CN105254905B - 一种氧化寡糖交联胶原的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氧化寡糖交联胶原的方法，其方法是以含有一定量醛基的氧化寡糖为交联剂，在一定温度下与胶原分子或其聚集体进行交联反应，再经过清洗或透析处理，最后采用冷冻干燥机冻干，得到含有寡糖结构的交联胶原分子或其聚集体。通过该方法得到的交联胶原既保留了胶原的原有性能，同时引入了含有活性的寡糖结构，形成的交联结构能够耐受一定生物酶的降解作用，各项基本性能优良、生物相容性良好、兼具一定的功能性。该方法可用于生物材料与皮革工业中。

Description

一种氧化寡糖交联胶原的方法

技术领域

本发明涉及一种氧化寡糖交联胶原的方法，可应用于生物医用材料及皮革行业。

背景技术

胶原是细胞外基质的主要组成部分，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，富含于动物的皮、骨骼、肌腱、内脏细胞间质、韧带、血管、巩膜等部位之中。胶原具有低的免疫原性、低刺激性、低细胞毒性、良好的生物相容性、良好的促进细胞生长的性能以及生物可降解性等诸多优点，在生物医学领域的应用日益广泛（但卫华，王坤余，曾睿，等.胶原的医学应用及其发展前景[J].生物医学工程与临床，2004，8（1）：45-52.）。不同用途的胶原医用生物材料，对物理机械性能、降解率等有着不同的要求，往往需要通过交联改性来改善胶原的物理机械性能、稳定性，降低抗原性，调节适宜的降解性（但年华，但卫华，曾睿，等.环氧化合物及其在胶原改性中的应用[J].材料导报. 2006，20（6）：119-122.）。经典的戊二醛交联由于细胞毒性大、易钙化等副作用已经趋于淘汰；碳化二亚胺曾被认为是理想的“零长度”交联剂，但交联程度较低，且存在副作用（但年华, 但卫华, 关林波，等.环氧化合物和碳化二亚胺交联pADM的性能比较[J]. 功能材料, 2009，8（40）：1352-1354.）；环氧化合物交联程度高，结构可设计和控制，但水溶解性差，应用受到限制（但年华,但卫华,丁洁，等.丙三醇缩水甘油醚交联脱细胞猪真皮基质的亲水性研究[J].功能材料, 2011，42（5）：803-806）；京尼平是目前认为比较好的交联剂，交联程度高，细胞毒性小，但交联颜色偏深，价格昂贵，且不能赋予胶原特殊功能性，仍算不上理想的交联剂（Sung HW.,Liang IL.,ChenCN.Stability of a biological tissue fixed with a naturally occurringcrosslinking agent (genipin) [J]. JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH,2001,55(4):538-546.）。从交联剂发展的趋势来看，交联剂从人工合成的有机化合物，转向自然界的天然提取物；从一般的追求耐降解性，转向注重生物相容性和功能性。目前交联胶原的方法尚未达到这种要求，因此，胶原类材料亟需一种生物相容性好、交联程度高、并具有一定生物功能的新型交联方法。

糖最初仅被认为是一种结构或能量物质，现在则被证明是除核酸和蛋白质之外另一类重要的生命物质，参与了生命，特别是多细胞生命的受精、着床、分化、发育、免疫、衰老等全部时间和空间过程。天然糖类广泛存在与自然界中，具有安全无毒、能够在体内降解代谢、具有较高的生物活性等特性（屠鹏飞.天然糖化学[M].北京：化学工业出版社，2013）。对这些具有良好生化性能的物质，将其与胶原复合可得到良好的效果，但单纯复合可能导致它从胶原中脱离，影响使用。为了使这种混合物之间形成更强的化学结合，有人以碳化二亚胺为媒介，活化糖羧基使之间形成共价键。但由于糖类分子较大，位阻影响大，且该化学反应活性基团有限，与胶原中能够相互反应的基团难以有效接触，导致糖类与胶原作用/交联程度低不能满足需要。

氧化寡糖是指含有2~9个糖单元，且分子中含有一定量醛基的寡糖（低聚糖），它是由寡糖经氧化（如高碘酸钠）、分离而得到的产物。包括氧化壳寡糖、氧化低聚异麦芽糖、氧化低聚麦芽糖、氧化海藻寡糖、氧化硫酸软骨素寡糖、氧化肝素寡糖、氧化葡甘寡糖、氧化大豆低聚糖、氧化低聚果糖、氧化低聚木糖。由于氧化寡糖中所含的醛基具有较高的反应活性，胶原中具有许多可与其反应产生交联的活性基团，如氨基、羧基、巯基等，使得氧化寡糖具有交联胶原的能力（Le‐Tien C, Millette M, Lacroix M, et al. Modified alginatematrices for the immobilization of bioactive agents[J]. Biotechnology &Applied Biochemistry, 2004, 39(2):189–198.）。由于氧化寡糖是由寡糖制备而得的，基本保留了原寡糖的生物化学性质，在交联胶原后，不仅能提高胶原的力学强度、降解性等物理化学性质，还能将寡糖分子引入到胶原中，从而将寡糖的功能性赋予交联胶原，故氧化寡糖作为交联剂，它兼顾了化学活性、生物相容性和功能性，实现了三者的有机统一，是新一代医用交联剂。目前氧化多糖，如氧化海藻酸钠已应用于胶原类材料的交联改性，效果良好且生物相容性俱佳（Yang H, Lan L, Gu Z, et al. Modification of collagen with anatural derived cross-linker, alginate dialdehyde.[J]. Carbohydrate Polymers,2014, 102(3):324–332.）。但氧化多糖分子量大，反应位阻大，水溶性差（如氧化壳聚糖、氧化纤维素），渗透性差，对表面致密的材料难以渗透，容易产生表面交联，交联效率低。与氧化多糖相比，氧化寡糖的分子量更小，水溶性好，并且空间位阻小，渗透性良好，反应活性高，因而氧化寡糖在交联效率上更胜多糖一筹。

可见，采用兼具反应活性和天然生物活性的氧化寡糖来交联胶原是新一代胶原基生物医用材料的交联方法。

发明内容

1. 一种氧化寡糖交联胶原的方法，包括以下步骤：

（1）预处理：称取100重量份的胶原（以干重计）；对于胶原纤维及其聚集体，将其浸泡于100～10000重量份的pH4.0至pH12.0的缓冲溶液中，充分湿润；对于提取得到的胶原分子，加入8000～100000重量份的pH3.0～6.5的醋酸溶液，振摇或搅拌使其完全溶解；

（2）氧化寡糖溶液的制备：称取1～20重量份的氧化寡糖，溶于20～1000重量份的pH3.0～12.0的缓冲溶液中，搅拌或振摇至其完全溶解；

（3）交联反应：将预处理后的胶原和氧化寡糖溶液加入反应容器中，并置于可控温的环境中，调整反应温度为0℃～45℃，保持振摇或搅拌，反应4～48小时；

（4）后期处理：对于胶原纤维及其聚集体，用酸或硫酸铵、氯化铵将浴液pH调至中性，弃去浴液，加入100～10000重量份蒸馏水振摇或搅拌清洗0.5～2小时，弃去清洗液，继续清洗2～5次，取出清洗后的交联胶原，用冷冻干燥机冻干；对于提取得到的胶原分子，交联反应后，在0~4℃的环境中进行后续操作，首先用氢氧化钠溶液调节pH值为弱碱性（pH值约7.50），缓慢加入固体硫酸铵使其浓度约为1.5 mol/L，连续搅拌至硫酸铵完全溶解，然后静置过夜（10～12h）；次日用高速低温离心机离心分离（8000~12000 r/min，15 min），弃上清液，向沉淀中加入800-10000重量份的0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌30 min；将其注入透析袋（截留分子量为3500～14000Da）中，在0.04mol/L的磷酸氢二钠溶液或磷酸二氢钠溶液中透析1～2天，再置于0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液或磷酸二氢钠溶液中透析1～2天，最后置于双蒸水或注射水中透析2天。

2.根据权利要求1所述的一种氧化寡糖交联胶原的方法，其中所述的氧化寡糖是指氧化壳寡糖、 氧化低聚异麦芽糖、氧化低聚麦芽糖、氧化海藻寡糖、氧化硫酸软骨素寡糖、氧化肝素寡糖、氧化葡甘寡糖、氧化大豆低聚糖、氧化低聚果糖、氧化低聚木糖。

3.根据权利要求1所述化寡糖交联胶原的方法，其中所述的缓冲液是指硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、氢氧化钠-碳酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸盐缓冲液。

4. 根据权利要求1所述化寡糖交联胶原的方法，其特征在于该交联方法可用于皮革行业中猪、牛、羊动物皮的加工或胶原类生物医学材料的制备中。

本发明具有以下优点：

（1）与胶原形成牢固的共价键交联

氧化寡糖含有多个化学活泼的醛基，能够与胶原中的氨基等活性基团发生迅速而牢固的共价交联，形成多点交联结构；

（2）交联程度可控

可以通过采用不同氧化度、不同用量的氧化寡糖及控制交联反应条件，来调控交联程度，从而控制其交联性能；

（3）交联效率高

氧化寡糖分子量较氧化多糖小，空间位阻小，可与胶原中的活性基团较好接触，交联效率高，特别是对于结构较致密的胶原，有优良的交联作用；

（4）交联条件低

氧化寡糖分子量较小，亲水性好，具有良好的水溶性，反应可在水中进行，克服了部分多糖与胶原共容困难的缺点；氧化寡糖化学性质活泼，在弱酸及碱性条件下均能与胶原发生交联，对交联条件的要求不苛刻，本方法的交联条件易于实施；

（5）赋予交联胶原优良性能

采用氧化寡糖交联胶原可改善胶原类材料的力学性能、亲水性能、耐湿热稳定性、降解性等性能，保证交联材料的使用性能；

（6）保证交联胶原的生物相容性

氧化寡糖保留了原寡糖生物学性能，生物相容性好，克服了合成交联剂本身生物毒性大，且可能导致试剂残留的缺陷，不会对胶原类材料的生物学性能造成不良影响；

（7）赋予交联胶原功能性

通过交联，将这些功能性寡糖引入到胶原分子中，这些结构单元保留了功能性寡糖的优良性能，从而赋予胶原类材料以相应的功能（如壳寡糖具有抗菌性、海藻寡糖具有保湿性、肝素寡糖抗凝血性、葡甘寡糖具有凝胶性等），在交联的同时实现了胶原的功能化。

综上所述，采用氧化寡糖交联胶原，相较于传统化学或物理改性方法具有诸多不可比拟的优点，本方法交联胶原兼顾了交联性、使用性、功能性及生物相容性，是新一代交联胶原类材料的方法，具有明显的创新性与实用性。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

（1）称取脱细胞猪真皮基质5克（干重）于锥形瓶中，加入80ml pH9.4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液；

（2）称取氧化度为45%的氧化海藻寡糖1克，加入上述锥形瓶中，摇匀，封闭瓶口；

（3）将上述锥形瓶置于可控温摇架的水浴中，调节反应温度为37℃，调节转速为150r/min；

（4）反应24小时，取出锥形瓶，弃去反应液，加入50ml 0.1mol/L的氯化铵溶液振摇0.5h后，再弃去溶液，加入100ml注射水清洗0.5小时，弃去清洗液，反复清洗三次；

（5）取出交联脱细胞猪真皮基质，置于冷冻干燥机中冻干。

实施例2

（1）称取胶原膜3克；

（2）称取氧化度为100%的氧化低聚异麦芽糖0.5克，置于盛有50ml pH7.4的磷酸盐缓冲溶液的烧杯中，振摇使其完全溶解；

（3）将胶原膜放入上述烧杯内，封闭杯口；

（3）向上述烧杯内放入磁力搅拌子，并将烧杯置于磁力搅拌器上，调节反应温度为25℃，搅拌速度为1000r/min；

（4）40小时后，弃去反应液，加入50ml蒸馏水清洗0.5小时，重复清洗三次；

（5）取出交联胶原膜，在超净工作台上风干。

实施例3

（1）称取胶原海绵100克，置于30升的反应釜中，加入19升 0.5mol/L醋酸溶液，在4℃下充分搅拌，至胶原海绵完全溶解；

（2）称取氧化度为10%的氧化壳寡糖10克，在4℃下，溶解于1升 0.5mol/L温度为4℃的醋酸溶液中；

（3）将氧化壳寡糖溶液缓慢加入到胶原溶液中，在4℃条件下持续搅拌，进行交联反应；

（4）反应16h后，用氢氧化钠溶液调节pH值为弱碱性（pH值约7.50）；缓慢加入固体硫酸铵使其浓度约为1.5 mol/L，连续搅拌至完全溶解，然后静置过夜（10～12h）；次日离心分离（8000 r/min，15 min），弃上清液，向沉淀中加入2升0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌30min，本步骤均在4℃条件下进行；

（5）在4℃条件下，将交联后的胶原溶液注入透析袋中（截留分子量为8000Da），在0.04mol/L的磷酸氢二钠缓冲液中透析1d，再在0.02mol/L的磷酸氢二钠缓冲液中透析1d，最后在双蒸水中透析2d；

（6）将透析后的胶原溶液取出置于容器中，采用冷冻干燥机，将其冷冻干燥。

Claims (4)

1.一种氧化寡糖交联胶原的方法，包括以下步骤：

(1)预处理：以干重计，称取100重量份的胶原；对于胶原纤维及其聚集体，将其浸泡于100～10000重量份的pH4.0至pH12.0的缓冲溶液中，充分湿润；对于提取得到的胶原分子，加入8000～100000重量份的pH3.0～6.5的醋酸溶液，振摇或搅拌使其完全溶解；

(2)氧化寡糖溶液的制备：称取1～20重量份的氧化寡糖，溶于20～1000重量份的pH3.0～12.0的缓冲溶液中，搅拌或振摇至其完全溶解；

(3)交联反应：将预处理后的胶原和氧化寡糖溶液加入反应容器中，并置于可控温的环境中，调整反应温度为0℃～45℃，保持振摇或搅拌，反应4～48小时；

(4)后期处理：对于胶原纤维及其聚集体，用酸或硫酸铵、氯化铵将浴液pH调至中性，弃去浴液，加入100～10000重量份蒸馏水振摇或搅拌清洗0.5～2小时，弃去清洗液，继续清洗2～5次，取出清洗后的交联胶原，用冷冻干燥机冻干；对于提取得到的胶原分子，交联反应后，在0～4℃的环境中进行后续操作，首先用氢氧化钠溶液调节pH值为弱碱性，缓慢加入固体硫酸铵使其浓度为1.5mol/L，连续搅拌至硫酸铵完全溶解，然后静置过夜；次日用高速低温离心机离心分离，弃上清液，向沉淀中加入800-10000重量份的0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌30min；将其注入透析袋中，在0.04mol/L的磷酸氢二钠溶液或磷酸二氢钠溶液中透析1～2天，再置于0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液或磷酸二氢钠溶液中透析1～2天，最后置于双蒸水或注射水中透析2天。

2.根据权利要求1所述的一种氧化寡糖交联胶原的方法，其中所述的氧化寡糖是指氧化壳寡糖、氧化低聚异麦芽糖、氧化低聚麦芽糖、氧化海藻寡糖、氧化硫酸软骨素寡糖、氧化肝素寡糖、氧化葡甘寡糖、氧化大豆低聚糖、氧化低聚果糖、氧化低聚木糖。

3.根据权利要求1所述化寡糖交联胶原的方法，其中所述的缓冲液是指硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、氢氧化钠-碳酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述化寡糖交联胶原的方法，其特征在于该交联方法可用于皮革行业中猪、牛、羊动物皮的加工或胶原类生物医学材料的制备中。