CN114533934A - 新型促愈合胶原基生物医用创面敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型促愈合胶原基生物医用创面敷料的制备方法，包括以下步骤：采用高碘酸钠对低分子肝素中的邻二羟基进行选择性氧化，制得氧化低分子肝素，再将其与胶原基材料交联，制得氧化低分子肝素交联改性胶原基材料。本发明制得的改性胶原基材料中胶原的生物相容性、促愈合性能与低分子肝素的促生长因子表达、促细胞黏附增殖产生协同作用，可以有效改善创面局部组织的细胞外基质微环境、促进创面的再上皮化和组织修复，将其用作创面敷料时不仅具有优异的湿热稳定性、机械性能、亲水性和细胞相容性，而且兼具显著的促愈合性能和抑制瘢痕增生，是一种新型促愈合胶原基生物医用创面敷料，可广泛用于皮肤创伤修复等生物医用材料领域。
Description
技术领域
本发明涉及新型促愈合胶原基生物医用创面敷料的制备方法，还涉及按照此方法制得的促愈合胶原基生物医用创面敷料的应用，属于生物医学材料领域。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，可以保护人体免受外界侵害、维持体内的新陈代谢，外界环境的各种物理、化学以及生物因素刺激会导致人体皮肤受到不同程度的损伤。损伤创面的愈合是一个动态的、复杂的过程，创面类型、病理学条件和敷料类型等因素均会影响创面的愈合速度和愈合质量（孟昭刚, 张子璇. 医用功能性敷料的研究进展[J]. 解放军预防医学杂志, 2020, 38(03): 88-89 + 93）。作为暂时性皮肤替代物，理想的创面敷料应具有保护新生组织、加速创面愈合、控制和吸收创面渗液、防止细菌侵入以及良好的吸湿保湿性、透水汽性、生物相容性和机械力学性能等。根据材料类型可将创面敷料分为传统敷料、天然生物敷料、人工合成敷料等，纱布、棉垫、绷带等传统敷料的成本低廉、制作工艺简单，但在临床应用中存在易感染、愈合慢、痛感强、无法保持创面湿润以及肉芽组织易长入纱布的网眼等弊端。
近年来，随着对创面愈合的深入研究，创面敷料的促愈合功能引起越来越多的重视，胶原敷料已经成为最具代表性的促愈合天然生物敷料，该类材料通常以动物Ⅰ型胶原或Ⅲ型胶原制备而成，其免疫原性较低，作为暂时性创面覆盖物应用于皮肤损伤创面后发生排斥反应的可能性较小，可以预防感染，减少渗出，重建创面愈合过程中细胞外基质的微环境，为表皮生长创造良好的营养场所，刺激创面中肉芽组织的生长，诱导细胞增殖和血管再生，具有加速愈合、控制并发症、减轻炎症反应等优点，同时还能减轻深度损伤创面在愈合过程中因缺少真皮组织而导致的瘢痕增生等问题（林桂清, 刘平洪, 黄锦刚, 等. 异种脱细胞真皮基质敷料对深度烧伤患者创面愈合及瘢痕增生的影响[J]. 中外医学研究,2021, 19(20): 146-148）。目前胶原基生物敷料多为膜型、海绵型和脱细胞真皮基质型，各类型胶原基敷料均在创面修复和整形美容等临床应用中取得了良好的治疗效果，是目前创面修复领域的研究热点。
但纯胶原敷料的力学性能较差，吸收渗液能力不强，降解速率较快且不可调控。因此需要通过化学交联改性来改善纯胶原材料的理化性能，以满足不同创面修复类型所需的敷料要求，目前临床上通常采用戊二醛进行交联改性，但戊二醛的引入会导致材料的生物相容性变差，组织易硬化、易钙化（陈一宁, 但卫华, 但年华. 脱细胞真皮基质的改性及应用概述[J]. 材料导报, 2018, 32(13): 2311-2319）。因此开发新型交联剂及交联技术，在兼顾材料生物相容性的同时，更有效地促进创面组织内细胞的生长、血管化修复以及附属器再生是目前胶原基材料用于创面修复的研究重点。
低分子肝素（low molecular weight heparin, LMWH）是从动物肝脏、肺和肠粘膜等组织中提取出的天然多糖，将其用于创面组织修复可以降低血液黏稠度，预防血栓形成，改善局部缺血，降低全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征的发病率（魏晓蕾, 王俊红. 低分子肝素对脓毒症患者炎症介质及凝血功能的影响[J]. 实用中西医结合临床,2020, 20(04): 76-77）。伤口愈合过程是多种细胞、蛋白质以及生长因子等形成网络式相互作用的综合结果，机体组织在应对炎症和自身免疫反应时可能会释放裂解酶，降解细胞外基质中的糖胺聚糖以及蛋白质，从而导致细胞外基质微环境的紊乱。低分子肝素可保护这些蛋白免受降解，且其抗凝效果优异，可以促进Ⅱa、IXa和Xa等因子与抗凝血酶Ⅲ形成复合物。已有报道证明（范宝玉, 王娟, 赵海磊. 皮下注射低分子肝素钙对烧伤植皮后深静脉血栓形成、创面愈合及感染率的影响[J]. 感染、炎症、修复, 2017, 18(03): 141-144），将低分子肝素类药物用于皮肤损伤创面时，低分子肝素可以与bFGF氨基酸序列的特定位点结合，增强FGF、EGF和TGF-β等生长因子的生物活性，使其免于蛋白酶、热和酸的破坏；能增强bFGF与靶细胞受体的亲和力，刺激细胞增殖分化，进而加强bFGF的促分裂作用和促愈合作用；能与胶原酶形成复合物，消减组织水肿，减少创面渗液，调控再生胶原的重新排列，促进损伤创面组织的再上皮化，加快烧伤创面的愈合速率。此外，低分子肝素还具有促进血管新生、中和多种炎症因子、缓解疼痛、降低内皮细胞的通透性、抑制瘢痕增生、防止创面加深，促进创面愈合等多重作用，近十几年来已被广泛应用于创面修复（王基建. 负压封闭引流联合低分子肝素对深度烧伤患者高凝状态、创面疼痛及愈合的影响[J]. 交通医学,2020, 34(05): 504-506）。
采用低分子肝素对胶原基材料进行化学修饰可以对其进行功能赋予，使其同时具有缓解疼痛、改善微循环、减轻水肿、促进血管新生、抑制瘢痕增生、抑制炎症反应、调节细胞增殖、增强免疫、促进创面愈合等多重作用。但低分子肝素与胶原基材料的结合方式为物理吸附，仅有少量的肝素分子能够发生电离作用与胶原分子进行络合，由此所得的改性材料表面接枝肝素多糖分子的密度较低。因此，如何在保证低分子肝素抗炎症、促愈合等功能的前提下，赋予肝素以化学反应活性，促进其与胶原分子间的产生强烈的相互化学作用，是解决问题的突破口。
为了有效解决该问题，我们采用高碘酸钠将低分子肝素分子中的部分羟基氧化为醛基制得氧化低分子肝素，在保留低分子肝素的生物相容性大分子结构的基础上引入具有化学交联活性的醛基。将其与胶原分子共同作用时，氧化低分子肝素中的醛基会与胶原中的氨基发生共价交联作用将肝素分子牢固地锁定在材料表面。当材料与皮肤创面组织接触时，锚定在胶原表面的肝素分子能改善局部缺血，预防血栓形成，同时中和多种炎症因子，防止创面加深，促进创面愈合，抑制瘢痕增生，有望显著改善并长期维持胶原基生物敷料对创面局部组织微循环的调控作用，进而实现其抗炎症、促愈合效果和其它理化性能。
综上所述，本发明公开了一种新型促愈合胶原基生物医用创面敷料的制备方法，该材料具有显著的促愈合性能，有效改善了创面局部组织的细胞外基质微环境，促进创面的再上皮化和组织修复，有望应用于大面积创伤修复的救治和皮肤整形美容等临床应用领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型促愈合胶原基生物医用创面敷料的制备方法、其制备的产品和应用，本发明的方法不但能够保证低分子肝素糖环的完整性而且能够使其仍然具有优异的反应性，进一步地，本发明方法获得的产品具有优良的湿热稳定性、机械力学性能、生物相容性以及促进伤口无瘢痕愈合等相关性能。
本发明一方面提供：
新型促愈合胶原基生物医用创面敷料的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备氧化低分子肝素：将低分子肝素溶解于溶剂中，加入高碘酸钠进行选择性氧化反应；再加入乙二醇终止反应；随后进行纯化和干燥，制得氧化低分子肝素；
（2）交联改性：将步骤（1）制得的氧化低分子肝素溶解于缓冲溶液中，搅拌均匀后加入胶原基材料进行化学交联，制得氧化低分子肝素改性胶原基材料；
（3）胶原基生物医用创面敷料的后处理：将步骤（2）制得的氧化低分子肝素改性胶原基材料浸泡在溶剂中进行漂洗，随后进行干燥和辐照灭菌，制得胶原基生物医用创面敷料。
在本发明的一些实施方案中，步骤（1）中，所述的低分子肝素包括依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙中的一种或几种，更优选地为依诺肝素钠。
在本发明的一些实施方案中，步骤（1）中，所述的溶剂为超纯水或注射水中的一种。
在本发明的一些实施方案中，步骤（1）中，所述的氧化反应的温度为0～10℃，更优选地为4℃；所述氧化反应的时间为24～72小时，更优选地为48小时。
在本发明的一些实施方案中，步骤（1）中，以低分子肝素的重量为100重量份计，所述溶剂的加入量为1000～3000重量份，所述高碘酸钠的加入量为100～400重量份，所述乙二醇的加入量为100～300重量份。
在本发明的一些实施方案中，步骤（1）中，所述的纯化包括以下步骤：将产物装入截留分子量为500～2000 Da的透析袋中，将其置于0~4℃的注射用水中透析60～120分钟，弃去注射用水；然后加入注射用水透析240～360分钟，弃去注射用水；再在注射用水中透析72小时，其间每隔24小时换一次注射用水。
在本发明的一些实施方案中，步骤（1）中，所述的干燥采用冷冻干燥法或真空干燥法，更优选地为冷冻干燥法。
在本发明的一些实施方案中，步骤（2）中，所述的缓冲液的pH范围为 8.0~10.4，包括磷酸盐缓冲液、硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的一种或几种。
在本发明的一些实施方案中，步骤（2）中，所述的胶原基材料包括猪皮胶原、胎牛皮胶原、牛跟腱胶原、羊皮胶原、鱼皮胶原中的一种或几种。
在本发明的一些实施方案中，步骤（2）中，所述的交联改性包括以下步骤：称取 6～30 重量份的步骤（1）中制得的氧化低分子肝素溶于 300~1500 重量份的pH 8.0~10.4缓冲液中，搅拌均匀后加入150 重量份的胶原基材料（以绝干重计），在18~37℃条件下搅拌反应24～72 h，加入200～1000重量份20~40℃的注射水，清洗60～120 min；弃去废液，加入200～1000重量份20～40℃的注射水，清洗60～120 min；得到氧化低分子肝素改性胶原基材料。
在本发明的一些实施方案中，步骤（3）中，后处理包括以下步骤：将步骤（2）制得的氧化低分子肝素改性胶原基材料浸泡在 200～1000重量份的注射用水中，清洗60～120min；弃去废液，加入200～1000重量份20～40℃的注射水，清洗60～120 min；加入200～1000重量份20～40℃的注射水，清洗60～120 min；将材料进行冷冻干燥、剂量为6~30 KGy/h的60Co-γ射线辐照灭菌，成型包装，制得胶原基生物医用创面敷料。
在本发明的一些实施方案中，所述的胶原基生物医用创面敷料的类型包括胶原聚集体型创面敷料、胶原海绵型创面敷料、胶原膜型创面敷料、脱细胞真皮基质型创面敷料中的一种或几种。
本发明另一方面提供本发明制备方法制备得到的新型胶原基生物医用创面敷料。
在本发明的一些实施方案中，所述的新型促愈合胶原基生物医用创面敷料，其特征在于所述胶原基生物医用创面敷料的关键性能指标如下：
（1）交联程度评价：经皮革热收缩温度仪检测，湿热收缩温度为77.6±1.2 ℃，经游离氨基含量检测，改性指数为48.3±2.4 %；
（2）亲水性评价：经亲水性检测，水接触角为17.6±0.8°，吸湿率为163.4±2.6％；
（3）细胞相容性评价：第7天的细胞相对增殖率为126±16 ％，细胞毒性反应 0级，符合创面敷料的使用要求；
（4）抗炎症动物实验评价：经SD大鼠背部全层皮肤损伤模型检测，材料植入后无红肿、粘连、积液、溃疡和脓肿等炎症并发症，术后第7天、第14天和第21天的创面组织学切片HE染色可见创面组织处无明显的炎症细胞浸润，且炎症细胞的数量逐渐减少，直至完全消失；
（5）生长因子表达水平动物实验评价：经SD大鼠背部全层皮肤损伤模型检测，对创面组织学切片进行免疫组织学染色，术后第14天的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的阳性表达水平为57.3 %，血管内皮生长因子（VEGF）的阳性表达水平为64.1 %，血小板衍生生长因子（PDGF）的阳性表达水平为48.9 %；
（6）促愈合动物实验评价：经SD大鼠背部全层皮肤损伤模型检测，术后第7天的创面愈合率为74.58 %，术后第14天的创面愈合率为87.73 %，术后第21天的创面愈合率为100%，新生皮肤光滑细腻、无瘢痕；创面组织学切片HE染色可见实验组更多胶原纤维横向有序排列，编织更为紧密，交织成网，皮肤附属器组织明显。
本发明另一方面提供按照本发明所述方法制得的新型促愈合胶原基生物医用创面敷料的用途。
本发明再一方面提供本发明制备方法步骤（1）中制备得到的氧化低分子肝素。
本发明具有以下优点
（1）化学交联活性高：本发明方法在低分子肝素的分子链基础上引入了醛基，制备出了具有高度交联活性的胶原交联剂——氧化低分子肝素（OLMWH），既保留了低分子肝素的生物相容性大分子结构，又赋予其优异的化学交联活性；可以根据产品的实际要求，通过选择低分子肝素的分子量、控制反应条件（如物料比、温度、时间等），制备出具有不同氧化度的氧化低分子肝素；
（2）促愈合性能强：胶原是细胞外基质的主要构成蛋白质，将其应用于创面可以促进创面组织释放出多种活性生长因子，诱发成纤维细胞的活性，促进体内胶原的再生、排列，增强渗出物的吸收及氧交换，诱导成纤维母细胞及异胶原纤维的产生及排列，促进肉芽组织的产生以及血管和新生瘢痕组织的形成，实现创面修复愈合；低分子肝素是直链氨基聚糖中最为硫酸化的氨基聚糖，采用氧化低分子肝素对胶原基材料进行交联改性可以发挥两者之间的协同促愈合作用；本发明制得的新型促愈合胶原基生物医用创面敷料不但能促进上皮细胞生长，提高创面愈合速度，而且为新生胶原蛋白的沉积提供“真皮模板”，促进新生胶原蛋白有序排列，减少瘢痕、提高创面愈合质量；
（3）抗炎性能好：低分子肝素是炎症因子如组胺、缓激肽和前列腺素E的拮抗剂，也是炎症细胞因子的主要转录诱导剂之一，可以增强网状内皮系统吞噬细胞活性，抑制补体系统及细胞活性，中和多种炎症因子，降低内皮细胞的通透性；因此，本发明制得的新型促愈合胶原基生物医用创面敷料具有优良的抗炎性能；
（4）保湿性好：经高碘酸钠氧化后的氧化低分子肝素并未破坏肝素的主体结构，并继承了低分子肝素优良的吸水性能，有利于维持创面的湿润环境，促进伤口愈合；
（5）生物相容性强：采用氧化低分子肝素作为交联剂，继承了低分子肝素中天然多糖分子链优异的生物相容，这在很大程度上弥补了醛基对细胞增殖率带来的负面影响；经检测，本发明制得的新型促愈合胶原基生物医用创面敷料的细胞毒性为 0 级，并具有诱导细胞粘附、增殖和生长的能力，符合创面敷料的使用要求，可用于生物医用领域。
附图说明
图1不同用量的氧化低分子肝素与胶原基材料交联后的傅里叶红外微观结构示意图。
图2新型胶原基生物医用创面敷料在SD大鼠背部全层皮肤损伤组织处的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）的阳性表达含量图。
具体实施方式
除非上下文中有相反说明，否则本发明中的术语具有如下含义。
术语“具有”、“包含”和“包括”应解释为开放式的，表明存在所列举的要素但不排除未列举的任何其他一个或多个要素的存在、出现或添加。
本文叙述的所有范围包括列举两个值之间的范围的那些端点，除非另有相反说明。不管是否指出，本文所列举的所有值包括用于测量该值的给定技术的预期实验误差、技术误差和仪器误差的程度。
术语“氧化低分子肝素（OLMWH）”指在低分子肝素分子链中引入醛基所形成的低分子肝素衍生物。本发明的合成方法能够在不破坏低分子肝素天然糖环结构完整性的前提下，赋予其优异的化学反应活性，同时保持优良的生物相容性等相关性能。本发明可以根据产品要求，通过选择低分子肝素的分子量、控制反应条件（如物料比、温度、时间等），制备出不同氧化度的氧化低分子肝素。
术语“新型促愈合胶原基生物医用创面敷料”指氧化低分子肝素和胶原基材料改性交联得到的产品，本发明中的胶原基材料来源可以是猪皮胶原、胎牛皮胶原、牛跟腱胶原、羊皮胶原、鱼皮胶原中的一种或几种，胶原基材料类型可以是胶原聚集体型创面敷料、胶原海绵型创面敷料、胶原膜型创面敷料、脱细胞真皮基质型创面敷料中的一种或几种，制得的促愈合胶原基生物医用创面敷料可以是诸如胎牛皮脱细胞真皮基质创面敷料、猪皮胶原聚集体创面敷料、牛跟腱胶原膜创面敷料和鱼皮胶原海绵创面敷料。
本发明的氧化低分子肝素分子链中的醛基能够与胶原分子链中的氨基等活性基团反应，形成牢固的席夫碱键，使低分子肝素分子与胶原结合更加牢固。如图1所示，本发明中不同用量的氧化低分子肝素与胶原基材料交联后仍保持着胶原的天然微观结构。作为低分子肝素的衍生物，氧化低分子肝素的主要成分仍为肝素的分子糖环单元，因而继承了其优异的亲水性和生物相容性，本发明方法制备的材料无皮肤致敏反应，无热原，其浸提液细胞毒性为0～1级。经氧化低分子肝素改性后的胶原基材料与皮肤创面组织接触时，锚定在胶原表面的肝素分子能预防创面组织处血栓形成，同时中和多种炎症因子、防止创面加深、促进创面愈合以及抑制瘢痕增生，有望显著改善并长期维持胶原基生物敷料对创面局部组织微循环的调控作用，进而实现其促愈合效果和其它理化性能。
本发明的新型促愈合胶原基生物医用创面敷料用于SD大鼠背部全层皮肤损伤模型可以促进创面组织的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）的阳性表达。如图2所示，三种生长因子的阳性表达均显著增强。氧化低分子肝素含有高度硫酸化的结构域，可以作为多种生长因子的结合位点，与创面组织中的bFGF、PDGF和VEGF等多种生长因子均具有高度亲和性，可以稳定其分子构象，维持其生物活性，保护其不被各种理化因素灭活，提高其生物利用度，进而促进血管内皮细胞增殖和毛细血管新生、加速新生组织的上皮化进程，并促进伤口收缩、抑制瘢痕形成。
本发明方法可以在氧化低分子肝素合成、交联改性条件两个方面，对制备工艺进行调控，制备出满足应用要求的材料。本发明方法也可以拓展到其它相关材料的制备上。
下面通过具体实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，本实施例只是对本发明进行进一步补充说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
实施例 1
（1）溶解低分子肝素：称取3.5 g那曲肝素钙溶于50 mL重量份的蒸馏水中，得到那曲肝素钙溶液；
（2）加入氧化剂：边搅拌边将80 mL重量份的0.25 mol/L的高碘酸钠溶液缓慢滴加入那曲肝素钙溶液中，滴加完毕后，将其置于4℃、避光条件下磁力搅拌48 h；
（3）加入乙二醇：缓慢滴加15 mL重量份的乙二醇，滴加完毕后，将其置于4℃、避光条件下磁力搅拌30 min；
（4）纯化：将产物装入截留分子量为500 Da的透析袋中，浸没于4℃的注射用水中；先透析60分钟，弃去注射用水；然后加入4℃的注射用水透析4小时，弃去注射用水；再在4℃的注射用水中透析72小时，其间每隔24小时换一次注射用水；
（5）干燥：取出透析后的产物，采用冷冻干燥法将其干燥，得到氧化那曲肝素钙；
（6）称取10 g胎牛皮胶原聚集体（以绝干重计），加入锥形瓶；
（7）加入100 mL重量份的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 9.4），磁力搅拌30 min；
（8）称取2 g氧化那曲肝素钙（以绝干重计），加入锥形瓶，将其置于37℃下磁力搅拌36 h；
（9）加入1500重量份的注射用水，清洗30 min，倒去废液；
（10）加入2500重量份的注射用水，清洗30 min，倒去废液；
（11）加入3000重量份的注射用水，清洗30 min，倒去废液；
（12）取出产物，采用冷冻干燥法将其干燥；
（13）选用剂量为6~30 KGy/h的60Co-γ射线对干燥后的产物进行辐照灭菌，成型包装；
（14）得到新型促愈合胎牛皮胶原聚集体型医用创面敷料。
实施例 2
（1）溶解低分子肝素：称取0.5 kg依诺肝素钠溶于50 mL重量份的蒸馏水中，得到依诺肝素钠溶液；
（2）加入氧化剂：边搅拌边将2.5 kg重量份的0.25 mol/L的高碘酸钠溶液缓慢滴加入依诺肝素钠溶液中，滴加完毕后，将其置于0℃、避光条件下搅拌72 h；
（3）加入乙二醇：缓慢滴加0.25 kg重量份的乙二醇，滴加完毕后，将其置于0℃、避光条件下搅拌1 h；
（4）纯化：将产物装入截留分子量为2000 Da的透析袋中，浸没于0℃的超纯水中；先透析60 min，弃去超纯水；然后加入0℃的超纯水透析4 h，弃去超纯水；再在0℃的超纯水中透析72 h，其间每隔24小时换一次超纯水；
（5）干燥：取出透析后的产物，采用冷冻干燥法将其干燥，得到氧化依诺肝素钠；
（6）称取1 kg脱细胞猪真皮基质（以绝干重计），加入转鼓；
（7）加入5 kg重量份的碳酸钠-氢氧化钠缓冲液（pH 10.4），转动30 min；
（8）称取0.12 kg氧化依诺肝素钠（以绝干重计），加入转鼓，升温至37℃，转动72h；
（9）加入2.5 kg重量份的超纯水，清洗30 min，倒去废液；
（10）加入3.5 kg重量份的超纯水，清洗30 min，倒去废液；
（11）加入4 kg 重量份的超纯水，清洗30 min，倒去废液；
（12）取出产物，采用冷冻干燥法将其干燥；
（13）选用剂量为6~30 KGy/h的60Co-γ射线对干燥后的产物进行辐照灭菌，成型包装；
（14）得到新型促愈合脱细胞猪真皮基质医用创面敷料。
实施例 3
（1）溶解低分子肝素：称取6 g达肝素钠溶于100 mL重量份的蒸馏水中，得到达肝素钠溶液；
（2）加入氧化剂：边搅拌边将200 mL重量份的0.25 mol/L的高碘酸钠溶液缓慢滴加入达肝素钠溶液中，滴加完毕后，将其置于8℃、避光条件下搅拌48 h；
（3）加入乙二醇：缓慢滴加15 g重量份的乙二醇，滴加完毕后，将其置于8℃、避光条件下搅拌1 h；
（4）纯化：将产物装入截留分子量为1000 Da的透析袋中，浸没于8℃的注射用水中；先透析60 min，弃去注射用水；然后加入8℃的注射用水透析4 h，弃去注射用水；再在8℃的注射用水中透析72 h，其间每隔24小时换一次注射用水；
（5）干燥：取出透析后的产物，采用真空干燥法将其干燥，得到氧化达肝素钠；
（6）称取25 g猪皮胶原海绵（以绝干重计），加入锥形瓶；
（7）加入150 mL重量份的磷酸盐缓冲液（pH 8.0），磁力搅拌30 min；
（8）称取3.2 g氧化达肝素钠（以绝干重计），加入锥形瓶，将其置于37℃条件下磁力搅拌72 h；
（9）加入1500 mL重量份的注射用水，清洗30 min，倒去废液；
（10）加入2500 mL重量份的注射用水，清洗30 min，倒去废液；
（11）加入3000 mL重量份的注射用水，清洗30 min，倒去废液；
（12）取出产物，采用真空干燥法将其干燥；
（13）选用剂量为6~30 KGy/h的60Co-γ射线对干燥后的产物进行辐照灭菌，成型包装；
（14）得到新型促愈合猪皮胶原海绵型医用创面敷料。
实施例4 结果与讨论
如图1所示，本发明中不同用量的氧化低分子肝素与胶原基材料交联后各组交联材料的特征吸收带和典型吸收峰均未发生较大变化，说明经过氧化低分子肝素交联后，各组交联材料仍保留着胶原的天然结构。与纯胶原相比，经过氧化低分子肝素改性的胶原材料在936cm-1以及892cm-1处出现了氧化低分子肝素的特征峰，在1080cm-1处糖苷键吸收峰的峰形有明显增强，并随氧化低分子肝素用量的增大而增强且变尖，引入氧化低分子肝素后酰胺A带的峰形变宽，并略微地向低波数移动，酰胺I带峰强稍有减弱，说明氧化低分子肝素分子链中的醛基与胶原的氨基反应形成了大量稳定的席夫碱键。因此，推断氧化低分子肝素和胶原基材料发生了化学交联，接枝到了胶原基材料表面，并且不会对胶原的天然结构产生影响。
如图2所示，本发明中新型胶原基生物医用创面敷料在SD大鼠背部全层皮肤损伤组织经组织学切片免疫组织学染色检测，术后第14天的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的阳性表达水平为57.3 %，血管内皮生长因子（VEGF）的阳性表达水平为64.1 %，血小板衍生生长因子（PDGF）的阳性表达水平为48.9 %，证明本发明中新型胶原基生物医用创面敷料可以显著促进创面组织中生长因子的阳性表达、提高细胞外基质中生长因子的生物活性和稳定性、加速创面组织毛细血管新生、改善创面细胞外基质微循环，进而促进伤口愈合、减少瘢痕增生。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本请所附权利要求书。
Claims (10)
1.一种新型促愈合胶原基生物医用创面敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备氧化低分子肝素：将低分子肝素溶解于溶剂中，加入高碘酸钠进行选择性氧化反应；再加入乙二醇终止反应；随后进行纯化和干燥，制得氧化低分子肝素；
（2）交联改性：将步骤（1）制得的氧化低分子肝素溶解于缓冲溶液中，搅拌均匀后加入胶原基材料进行化学交联，制得氧化低分子肝素改性胶原基材料；
（3）胶原基生物医用创面敷料的后处理：将步骤（2）制得的氧化低分子肝素改性胶原基材料浸泡在溶剂中进行漂洗，随后进行干燥和辐照灭菌，制得胶原基生物医用创面敷料。
2.根据权利要求 1 所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的低分子肝素包括依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙中的一种或几种；步骤（2）中所述的缓冲液的pH范围为8.0~10.4，包括磷酸盐缓冲液、硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的一种或几种；步骤（2）中所述的胶原基材料包括猪皮胶原、胎牛皮胶原、牛跟腱胶原、羊皮胶原、鱼皮胶原中的一种或几种。
3.根据权利要求 1 所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的低分子肝素包括依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙中的一种或几种；步骤（2）中所根据权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的氧化反应的温度为0～10℃，所述氧化反应的时间为24～72小时；步骤（1）中所述的溶剂为超纯水或注射用水中的一种；以低分子肝素的重量为100重量份计，步骤（1）中所述溶剂的加入量为1000～3000重量份，所述高碘酸钠的加入量为100～400重量份，所述乙二醇的加入量为100～300重量份。
4.根据权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的纯化包括以下步骤：将产物装入截留分子量为500～2000 Da的透析袋中，将其置于0~4℃的注射用水中透析60～120分钟，弃去注射用水；然后加入注射用水透析240～360分钟，弃去注射用水；再在注射用水中透析72小时，其间每隔24小时换一次注射用水；步骤（1）中所述的干燥采用冷冻干燥法或真空干燥法。
5.根据权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的交联改性包括以下步骤：称取 6～30 重量份的步骤（1）中制得的氧化低分子肝素溶于 300~1500 重量份的pH8.0~10.4 缓冲液中，搅拌均匀后加入150 重量份的胶原基材料（以绝干重计），在18~37℃条件下搅拌反应24～72 h，加入200～1000重量份20~40℃的注射水，清洗60～120 min；弃去废液，加入200～1000重量份20～40℃的注射水，清洗60～120 min；得到氧化低分子肝素改性胶原基材料。
6.根据权利要求1 所述的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的后处理包括以下步骤：将步骤（2）制得的氧化低分子肝素改性胶原基材料浸泡在 200～1000重量份的注射用水中，清洗60～120 min；弃去废液，加入200～1000重量份20～40℃的注射水，清洗60～120min；加入200～1000重量份20～40℃的注射水，清洗60～120 min；将材料进行冷冻干燥、剂量为6~30 KGy/h的60Co-γ射线辐照灭菌，成型包装，制得胶原基生物医用创面敷料。
7.根据权利要求5-6 所述的制备方法，其特征在于所述的胶原基生物医用创面敷料的类型包括胶原聚集体型创面敷料、胶原海绵型创面敷料、胶原膜型创面敷料、脱细胞真皮基质型创面敷料中的一种或几种。
8.根据权利要求5-7 所述的制备方法制备得到新型促愈合胶原基生物医用创面敷料，其特征在于所述新型促愈合胶原基生物医用创面敷料的关键性能指标如下：
（1）交联程度评价：经皮革热收缩温度仪检测，湿热收缩温度为77.6±1.2 ℃，经游离氨基含量检测，改性指数为48.3±2.4 %；
（2）亲水性评价：水接触角为17.6±0.8°，吸湿率为163.4±2.6 ％；
（3）细胞相容性评价：第7天的细胞相对增殖率为126±16 ％，细胞毒性反应 0 级，符合创面敷料的使用要求；
（4）抗炎症动物实验评价：经SD大鼠背部全层皮肤损伤模型检测，材料植入后无红肿、粘连、积液、溃疡和脓肿等炎症并发症，术后第7天、第14天和第21天的创面组织学切片HE染色可见创面组织处无明显的炎症细胞浸润，且炎症细胞的数量逐渐减少，直至完全消失；
（5）生长因子表达水平动物实验评价：经SD大鼠背部全层皮肤损伤模型检测，对创面组织学切片进行免疫组织学染色，术后第14天的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的阳性表达水平为57.3 %，血管内皮生长因子（VEGF）的阳性表达水平为64.1 %，血小板衍生生长因子（PDGF）的阳性表达水平为48.9 %；
（6）促愈合动物实验评价：经SD大鼠背部全层皮肤损伤模型检测，术后第7天的创面愈合率为74.58 %，术后第14天的创面愈合率为87.73 %，术后第21天的创面愈合率为100 %，新生皮肤光滑细腻、无瘢痕；创面组织学切片HE染色可见实验组更多胶原纤维横向有序排列，编织更为紧密，交织成网，皮肤附属器组织明显。
9.根据权利要求7-8所述的新型促愈合胶原基生物医用创面敷料在制备创面组织敷料中的用途。
10.根据权利要求5-7的所述制备方法的步骤（1）中制备得到的氧化低分子肝素。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220527 |
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