CN104013995B - 氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜及其制备方法，其特点是应用静电纺丝技术，以可溯源纯化猪真皮为原料，六氟异丙醇为溶剂，在4-10℃下搅拌至透明，配制成浓度为0.5%～10%的静电纺丝母液，直接纺制得到猪真皮胶原微纳纤维膜。然后采用氧化壳聚糖对猪真皮胶原微纳纤维膜进行了接枝改性，最终得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜。该膜材料既具有良好的生物相容性、可生物降解性、力学性能，又具有壳聚糖的抗氧化作用、抗菌活性、抗炎/促进伤口愈合作用、抗癌/抗肿瘤作用以及抗病毒作用，明显优于以胶原为原料制备的胶原基复合膜材料，可广泛应用于止血材料、组织工程支架材料、生物敷料等生物医学材料的制备。
Description
技术领域
本发明涉及了氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜及其制备方法，属于生物医用材料制备领域。
背景技术
近年来，静电纺丝技术常被用于制备纳米级的连续超细纤维,因其结构能够最大限度地仿生细胞外基质（李欢.明胶与胶原的静电纺丝研究进展[J].明胶科学与技术,2007，27(1)：1-9），因此这类支架被大量用于制备组织工程支架材料、生物敷料等。但通常六氟异丙醇或三氟乙酸被用来作为胶原静电纺丝的溶剂，电纺得到的纤维膜力学性能差，在水中易被分散，同时大量文献（DimitriosI.Z.,ShihT.K.,ElijahS.Y.Y.,AndrewK.E.,YenW.T.,LinY.L.Y.,etal.Electro-spinningofpurecollagennano-fibreseJustanexpensivewaytomakegelatin[J].Biomaterials,2008,29(15):2293-2305）证实了六氟异丙醇或三氟乙酸的强极性会破坏胶原分子内的疏水作用，削弱胶原分子间或分子内的氢键作用，甚至导致胶原被降解为明胶，影响胶原本身的生物相容性和生物降解性，限制了其的应用。
纯化猪真皮是由动物或人类的皮肤，通过物理、化学、生物学等方法，除去了皮肤的全层表皮及真皮层中的全部细胞成分，保留了真皮的胶原（纤维）成分和组织基本结构的材料。人体真皮组织的主要成分包括成纤维细胞、血管内皮细胞等细胞成分和细胞外基质蛋白、胶原等非细胞成分等。纯化猪真皮的细胞成分及Ⅰ、Ⅱ型细胞相容性抗原已经被完全清除掉，因而免疫活性很低,故而它不会诱发针对异体组织移植所产生的特异性细胞免疫反应，也不会诱发非特异性异物反应（WainwrightD.J.,MaddenM.,LutermanA.,etal.Clinicalevaluationofanacellulaallograftdermalmatrixinfull-thicknessburn[J].JournalofBurnCare&Rehabilitation,1996,17(2):124-136）。目前，因其独特的组织三维结构和低免疫原性，已被广泛应用于组织工程支架。纯化猪真皮的主体成分为胶原纤维，它是胶原的聚集体结构，与胶原相比，其同样具有良好的生物相容性和生物降解性，又能激活细胞的特性基团表达，维持细胞正常的特性表达，有利于细胞的黏附、生长，因而可作为医用材料，但其结构的稳定性决定了它的生物降解性、可纺性、机械强度、耐水、耐酶、耐化学品等性能都要优于胶原，因此六氟异丙醇更加难以破坏其聚集体结构，而且胶原纤维的基本结构为胶原，仍具有良好的生物活性，在我们的研究中也得到了证实。
为了改善体内环境下胶原基材料的力学性能不足，降解速率过快，稳定性不足等问题，需要采用一定的交联剂，目前普遍使用的是戊二醛蒸汽交联方式、碳化二亚胺交联、京尼平交联、环氧化合物等，尽管经各交联剂改性之后耐酶解性能有很大提高，但是这些交联剂或多或少存在如具有潜在的生物毒性，力学性能及耐酶解性能方面的控制均表现出一定的局限性，而且有些交联剂价格昂贵，不便于大规模推广使用(HuY.,LiuL.,GuZ.,DanW.,DanN.,&YuX.Modificationofcollagenwithanaturalderivedcross-linker,alginatedialdehyde[J].CarbohydratePolymers,2014,102(15):324–332)。壳聚糖是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖，具有优异的抗氧化作用、抗菌活性、抗炎/促进伤口愈合作用、抗癌/抗肿瘤作用、抗病毒作用等。氧化壳聚糖仍部分保留了壳聚糖的基本结构单元，因此也继承了壳聚糖的上述生物活性，因而在氧化壳聚糖接枝改性胶原后，根据协同理论，改性后胶原也会具有壳聚糖的上述优良性能，同时氧化壳聚糖又能与胶原发生席夫碱反应，形成有效交联，增强胶原的结构稳定性（有利于胶原在电纺过程中胶原三股螺旋的保持），热稳定性、力学性能等。
综上所述，本发明为了解决已有的医用复合膜材料生物相容性差、孔结构不合理、成型性差、力学性能差以及降解稳定性差等问题，直接以纯化猪真皮纤维为静电纺丝的原料，采用氧化壳聚糖对其进行接枝改性，制备得到了氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜，该膜材料具有良好的生物相容性、亲水性、可生物降解性等优良性能，完整地保持了胶原本身的三股螺旋结构，生物活性好，是制备生物医用材料的理想原料。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜。该膜材料既具有较好的亲水性、良好的生物降解性能和生物相容性等优良性能，又能够快速有效止血、抗氧化性、抗菌、消炎镇痛、促进创面愈合和修复，是生物医用材料的理想原料。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
（1）静电纺丝原液制备：取1重量份的纯化猪真皮，在碎皮机上将其粉碎成1.0～5.0mm×1.0～5.0mm的小块，接着将其直接浸渍于10～200体积份的六氟异丙醇中，4～10℃下搅拌10～24h至溶液澄清，配制成0.5%～10%的溶液，即得到静电纺丝原液；
（2）氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的制备：将静电纺丝母液注入静电纺丝装置中，直接进行静电纺丝制备得到猪真皮胶原微纳纤维膜；将0.005～0.2重量份的氧化壳聚糖溶解于pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，制备得到氧化壳聚糖溶液；将制备得到的胶原微纳纤维膜浸渍于上述氧化壳聚糖溶液中，4-10℃下搅拌反应12-36h，冷冻干燥得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品；
（3）将上述氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品先后浸渍在生理盐水、PBS缓冲液和去离子水中，以除去残留在猪真皮胶原微纳纤维膜中的六氟异丙醇溶剂和无机盐，经冷冻干燥、剂量为6～30KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的最终成品。
在上述的制备方法中，步骤（1）中的猪皮为生态猪皮，可溯源；步骤（2）中壳聚糖为市售，壳聚糖的脱乙酰度为75%～95%；步骤（2）中的猪真皮胶原微纳纤维膜的孔径大小可以通过调节静电纺丝过程中的纺丝参数（静电场电压、喷丝孔直径、滚筒的转速、纺丝距离等）来有效控制，孔径分布范围为90nm～30μm，纤维直径在10～1000nm之间。
氧化接枝壳聚糖改性猪真皮胶原微纳纤维膜的关键性能应符合以下要求：
外观：白色或微黄色膜状或片状物，表面光滑，无肉眼可见之杂质；
水分含量：≤10%（wt）；
重金属含量：≤10μg/g(m/m)；
羟脯氨酸含量：不小于总蛋白含量的6%（m∕m）；
细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级；
胶原纤维膜层孔径范围：90nm～30μm；
胶原纤维膜层纤维直径范围：10nm～1000nm；
无菌试验：无菌；
致敏试验：无迟发性超敏反应；
皮内反应试验：原发性刺激指数PII<0.4。
本技术与现有技术相比，具有如下优点：
（1）与已有报道的静电纺丝胶原微纳纤维膜不同，本发明以纯化猪真皮纤维为静电纺丝原料，经静电纺丝制得的猪真皮胶原微纳纤维膜能够最大程度地维持胶原的三股螺旋结构，保持胶原原有的生物活性；
（2）与以胶原为原料制备得到的胶原微纳纤维膜相比，本发明所得猪真皮胶原微纳纤维膜力学性能较好，在水中结构保持稳定，生物降解性明显提高；
（3）氧化壳聚糖具有很高的化学反应活性、可控的分子链长和分子量、水溶性好、良好的可吸收性等特点，而且氧化壳聚糖生产成本低，便于大规模推广使用，为优良的生物交联剂；
（4）本发明为首次使用氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原，氧化壳聚糖继承了壳聚糖的抗氧化作用、抗菌活性、抗炎/促进伤口愈合作用、抗癌/抗肿瘤作用、抗病毒作用等性能，根据协同理论，改性后的胶原也应具有上述氧化壳聚糖的特点，同时经氧化壳聚糖改性后，胶原的力学性能、生物降解性、稳定性都得到了不同程度的提高，因此本发明所得的氧化壳聚糖改性猪真皮胶原微纳纤维膜综合性能优良，功能多样，易于形成规模化产业链，取得规模化效益的良好前景。
附图说明
图1为氧化壳聚糖接枝改性的猪真皮胶原微纳纤维膜的扫描电镜（SEM）图
图2为本发明猪真皮胶原微纳纤维膜的超灵敏差示扫描量热仪（VP-DSC）检测图
图3为本发明猪真皮胶原微纳纤维膜的圆二色谱（CD）检测图。
具体实施方式
下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出非本质的改进和调整。
实施例1
（1）纯化猪真皮的制备：将新鲜生态猪皮在去肉机上除去皮下组织层，将猪皮投入转鼓中，在25℃下采用10%平平加反复脱脂3次，再反复冻融3次，使用5mM三羟甲基氨基甲烷、5mMEDTA和0.1M氯化钠进行除杂蛋白与脱细胞处理，使用活力单位为1：10的胰酶进行再次脱细胞处理，用去离子水反复清洗，最终经冷冻干燥机干燥，获得纯化猪真皮；
（2）生物交联剂—氧化壳聚糖的制备：将1000体积份的pH为3.0的醋酸-醋酸钠缓冲液缓冲液倾入反应釜中，另取10重量份的脱乙酰度为75%壳聚糖也加入到反应釜中，室温下搅拌至澄清，接着缓慢加入1重量份的高碘酸钠，4℃下搅拌反应24h，加入20体积份聚乙二醇终止反应，接着加入20重量份的氯化钠和2000体积份的无水乙醇，静置使沉淀析出，除去上清液，将底部的反应液在15000rpm离心30min，再次除去上清液，将其溶解在去离子水中，使用3000Da的透析袋在去离子水中透析5天，最终冷冻干燥制备得到氧化壳聚糖；
（3）静电纺丝原液制备：取1重量份的纯化猪真皮，在碎皮机上将其粉碎成1.0mm×1.0mm的小块，接着将其直接浸渍在10体积份的六氟异丙醇中，4℃下搅拌24h至溶液澄清，配制成10%的溶液，即得到静电纺丝原液；
（4）氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的制备：将静电纺丝母液注入静电纺丝装置中，按照正电压15kv、负电压-0.1kv，溶液流量为0.1mm/min、接收距离为10cm的纺丝参数进行静电纺丝，制备得到猪真皮胶原微纳纤维膜；接着将0.05重量份的氧化壳聚糖溶解于10体积份的pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，制备得到氧化壳聚糖溶液；将制备得到的猪真皮胶原微纳纤维膜浸渍于上述氧化壳聚糖溶液中，4℃下搅拌反应12h，冷冻干燥得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品；
（5）将上述氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品先后浸渍在生理盐水、PBS缓冲液和去离子水中，以除去残留在猪真皮胶原微纳纤维膜中的六氟异丙醇溶剂和无机盐，经冷冻干燥、剂量为6KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的最终产品。
实施例2
（1）纯化猪真皮的制备：将新鲜生态猪皮在去肉机上除去皮下组织层，将猪皮投入转鼓中，在35℃下采用12%平平加反复脱脂3次，再反复冻融3次，使用20mM三羟甲基氨基甲烷、10mMEDTA和0.5M氯化钠进行除杂蛋白与脱细胞处理，使用活力单位为1：20的胰酶进行再次脱细胞处理，用去离子水反复清洗，最终经冷冻干燥机干燥，获得纯化猪真皮；
（2）生物交联剂—氧化壳聚糖的制备：将1500体积份的pH为3.0的醋酸-醋酸钠缓冲液缓冲液倾入反应釜中，另取10重量份的脱乙酰度为85%壳聚糖也加入到反应釜中，室温下搅拌至澄清，接着缓慢加入10重量份的高碘酸钠，6℃下搅拌反应48h，加入50体积份聚乙二醇终止反应，接着加入50重量份的氯化钠和5000体积份的无水乙醇，静置使沉淀析出，除去上清液，将底部的反应液在18000rpm离心25min，再次除去上清液，将其溶解在去离子水中，使用5000Da的透析袋在去离子水中透析5天，最终冷冻干燥制备得到氧化壳聚糖；
（3）静电纺丝原液制备：取1重量份的纯化猪真皮，在碎皮机上将其粉碎成3.0mm×3.0mm的小块，接着将其直接浸渍在50体积份的六氟异丙醇中，4℃下搅拌20h至溶液澄清，配制成2%的溶液，即得到静电纺丝原液；
（4）氧化壳聚糖改性的猪真皮胶原微纳纤维膜的制备：将静电纺丝母液注入静电纺丝装置中，按照正电压16kv、负电压-0.15kv，溶液流量为0.3mm/min、接收距离为15cm的纺丝参数进行静电纺丝，制备得到猪真皮胶原微纳纤维膜；接着将1重量份的氧化壳聚糖溶解于10体积份的pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，制备得到氧化壳聚糖溶液；将制备得到的猪真皮胶原微纳纤维膜浸渍于上述氧化壳聚糖溶液中，5℃下搅拌反应12h，冷冻干燥得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品；
（5）将上述氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品先后浸渍在生理盐水、PBS缓冲液和去离子水中，以除去残留在猪真皮胶原微纳纤维膜中的六氟异丙醇溶剂和无机盐，经冷冻干燥、剂量为20KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的最终产品。
实施例3
（1）纯化猪真皮的制备：将新鲜生态猪皮在去肉机上去除皮下组织层，将猪皮投入转鼓中，在35℃下采用15%平平加反复脱脂3次，再反复冻融3次，使用40mM三羟甲基氨基甲烷、15mMEDTA和1.0M氯化钠进行除杂蛋白与脱细胞处理，使用活力单位为1：25的胰酶进行再次脱细胞处理，用去离子水反复清洗，最终经冷冻干燥机干燥，获得纯化猪真皮；
（2）生物交联剂—氧化壳聚糖的制备：将2000体积份的pH为3.0的醋酸-醋酸钠缓冲液缓冲液倾入反应釜中，另取10重量份的脱乙酰度为95%壳聚糖也加入到反应釜中，室温下搅拌至澄清，接着缓慢加入25重量份的高碘酸钠，6℃下搅拌反应60h，加入50体积份聚乙二醇终止反应，接着加入100重量份的氯化钠和10000体积份的无水乙醇，静置使沉淀析出，除去上清液，将底部的反应液在20000rpm离心20min，再次除去上清液，将其溶解在去离子水中，使用8000Da的透析袋在去离子水中透析5天，最终冷冻干燥制备得到氧化壳聚糖；
（3）静电纺丝原液制备：取1重量份的纯化猪真皮，在碎皮机上将其粉碎成5.0mm×5.0mm的小块，接着将其直接浸渍在200体积份的六氟异丙醇中，4℃下搅拌20h至溶液澄清，配制成0.5%的溶液，即得到静电纺丝原液；
（4）氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的制备：将静电纺丝母液注入静电纺丝装置中，按照正电压20kv、负电压-0.2kv，溶液流量为0.5mm/min、接收距离为20cm的纺丝参数进行静电纺丝，制备得到猪真皮胶原微纳纤维膜；接着将2重量份的氧化壳聚糖溶解于10体积份的pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，制备得到氧化壳聚糖溶液；将制备得到的猪真皮胶原微纳纤维膜浸渍于上述氧化壳聚糖溶液中，10℃下搅拌反应24h，冷冻干燥得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品；
（5）将上述氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品先后浸渍在生理盐水、PBS缓冲液和去离子水中，以除去残留在猪真皮胶原微纳纤维膜中的六氟异丙醇溶剂和无机盐，经冷冻干燥、剂量为30KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的最终产品。
Claims (6)
1.氧化壳聚糖接枝改性的猪真皮胶原微纳纤维膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)静电纺丝原液制备：取1重量份的纯化猪真皮，在碎皮机上将其粉碎成1.0～5.0mm×1.0～5.0mm的小块，接着将其直接浸渍于10～200体积份的六氟异丙醇中，4～10℃下搅拌10～24h至溶液澄清，配制成0.5％～10％的溶液，即得到静电纺丝原液；
(2)氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的制备：将静电纺丝原液注入静电纺丝装置中，直接进行静电纺丝制备得到猪真皮胶原微纳纤维膜；将0.005～0.2重量份的氧化壳聚糖溶解于pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，制备得到氧化壳聚糖溶液；将制备得到的胶原微纳纤维膜浸渍于上述氧化壳聚糖溶液中，4-10℃下搅拌反应12-36h，冷冻干燥得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品；
(3)将上述氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜中间产品先后浸渍在生理盐水、PBS缓冲液和去离子水中，以除去残留在猪真皮胶原微纳纤维膜中的六氟异丙醇溶剂和无机盐，经冷冻干燥、剂量为6～30KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的最终成品；所制得的猪真皮胶原微纳纤维膜主要含有猪皮胶原纤维和氧化壳聚糖，其关键性能指标如下：
外观：白色或微黄色膜状或片状物，表面光滑，无肉眼可见之杂质；
水分含量：≤10％(wt)；
重金属含量：≤10μg/g(m/m)；
羟脯氨酸含量：不小于总蛋白含量的6％(m/m)；
细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级；
胶原纤维膜层孔径范围：90nm～30μm；
胶原纤维膜层纤维直径范围：10nm～1000nm；
无菌试验：无菌；
致敏试验：无迟发性超敏反应；
皮内反应试验：原发性刺激指数PII<0.4。
2.如权利要求1所述的氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的制备方法，其特征在于所述的纯化猪真皮是采用如下方法获得的：将新鲜生态猪皮在去肉机上除去皮下组织层，将猪皮投入转鼓中，在25～35℃下采用10～15％平平加反复脱脂3次，再反复冻融3次，使用5～40mM三羟甲基氨基甲烷、5～15mMEDTA和0.1～1M氯化钠进行除杂蛋白与脱细胞处理，使用活力单位为1：10～25的胰酶进行再次脱细胞处理，用去离子水反复清洗，最终冷冻干燥，获得纯化猪真皮。
3.如权利要求1所述的氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的制备方法，其特征在于所述的氧化壳聚糖是采用如下方法获得的：将1000～2000体积份的pH为3.0的醋酸-醋酸钠缓冲液倾入反应釜中，另取10重量份的壳聚糖也加入到反应釜中，室温下搅拌至澄清，接着缓慢加入1～25重量份的高碘酸钠，4～10℃下搅拌反应24-60h，加入20～100体积份聚乙二醇终止反应，接着加入20～100重量份的氯化钠和2000～10000体积份的无水乙醇，静置使沉淀析出，除去上清液，将底部的反应液在15000～20000rpm离心20～30min，再次除去上清液，将其溶解在去离子水中，使用3000～8000Da的透析袋在去离子水中透析5天，最终冷冻干燥制备得到氧化壳聚糖。
4.如权利要求1所述的氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的制备方法，其特征在于所述的静电纺丝条件为：正电压15～20kV、负电压-0.1～-2.0kV，溶液流量为0.1～0.5mm/min、接收距离为10～20cm；静电纺丝原液的表观粘度为50～150mPa·s，检测温度为常温，转速为10～30r/min。
5.如权利要求1所述的氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的制备方法，其特征在于所述的氧化壳聚糖的氧化度为25％～48％，粘均分子量为12.7～26.1万。
6.如权利要求1所述的氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜的制备方法，所述的制备过程的特征还在于：
(1)转鼓为不锈钢转鼓；
(2)反应釜为搪玻璃反应釜，内层为搪玻璃层，厚度1.2～1.6mm；
(3)静电纺丝采用静电纺丝机进行。
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