CN105079886B - 一种氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,属于生物医用复合材料技术领域。所述方法步骤如下:一、胶原蛋白海绵的制备;二、纳米纤维素的制备;三、氧化纳米纤维素的制备;四、氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备。本发明利用纤维素与胶原蛋白之间的氢键作用使纤维素在胶原溶液中较好的相容,最终使得胶原蛋白的物理机械性能提高,解决了胶原蛋白在单独使用过程中力学性能差、降解速度过快的问题。本发明制备的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵吸水率下降50~60%,溶失率下降了30~40%,最大承受力增加了2~3倍。
Description
技术领域
本发明属于生物医用复合材料技术领域,涉及一种胶原蛋白复合海绵的制备方法,用于组织工程支架材料。
背景技术
胶原蛋白(也称胶原)是动物结缔组织(骨、皮肤、腱、韧带等)的重要组分,也是哺乳动物体内分布最广、含量最丰富的一种大分子蛋白质,约占动物体内蛋白质总量的25~30%,起保护基体、支撑器官的作用。胶原蛋白的种类很多,目前已发现有26种,按不同类型可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型等,其中Ⅰ型胶原蛋白广泛存在于皮肤和跟腱中,相对较易被提取,因此得到更多的应用。而其他类型的胶原蛋白由于价格昂贵,目前仅处于实验室研究阶段,不适宜大规模工业化应用。胶原的提取过程较为繁琐,目前有以下几种方法:①传统提取法,也是目前最主要的提取方式,该法利用酸、碱水解或酶解的方法从动物结缔组织(猪皮、牛腱等)提取;②化学合成法,即利用化学方法直接合成胶原蛋白,但该法得到的胶原不具有生物活性,且技术复杂成本高;③基因工程法,即选用适当的宿主细胞生产重组人胶原细胞,该法是近几年的研究热点。
胶原蛋白在食品领域和化妆品领域的应用已得到了国内外的一致认可。而胶原蛋白在医用生物材料方面的研究和应用也已有相关报道,美国在上世纪90年代就批准将Apligraf用于静脉溃疡的治疗,国内对于胶原蛋白用作止血材料的研究也取得了一定的进展。由于胶原蛋白本质上就是一种天然组织支架材料,因此胶原蛋白成为构建组织工程支架的理想材料,如皮肤、骨组织、血管等器官的支架,之后体内组织细胞爬入支架内与其生长融合,引导组织再生。纯胶原蛋白组织工程支架具有良好的生物相容性、可塑性、易加工并能有效促进细胞粘附和增殖等优点。但是,胶原蛋白作为纯天然高分子,最大的缺点就是力学强度差,降解速度过快,在体内使用时难以有足够的强度来支撑组织重建,使其不能达到作为细胞支架的要求,大大限制了胶原在医用领域的应用。因此近年来,胶原蛋白在生物医用领域方面的应用以及对其改性以提高其支架性能成为研究的热点。
由于具有资源丰富、可再生、原料易得、生物降解、生物相容、价格低廉、较高机械性能等优异性能,纤维素在医用材料领域得到了广泛的应用,其中最有应用前景的材料就是纳米微晶纤维素(Nanocrystal cellulose,NCC),纳米微晶纤维素可通过天然纤维素或微晶纤维素经强酸降解制得。纤维素大分子中的β-(1, 4)糖苷键是一种缩醛键,对酸特别敏感,在适当的氢离子浓度、反应温度和时间的作用下,糖苷键断裂,聚合度下降,形成结晶度很高的纳米微晶纤维素。它不仅具有纤维素的基本结构与性能,如特殊的粘性、成胶性、悬浮性、稳定性和光学特性等,还具有纳米颗粒的特性,如巨大的比表面积、超强的吸附能力、高的反应活性、杨氏模量和抗张强度有指数级的增长,且能够长期稳定的分散在体系中,被广泛用于复合材料的增强剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,通过氧化纳米纤维素增强胶原蛋白,使得胶原蛋白的物理机械性能提高,同时不会在体系中引入其他有毒的物质,使其不具备细胞毒性,更好的应用于组织工程支架材料,解决胶原蛋白在单独使用过程中力学性能差、降解速度过快的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,按照以下步骤进行:
一、胶原蛋白海绵的制备:
取低温(0~4℃))冷冻纯净的牛跟腱,剪碎,放入Na2CO3溶液(1wt%)中浸泡6~24h,取出晾干后低温冷冻(0~4℃)保存。
将5~15g牛跟腱碎末放入含3~5g胃蛋白酶的醋酸溶液(3wt%)中,置于0~5℃恒温水浴池中缓慢搅拌48~72h,至反应液粘度不再变化,高速冷冻离心机离心15~45min,取上层透明粘性清液,即得到粗提取的胶原蛋白原液;
在胶原蛋白液中快速加入1~5g氯化钠粉末且不断用玻璃棒搅拌,在3~5℃条件下盐析,有白色块状沉淀析出,持续搅拌至析出完全,低温(0~4℃)静置6~24h,滤出白色沉淀,放入Tris-HCl缓冲液(pH=7)中溶胀6~24h;
将溶胀后的胶原溶液放入透析袋中,在0.1~0.5mol/L的乙酸溶液中分别透析12~48h,再用蒸馏水透析至透析袋中胶原溶液透明,得到纯净的胶原溶液;
取胶原溶液置于模具中,在-10~-20℃预冻20~40h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下处理20~40h,得到胶原蛋白海绵;
二、纳米纤维素的制备:
将1.0~5.0g微晶纤维素放于适量50~70 wt%硫酸溶液中且磁力搅拌,控制微晶纤维素与硫酸二者之间的质量比为1:15~45,在30~50℃温度的水浴条件下反应1~3h;
将反应液倾入400~500ml的去离子水中结束反应,静置,去除上清液;对悬浮液去离子水离心洗涤4~6次,测得pH值5~7;超声处理15~30min后将溶胶放入透析袋(截留分子量3000)中进行纯化处理4~6天,去除剩余的SO4 2-;
将纯化后的纳米晶纤维素在-10~-20℃预冻20~40h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下处理20~40h,得到白色的纳米纤维素粉末。
三、氧化纳米纤维素的制备:
①将0.1~1.0g步骤二中制备的纳米纤维素溶于装有50~200mL去离子水,超声处理30~45min;
②用NaOH标准液调节pH至10~11,加入一定量TEMPO和NaBr混合均匀,控制纳米纤维素、TEMPO和NaBr质量比为5~15:1:10,取NaClO调节pH在10~11.8;
③反应结束倒入过量的乙醇终止反应,离心处理,去除上层液体,使用无水乙醇离心洗涤4~6次;
④用HCl溶液进行酸化处理 3~4h,用乙醇进行离心洗涤4~6次,溶于去离子水中,在-10~-20℃预冻20~40h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下处理20~40h,得到白色带有羧基基团的氧化纳米纤维素。
四、氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备:
取纯胶原0.1~0.5g,剪碎后放入培养皿中,加入10~50ml醋酸溶液,且磁力搅拌至胶原完全溶解得到较为粘稠的胶原溶液,将氧化纳米纤维素加入胶原溶液中,搅拌均匀,得到氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合溶液,控制氧化纳米纤维素与纯胶原的质量比为1~10:100;
将氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合溶液在-10~-20℃预冻20~40h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下处理20~40h,得到氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明利用纤维素与胶原蛋白之间的氢键作用使纤维素在胶原溶液中较好的相容,最终使得胶原蛋白的物理机械性能提高,解决了胶原蛋白在单独使用过程中力学性能差、降解速度过快的问题。
2、本发明不会在体系中引入其他有毒的物质,使其不具备细胞毒性,更好的应用于组织工程支架材料。
3、本发明的制备过程无需特殊设备、反应条件温和,可实现氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵工厂化生产。
4、本发明制备过程中所用的原料为可再生资源且成本低,可实现氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的低成本化。
5、本发明制备的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵吸水率下降50~60%,溶失率下降了30~40%,最大承受力增加了2~3倍。
附图说明
图1为氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的产品图;
图2为氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一:本实施方式提供了一种胶原蛋白海绵的制备方法,具体按照以下步骤进行:
取低温冷冻纯净的牛跟腱,剪碎,放入Na2CO3溶液中浸泡6h、12h、24h,取出晾干后低温冷冻保存。
将5g牛跟腱碎末放入含4g胃蛋白酶的醋酸溶液中。将烧瓶置于4℃恒温水浴池中缓慢搅拌72h,至反应液粘度不再变化,高速冷冻离心机离心30min,取上层透明粘性清液,即得到粗提取的胶原蛋白原液。
在胶原蛋白液中快速加入氯化钠粉末且不断用玻璃棒搅拌,在4℃条件下盐析,有白色块状沉淀析出,持续搅拌至析出完全,低温静置12h,滤出白色沉淀,放入适当Tris-HCl缓冲液中溶胀12h。
将溶胀后的胶原溶液放入透析袋中,在0.1、0.3、0.5mol/L的乙酸溶液中分别透析24h,再用蒸馏水透析至透析袋中胶原溶液透明,得到纯净的胶原溶液。
取胶原溶液置于模具中,在-10~-20℃预冻24h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下,处理24h,得到胶原蛋白海绵。
具体实施方式二:本实施方式提供了一种纳米纤维素的的制备方法,具体按照以下步骤进行:
将2.0g微晶纤维素分别放于45ml 的50 wt%、60 wt%、64 wt%、70 wt%硫酸溶液中,且磁力搅拌,在30℃、40℃、50℃温度的水浴条件下反应1h、2h、3h;
将反应液倾入450ml的去离子水中结束反应,静置,去除上清液;对悬浮液去离子水离心洗涤5次左右,测得pH≈7;超声处理30min后将溶胶放入透析袋(截留分子量3000)中进行纯化处理5天左右,去除剩余的SO4 2-;
将纯化后的纳米晶纤维素在-10~-20℃预冻24h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下,处理24h,得到白色的纳米纤维素粉末。
具体实施方式三:本实施方式提供了一种氧化纳米纤维素的制备方法,具体按照以下步骤进行:
①将0.1g、0.5g、1.0g的具体实施方式二中制备的纳米纤维素溶50mL去离子水,超声处理30min;
②用NaOH标准液调节pH至10.8,加入一定量TEMPO和NaBr混合均匀,控制纳米纤维素、TEMPO和NaBr质量比为10:1:10,取NaClO调节pH在10~11.8;
③反应结束倒入过量的乙醇终止反应,离心处理,去除上层液体,使用无水乙醇离心洗涤5次;
④用HCl溶液进行酸化处理 3h,用乙醇进行离心洗涤5次,溶于去离子水中,在-10~-20℃预冻24h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下,处理24h,得到白色带有羧基基团的氧化纳米纤维素。
具体实施方式四:本实施方式提供了一种氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,具体按照以下步骤进行:
取纯胶原0.2g,剪碎后放入培养皿中,加入20ml醋酸溶液,且磁力搅拌至胶原完全溶解得到较为粘稠的胶原溶液,将质量分数1%、5%、10%氧化纳米纤维素加入胶原溶液中,搅拌均匀。
在-10~-20℃预冻24h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下,处理24h,得到氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵,其产品图如图1所示,产品扫面电镜图如图2所示,产品最大承受拉力如表1所示,表明氧化纳米纤维素对胶原的连续部分进行增强。
表1为氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的最大承受拉伸力
Claims (7)
1.一种氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,其特征在于所述方法按照以下步骤进行:
一、胶原蛋白海绵的制备:
取低温冷冻纯净的牛跟腱,剪碎,放入Na2CO3溶液中浸泡6~24h,取出晾干后低温冷冻保存;
将5~15g牛跟腱碎末放入含3~5g胃蛋白酶的醋酸溶液中,置于0~5℃恒温水浴池中缓慢搅拌48~72h,至反应液粘度不再变化,高速冷冻离心机离心15~45min,取上层透明粘性清液,即得到粗提取的胶原蛋白原液;
在胶原蛋白液中快速加入1~5g氯化钠粉末且不断用玻璃棒搅拌,在3~5℃条件下盐析,有白色块状沉淀析出,持续搅拌至析出完全,低温静置6~24h,滤出白色沉淀,放入Tris-HCl缓冲液中溶胀6~24h;
将溶胀后的胶原溶液放入透析袋中,在0.1~0.5mol/L的乙酸溶液中透析12~48h,再用蒸馏水透析至透析袋中胶原溶液透明,得到纯净的胶原溶液;
取胶原溶液置于模具中,在-10~-20℃预冻20~40h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下处理20~40h,得到胶原蛋白海绵;
二、纳米纤维素的制备:
将1.0~5.0g微晶纤维素放于硫酸溶液中磁力搅拌,在30~50℃温度的水浴条件下反应1~3h;
将反应液倾入400~500mL的去离子水中结束反应,静置,去除上清液;对悬浮液去离子水离心洗涤4~6次,测得pH值5~7;超声处理15~30min后将溶胶放入透析袋中进行纯化处理4~6天,去除剩余的;
将纯化后的纳米晶纤维素在-10~-20℃预冻20~40h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下处理20~40h,得到白色的纳米纤维素粉末;
三、氧化纳米纤维素的制备:
①将0.1~1.0g步骤二中制备的纳米纤维素溶于50~200mL去离子水,超声处理30~45min;
②用NaOH标准液调节pH至10~11,加入一定量TEMPO和NaBr混合均匀,控制纳米纤维素、TEMPO和NaBr质量比为5~15:1:10,取NaClO调节pH在10~11.8;
③反应结束倒入过量的乙醇终止反应,离心处理,去除上层液体,使用无水乙醇离心洗涤4~6次;
④用HCl溶液进行酸化处理3~4h,用乙醇进行离心洗涤4~6次,溶于去离子水中,在-10~-20℃预冻20~40h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下处理20~40h,得到白色带有羧基基团的氧化纳米纤维素;
四、氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备:
取纯胶原0.1~0.5g,剪碎后放入培养皿中,加入10~50mL醋酸溶液,且磁力搅拌至胶原完全溶解得到较为粘稠的胶原溶液,将氧化纳米纤维素加入胶原溶液中,搅拌均匀,得到氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合溶液,控制氧化纳米纤维素与纯胶原的质量比为1~10:100;
将氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合溶液在-10~-20℃预冻20~40h,预冻后放入冷冻干燥机中,在温度-56~-20℃、真空度10~40Pa的条件下处理20~40h,得到氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵。
2.根据权利要求1所述的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,其特征在于所述Na2CO3溶液的浓度为1wt%。
3.根据权利要求1所述的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,其特征在于步骤一和步骤四中,所述醋酸溶液的浓度为3wt%。
4.根据权利要求1所述的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,其特征在于所述Tris-HCl缓冲液的pH=7。
5.根据权利要求1所述的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,其特征在于步骤一和步骤二中,所述透析袋的截留分子量为3000。
6.根据权利要求1所述的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,其特征在于所述硫酸溶液的浓度为50~70wt%。
7.根据权利要求1或6所述的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵的制备方法,其特征在于所述微晶纤维素与硫酸二者之间的质量比为1:15~45。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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