CN103554527A - 一种可水解逆转胶原蛋白的水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可水解生物逆转胶原蛋白的医用水凝胶及其制备方法。本发明的水凝胶主要由胶原蛋白和糖胺聚糖进行交联制备而成，糖胺聚糖氧化形成醛基与胶原蛋白混合，糖胺聚糖中的醛基与胶原蛋白中的氨基进行共轭的交联反应，获得胶原蛋白水凝胶。应用本发明方法制备的胶原蛋白水凝胶具有良好的亲水性和生物相容性，良好的柔韧性使其能与创面紧密贴合，促进新上皮再生，缩短伤口愈合时间并减少疤痕的生成，可调控降解速率。
Description
技术领域：
本发明涉及一种医用水凝胶，尤其涉及一种可降解的胶原蛋白水凝胶及其制备方法。
背景技术：
胶原蛋白(Collagen)是一种广泛存在于动物结缔组织的多糖蛋白，呈白色，含有少量的半乳糖和葡萄糖，是哺乳动物体内含量最多分布最广的功能性蛋白，也是细胞外基质(ECM)的主要成分。多存在于动物的结缔组织，使其作为一种可应用于医学领域的生物材料，具有低免疫原性的重要特点。
胶原蛋白是机体自然蛋白，对蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性、良好的生物相容性、可被机体生物降解和吸收。从临床应用的角度，纯胶原蛋白是一种天然的组织支架材料，具有生物相容性好、易加工、可塑性和促进细胞粘附与增殖的特点，但胶原蛋白的力学性能差，在含水时难以塑性，且在使用过程中快速被酶水解而导致变型。
目前，研究者常采用疏水性的可降解高分子材料来包埋胶原蛋白，以达到使胶原蛋白性质稳定，且在体内特定部位的修补作用。但是，在高分子材料包裹药物的过程中，难以避免的会有与有机溶剂接触、包裹温度高于人体体温、胶原蛋白在包埋过程中发生变性和分解等问题。因此，聚合物作为蛋白水凝胶的载体已经引起了研究者的注意，常规的注射水凝胶与物理交联的水凝胶虽然避免了蛋白与有机溶剂的接触，但是，此类方法仅适用于大块凝胶和非光敏性蛋白，且无法调控降解速率。
发明内容：
本发明提出了将胶原蛋白与糖胺聚糖高分子材料交联以制备出胶原蛋白水凝胶及其制备方法。
主要步骤如下：
(a)通过基因工程的方法将含有特定胶原蛋白基因的载体在细胞中表达所述胶原蛋白分子，而后分离纯化；从动物组织中提取分离得到胶原蛋白。
(b)采用现有技术中通过细菌发酵，或者动物组织提取分离得到的糖胺聚糖，对糖胺聚糖分别进行醛基和酰肼化衍生。
(c)将步骤(a)和步骤(b)所制得的胶原蛋白与糖胺聚糖(配比为1：1到100：1(W/W)，优选的配比为30：1或35：1)进行交联，将糖胺聚糖醛基化衍生物和酰肼化衍生物按摩尔比5：1～1：5的比例混合(优选的比例为1：1)，搅拌4～8小时(优选的搅拌时间为6小时)，使其具有与胶原蛋白共价键合实现交联反应的能力，由醛基衍生化产物和胶原蛋白肽链上的氨基NH2进行共价键合形成亚胺，进而通过加入糖胺聚糖酰肼化产物实现原位聚合包埋胶原蛋白分子。此交联为羟基与醛基以及氨基与醛基形成的水解可逆的交联反应，实现原位聚合包埋胶原蛋白分子。
(d)将水相溶液(糖胺聚糖水溶液)与有机相溶液(含有交联剂的活性酯)按照1：14～1：56(V/V)混合，涡旋至两相混合完全澄清状，随后加入可逆交联剂酰肼类化合物(ADH)或碳化二亚胺(EDC)或二乙烯基砜(DVS)，交联剂的用量为透明质酸结构单元上羧基的物质的量的0.5～15倍，混合后的溶液在磁力搅拌条件下进行交联反应，即可得到胶原蛋白水凝胶。
糖胺聚糖包括但不限于以下材料：透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素。胶原蛋白包括但不限于以下材料：间隙胶原I—III型，基膜胶原IV-VII型，软骨胶原。
本发明涉及的胶原蛋白水凝胶产品，集胶原蛋白与糖胺聚糖对创伤修复的优越性于一身：既保留了对水分的强烈亲和力，又弥补了单独胶原蛋白的力学性能和可塑性，即使含水也能与创面紧密贴合，不会快速被酶水解；胶原蛋白在包埋过程中不会发生变性和分解；不仅适用于大块凝胶和非光敏性蛋白，对一般水凝胶与胶原蛋白都适用；可调控降解速率。
附图说明：
为了加深对本发明的理解，下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。但并非是对本发明的进一步限定，根据本发明的上述内容作出其他形式的变更、替换等均属于本发明的范围。其中：
图1：透明质酸醛基衍生化后与胶原蛋白键合的两步反应
图2：透明质酸醛基衍生化IR谱图
图3：透明质酸醛基衍生化核磁1H谱图
图4：键合有胶原蛋白的透明质酸醛基衍生物与透明质酸酰肼化衍生物共价交联制备水凝胶。(a)在4℃PBS缓冲溶液中，HA的酰肼化衍生物(HA-ADH)与键合胶原蛋白的醛基化衍生物(HA-ALD)，交联反应6小时。(b)在反应结束后，逆向乳化得到微凝胶。
具体实施方式：
实施例1
一、糖胺聚糖与胶原蛋白的共价键合
通过如图1所示的两步反应，透明质酸在高碘酸的氧化作用下实现醛基化，醛基化的透明质酸与鼠尾I型胶原蛋白(C3867-1VL)的氨基进行共轭缩合形成醛基化衍生物。高碘酸钠0.1M，氧化透明质酸HA(分子量200kD，浓度2％)实现醛基化(图2和图3)，使其具有多个醛基，在pH=8.0条件下醛基化的透明质酸(HA-ADH)与胶原蛋白氨基共轭反应16小时使反应完全，共轭百分比为10％。共轭百分比定义为：通过三硝基苯磺酸实验以及样品在334nm处的吸收，反应前后聚合物分子中醛基数量的比值。
二、合成凝胶的制备
采用原位交联技术制备胶原蛋白水凝胶基质，通过原位聚合来包埋胶原蛋白分子。具体方案：在上一步反应结束后的溶液中，按HA-缩氨酸醛基化衍生物与透明质酸酰肼化衍生物(HA)的摩尔比按1：1加入，在4℃下搅拌反应6个小时，反应过程如图4(a)所示。酰肼结构的HA(HA-ADH)可以事先通过透明质酸HA与己二酰二肼(ALD)二氯乙烷溶液和1-羟基苯并三唑(HOBt)在pH6.8条件下合成。
三、水凝胶微球的制备
透明质酸微球的制备：将水相溶液与有机相溶液按照体积比1：14～1：56混合，涡旋至两相混合完全澄清状，随后加入交联剂二乙烯基砜，交联剂的用量为透明质酸结构单元上羧基的物质的量的0.5～15倍；混合后的溶液在磁力搅拌条件下进行交联反应，反应完全后，去反应液在丙酮中沉淀，沉淀依次经历丙酮洗、乙醇洗、水洗、乙醇洗和丙酮洗的过程，洗涤干净的沉淀经过干燥即可得到透明质酸微球，微球扫描电镜如图4(b)所示。
实施例2
一、胶原基质水凝胶的制备
新鲜猪皮去毛、去脂后搅碎成浆，用反渗透水通过离心清洗二次，收集沉淀的细胞外胶原基质。细胞外胶原基质再用0.5％的Trition-x100净洗20小时，其中12小时换液一次；洗净去除细胞蛋白质和部分细胞外基质蛋白质。用反渗透水通过离心清洗四次，除去Trition-x100残留。沉淀的细胞外胶原基质重新悬浮在0.9％生理盐水中，制备成2-5％(w/v)胶原基质悬浮液。经测定含有约92％的胶原蛋白质(羟基脯氨酸法)。取20ml胶原基质悬浮液，按HA-缩氨酸醛基化衍生物与透明质酸酰肼化衍生物(HA)的摩尔比按1：1加入，在20℃下搅拌反应16个小时，按实施例1中方法制成水凝胶微球。
二、效果评价
烫伤模型：单独饲养的雄性Sprague-Dawley(斯普拉格-杜勒鼠)大白鼠12只，200克左右，适应环境一周，自由饮水进食。异戊巴比妥纳(80mg/kg)腹腔麻醉后，背部剃毛，以8％硫化钠脱尽背部毛，温水洗净残留的硫化钠。施以1.0×1.0厘米大小III度烫伤伤口，15min后，腹腔注射3m L无菌生理盐水补充水分。
促进伤口愈合作用：随机分为两组，每组6只，其中一组每天于伤口使用约1cc胶原蛋白水凝胶涂覆，对照组使用生理盐水，每日用药2次。分别在连续用药的第1、2和3周各处死2只白鼠做组织学观察，判断愈合状况。涂抹药膏后的第1周，烫伤伤口处皮肤不形成结痂，组织学检查皮层坏死，迎面边缘已有上皮再生，对照组烫伤伤口处也有结痂，但组织学检查已发现有部分球菌感染。第2周，涂抹胶原蛋白水凝胶的伤口创面肉芽组织部分取代烫伤组织，创口边缘处上皮增生明显加快。第3周，涂抹胶原蛋白水凝胶的伤口，已基本愈合，且伤口平整，没有明显的肉芽状增生，而对照组伤口边缘脱痂愈合但是有肉芽状增生且伤口不平整，而伤口中心部位呈现出化脓症状。动物实验结果显示使用胶原蛋白水凝胶敷料3周后，大鼠背部伤口愈合明显好于对照组，且可以有效的避免伤口边缘的增生和黑色素的沉积。
Claims (9)
1.一种可水解逆转胶原蛋白水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(a)通过基因工程的方法将含有特定胶原蛋白基因的载体在细胞中表达所述胶原蛋白分子，而后分离纯化；从动物组织中提取分离得到胶原蛋白；
(b)采用现有技术中通过细菌发酵，或者动物组织提取分离得到的糖胺聚糖，对糖胺聚糖分别进行醛基和酰肼化衍生；
(c)将步骤(a)和步骤(b)所制得的胶原蛋白与糖胺聚糖按1：1到100：1(W/W)的配比进行交联，将糖胺聚糖醛基化衍生物和酰肼化衍生物按摩尔比5：1～1：5的比例混合，搅拌4～8小时，使其具有与胶原蛋白共价键合实现交联反应的能力；由醛基衍生化产物和胶原蛋白肽链上的氨基NH2进行共价键合形成亚胺，进而通过加入糖胺聚糖酰肼化产物实现原位聚合包埋胶原蛋白分子；此交联为羟基与醛基以及氨基与醛基形成的水解可逆的交联反应，实现原位聚合包埋胶原蛋白分子；
(d)将步骤(c)得到的水相溶液与有机相溶液按照1：14～1：56(V/V)混合，涡旋至两相混合完全澄清状，随后加入可逆交联剂，交联剂的用量为糖胺聚糖结构单元上羧基的物质的量的0.5～15倍，混合后的溶液在磁力搅拌条件下进行交联反应，即可得到胶原蛋白水凝胶。
2.如权利要求1所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的天然生物糖胺聚糖为：透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素当中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的胶原蛋白基质为：动物提取、人工合成的间隙胶原I—III型，基膜胶原IV-VII型，软骨胶原当中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(c)所述胶原蛋白与糖胺聚糖的配比为30：1或35：1(W/W)。
5.如权利要求1所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(c)所述糖胺聚糖醛基化衍生物和酰肼化衍生物按摩尔比1：1的比例混合。
6.如权利要求1所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(c)所述混合溶液的搅拌时间为6小时。
7.如权利要求1所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述水相溶液与有机相溶液分别为糖胺聚糖水溶液和含有交联剂的活性酯，配比为1：25(V/V)。
8.如权利要求1所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述可逆交联剂为二乙烯基砜、酰肼类化合物或碳化二亚胺中的一种或多种。
9.一种可水解逆转胶原蛋白水凝胶，其特征在于：是由权利要求1所述的方法产生的。
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