶膜上沉积一层聚丙烯酸薄膜,将其浸泡在硝酸银溶液中,再取出浸泡在还原剂溶液中,洗涤,得到表面修饰有纳米银的硅橡胶膜;
制备负载有VEGF的脂质体:制备脂质体膜,将其放入水溶液中,溶胀,水合,加入VEGF和冻干保护剂,搅拌,粉碎,得到负载有VEGF的脂质体;
制备胶原复合物膜:取粘多糖溶液加入胶原溶液中,搅拌,加入负载有VEGF的脂质体,搅拌,得到胶原复合液,将胶原复合液倒入模具中,预冻,冷冻干燥,得到胶原复合物膜;
采用硅凝胶将所述表面修饰有纳米银的硅橡胶膜和所述胶原复合物膜粘合,得到双层结构;
将所述双层结构进行交联反应,清洗,得到人工皮肤。
6.根据权利要求5所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,所述脂质体膜是通过下列步骤制备得到:取卵磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中,恒温水浴中蒸发去除有机溶剂,抽干,得到脂质体膜。
7.根据权利要求5所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,所述交联反应是将双层结构浸泡在戊二醇-醋酸溶液中进行交联反应。
8.根据权利要求5-7任一项所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,所述硝酸银溶液的浓度为8-11 mmol/L。
9.根据权利要求5-7任一项所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,所述还原剂溶液为浓度为0.8-1.1 mmol/L的NaBH4溶液。
10.根据权利要求5-7任一项所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,所述VEGF的加入量为5-10 ng/mg脂质体。
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