KR20080080481A - 교차-결합된 다당류 및 단백질 매트릭스 및 그의 제조 방법 - Google Patents

교차-결합된 다당류 및 단백질 매트릭스 및 그의 제조 방법 Download PDF

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KR20080080481A
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토마스 바이엘
아리에 골드러스트
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콜바르 라이프사이언스 리미티드
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Abstract

아미노-기능화 다당류 또는 다당류를 함유하는 하나 이상의 아미노기를 환원당 및/또는 환원당 유도체로 교차-결합시켜, 교차-결합된 다당류 매트릭스를 제조하는 방법이 제공된다. 만들어진 매트릭스는 다당류 기질 및 단백질 및/또는 폴리펩티드와 교차-결합된 다당류를 함유하는 혼성 교차-결합된 매트릭스를 포함할 수 있다. 첨가제 및/또는 세포는 매트릭스 내에 포함되거나 함침될 수도 있다. 교차 결합을 수행하기 위한 다양한 다른 용매 시스템 및 환원당 교차-링커를 개시하였다. 만들어진 매트릭스는 다양한 다른 물리적, 화학적 및 생물학적 특성을 보유한다.

Description

교차-결합된 다당류 및 단백질 매트릭스 및 그의 제조 방법{CROSS-LINKED POLYSACCHARIDE AND PROTEIN MATRICES AND METHODS FOR THEIR PREPARATION}
관련 출원에 교차-참조
본 출원은 전체가 본원에 참조로 인용된 2005년 9월 2일자 출원된 미국 가 출원 제 60/713390호에 대한 우선권을 청구한다.
본 발명은 일반적으로 교차-결합된(cross-link)된 다당류 기초의 매트릭스 및 제제에 관한 것이며, 더욱 자세하게 가교제(cross-linking agent)로서 환원당 및 그의 유도체를 이용하여 아미노-다당류 및 아미노 기능화 다당류를 교차-결합시키기 위한 신규한 방법에 관한 것이며, 이 방법을 이용하여 형성되는 교차-결합된 다당류 매트릭스 및 제제에 관한 것이다.
히아루론산-기초의 또는 다른 아미노-당 기초의 산물의 성능은 숙주에서 그 작용 수명을 조절하는 것과 천연 히아루론산(HA) 또는 다른 다당류 성분의 생물학적 특성의 보존에 의존한다. HA 또는 다른 다당류 성분의 작용 수명은 히아루론산 분해 효소에 의한 또는 숙주에 존재하는 임의의 다른 다당류 분해 효소에 의한 특정 효소적 분해에 저항하는 그의 능력에 의존한다. 이러한 능력은 HA 또는 다른 다당류 기초의 폴리머 내에서 분자내 및 분자간 교차-결합의 수에 직접적으로 연관된 다. 전형적으로, 더 많은 수의 교차-결합은 효소적 분해에 더 큰 저항성을 제공한다.
교차-결합된 다당류 및/또는 다당류의 유도체 및/또는 다당류의 인공적 기능화 형태에 대해 본 분야에 알려진 예시적인 가교제(cross-linking agent)의 선택은 이중기능화(또는 다기능화) 링커, 이를 테면, 1,4-부난디올디글리시딜 에테르, 다양한 다른 합성 이중기능화 교차-링커 및 다른 관련된 비-생리적 제제이다. 이 가교제는 아미노기 또는 다당류 분자의 다른 작용기와 반응하여, 분자간 교차-결합을 형성시킨다. 그러나, 강한 약제는 교차-결합된 다당류-기초의 바이오 생산물(bioproduct)의 생체적합성 및 생물학적 활성에 부정적 영향을 미칠 수 있으며, 이는 다당류 분자의 형태 변형과 가교제의 걸러짐에 의해 유발될 수 있다. 이에 따라, 비-생리 제제에 의해 교차-결합된 다당류 산물은 어느 정도의 항원성을 보유할 수 있다. 더욱이, 국부 부기, 가려움증, 일시적 또는 장기 홍반, 부종, 육아종 형성, 피부 괴사 두드러기 및 여드름형태 병변을 포함하는 국부 염증 및 더 복합적인 전신 반응은 상업적으로 판매되는 교차-결합된 다당류 산물로 심미적으로 치료된 환자의 적은 확률에서 불리한 부작용일 수 있다.
또한, 산물이 현탁액, 겔 또는 에멀전의 형태로 주사용으로 제형화되는 경우, 본 분야에 알려진 인공적 교차-링커의 이용은 주사가능한 제제의 목적하는 유동적 특성과 조합하여 효소 분해에 대해 안정적 저항성을 갖는 교차-결합된 산물을 수득하는 것이 항상 허용되지 않을 수 있다.
요약
따라서, 본 발명의 구체예에 따라, 교차-결합된 다당류를 제조하는 방법이 제공된다. 아미노-다당류 및/또는 아미노-기능화 다당류 및/또는 이들의 조합에서 선택된 적어도 하나의 다당류를 적어도 하나의 환원당과 반응시켜 교차-결합된 다당류를 형성하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 적어도 하나의 다당류는 자연적으로 발생하는 아미노-다당류, 합성 아미노-다당류, 아미노 헤테로다당류, 아미노 호모다당류, 아미노-기능화 다당류 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 아미노-기능화 히아루론산 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 아미노 기능화 히아루로난(hyaluronan) 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 키토산 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 헤파린 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 아미노 기능화 글리코사미노글리칸 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 및 이들의 임의의 조합에서 선택된다.
게다가, 본 발명의 구체예에 따르면, 적어도 하나의 환원당은 알도스, 케토스, 알도스의 유도체, 케토스의 유도체, 2탄당, 3탄당, 4탄당, 5탄당, 6탄당, 7탄당, 8탄당, 9탄당, 10탄당, 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 리보스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 글로스(gulose), 아이도스(idose), 갈락토스 및 탈로스, 환원 단당류, 환원 이당류, 환원 삼당류, 환원 올리고당, 올리고당의 유도체, 단당류의 유도체, 단당류의 에스테르, 올리고당의 에스테르, 단당류의 염, 올리고당의 염, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 겐티오비오스(gentiobiose), 멜리비오스(melibiose), 튜라노스(turanose), 트 레할로스(trehalose), 이소말토스, 라미나리비오스(laminaribiose), 만노비오스(mannobiose) 및 자일로비오스(xylobiose), 글리세르알데히드, 리보스, 에리트로스, 아라비노스, 소르보스, 프룩토스, 글루코스, D-리보스-5-포스페이트, 글루코사민 및 이들의 조합에서 선택된다.
더욱이, 본 발명의 구체예에 따르면, 적어도 하나의 환원당은 적어도 하나의 환원당의 우선성 형태, 적어도 하나의 환원당의 좌선성 형태 및 적어도 하나의 환원당의 우선성 및 좌선성 형태에서 선택될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 구체예에 따르면, 반응은 적어도 하나의 용매 및 적어도 하나의 환원당을 포함하는 용액 중에서 적어도 하나의 다당류를 인큐베이션하는 것을 포함하여, 교차-결합된 다당류를 형성하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 용액은 적어도 하나의 완충액을 포함하는 완충된 용액이다.
게다가, 본 발명의 구체예에 따르면, 용매는 용액의 pH를 조절하기 위한 적어도 하나의 완충액을 포함하는 완충 수성 용매이다.
더욱이, 본 발명의 구체예에 따르면, 용매는 용액의 이온 세기를 조절하기 위한 적어도 하나의 이온화가능 염을 포함하는 수성 용매이다.
뿐만 아니라, 본 발명의 구체예에 따르면, 용매(들)는 유기 용매, 무기 용매, 극성 용매, 비극성 용매, 친수성 용매, 소수성 용매, 수혼화성 용매, 비-수혼화성 용매 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 용매를 포함한다.
또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 용매는 물 및 친수성 용매, 극성 용매, 수혼화성 용매 및 이들의 조합에서 선택된 적어도 하나의 부가 용매를 포함한다.
게다가, 발명의 구체예에 따르면, 용매는 물, 인산-완충 용액, 에탄올, 2-프로판올, 1-부탄올, 1-헥산올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 디에틸 에테르, 헥산, 톨루엔 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
더욱이, 본 발명의 구체예에 따르면, 반응은 교차-결합가능한 아미노기를 지닌 적어도 하나의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 적어도 하나의 다당류 및 적어도 하나의 환원당에 첨가하여, 교차-결합된 매트릭스를 형성하는 것을 포함한다.
뿐만 아니라, 본 발명의 구체예에 따르면, 교차-결합가능한 아미노기를 지닌 적어도 하나의 단백질 및/또는 폴리펩티드는 콜라겐, 콜라겐 상과(superfamily)에서 선택된 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 효소, 구조 단백질, 혈액 유래 단백질, 당단백질, 지질단백질, 천연 단백질, 합성 단백질, 호르몬, 성장 인자, 연골 성장 촉진 단백질(cartilage growth promoting protein), 골 성장 촉진 단백질(bone growth promoting prtoein), 세포내 단백질, 세포외 단백질, 막 단백질, 엘라스틴, 피브린, 피브리노겐 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 콜라겐은 천연 콜라겐, 섬유상(fibrillar) 콜라겐, 섬유상 아텔로펩티드(atelopeptide) 콜라겐, 텔로펩티드(telopeptide) 함유 콜라겐, 동결건조된 콜라겐, 동물 원으로부터 수득된 콜라겐, 인간 콜라겐, 포유동물 콜라겐, 재조합 콜라겐, 펩신처리된 콜라겐, 재구성된 콜라겐, 소 아텔로펩티드 콜라겐, 돼지 아텔로펩티드 콜라겐, 식물 종으로부터 수 득된 콜라겐, 재조합 콜라겐, 유전자공학적으로 조작되거나 변형된 콜라겐, 콜라겐 I, II III, V, XI, XXIV 형, 섬유-관련 콜라겐 IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII 및 XXVI 형, VIII 및 X 형 콜라겐, IV 형 콜라겐, VI 형 콜라겐, VII 형 콜라겐, XIII, XVII, XXIII 및 XXV 형 콜라겐, XV 및 XVIII 형 콜라겐, 유전적으로 변형된 진핵 또는 원핵 세포에 의해, 또는 유전적으로 변형된 유기체에 의해 제조된 인공적으로 생산된 콜라겐, 정제된 콜라겐 및 재구성된 정제 콜라겐, 섬유상 콜라겐의 입자, 섬유상 재구성 아테로펩티드 콜라겐, 세포 배양 배지로부터 정제된 콜라겐, 유전자공학적으로 조작된 식물에서 유래된 콜라겐, 콜라겐의 단편, 원시(proto)-콜라겐, 이들의 임의의 조합에서 선택된다.
게다가, 본 발명의 구체예에 따르면, 반응은 적어도 하나의 첨가제를 적어도 하나의 다당류 및 적어도 하나의 환원당에 첨가하는 것을 포함하여 적어도 하나의 첨가제를 함유하는 교차-결합된 매트릭스를 형성한다.
더욱이, 본 발명의 구체예에 따르면, 적어도 하나의 첨가제는, 약제류, 약물류, 단백질, 폴리펩티드, 마취제, 항-박테리아제류, 항-미생물제, 항-바이러스제, 항균제(antifungal agent), 항-진균제(anti-mycotic agent), 항염증제, 당단백질류, 프로테오글리칸류, 글리코사미노글리칸류, 다양한 세포외 매트릭스 성분, 호르몬, 성장 인자, 형질전환 인자(transforming factor), 수용체 또는 수용체 복합체, 천연 폴리머, 합성 폴리머, DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 약물, 치료제, 항-염증제, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 형태형성 단백질(morphogenic protein), 당단백질, 점액 단백질(mucoprotein), 점액다당류, 매트릭스 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 항-염증제, 단백질, 펩티드, 호르몬, 유전 치료법을 위한 유전 물질, 핵산, 화학적으로 변형된 핵산, 올리고뉴클레오티드, 리보 핵산, 디옥시리보 핵산, 키메라 DNA/RNA 작제물, DNA 또는 RNA 프로브, 항-센스 DNA, 항-센스 RNA, 유전자, 유전자 부분, 자연 또는 인공적으로 생성된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, 세포 흡수 및 전사를 증진시키기 위해 요구되는 바이러스 및 비-바이러스 벡터, 글리코사미노글리칸, 콘드로이틴 4-설페이트, 콘드로이틴 6-설페이트, 케라틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 히아루로난, 레시틴 풍부 사이질 프로테오글리칸, 데코린(decorin), 바이글리칸(biglycan), 피브로모듈린(fibromodulin), 루미칸(lumican), 아그레칸(aggrecan), 신데칸(syndecans), 베타-글리칸, 베르시칸(versican), 센트로글리칸(centroglycan), 세르글리칸(serglycin), 피브로넥틴, 피브로글리칸, 콘드로어드헤린(chondroadherin), 피불린(fibulin), 트롬보스폰딘-5(thrombospondin-5), 효소, 효소 억제제, 항체 및 이들의 임의의 조합에서 선택된다.
뿐만 아니라, 본 발명의 구체예에 따르면, 반응은 하나 이상의 생 세포를 교차-결합되기 전에, 결합하는 동안에 또는 이후에, 적어도 하나의 다당류 및 적어도 하나의 환원당에 첨가하는 것을 포함하여, 매트릭스에 함침된 적어도 하나의 생 세포를 함유하는 교차-결합된 매트릭스를 형성한다.
또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 생 세포는 척추동물 연골 세포, 골아세포, 파골세포, 척추동물 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 줄기 세포 유래 성인 조직, 척추동물 선구 세포, 척추동물 섬유아세포, 하나 이상의 매트릭스 단백질, 글리코 사미노글리칸, 프로테오글리칸, 형태형성 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 항-염증제, 단백질, 호르몬, 펩티드를 분비하도록 유전적으로 조작된 세포, 단백질, 펩티드, 호르몬, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 형태형성 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 항-염증제, 당단백질, 점액 단백질 및 점액 다당류로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 분자에 수용체를 발현하도록 조작된 하나 이상의 타입의 생 세포, 및 이들의 임의의 조합에서 선택된다.
게다가, 본 발명의 구체예에 따르면, 방법은 교차-결합된 다당류에 건조, 동결-건조, 탈수, 임계점 건조, 몰딩, 살균, 균질화, 기계적 절단, 전리 방사선에 의한 조사, 전자기 방사선에 의한 조사, 약제학적으로 허용되는 비히클(vehicle)과 혼합, 첨가제 주입 및 이들의 조합에서 선택된 처리를 하는 것을 더 포함한다.
본 발명의 구체예에 따르면, 교차-결합된 다당류를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 다당류를 하나 이상의 반응물과 반응시켜, 다당류의 유도체를 형성하는 단계를 포함한다. 유도체는 하나 이상의 아미노기를 함유하며, 유도된 다당류를 적어도 하나의 환원당과 교차-결합하여 교차-결합된 다당류를 형성한다.
더욱이, 본 발명의 구체예에 따르면, 아미노기는 일차 아미노기 및 이차 아미노기에서 선택된다.
뿐만 아니라, 본 발명의 구체예에 따르면, 하나 이상의 반응물은 카보디이미드를 포함한다.
또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 하나 이상의 반응물은 아디프산 디하이드라지드의 존재 하에서 카보디이미드를 포함한다.
게다가, 본 발명의 구체예에 따르면, 카보디이미드는 1-에틸-3-(디메틸 아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드이다.
더욱이, 본 발명의 구체예에 따르면, 적어도 하나의 환원당은 알도스, 케토스 및 이들의 조합에서 선택된다.
뿐만 아니라, 본 발명의 구체예에 따르면, 적어도 하나의 환원당은 글리세르알데히드, 리보스, 에리트로스, 아라비노스, 소르보스, 프룩토스, 글루코스, D-리보스-5-포스페이트, 글루코사민, 2탄당, 3탄당, 4탄당, 5탄당, 6탄당, 7탄당, 8탄당, 9탄당, 10탄당, 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 리보스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 글로스(gulose), 아이도스(idose), 갈락토스, 탈로스, 환원 단당류, 환원 이당류, 환원 삼당류, 환원 올리고당, 올리고당의 유도체, 단당류의 유도체, 단당류의 에스테르, 올리고당의 에스테르, 단당류의 염, 올리고당의 염, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 멜리비오스, 튜라노스, 트레할로스, 이소말토스, 라미나리비오스, 만노비오스 및 자일로비오스, 및 이들의 조합에서 선택된다.
본 발명의 구체예에 따르면, 혼성 교차-결합된 매트릭스를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 적어도 하나의 환원당을 적어도 하나의 교차-결합가능한 단백질의 존재 하에서 아미노-다당류, 아미노-기능화 다당류 및 이들의 조합에서 선택된 적어도 하나의 다당류와 교차-결합시켜, 혼성 교차-결합된 매트릭스를 형성하는 것을 포함한다.
마지막으로, 본 발명의 구체예에 따르면, 상기 개시된 방법에 의해 제조된 하나 이상의 단백질과 다당류를 포함하는 혼성 매트릭스와 교차-결합된 다당류가 또한 제공된다.
본 발명을 이해하고, 실제로 그것이 어떻게 수행될 수 있는지 이해하기 위하여, 비-제한적인 예시로, 도면을 참조하여 몇몇 바람직한 구체예를 기술하였다:
도 1은 본 발명의 방법의 구체예에 따라 수득된, 파선으로 나타낸 아미노-기능화 히아루론산(AFHA) 및 실선으로 나타낸 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 AFHA의 UV-가시 스펙트럼을 나타내는 개략적인 그래프이다;
도 2는 본 발명의 방법의 구체예에 따라 수득된, 파선으로 나타낸 D(-)-리보스 교차-결합된 AFHA, 실선으로 나타낸 D(-)-에리트로스 교차-결합된 AFHA 및 점선으로 나타낸 D(-)-아라비노스 교차-결합된 AFHA의 UV-가시 스펙트럼을 나타내는 개략적인 그래프이다;
도 3은 본 발명의 방법의 구체예에 따라 수득된, 실선으로 나타낸 교차-결합되지 않은 키토산, 파선으로 나타낸 D(-)-리보스 교차-결합된 키토산 및 점선으로 나타낸 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 키토산의 UV-가시 스펙트럼을 나타내는 개략적인 그래프이다;
도 4는 본 발명의 방법의 구체예에 따른, 점선으로 나타낸 히아루론산, 파선으로 나타낸 AFHA 및 실선으로 나타낸 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 AFHA의 푸리에 변환 적외（Fourier transform infrared, FTIR) 스펙트럼을 나타내는 개략 적인 그래프이다;
도 5-7은 일부 상업적으로 입수할 수 있는 히아루론산 기초의 매트릭스의 유동학 특성과 비교하여, 다양한 시점에서 다양한 다른 DL-글리세르알데히드 농도와 교차-결합된, 본 발명의 방법의 구체예에 따른 AFHA 기초의 다당류의 6개의 상이한 조성물의 유동학 특성의 측정 결과를 나타낸 개략적인 그래프이다;
도 8은 본 발명의 구체예에 따른, 다양한 다른 농도의 DL-글리세르알데히드와 교차-결합된 아미노 기능화 HA의 팽윤 행태의 측정 결과를 나타낸 개략적인 그래프이다;
도 9는 본 발명의 구체예에 따른, 다양한 다른 농도의 DL-글리세르알데히드와 교차-결합된 키토산의 팽윤 행태의 측정 결과를 나타내는 개략적인 그래프이다;
도 10은 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 아미노-기능화 HA 및 상업적으로 수득한 Perlane®의 히아루론산 분해 효소에 의한 분해의 카르바졸 분석 결과를 나타내는 개략적인 그래프이다;
도 11은 Perlane®의 흡광도 값을 10배로 증가시켜 Perlane® 실험 샘플을 10배 희석한 것이 보상되도록 한 도 10의 카르바졸 분석 결과를 나타내는 개략적인 그래프이다;
도 12는 분해 시간의 작용에 따른 D(-)-프룩토스 교차-결합된 아미노-기능화 HA 매트릭스 및 Perlane®의 실험 샘플의 시험관 내 히아루론산 분해 효소에 대한 % 저항성을 나타내는 개략적인 그래프이다.
이용된 표기
본 출원을 통해 다음 표기가 이용된다.
용어 정의
㎕ 마이크로리터
ADH 아디프산 디하이드라지드
AFHA 아미노 기능화 히아루론산
AGE 최종 당화 산물
CH 키토산
DI 물 탈이온화 물
EDC 1-에틸-3-(디메틸 아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드
FTIR 푸리에 변환 적외선
G 게이지
HA 히아루론산
HZ 헤르즈
IR 적외선
M 몰
MDa 백만 달톤
㎎ 밀리그램
㎖ 밀리리터
mM 밀리몰
Mw 분자량
N 정상
Pas 파스칼
PBS 인산 완충 용액
RPM 분당 회전
본 발명은 신규한 교차-결합된 다당류 기초의 생체적합성 매트릭스를 제조하는 신규한 방법과 생체 내 및 시험관 내에서 효소적 분해에 큰 저항성과 다른 유용한 유동학 및/또는 생물학적 특성을 갖는 제제를 개시한다. 상기 방법은 특히 아미노-다당류(이를 테면, 비제한적으로 키토산) 및/또는 아미노-기능화 다당류(이를 테면, 비제한적으로 아미노-기능화 히아루론산)와 환원당, 이를 테면, D(-)-리보스, DL-글리세르알데히드, D(-)-에리트로스, D(-)-아라비노스 및 본 분야에 공지인 많은 다른 타입의 환원당의 교차-결합에 기초한다. 상기 신규한 교차-결합된 매트릭스의 예도 개시된다.
본 발명은 또한 생체 내 및 시험관 내에서 효소 분해에 대하여 뛰어난 저항성을 가지며, 다른 유용한 유동학 및/또는 생물학적 특성을 가지는 신규 혼성 다당류/단백질 기초의 매트릭스 및 제제를 형성하기 위하여, 하나 이상의 아미노-다당류 및/또는 하나 이상의 아미노-기능화 다당류 및/또는 하나 이상의 단백질(및/또는 폴리펩티드)과 하나 이상의 환원당(들)(교차-링커와 같이)의 교차-결합된 혼합물에 의해 생산되는 혼성의 교차-결합된 매트릭스를 제조하기 위한 신규 방법을 개시한다.
용어 "다당류" 및 "다당류들" 및 그의 컨쥬게이트(conjugate) 형태는 상기 다당류(들)의 임의의 화학적으로 변형체 및/또는 유도체를 포함하며, 제한없이, 이 다당류 또는 이의 유도체의 에스테르 및 염을 비제한적으로 포함하며, 임의의 자연적으로 발생하고/하거나 인공적으로 제조된(및/또는 인공적으로 합성된) 다당류 또는 다당류들을 정의하는 것으로 본원에서 사용된다.
용어 "아미노-다당류" 및 "아미노-다당류들" 및 그의 컨쥬게이트 형태는 환원당에 의해 교차-결합될 수 있는 하나 이상의 아미노기를 함유하는 임의의 형태의 다당류 또는 다당류(들)을 정의하는 것으로 본원에서 사용된다.
용어 "아미노-기능화 다당류" 및 "아미노-기능화 다당류들" 및 그의 컨쥬게이트 형태는 특히 환원당에 의해 교차-결합될 수 있는 하나 이상의 아미노기를 포함하는 하나 이상의 화학적 부분에 부착되도록 화학적으로 변형된 임의의 다당류를 정의하는 것으로 본원에서 사용된다.
이에 따라, 본원에 개시된 교차-결합된 방법은 특히 자연적으로 발생하는 아미노-다당류, 합성 아미노-다당류, 아미노 헤테로다당류, 아미노 호모다당류, 아미노-기능화 다당류, 히아루론산 및 그의 유도체, 히아루로난 및 이의 유도체, 키토산 및 그의 유도체, 헤파린 및 그의 유도체 및 이의 다양한 조합을 교차-결합시키는 데 이용될 수 있다. 개시된 방법은 상기 아미노-다당류 및 아미노-기능화 다당류의 임의의 적합한 에스테르 및 염의 교차-결합을 포함한다.
이하 특정 실시예 및 실험에서 개시되지 않은 다당류 및/또는 아미노 기능화 다당류를 함유하는 다른 타입의 아미노기도 본원에 개시된 방법에 의하여 교차-결합되어 다양한 교차-결합된 산물을 제공할 수 있는 것은 탄수화물 화학에 숙련자에게 인지될 것이다. 환원당(또는 환원당 유도체)을 이용한 상기 아미노 다당류 또는 아미노 기능화 다당류 교차-결합의 교차-결합이 본 발명 및 본 발명의 산물의 범주 내에 포함된다. 본 발명의 방법에서 임의의 적합한 환원당은 가교제로 이용될 수 있다. 당은 단당류, 환원 말단을 지닌 이당류, 환원 말단을 지닌 삼당류 등일 수 있다. 적합한 당은 알도스 및 케토스를 포함할 수 있다. 단당류가 교차-링커로 이용될 때, 이는 3탄당, 4탄당, 5탄당, 6탄당, 7탄당일 수 있으나, 7개를 넘는 탄소 원자를 갖는 단당류 또한 이용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 신규한 교차-결합된 방법에서 이용될 수 있는 당 중 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 알로스, 알토스, 글루코스, 만노스, 글로스, 아이도스, 갈락토스, 프룩토스, 탈로스, 또는 임의의 다른 2탄당, 3탄당, 4탄당, 5탄당, 6탄당, 7탄당, 8탄당, 9탄당, 또는 10탄당 및 그의 다양한 적합한 유도체일 수 있다.
활성 알데히드 또는 케토기를 지니는 상기 개시된 단당류 또는 올리고당의 환원 유도체는 본 발명에서 가교제로 이용될 수도 있다.
교차-결합된 반응 속도는 본 분야에 알려진 바와 같이 이용된 특정 당의 개환 형태에 존재하는 알데히드 또는 케토기의 평형화 농도에 의존할 수 있다. 그러나 본 분야에 알려진 바와 같이 단순하게 반응 시간을 늘려 특정 특이 당의 느린 반응 속도를 보상할 수 있다.
이하 기술된 실험은 상기 아미노-다당류 및 합성적으로 아미노기로 기능화된 다당류와 선택된 예시적인 환원당과의 전형적인 반응을 나타내는 비-제한적인 실시예이며, 만들어진 매트릭스에서 개선된 분해 저항성 및 유동 특성을 나타낸다. 다음 실험은 예시적인 수단으로만 주어지며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 없다. 이에 따라, 만들어진 교차-결합된 매트릭스의 다당류, 기능화 다당류, 환원당(교차-링커로 이용), 반응 조건, 반응 혼합물 조성물, 반응 온도, 반응 기간 및 화학적, 물리적, 유동적 및 생물내구성 특성은 이하 개시된 실험에서 특히 기술된 바로부터 다양할 수 있음이 본 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.
일반적 용어로 다음 본문에서 이용된 용어 히아루론산(HA)는 히아루론산 그 자체 및 그의 염 또는 염의 혼합물, 특히 히아루론산 염을 나타낸다.
용어 아미노 기능화 히아루론산은 유리 아미노기를 지닌 부분을 함유하도록 유도화된 히아루론산 및 그의 염 또는 염의 혼합물을 나타내기 위한 일반적인 용어로서 다음 본문에서 이용된다. 아미노기는 일차 아미노기 및/또는 이차 아미노기일 수 있다. 아미노기를 함유하는 부분을 도입하기 위한 바람직한 부분은 다당류의 카복실기이나, 당 고리(들) 상의 다른 부위에서 아미노기 함유 부분을 도입하는 것이 가능할 수 있다. 전체 및 일부 카복실기일 필요가 없는 아미노-기능화은 비-유도화되어 있을 수 있다(이용된다면 다른 유도화 부위).
용어 아미노 기능화 다당류는 교차-결합된 환원당의 알데히드기 또는 케토기와 반응할 수 있는 아미노기를 함유하는 임의의 다당류를 나타내는 일반적인 용어로 다음 본문에서 이용된다. 아미노기는 일차 및/또는 이차 아미노기일 수 있다. 아미노기는 당 고리 구조(키토산에서와 같이)에 직접적으로 위치될 수 있을 뿐 아니라, 다당류 사슬의 당 고리에 하나 이상의 부위 또는 화학 그룹에 공유적으로 결합된 부위의 부분일 수도 있다.
이에 따라, 아미노기는 키토산의 경우에서와 같이(이후 자세하게 기술되는 바와 같이), 기능화될 필요가 없는 당 고리 상에 직접적으로 위치될 수 있으며, 고리 뼈대 아미노기를 통하여 환원당과 직접적으로 교차-결합될 수 있다. 유리 아미노기(일차 또는 이차)를 지닌 임의의 다당류와 같이 부분적으로 탈아세틸화된 키틴 기초의 폴리머는 본 발명의 당 교차-결합된 방법으로 교차-결합될 수도 있다.
본원에 개시된 실험의 결과에 따라, 교차-결합된 반응 혼합물에 비제한적으로 에탄올과 같은 극성인, 물과 혼화할 수 있는 용매를 첨가하면, 임의의 극성 용매 없는 완충 수용액의 존재 하에서의 교차-결합과 비교하여 반응 산물의 분해 저항성이 개선되고, 교차-결합된 효능을 상당히 증가시킬 수 있다.
교차-결합의 정확한 반응 기작과 만들어진 교차-결합된 다당류의 화학적 특성은 현재 전부 밝혀지지 않았으나, 당의 알데히드 또는 케토기와 단백질의 아미노산의 아미노기, 이를 테면, 라이신 또는 아르기닌 또는 단백질의 쇄에 존재하는 다른 아미노산의 유리 아미노산의 반응에 기초하여 단백질 분자를 교차-결합시키는데 환원당이 이용되는 통상의 당화 반응과 상기 반응이 유사한 것(동일한 것은 아닐지라도)일 수 있으리라 가정된다.
이들 환원당의 단백질 교차-결합된 반응은 본 분야에 잘 알려져 있다. 그러한 단백질 교차-결합된 반응은 적어도 부분적으로 초기 반응 산물의 아마도리(Amadori) 재배열을 통하여 수행되어, 노란색을 띄거나 갈색의 최종 당화 산물을 유발한다고 여겨진다.
본 발명의 발명자들이 본 출원에 개시된 실험에서 수득된 교차-결합된 다당류의 구조를 완전히 특성화하지 않았지만, 만들어진 교차-결합된 다당류의 225-235 및 285-355 나노미터 범위의 특징적인 흡광도 피크는 단백질 당화 산물 및 최종 단백질 당화 산물(AGE)과 다소 유사한(필수적으로 동일하지 않은) 특성의 당화 산물의 존재를 지시하는 것일 수 있다.
실험에 이용된 물질
헤파린 소듐 EP (제조 번호 9818030)를 JUK Kraeber GmbH & Co, Hamburg, Germany에서 입수하였다.
Restylane® (제품 번호 7349) 및 Restylane - Perlane (제품 번호 7064)는 상업적으로 Q-Med AB로부터 입수가능하며, Uppsala Sweden. Hylaform® Plus (제품 번호 R0409는 판매점 INAMED AESTHETICS, Ireland를 통하여 상업적으로 Genzyme Biosurgery(Genzyme Corporation의 지사)로부터 입수가능하다
달리 언급되지 않으면, IKA®-WERKE, Germany로부터 상업적으로 입수가능한 ULTRA TURRAX® T-25 (basic)를 이용하여 Turrax 균질화를 수행하였다.
Heto Lab Equipment, Denmark에서 상업적으로 입수가능한 모델 FD 8 동결 건조기를 이용하여 모든 동결건조 과정을 수행하였다. 응축기 온도는 -80℃였다. 전-동결시 선반의 온도는 -40℃였다. 동결 건조를 위한 선반 온도는 +30℃였다. 전-냉동 시간은 8시간 이었으며, 동결 건조 시간은 24시간 이었다. 동결건조시 진공압은 약 0.01바였다.
하기의 표 1은 본 출원에 개시된 실험에서 이용된 물질의 상업적 소스를 열거하였다.
Figure 112008023708495-PCT00001
HA 아미노 기능화 과정 I
1.4-1.8 MDa 범위의 분자량을 갖는 HA 150 (NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway에서 소듐 히아루로네이트 의약품 등급 150을 제품 번호 2222003로 상업적으로 입수가능) 400 mg 또는 0.62-1.15 MDa 범위의 분자량을 갖는 HA 80 (NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway에서 소듐 히아루로네이트 의약품 등급 150을 제품 번호 2222002로 상업적으로 입수가능)을 DI 물 350 ㎖ 중에 용해하고, 7 g의 아디프산 디하이드라지드(ADH)을 혼합물에 첨가하였다. 만들어진 용액의 pH를 4.75로 적정하고, 용액을 2 시간 동안 교반하였다. 764 mg의 1-에틸-3-(디메틸 아미노 프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드를 2.0 ㎖의 DI 물 중에 용해하고, 혼합물에 첨가하고, 실온에서 pH를 다시 4.75로 적정하였다. 반응의 pH 변화를 모니터하고, 계속하여 4.75로 적정하였다. pH의 변화가 검출되지 않으면, 반응 혼합물을 추가의 시간 동안 또는 밤새 놔두었다. 그 후에, 용액을 투석 튜브로 옮기고 투석물에서 ADH가 검출되지 않을 때까지 DI 물에 대하여 투석하였다. 투석된 용액을 100% 에탄올 3.5 리터로 옮기고, 2 그램의 NaCl을 첨가하고, 혼합물을 한시간 동안 교반하였다. 침전된 변형 HA를 분리하기 위하여, 용액을 7000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 아미노-기능화 HA(AFHA)를 이용시까지 4℃에서 보관하였다.
하기 기술한 AFHA를 이용한 모든 교차-결합된 실험에서 기능화 HA 80에서 유발된 아미노 기능화 HA는 계속 하기에서 AFHA80로 언급되며, 기능화 HA 150에서 유발된 아미노 기능화 HA는 AFHA I 150으로 언급된다. 이러한 두 아미노-기능화 H?A 물질(AFHA80 및 AFHA I 150)은 하기 기술된 모든 HA 교차-결합된 실험에 이용된다.
HA 교차-결합된 과정
이하 기술된 모든 실험 과정에서 보텍싱(vortexing)을 vortex™ 회전 믹서를 이용하여 수행하였다. SORVALL® Instruments DU PUNT, USA로부터 상업적으로 입수가능한 SORVALL SS-34 로터로 모든 원심분리(특별히 다리 언급되지 않는 함)를 모델 RC5C 원심분리를 이용하여 수행하였다.
첫번째 숫자(실험 시리즈 숫자로 언급) 다음 슬래쉬(/) 그리고 그 다음, 시리즈에서 수행된 실제 실험의 범위와 같이 하기 기술한 각각의 다음의 실험을 수행하였다. 예를 들어, 하기 실험 시리즈 32/1-3은 하기 세 실험을 포함한다: 실험 32/1, 실험 32/2, 및 실험 32/3. 이러한 명명을 상세한 설명을 통해 계속하여 이용하였다.
실험 시리즈 32/1-3
약 5 mg AFHA80를 1 mL DI 물 중에 용해시키고, 5 mL 100% 에탄올에 첨가하고, 1분 동안 보텍싱한 다음, 다른 양의 글리세르알데히드를 다음과 같이 QAFHA80 혼합물에 첨가하였다:
a) 100 ㎕의 DI 물 중 용해된 2 mg의 글리세르알데히드(실험 32/1)
b) 200 ㎕의 DI 물 중 용해된 4 mg의 글리세르알데히드(실험 32/2)
c) 300 ㎕의 DI 물 중 용해된 6 mg의 글리세르알데히드(실험 32/3).
만들어진 반응 혼합물을 1분 동안 보텍싱하고, 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 이후에, 용액을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 1mL의 DI 물을 남아있는 펠렛(pellet)에 첨가하였다. 실온에서 30분 후에 혼합물을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 만들어진 교차-결합된 산물은 다음 특성을 갖는다:
a) (실험 32/1): 500 ㎕의 단단한 겔.
b) (실험 32/2): 교차-결합된 HA 및 물 사이의 상 분리가 없는 연질 불투명 겔 (3 시간 동안의 재-원심분리후 500 ㎕의 투명 겔 유발).
c) (실험 32/3): 800 ㎕의 겔.
실험 33/1
약 25mg의 AFHA80을 5㎖의 DI 물 중에 용해하고, 25 ㎖의 100% 에탄올에 첨가하고, 1 분 동안 보텍싱하였다. 500㎕의 DI 물 중 용해된 DL-글리세르알데히드 10 mg의 용액을 혼합물에 첨가하고, 만들어진 혼합물을 1분 동안 보텍싱하고, 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이터에서 6 시간 동안 순환시킨 다음, 250 ㎕의 DI 물 중 용해된 추가의 5 mg 글리세르알데히드를 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 인큐베이터에 다시 넣어 인큐베이션 기간을 완성하였다. 24 시간 인큐베이션의 마지막에, 용액을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 40 ㎖의 DI 물과 2㎖의 PBS 완충액(10 mM)을 펠렛에 첨가하고, 실온에서 6 시간 동안 놔두었다. 그 다음, 혼합물을 다시 6000rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 만들어진 산물은 500 ㎕의 단단한 불투명 겔이다.
실험 시리즈 35/1-4
약 5mg의 AFHA80을 1mL의 DI 물 중에 용해시키고, 12 mL의 100% 에탄올에 첨가하고, 1 분 동안 보텍싱한 다음, 다른 양의 DL-글리세르알데히드를 다음과 같이 첨가하였다:
a) 75 ㎕의 DI 물 중 용해된 1.5 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 35/1).
b) 150 ㎕의 DI 물 중 용해된 3.0 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 35/2).
c) 225 ㎕의 DI 물 중 용해된 4.5 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 35/3).
d) 300 ㎕의 DI 물 중 용해된 6.0 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 35/4).
만들어진 반응 혼합물을 1 분 동안 보텍싱하고, 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 24 시간 후에, 용액을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 5mL의 DI 물을 각 펠렛에 첨가하였다. 실온에서 30분 후에 혼합물을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 만들어진 교차-결합된 산물은 다음 특성을 갖는다:
a) (실험 35/1): 3.4 ㎖의 투명 겔.
b) (실험 35/2): 3.5 ㎖의 투명 겔.
c) (실험 35/3): 4.0 ㎖의 투명 겔.
d) (실험 35/4): 4.0 ㎖의 투명 겔.
실험 시리즈 37/4-6
약 5mg의 AFHA80을 1mL의 DI 물 중에 용해시키고, 10 mL의 100% 에탄올에 첨가하였다. 혼합물을 1 분 동안 보텍싱한 다음, 다른 양의 DL-글리세르알데히드를 다음과 같이 혼합물에 첨가하였다:
a) 400 ㎕의 DI 물 중 용해된 8 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 37/4).
b) 500 ㎕의 DI 물 중 용해된 10 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 37/5).
c) 600 ㎕의 DI 물 중 용해된 12 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 37/6).
만들어진 반응 혼합물을 1 분 동안 보텍싱하고, 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 용액을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 5mL의 DI 물을 각 펠렛에 첨가하였다. 실온에서 30분 후에 혼합물을 6000rpm에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. 만들어진 교차-결합된 산물은 다음 특성을 갖는다:
a) (실험 37/4): 2.5 ㎖의 투명 겔.
b) (실험 37/5): 1.9 ㎖의 투명 겔.
c) (실험 37/6): 1.5 ㎖의 투명 겔.
실험 시리즈 38/1-3
약 5mg의 AFHA80을 1mL의 DI 물 중에 용해시키고, 10 mL의 100% 에탄올에 첨가하고, 1 분 동안 보텍싱한 다음, 다른 양의 DL-글리세르알데히드를 다음과 같이 혼합물에 첨가하였다:
a) 700 ㎕의 DI 물 중 용해된 14 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 38/1).
b) 800 ㎕의 DI 물 중 용해된 16 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 38/2).
c) 900 ㎕의 DI 물 중 용해된 18 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 38/3).
만들어진 반응 혼합물을 1 분 동안 보텍싱하고, 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 24 시간 후, 용액을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 5mL의 DI 물을 각 펠렛에 첨가하였다. 37℃에서 30분 후에 혼합물을 6000rpm에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. 만들어진 교차-결합된 산물은 다음 특성을 갖는다:
a) (실험 38/1): 1.0 ㎖의 투명 겔.
b) (실험 38/1): 0.75 ㎖의 투명 겔.
c) (실험 38/1): 0.50 ㎖의 투명 겔.
실험 시리즈 41/1-4
약 5mg의 AFHA I 150을 5mL의 DI 물 중에 용해시키고, 10 mL의 100% 에탄올에 첨가하고, 1 분 동안 보텍싱한 다음, 다른 양의 DL-글리세르알데히드를 다음과 같이 혼합물에 첨가하였다:
a) 300 ㎕의 DI 물 중 용해된 6 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 41/1).
b) 400 ㎕의 DI 물 중 용해된 8 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 41/2).
c) 500 ㎕의 DI 물 중 용해된 10 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 41/3).
d) 600 ㎕의 DI 물 중 용해된 12 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 41/4).
만들어진 반응 혼합물을 1 분 동안 보텍싱하고, 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 24 시간 후, 용액을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 20mL의 DI 물을 각 펠렛에 첨가하였다. 37℃에서 30분 후에 혼합물을 6000rpm에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. a(실험 41/1), b(실험 41/2) 및 c(실험 41/3)의 경우에 상 분리가 관찰되지 않았다; 5 ㎖의 상층액을 d 경우(실험 41/4)에서 제거할 수 있었다. 그 다음, 50 1N NaOH 용액을 모든 샘플에 첨가하고, 샘플을 다시 원심분리하고, 40 ㎖의 PBS 완충액(10 mM, pH 7.36)으로 2회 세척하였다. 각 단계 후 희석된 교차-결합된 산물을 6000rp에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 결과는 다음과 같다: 샘플 a (실험 41/1), b (실험 41/2) 및 c (실험 41/3)에서, 겔이 남아있지 않았다. 샘플 d(실험 41/4)에서 5㎖의 투명 겔을 수득하였다.
실험 시리즈 42/1-3
약 5mg의 AFHA I 150을 5mL의 DI 물 중에 용해시키고, 40 mL의 100% 에탄올에 첨가하고, 1 분 동안 보텍싱한 다음, 다른 양의 DL-글리세르알데히드를 다음과 같이 혼합물에 첨가하였다:
a) 800 ㎕의 DI 물 중 용해된 16 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 42/1).
b) 1000 ㎕의 DI 물 중 용해된 20 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 42/2).
c) 2000 ㎕의 DI 물 중 용해된 40 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 42/3).
만들어진 반응 혼합물을 1 분 동안 보텍싱하고, 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 24 시간 후, 용액을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 40mL의 DI 물을 각 펠렛에 첨가하였다. 실온에서 30분 후에 각각의 혼합물을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 만들어진 교차-결합된 겔은 a)에서 b)를 통하여 c)까지 증가된 겔 점성을 갖는다(예를 들어, 실험 42/1에서 만들어진 겔은 셋 중 가장 낮은 점성을 가지며, 실험 42/3에서 만들어진 겔은 셋 중 가장 높은 점성을 가지며, 실험 42/2에서 만들어진 겔은 세 샘플의 가장 높은 값과 가장 낮은 값 사이의 점성 값을 갖는다).
실험 시리즈 44/1-2
약 5mg의 AFHA80을 5mL의 DI 물 중에 용해시키고, 40 mL의 100% 에탄올에 첨가하고, 1 분 동안 보텍싱한 다음, 다른 양의 상이한 환원당 교차 링커를 다음과 같이 혼합물에 첨가하였다:
a) 2 ㎖의 DI 물 중 용해된 44 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 44/1).
b) 2 ㎖의 DI 물 중 용해된 44 mg의 D(-)-리보스(실험 44/2).
반응 혼합물을 1 분 동안 보텍싱하고, 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안(실험 44/1) 그리고 37℃에서 11일 동안(실험 44/2) 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 각 반응 혼합물을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 40mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 만들어진 각 펠렛에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 놔두고 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 결과는 다음과 같다: a) (실험 44/1): 연질 투명 겔을 수득하였다 b) (실험 44/2) 회백색 내지 노란색을 띄는 겔을 수득하였다.
실험 시리즈 53/1-3
약 50mg의 AFHA I 150을 2mL의 DI 물 중에 용해시키고, 100 mg의 DL-글리세르알데히드를 2mL의 DI 물 중에 용해하였다. 두개의 용액을 혼합하고, 주사 바늘 없이, 주사기를 통하여 5회 압출하고, 18G 주사 바늘을 통해 2회 압출하였다. 최종적으로 혼합물을 다음 양의 에탄올로 18G 주사 바늘을 통하여 압출하였다:
a) 20 mL의 100% 에탄올(실험 53/1).
b) 30 mL의 100% 에탄올(실험 53/2).
c) 40 mL의 100% 에탄올(실험 53/3).
각각의 만들어진 교차-결합된 반응 혼합물을 인큐베이터에 두고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 각각의 용액을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 20 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 만들어진 각 펠렛에 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 놔두고 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다.
실험 시리즈 54/1
약 50mg의 AFHA I 150을 150 mg의 DL-글리세르알데히드를 함유하는 4mL의 DI 물 중에 용해시켰다. 혼합물을 반복하여 22 G 주사 바늘을 통해 압출하고(6회), 그 다음, 18G 주사 바늘을 통해 40 mL의 100% 에탄올로 압출하고, 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 후, 용액을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하고, 20 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 펠렛에 첨가하였다. 만들어진 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 놔두고 그 다음 혼합물을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다.
실험 시리즈 55/1
약 50mg의 AFHA I 150을 150 mg의 DL-글리세르알데히드를 함유하는 4mL의 DI 물 중에 용해시켰다. 혼합물을 반복하여 22 G 주사 바늘을 통해 압출하고(6회), 그 다음, 18G 주사 바늘을 통해 35 mL의 100% 에탄올 및 5 mL의 DI 물의 혼합물로 압출하였다. 반응 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간 후, 혼합물을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하고, 20 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 펠렛에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 후, 혼합물을 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 만들어진 백색 물질은 물 흡수를 보이지 않았다.
실험 시리즈 60/1
약 50mg의 AFHA I 150을 300 mg의 DL-글리세르알데히드를 함유하는 4mL의 DI 물 중에 용해시키고, 50℃에서 30 분 동안 쉐이킹(shaking)하였다. 그 다음 반응 혼합물을 주사기(주사 바늘 없이)를 통해 40 mL의 100% 에탄올로 압출하고, 만들어진 혼합물을 수조에 놓고, 50℃에서 6 시간 동안 쉐이킹하였다. 그 다음 혼합물을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 펠렛에 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 만들어진 반응 산물은 2.8 mL의 겔이다.
실험 시리즈 61/1
약 50mg의 AFHA I 150을 300 mg의 DL-글리세르알데히드를 함유하는 4mL의 DI 물 중에 용해시키고, 50℃에서 60 분 동안 쉐이킹하였다. 그 다음 반응 혼합물을 주사기(주사 바늘 없이)를 통해 40 mL의 100% 에탄올로 압출하고, 만들어진 혼합물을 수조에 놓고, 50℃에서 5 시간 동안 쉐이킹하였다. 인큐베이션 후, 혼합물을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 펠렛에 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다.
실험 시리즈 62/1
약 50mg의 AFHA I 150을 300 mg의 DL-글리세르알데히드를 함유하는 4mL의 DI 물 중에 용해시키고, 실온에서 10분 동안 쉐이킹하였다. 혼합물을 주사기를 통해 40 mL의 100% 에탄올으로 방출시키고, 수조에 놓고, 50℃에서 24 시간 동안 쉐이킹하였다. 이후, 용액을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 펠렛에 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 만들어진 산물은 1mL의 불투명 겔이다.
실험 시리즈 65/3-5
약 50mg의 AFHA I 150을 다음을 함유하는 4mL의 DI 물 중에 용해시켰다:
a) 100mg DL-글리세르알데히드(실험 65/3).
b) 200mg DL-글리세르알데히드(실험 65/4).
c) 300mg DL-글리세르알데히드(실험 65/5).
만들어진 반응 혼합물을 20G 주사 바늘을 통하여 4회 압출하고, 각각의 반응 혼합물을 주사 바늘 없이 주사기를 통하여 40 mL 100% 에탄올로 압출하고, 가온 수조에 놓고, 3 시간 동안 50℃에서 쉐이킹한 다음, 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 16 시간 동안 순환시켰다. 그 다음, 각각의 만들어진 반응 혼합물을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 만들어진 펠렛에 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 만들어진 산물은 다음의 외형을 갖는다:
a) (실험 65/3) 3.5 mL의 불투명 겔.
b) (실험 65/3) 2.5 mL의 불투명 겔.
c) (실험 65/3) 2.0 mL의 불투명 겔.
실험 시리즈 67/1-2
약 50mg의 AFHA I 150을 50 mg의 DL-글리세르알데히드를 함유하는 4mL의 DI 물 중에 용해시켰다. 물질을 주사기에서 혼합하고, 40 mL의 100% 에탄올로 방출시켰다. 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 다음 기간 동안 순환시켰다:
a) 37℃에서 2일.(실험 67/1).
b) 37℃에서 3일.(실험 67/2).
인큐베이션 기간 후, 용액을 9000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 펠렛에 첨가하였다. 그 다음, 혼합물을 9000rpm에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. 만들어진 반응 산물은: a) 2mL의 불투명 겔(실험 67/1) 및 b) 1.6 mL의 불투명 겔(실험 67/2).
실험 시리즈 67/4-6
약 50 mg의 AFHA I 150을 다음을 함유하는 4 mL DI 물 중에 용해시켰다:
a) 300 mg D(-)-리보스(실험 67/4).
b) 300 mg D(-)-아라비노스(실험 67/5).
c) 약 150 mg D(-)-에리트로스(실험 67/6).
세 혼합물을 20G 주사 바늘을 통하여 수회 압출하여 각각 주사기 내에서 혼합한 다음, 20G 주사 바늘을 통하여 40 mL의 100% 에탄올로 압출하였다. 그 다음, 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 15일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 후에, 혼합물을 9000 rpm에서 20분 동안 원심분리시키고, 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 펠렛에 첨가하고, 혼합물을 9000rpm에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. 만들어진 반응 산물은 다음과 같은 특성을 나타낸다:
a) (실험 67/4) 물 흡수 없음- 노란색을 띄는 섬유질.
b) (실험 67/5) 투명 겔.
c) (실험 67/6) 물 흡수 없음- 백색 섬유질.
실험 72/1
약 100mg의 AFHA I 150을 100 mg의 DL-글리세르알데히드를 함유하는 4mL의 DI 물 중에 용해시켰다. 만들어진 반응 혼합물을 18G 주사 바늘을 통해 4회 압출한 다음, 21G 주사 바늘을 통해 2회 압출하였다. 혼합물을 동량의 두 부분으로 나누었다. 각각의 두 부분을 21G 주사 바늘을 통해 40 mL의 100% 에탄올로 압출하였다. 만들어진 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 3일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간 후, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 만들어진 펠렛에 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 9000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 만들어진 펠렛을 결합하였다. 이 실험으로 2.1 mL의 전체(결합된) 부피의 불투명 겔을 얻었다.
실험 75/1,2
약 100mg의 DL-글리세르알데히드를 7mL의 DI 물 중에 용해시켰다. 1.5 mL의 100% 에탄올 중 100 mg의 AFHA I 150의 슬러리를 제조된 DL-글리세르알데히드 용액에 첨가하였다. 만들어진 혼합물을 18G 주사 바늘을 통한 압출로 균질화시키고(3회), 두 부분으로 나누었다. 각각의 두 부분을 21G 주사 바늘을 통해 40 mL의 10% 에탄올로 압출하였다. 만들어진 혼합물을 40mL의 100% 에탄올로 압출하였다. 그 다음 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 3일 동안 순환시켰다. 이후에, 5 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 두 혼합물에 첨가하고, 용액을 9000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 만들어진 펠렛에 첨가하였다. 그 다음 두 혼합물을 9000 rpm에서 20 분 동안 다시 원심분리하고, 두 펠렛을 결합하였다.
실험 75/3,4
약 80mg의 DL-글리세르알데히드를 7mL의 DI 물 중에 용해시켰다. 2 mL의 100% 에탄올 중 100 mg의 AFHA I 150의 슬러리를 제조된 DL-글리세르알데히드 용액에 첨가하였다. 만들어진 혼합물을 18G 주사 바늘을 통한 압출로 균질화시키고(3회), 두 부분으로 나누었다. 각각의 두 부분을 따로 40 mL의 100% 에탄올로 압출하였다. 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 3일 동안 순환시켰다. 이후에, 5 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 두 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 9000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 만들어진 펠렛에 첨가하였다. 그 다음 펠렛을 9000 rpm에서 20 분 동안 다시 원심분리하고, 만들어진 펠렛을 결합하였다.
실험 77/1
90mg의 DL-글리세르알데히드를 14mL의 DI 물 중에 용해시켰다. 5 mL의 100% 에탄올 중 100 mg의 AFHA I 150의 슬러리를 제조된 DL-글리세르알데히드 용액에 첨가하였다. 만들어진 반응 혼합물을 18G 주사 바늘을 통한 압출로 균질화시키고(3회), 두 부분으로 나누었다. 각 부분을 40 mL의 100% 에탄올로 첨가하였다. 만들어진 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 3일 동안 순환시켰다. 이후에, 5 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 9000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 만들어진 펠렛에 첨가하고 혼합하였다. 혼합물을 9000 rpm에서 20 분 동안 다시 원심분리하고, 만들어진 펠렛을 결합하였다.
키토산 교차-결합된 과정
본 실험에서 이용된 피브릴화 완충액(fibrillation buffer)을 다음과 같이 제조하였다: 6.5 리터 DI 물을 10 리터 유리관에 넣었다. 11.3 그램의 NaOH(0.04M의 최종 농도를 위해) 및 252 그램의 Na2HPO4·2H2O(0.2M 최종 농도를 위해)를 DI 물 주에서 용해시켰다. pH를 10N NaOH로 11.2로 적정하였다. 최종 pH를 pH 11.20 - 11.30의 범위까지 적정하였다(NaOH로).
실험 9/1
약 181.5 mg의 키토산을 9.6mL의 0.1N HCl 중에 용해시켰다. 14 mg의 DL-글리세르알데히드를 2.5 mL의 DI 물 중에 용해시키고, 키토산 용액과 혼합하였다. 혼합물을 1분 동안 보텍싱하고, 1mL의 피브릴화 완충액과 9.6 mL의 100% 에탄올을 교반하면서 천천히 키토산/DL-글리세르알데히드 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션의 마지막에, 1.4 mL의 DI 물 중에 용해된 28 mg의 DL-글리세르알데히드를 함유하는 용액을 혼합물에 첨가하고, 만들어진 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 추가의 24 시간 동안 순환시켰다. 그 다음 혼합물을 7000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 만들어진 펠렛을 30 mL의 1N HCl로 세척하고, 그 다음 30 mL의 DI 물로 세척하였다. 과량의 액체를 제거하기 위하여, 각 세척 단계는 샘플의 원심분리를 포함한다. 만들어진 펠렛은 확실한 겔 일관성이 있다.
실험 12/1
글리세르알데히드의 6개의 다른 용액을 다음과 같이 제조하였다:
a) 2.5mL DI 물 중 20 mg의 DL-글리세르알데히드.
b) 2.5mL DI 물 중 40 mg의 DL-글리세르알데히드.
c) 2.5mL DI 물 중 60 mg의 DL-글리세르알데히드.
d) 2.5mL DI 물 중 80 mg의 DL-글리세르알데히드.
e) 2.5mL DI 물 중 100 mg의 DL-글리세르알데히드.
각각의 만들어진 DL-글리세르알데히드 용액 a-e를 따로 0.1N HCl의 10mL에 196mg의 키토산을 용해시켜 제조된 용액과 혼합하였다. 각각의 만들어진 여섯개의 반응 혼합물을 1 분 동안 보텍싱하였다. 6개 혼합물 각각에 1mL의 피브릴화 완충액을 교반하면서 천천히 첨가한 다음, 교반하면서 천천히 70% 에탄올/DI 물 혼합물(v/v)을 첨가하였다. 그 다음 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 24 시간 인큐베이션 후, 5 mL PBS 완충액 및 2.5 mL 피브릴화 완충액을 반응 혼합물에 천천히 첨가하고, 보텍싱하였다. 그 다음, 혼합물을 37℃에서 재-인큐베이션하였다. 이차 인큐베이션하는 동안, 혼합물을 2회 취하여, 보텍싱한 다음 인큐베이터에 다시 넣었다(PBS 및 피브릴화 완충액을 첨가한 후 1 및 2 시간). 그 다음, 혼합물을 인큐베이터에 두고, 순환시켰다. 37℃에서 총 인큐베이션 시간은 48 시간이었다. 인큐베이션의 완료 후에, 6개 샘플(a-e)을 7000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 산물을 30 mL 1N HCl 후 30 mL DI 물로 세척하였다. 과량의 용매를 제거하기 위하여, 각각의 세척 단계에 샘플의 원심분리가 포함된다. 모든 다섯개의 만들어진 샘플은 아마도 당화 산물의 형성으로 인해 노란색을 띈다(반응되지 않은 키토산 용액의 초기 노란색을 띄는 색보다 더 강함). 관찰된 겔 상이 되는 분명한 상 분리는 샘플 a 및 b에서만 관찰되었다.
실험 시리즈 35/1-4
다음 네개의 다른 DL-글리세르알데히드 용액을 제조하였다:
a) 75 ㎕의 PBS 중 용해된 15 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 35/1).
b) 150 ㎕의 PBS 중 용해된 30 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 35/2).
c) 225 ㎕의 PBS 중 용해된 45 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 35/3).
d) 300 ㎕의 PBS 중 용해된 60 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 35/4).
각각의 만들어진 DL-글리세르알데히드 용액 a-d를 따로 0.1N HCl의 1mL 중에 용해된 약 20mg의 키토산의 용액과 혼합하고, 0.1N HCl을 이용하여 중화시켰다(pH 7.0으로). 각각의 만들어진 네개의 반응 혼합물을 1 분 동안 보텍싱하고, 각 보텍싱된 반응 혼합물 각각에 12 mL 100% 에탄올을 교반하면서 천천히 첨가하였다. 그 다음 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간의 완료 후, 반응 혼합물을 7000 rpm에서 15 분동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 만들어진 펠렛을 10 mL 1N HCl 후 5 mL DI 물로 세척하였다. 과량의 용매를 제거하기 위하여, 각각의 세척 단계에 샘플의 원심분리가 포함된다. 물과 키토산 겔 사이의 상 분리가 임의의 네개의 샘플 a-d(각각 실험 37/1, 37/2, 37/3 및 37/4)에서 관찰되지 않았다.
실험 시리즈 38/1-6, 및 39/1-4
20mg의 키토산을 1 mL의 0.1N HCl 중에 용해시키고, 0.1N NaCl을 이용하여 중화시켰다. 10개의 다른 DL-글리세르알데히드 용액을 다음과 같이 제조하였다:
a) 400 ㎕의 PBS 중 용해된 80 mg의 글리세르알데히드 (실험 38/1).
b) 500 ㎕의 PBS 중 용해된 100 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 38/2).
c) 600 ㎕의 PBS 중 용해된 120 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 38/3).
d) 800 ㎕의 PBS 중 용해된 160 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 38/4).
e) 1000 ㎕의 PBS 중 용해된 200 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 38/5).
f) 1200 ㎕의 PBS 중 용해된 240 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 38/6).
g) 1500 ㎕의 PBS 중 용해된 300 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 39/1).
h) 1750 ㎕의 PBS 중 용해된 350 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 39/2).
i) 2000 ㎕의 PBS 중 용해된 400 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 39/3).
j) 2500 ㎕의 PBS 중 용해된 500 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 39/4).
각각의 DL-글리세르알데히드 용액 a-j를 따로 0.1N HCl의 1mL 중에 용해된 약 20mg의 키토산을 함유하는 키토산 용액 1mL과 혼합하고, 0.1N HCl을 이용하여 중화시켰다(pH 7.0으로). 각각의 반응 혼합물을 1 분 동안 보텍싱하고, 반응 혼합물 각각에 10 mL의 100% 에탄올을 교반하면서 천천히 첨가하였다. 그 다음 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간의 완료 후, 반응 혼합물을 7000 rpm에서 15 분동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 만들어진 펠렛을 10 mL 1N HCl 후 5 mL DI 물(상기 실험 38/1-6에서) 또는 10 mL DI 물(상기 실험 39/1-4에서)로 세척하였다. 과량의 용매를 제거하기 위하여, 각각의 세척 단계에 샘플의 원심분리가 포함된다. 실험 38/1-6의 최종 반응 산물에서, 물과 교차-결합된 키토산 겔의 상 분리가 원심분리 후에 관찰되었다. 실험 38/1-6 및 39/1-4의 반응 산물의 색이 회백색 내지 노란색을 띄는 것으로 다양하게 관찰됨과 함께, 교차-링커(DL-글리세르알데히드) 농도를 증가를 위하여 만들어진 교차-결합된 키토산 겔의 물 흡수를 감소시켰다.
실험 시리즈 40/1-3
본 실험에서 조건은 g, i, 및 j를 다음과 같은 DL-글리세르알데히드 농도로 구행된 일부분 제외하고, 상기 기술된 실시예 39를 정확하게 반복하였다:
g) 1500 ㎕의 PBS 중 용해된 300 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 40/1).
i) 2000 ㎕의 PBS 중 용해된 400 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 40/2).
j) 2500 ㎕의 PBS 중 용해된 500 mg의 DL-글리세르알데히드 (실험 40/3).
반응 조건의 나머지를 상기 상세하게 기술된 바와 같은 실험 시리즈 39/1-4에서와 같이 수행하였다.
만들어진 펠렛을 산물의 팽윤 행동을 측정하는 데 이용하였다(결과를 도 9에 나타내었다).
실험 시리즈 44/3-4
a) 500 ㎕의 DI 물 중 용해된 56 mg의 DL-글리세르알데히드(실험 44/3).
b) 500 ㎕의 DI 물 중 용해된 56 mg의 D(-)-리보스(실험 44/4).
상기 a 및 b의 용액 각각을 약 100 mg의 키토산을 0.1N HCl 5 mL 중에 용해시켜 제조된 키토산 용액과 각각 혼합하고, 0.1N NaCl을 이용하여 용액을 중화시켰다. 만들어진 두개의 각각의 반응 혼합물을 1분 동안 보텍싱하고, 40 mL의 100% 에탄올과 혼합하였다. 반응 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 24 시간 동안(실험 44/3), 또는 37℃에서 12 시간 동안(실험 44/4) 순환시켰다. 두 다른 인큐베이션 기간이 완료된 다음, 반응 혼합물을 7000 rpm에서 15 분동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠렛을 40 mL의 1N HCl 다음 10 mL의 DI 물로 세척하였다. 과량의 용매를 제거하기 위하여, 각각의 세척 단계에 샘플의 원심분리가 포함된다. 두 실험으로 연질 겔이 만들어졌다. 실험 44/3에서 만들어진 겔에서, DL-글리세르알데히드 교차-결합된 겔은 실험 44/4에서 만들어진 D(-)-리보스 교차-결합된 겔의 그것보다 더 밝은 노란색을 띄는 색을 갖는다.
교차- 결합된 다당류의 분광 특성
도 1-4를 참조하였다. 도 1-3에서 나타낸 그래프에서, 수직 축은 샘플의 흡광도를 나타내며, 수평 축은 파장(nm)를 나타낸다. 도 4에 나타낸 그래프에서, 수직 축은 샘플의 흡광도를 나타내며, 수평 축은 파장(cm-1의 단위로)을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 방법의 구체예에 따라 수득된 아미노-기능화 히아루론산(AFHA)(파선 10으로 나타냄) 및, DL-글리세르알데히드 교차-결합된 AFHA(실선 20으로 나타냄)의 UV-가시 스펙트럼을 나타내는 도시적 그래프이다. 파선 곡선은 아미노 기능성 HA(AFHA I 150, 상기에서 상세히 개시된 바와 같이 제조)의 샘플의 스펙트럼을 나타내며, 실선 곡선은 상기 개시된 바와 같은 실험 72/1에서 수득된 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 산물의 스펙트럼을 나타낸다. AFHA I 150 샘플과 반대로, 교차-결합된 다당류 샘플은 225-235 nm 및 285-355에서 강한 흡광도를 보유하며, 이는 교차-결합된 반응에서 당화 산물의 형성을 나타낼 수 있다.
도 2는 본 발명의 방법의 구체예에 따라 수득된 D(-)-리보오스 교차-결합된 AFHA(파선 30으로 나타냄), D(-)-에리트로스 교차-결합된 AFHA(실선 32으로 나타냄) 및 D(-)-아라비노스 교차-결합된 AFHA(점선 34로 나타냄)의 UV-가시 스펙트럼을 나타내는 도시적 그래프이다. D(-)-리보스 교차-결합된 HA의 샘플을 실험 67/1의 샘플에서 수득하였다. D(-)-에리트로스 교차-결합된 HA의 샘플을 실험 67/6의 샘플에서 수득하였다. D(-)-아라비노스 교차-결합된 HA의 샘플을 실험 67/2의 샘플에서 수득하였다. 피크 이동은 HA를 교차-결합시키느 데 이용되는 다른 환원당의 결과일 수 있다. 각각의 당은 반응에서 형성된 최종 단백질 당화 산물(AGE)에서 영향력을 갖는 그의 고유의 특정 쇄 길이 및 형태를 갖는다.
도 3은 본 발명의 방법의 구체예에 따라 수득된, 교차-결합되지 않은 키토산(실선 40으로 나타냄), D(-)-리보스 교차-결합된 키토산(파선 42로 나타냄), 및 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 키토산(점선 44로 나타냄)의 UV-가시 스펙트럼을 나타내는 도시적 그래프이다. 비 교차-결합된 키토산(곡선 40)의 샘플을 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 Aldrich에서 수득하였다. D(-)-리보스 교차-결합된 키토산(곡선 42)를 실험 44/4의 샘플로부터 수득하였다. DL-글리세르알데히드 교차-결합된 키토산(곡선 44)의 샘플을 실험 44/3으로부터 수득하였다.
변형되지 않은(교차-결합되지 않은) 키토산과 달리, D(-)-리보스 및 DL-글리세르알데히드와 교차-결합된 키토산의 두 샘플은 대략 290nm에서 증진된 흡광도를 지닌다(당화 산물과 어쩌면 AGE의 전형적 흡광도 합을 아마도 나타냄).
도 4는 본 발명의 방법의 구체예에 따른 히아루론산(점선 46으로 나타냄), 파선 48로 나타낸 AFHA 및 실선 50으로 나타낸 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 AFHA의 푸리에 변환 적외（FTIR) 스펙트럼을 나타내는 도시적 그래프이다.
점선은 히아루론산(HA150)의 IR 스펙트럼을 나타낸다. 파선은 아미노 기능화 HA (AFHA I 150)의 IR 스펙트럼을 나타낸다. 실선은 실험 33/1에서 수득된 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 HA의 샘플의 스펙트럼을 나타낸다. 도 4의 IR 스펙트럼은 카복실기(COO-)의 흡광도 범위를 나타내며, 그의 환경에 따라 더 높거나 더 낮은 파장수(wavenumber)로 이동할 수 있는 아미드 및 아민기의 흡광도(각각 1650 cm-1 및 1560 cm-1)는 1610 - 1550 cm-1 및 1420 - 1300 cm-1 범위에서 이들 흡광도와 겹쳐진다. 또한, 1740 - 1700 cm-1의 범위에서 흡광도는 교차-결합된 후에 나타난다. 전형적으로 카복실산의 흡광도, 뿐 아니라 아미드 및 아미노산의 흡광도는 이 파장 범위에서 발견된다(1740-1700 cm-1). 이들 작용기 모두가 최종 교차-결합된 HA에 존재하기 때문에, 그들을 구별하는 것이 어렵다. 일반적으로, 상당한 흡광도 스펙트럼 변화는 본원에 개시된 교차-결합된 반응 산물에서 관찰될 수 있으며, 이용된 아미노-기능화 및 교차-결합된 산물과 당화 산물이 형성되는 동안 변형 및 화학 반응이 일어남이 강하게 제시된다.
교차- 결합된 다당류의 물리적 특성
상기에 개시된 실험에서 수득된 교차-결합된 다당류의 모든 특성을 hermo Electron Corporation GmbH, Germany에서 상업적으로 입수할 수 있는 모델 HAAKE RheoStress 600 회전 유량계에서 표준 방법을 이용하여 수행하였다. 모든 측정에서, 모델 PP 20 Ti PR 로터를 모델 MPC20/S QF 측정 플레이트 커버와 이용하였다. 23℃의 온도에서 측정을 수행하였다.
진동(oscillatory) 측정법을 이용하여 모든 유량 시험을 수행하였다. 400㎕의 시험된 물질을 유량계의 두 사각형 모양의 플레이트 사이에 넣었다. 시누소이드(Sinusoidal) 스트레스를 0.01 내지 10 Hz 사이의 진동 범위에서 모든 샘플에 적용하였다. 복합체 점성 |η*|의 얻은 값을 하기 표 2에 나타내었다. 선택된 유동 측정 결과는 도 5-7에 더 자세하게 나타내었다.
Figure 112008023708495-PCT00002
Figure 112008023708495-PCT00003
|η*|의 다중 측정된 값은 표 2의 오른쪽 부분에 나타낼 때, 첫번째 지시된 값은 최종 펠렛에서 직접 취한(또는 Restylane®, Perlane® 및 Hylaform® 샘플에서 상업적 산물 주사기에서 직접 취한) 최종 반응 산물 샘플의 측정 결과를 나타낸다. 같은 실험의 같은 샘플을 위해 나타낸(같은 줄 내에서) 다른 |η*| 측정값은 주사 바늘을 통해 샘플을 압출하거나(수치 뒤의 괄호 내에 상세하게 지시된 바와 같이) 37℃에서 특정 시간 동안 샘플을 더 인큐베이션하여(인큐베이션 시간은 수치 뒤의 괄호 내에 상세하게 기술된다), 더 처리된 같은 샘플에서 수득된 결과를 나타낸다.
일부 상업적으로 입수할 수 있는 히아루론산 기초의 매트릭스의 유동학 특성과 비교하여, 다양한 시점에서 다양한 다른 DL-글리세르알데히드 농도와 교차-결합된 AFHA 기초의 다당류의 상이한 조성물의 유동학 특성의 측정 결과를 나타낸 개략적인 그래프인 도 5-7을 참조한다. 도 5-7에서 수직 축은 복합체 점성(파스칼, |η*| )을 나타내며, 수평 축은 진동수(Hz)를 나타낸다.
도 5에서, 채워진 원은 실험 53/3의 교차-결합된 매트릭스에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다(37℃에서 24시간 동안 100mg의 글리세르알데히드와 교차-결합됨). 채워진 사각형은 실험 54/1의 교차-결합된 매트릭스에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다(37℃에서 24시간 동안 150mg의 DL-글리세르알데히드와 교차-결합됨). 채워진 삼각형은 실험 62/1의 교차-결합된 매트릭스에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다(37℃에서 24시간 동안 300mg의 DL-글리세르알데히드와 교차-결합됨). 채워지지 않은 원은 상업적으로 수득된 Perlane® (제조 번호 :7064)에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다(정확한 수치를 위해 표 2 참조).
도 5의 그래프에 나타낸 바와 같이, 동일한 반응 조건 하에서 DL-글리세르알데히드 농도의 증가는 만들어진 교차-결합된 다당류의 점성을 상당히 증가시킨다. 또한, 실험 62/1에서 유발된 교차-결합된 다당류(여기서, 300mg의 DL-글리세르알데히드가 교차-결합된 혼합물에 이용된다)는 0.1Hz 미만의 진동수에 대하여 상업적으로 입수가능한 히아루론산 기초의 Restylane®- Perlane®의 것보다 상당히 더 큰 복합체 점성 값을 갖는다.
도 6에서, 채워진 원은 실험 67/1의 교차-결합된 매트릭스에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다(37℃에서 48시간 동안 50mg의 글리세르알데히드와 교차-결합됨). 채워진 사각형은 실험 67/2의 교차-결합된 매트릭스에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다(37℃에서 72시간 동안 50mg의 DL-글리세르알데히드와 교차-결합됨). 채워지지 않은 원은 상업적으로 수득된 Perlane® (제조 번호 :7064)에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다(정확한 수치를 위해 표 2 참조).
도 6에서 보이는 바와 같이, AFHA의 교차-결합된 반응 인큐베이션 시간이 48시간에서 72시간으로 증가될 때, 교차-결합된 반응 기간이 증가하여 만들어진 HA 기초의 교차-결합된 다당류의 복합체 점성 값이 상당히 증가한다. 더욱이, 실험 67/2에서 수득된 교차-결합된 다당류(여기서, 72 시간 교차-결합된 반응이 교차-결합된 혼합물에서 이용된 50mg의 DL-글리세르알데히드와 함께 수행됨)는 0.1 Hz 미만의 진동수에서 상업적으로 입수할 수 있는 히아루론산 기초의 Restylane®- Perlane®의 그것보다 상당히 큰 복합체 점성 값을 갖는다.
도 7에서, 채워진 마름모는 실험 77/1의 교차-결합된 매트릭스에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다(37℃에서 3일 동안 40mg의 DL-글리세르알데히드와 교차-결합됨). 채워지지 않은 원은 상업적으로 수득된 Perlane®(제조 번호:7064)에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다. 채워지지 않은 사각형은 상업적으로 수득된 Restylane®(제조 번호:7349)에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다. 채워지지 않은 삼각형은 상업적으로 수득된 Hylaform® Plus 제조 번호 R040에 대하여 수득된 실험 데이터 점을 나타낸다(정확한 수치를 위하여 표 2 참조).
도 7에 나타낸 바와 같이, 세개의 상업적으로 입수할 수 있는 히아루론산 기초의 주입가능한 겔 및 실험 77/1의 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 HA 기초의 다당류의 복합체 점성 값을 비교할 때, 측정된 복합체 점성 값은 0.1-0.01 Hz의 진동수 범위에 걸쳐 실험 77/1에서 수득된 교차-결합된 물질에서 지속적으로 그리고 상당히 더 높다.
예를 들어, 0.01Hz에서, 실험 77/1에서 수득된 교차-결합된 물질의 복합체 점성은 Restylane®- Perlane® 제조 번호 7064에서 측정된 복합체 점성의 두배를 초과하고, Restylane® - 제조 번호 7349에서 측정된 복합체 점성의 3배를 초과하며, Hylaform® -Plus 제조 번호 R0409에서 측정된 복합체 점성의 8배를 초과한다.
점성값의 증가가 성형술 및 미용 목적을 위해 이용된 물질에서 특히 바람직할 수 있는 필러(filler)의 건축능과 리프팅(lifting)의 개선과 유리하게 관련될 수 있는 것이 본 분야의 숙련자에게 인지될 것이다. 본원에 개시된 개선된 겔이 뛰어난 점성 값을 갖고 있으나, 그럼에도 불구하고, 30G 주사 바늘만큼 작은 주사 바늘을 통하여 쉽게 주사가능하다.
효소 분해 저항성 분석
분해 저항성 분석을 히아루론산 분해 효소 분해 및 다음 기술된 바와 같은 우론산/카바졸 분석법을 이용하여 수행하였다: 탄수화물 분석: 본원에 모든 목적을 위하여 전체가 참조로 인용된 A Practical Approach, 2nd ed.: M. F. Chaplin and J. F. Kennedy, IRL Press at Oxford University Press, UK, 1994, (ISBN 0-19-963449-1P) pp. 324.
몇몇 상기 개시된 실험의 히아루론산 분해 실험의 결과을 하기 도 10에 나타내었다. 두 실험을 수행하였다:
첫번째 분해 실험
1a) 교차-결합된 HA 의 분해
실험 75/3에서 수득된 5개 샘플의 200㎕ 교차-결합된 아미노 기능성 HA를 250 ㎕의 NaCl(0.9%) 용액 및 DI 물 50㎕ 중 용해된 60.8 유니트의 히아루론산 분해 효소와 각각 혼합하였다. 모든 샘플을 37℃에서 인큐베이션시켰다. 분해 시작 후 연속적으로 1시간 간격에서 취한 샘플은, 1분 동안 물질을 보텍싱하여 균질화시키고, 13000rpm에서 5분 동안 Heraeus # 3325B 로터를 이용한 Heraeus "biofuge pico" 원심분리기 제품 번호. 75003280로 원심분리하였다(원심분리기 및 로터는 Kendro Laboratory Products, Germany에서 상업적으로 입수 가능). 만들어진 상층액의 250㎕를 카바졸 분석을 수행하는 데 이용하였다.
1b) Perlane ® 제조 번호 7064의 분해
5개 샘플의 200㎕의 Perlane® (제조 번호 7064)를 250 ㎕의 NaCl(0.9%) 용액 및 DI 물 50㎕ 중 용해된 60.8 유니트의 히아루론산 분해 효소와 각각 혼합하고, 샘플을 37℃에서 인큐베이션시켰다. 분해 시작 후 연속적으로 1시간 간격에서 샘플을 취했다. 제거된 샘플에서 1분 동안 물질을 보텍싱하여 균질화시키고, 13000rpm에서 5분 동안 동일한 Heraeus "biofuge pico" 원심분리기에서 원심분리하였다. 만들어진 상층액의 250㎕를 카바졸 분석을 수행하는 데 이용하였다.
카바졸 분석 과정에 따르면, 흡광도는 각 샘플에 대하여 525 nm에서 측정하였다. Perlane®의 경우에 너무 강렬한 색 반응으로 인하여, 샘플을 황산 보레이트를 이용하여 1 : 10으로 희석시킬 필요가 있다. 2시간 인큐베이션시 샘플은 카바졸 과정 동안의 과도하게 높은 온도로 인하여 두 경우 (75/3 실험 산물 및 Perlane®)에서 거부되며, 도 10의 그래프에 나타내지 않았다
DL-글리세르알데히드 교차-결합된 아미노-기능화 HA 및 상업적으로 수득한 Perlane®의 카바졸 분석 결과를 나타내는 개략적인 그래프인 도 10을 참조한다.
도 10의 그래프의 수직 축은 525 nm에서 실험 샘플의 흡광도를 나타내며, 수평 축은 분해 실험의 시작으로부터의 시간을 나타낸다. Perlane® 샘플(도 10에서 채워진 사각형으로 나타낸 데이터 점)에서 흡광도를 판독하기 전에 10배 희석된(희석되지 않은 샘플의 읽은 수 없을 정도로 높은 흡광도 때문에) 점을 고려하여, 실험 75/3에서 유발된 아미노-기능성 HA의 다른 샘플의 흡광도(도 10에서 채워진 원으로 나타낸 데이터 점)는 그들 원래대로(희석 없이) 판독하여, 실험 75/3에서 수득된 교차-결합된 아미노-기능성 HA의 샘플은 히아루론산 분해 효소에 의한 분해에 대하여 Perlane®이 보유한 저항성보다 더 큰(적어도 몇 배 더 큰) 저항성을 갖는 것이 명백하다.
Perlane®의 흡광도 값(도 11에 채워진 사각형으로 개략적으로 나타냄)을 10배로 증가시켜 Perlane® 실험 샘플을 10배 희석한 것이 보상되도록 한 도 10의 카르바졸 분석 결과를 나타내는 개략적인 그래프인 도 11을 참조한다. 도 11에서, 실험 75/3에서 유발된 아미노-기능화 HA의 샘플의 흡광도 값을 채워진 원으로 개략적으로 나타내었다. 실험 75/3에서 유발된 Perlane® 샘플의 흡광도 값을 도 11에서 채워진 원으로 나타내었다.
보통 희석된 샘플에서 수득된 흡광도 값을 간단히 증가시켜 흡광도의 정확한 값을 얻는 것이 가능하지 않다고 알려져 있지만, 이는 실험 75/3에서 수득된 교차-결합된 아미노-기능화 HA와 Perlane®의 흡광도 값 사이의 차이의 근사한 결과를 제공하기 위하여 간단히 수행된다. 이에 따라, 도 11에 나타낸 값은 나타내기 위한 목적의 대충의 근사치이며, 두 물질 사이의 흡광도의 실제 차이를 정확히 나타낼 수 없다.
두번째 분해 실험
0.1439 mg 교차-결합된 HA 또는 0.1507 mg Perlane® (제조 번호 7064)를 각각 따로 250㎕ NaCl (0.9%) 용액 및 DI 물 50㎕ 중 용해된 60.8 유니트의 히아루론산 분해 효소와 각각 혼합하였다. 두개의 만들어진 분해 반응 혼합물을 37℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 4시간 후, 1분 동안 물질을 보텍싱하여 균질화시키고, 13000rpm에서 5분 동안 Heraeus biofuge pico 원심분리기로 원심분리하였다. 상층액을 두 샘플에서 제거하고, 남아있는(분해되지 않은) 샘플량을 각 분해 샘플에 대하여 측정하였다. 실험 75/3에서 수득된 교차 결합 아미노-기능성 HA 99.5 % 및 Perlane® (제조 번호 7064) 9.3%가 원심분리하고 상층액을 제거한 후 침전물로 남아있었다. 이들 결과는 Perlane®의 상업적 샘플과 비교하여 실험 75/3에서 유발된 아미노-기능성 HA의 히아루론산 분해 효소에 대한 더욱 높은(시험관 내) 저항성을 확실하게 보여준다.
본원에 개시된 교차-결합법에 따라 제조된 당 교차-결합된 다당류 물질의 시험관내 히아루론산 분해 효소 분해에 대한 높은 저항성은 물질이 생채 내에서 생-분해에 대하여 유사하게 높은 저항성을 보유할 수 있음을 나타내며, 이는 일반적으로 및 성형적인 처리에서 조직 증대용 필러 또는 팽화제(bulking agent)로 이용되는 매트릭스에서 매우 유익하며, 특히 이식물 수명을 증가시킬 수 있고, 필요한 성형적 치료의 빈도를 감소시킬 수 있어, 치료의 전체 비용을 감소시키고, 치료의 수 및/또는 빈도 또는 필요한 주사를 감소시켜, 환자에게 개선된 편안함을 제공할 수 있다.
샘플 팽윤 실험
교차-결합된 과정에서 과량의 에탄올의 존재로 인하여, 당 교차-결합된 아미노 기능성 HA는 그의 탈수된 형태로 나타난다. 그 수화 형태와 비교하여, 교차-결합된 HA의 탈수된 형태의 부피는 무시해도 좋을 정도이다. 기술된 세척 과정(최종 세척에 의해 재-수화된 반응 산물(예를 들어, 실험 35에서 5mL의 DI 물 중)후에, 만들어진 겔을 표준 실험 튜브에 옮기고, 겔의 부피(mL)를 측정하였다.
이제 도 8-9를 참조한다. 도 8은 본 발명의 구체예에 따른, 다양한 다른 농도의 DL-글리세르알데히드와 교차-결합된 아미노 기능화 HA의 팽윤 행태의 측정 결과를 나타낸 개략적인 막대 그래프이다;
도 8의 개략적 막대 도식은 실험 35/2, 35/4, 37/4, 37/5, 37/6, 38/1, 38/2 및 38/3에서 수득된(각각 도 8에서 막대 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 및 66으로 나타냄) DL-글리세르알데히드 교차-결합된 아미노-기능화 히아루론산 샘플의 물 흡수(팽윤)의 결과를 나타낸다. 도 8의 가장 왼쪽 막대 50은 DL-글리세르알데히드를 이용한 것을 제외하고, 교차-결합 실험에서 이용된 양과 같은 양으로 AFHA80을 수화시킨 결과를 나타낸다(이러한 결과는 교차-결합되지 않은 AFHA80 샘플을 나타낸다). 도 8의 그래프의 각 막대에 대하여, 각 샘플의 교차-결합에 이용된 DL-글리세르알데히드의 양(mg)은 그래프의 수직 축에 나타내었다. 세척에 의해 반응 혼합물에서 에탄올의 제거 후에, 샘플의 물-유도 팽윤의 양의 표현으로서, 수화 후(세척에 의하여) 시험된 샘플의 부피(mL) 및 원심분리를 수평 축에 나타내었다. 도 8의 결과는 교차-결합되지 않은 AFHA80 샘플에서 최대인 더 높은 샘플 팽윤이 지속적으로 나타나며, 반응 혼합물에서 교차-링커(DL-글리세르알데히드)의 양이 증가함에 따라, 지속적으로 감소하는 것을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 구체예에 따른, 다양한 다른 농도의 DL-글리세르알데히드와 교차-결합된 키토산의 팽윤 행태의 측정 결과를 나타내는 개략적인 그래프이다. 도 9의 개략적인 막대 도식은 실험 40/1, 40/2 및 40/3에서 수득된 DL-글리세르알데히드 교차-결합된 키토산 샘플의 물 흡수(팽윤) 결과를 나타낸다(각각 도 9에서 막대 62, 64 및 66으로 나타냄). 도 9의 가장 왼쪽 막대 60은 DL-글리세르알데히드를 이용한 것을 제외하고, 교차-결합 실험 시리즈 40/1-3에서 이용된 양과 같은 양으로 교차-결합되지 않은 키토산을 수화시킨 결과를 나타낸다(교차-결합되지 않은 키토산 샘플). 키토산 샘플의 교차-결합에 이용된 DL-글리세르알데히드의 양(mg)은 그래프의 수직 축에 나타내었다. 세척에 의해 반응 혼합물에서 에탄올의 제거 후에, 샘플의 물-유도 팽윤의 양의 표현으로서, 수화 후(세척에 의하여) 샘플의 부피(mL) 및 원심분리를 수평 축에 나타내었다. 도 9의 결과는 교차-결합되지 않은 키토산 샘플에서 최대인 더 높은 샘플 팽윤이 지속적으로 나타나며, 반응 혼합물에서 교차-링커(DL-글리세르알데히드)의 양이 증가함에 따라(도 9에 나타낸 예에서, 300mg에서 400mg을 통하여 500mg까지), 지속적으로 감소하는 것을 나타낸다.
키토산 및 콜라겐의 교차-결합에 의해 제조된 혼성 매트릭스
섬유상(Fibrillar) 콜라겐은 본원에 모든 목적을 위해 전체가 인용된 미국 특허 제 6,682,760호에 상세히 기술된 바와 같이 제조하였다. 원심분리(4500rpm)하여 섬유상 콜라겐을 농축하였다.
실험 1
14.5 mL의 10 mM PBS 완충액 (pH 7.36), 5 mL의 피브릴화 완충액(상기 상세히 개시된 바와 같이 제조), 35 mL 100% 에탄올 및 500㎕ PBS 완충액 중 용해된 100 mg의 D(-)-리보스의 혼합물에 첨가된 140 mg의 피브릴화 콜라겐(fibrillated)을 각각 함유하는 3개의 다른 시험 튜브를 준비하였다.
3개의 다른 키토산 용액 a, b 및 c를 다음과 같이 제조하였다:
a) 0.1N HCl 2.5mL 중 용해된 13.5mg의 키토산
b) 0.1N HCl 5.0mL 중 용해된 27mg의 키토산
c) 0.1N HCl 10.0mL 중 용해된 54mg의 키토산
각각의 용액 a, b 및 c를 교반하면서 시험 튜브 중 콜라겐/D(-)-리보스 혼합물 중 하나에 천천히 점적 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 보텍싱하고, 인큐베이터, 37℃에서 12일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면 혼합물을 5000rpm에서 15 분동안 원심분리하였다. 모든 만들어진 반응 산물은 반죽-유사 경도(paste-like consistency)를 가진다. 키토산의 증가된 농도로, 노란색을 띄는 색의 산물은 또한 점차적으로 회백색에서 진한 노란색으로 변한다. c) 경우에서 교차-결합된 키토산의 덩어리가 반죽의 내부에서 발견된다.
실험 2
17.5 mL의 10 mM PBS 완충액 (pH 7.36), 5 mL의 피브릴화 완충액, 17.5 mL 100% 에탄올 및 300㎕의 10mM PBS 완충액 중 용해된 33 mg의 DL-글리세르알데히드의 혼합물에 첨가된 140 mg의 피브릴화 콜라겐을 각각 함유하는 3개의 다른 시험 튜브를 준비하였다.
3개의 다른 키토산 용액 a, b 및 c를 다음과 같이 제조하였다:
a) 0.1N HCl 2.5mL 중 용해된 13.5mg의 키토산
b) 0.1N HCl 5.0mL 중 용해된 27mg의 키토산
c) 0.1N HCl 10.0mL 중 용해된 54mg의 키토산
상기 각각의 용액 a, b 및 c를 교반하면서 시험 튜브 중 콜라겐/DL-글리세르알데히드 반응 혼합물 중 하나에 천천히 점적 첨가하였다. 1분 동안 추가로 보텍싱하고, 반응 혼합물을 인큐베이터, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면 혼합물을 5000rpm에서 15 분동안 원심분리하였다. 모든 만들어진 반응 산물은 반죽-유사 경도(paste-like consistency)를 가진다. 키토산의 농도가 증가함에 따라, 노란색을 띄는 색의 산물은 또한 점차적으로 회백색에서 진한 노란색으로 변한다. c) 경우에서 교차-결합된 키토산의 덩어리가 반죽의 내부에서 발견된다.
실험 7/1
9.8 mL 100% 에탄올 및 700 ㎕의 피브릴화 완충액에 용해된 14 mg의 DL-글리세르알데히드의 혼합물에 각각 108 mg의 피브릴화 콜라겐을 함유하는 다섯개의 다른 시험 튜브를 준비하고, 보텍싱하였다. 다섯개의 콜라겐/DL-글리세르알데히드 혼합물을 인큐베이터, 37℃에서 6 시간 동안 순환시켰다.
다음 다섯개의 키토산 용액도 준비하였다:
a) 3.2 mL의 0.1 N HCL 중 용해된 53 mg의 키토산
b) 4.5 mL의 0.1 N HCL 중 용해된 75.6 mg의 키토산
c) 6.4 mL의 0.1 N HCL 중 용해된 107.5 mg의 키토산
d) 8.4 mL의 0.1 N HCL 중 용해된 141 mg의 키토산
e) 9.6 mL의 0.1 N HCL 중 용해된 161.3 mg의 키토산
상기 각각의 용액 a, b, c, d 및 e를 상기 개시된 콜라겐/DL-글리세르알데히드 혼합물을 함유하는 다섯개의 시험 튜브 중 하나에 천천히 점적 첨가하였다. 1분 동안 추가로 보텍싱하고, 혼합물을 인큐베이터, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 두번째 인큐베이션 기간이 끝나면 혼합물을 5000rpm에서 15 분동안 원심분리하였다.
모든 만들어진 교차-결합된 산물은 반죽-유사 경도(paste-like consistency)를 가진다. 키토산의 농도 증가로, 노란색을 띄는 색의 산물은 또한 점차적으로 회백색에서 진한 노란색으로 변한다. 샘플 c)를 50℃에서 6 시간 동안 과량의 6N NaOH 중에 인큐베이션하여, 교차-결합되지 않은 콜라겐을 용해시켰다. 3번의 세척(DI 물)과 원심분리 단계 후, 샘플을 HCl 가수분해하고, 아미노산 분석기(통상 실험실에서)로 분석하여, 키토산에 공유 결합된 하이드록시프롤린(콜라겐을 나타냄)을 검출하였다. 하이드록시프롤린은 샘플에서 검출되었다.
실험 7/2
9.8 mL 100% 에탄올 및 700 ㎕의 피브릴화 완충액에 용해된 14 mg의 DL-글리세르알데히드의 혼합물에 각각 108 mg의 피브릴화 콜라겐을 함유하는 세개의 다른 시험 튜브를 준비하고, 보텍싱하였다.
다음 세 키톤산 용액 a, b 및 c도 준비하였다:
a) 3.2 mL의 0.1 N HCL 중 용해된 53 mg의 키토산.
b) 6.4 mL의 0.1 N HCL 중 용해된 107.5 mg의 키토산.
c) 9.6 mL의 0.1 N HCL 중 용해된 161.3 mg의 키토산.
각각의 용액 a, b 및 c를 교반하면서, 콜라겐/DL-글리세르알데히드 혼합물을 함유하는 세개의 시험 튜브 중 하나에 천천히 점적 첨가하였다. 1분 동안 추가로 보텍싱하고, 혼합물을 인큐베이터, 37℃에서 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면 혼합물을 5000rpm에서 15 분동안 원심분리하였다. 모든 만들어진 반응 산물은 반죽-유사 경도(paste-like consistency)를 가진다. 키토산의 농도 증가로, 노란색을 띄는 색의 산물은 또한 점차적으로 회백색에서 진한 노란색으로 변한다.
헤파린 아미노 기능화
500 mg의 헤파린 소듐 EP (배취 번호. 9818030)를 300 mL의 DI 물 중에 용해시켰다. 3.0 g의 아디프산 디하이드라지드 (ADH)를 혼합물에 첨가하였다. 만들어진 용액의 pH를 4.75로 적정하고, 균질 용액을 수득할 때까지 용액을 교반하였다. 400 mg의 1-에틸-3-(디메틸 아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드를 2.0mL DI 물 중에 용해시키고, 혼합물에 첨가하고, pH를 다시 실온에서 4.75로 적정하였다. 계속 4.75로 적정된 pH를 모니터하여, 반응을 모니터하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 그 다음, 용액을 투석 튜브에 넣고, 투석물에서 ADH가 검출되지 않을 때 까지 DI 물 및 DI 물/에탄올 혼합물(4:1 v/v)에 대하여 교대로 투석을 하였다. 만들어진 아미노-기능화 헤파린 소듐 EP (Heparin-M)를 이용시까지 4℃에 보관하였다.
HA 아미노-기능화 과정 II
1.4-1.8 MDa의 분자량을 갖는 2.4 g의 HA 150 (소듐 히아루로네이트 의약품 등급 150, 제품 번호. 2222003로 NovaMatrix FMC Biopolymer.Oslo, Norway에서 상업적으로 입수가능)를 2.0L의 DI 물 중에 용해시키고, 7.0g의 아디프산 디하이드라지드(ADH)를 혼합물에 첨가하였다. 만들어진 용액의 pH를 pH4.75로 적정하고, 균질한 용액을 수득할 때까지 용액을 교반하였다. 760 mg의 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드를 10.0mL DI 물 중에 용해시키고, 혼합물에 첨가하고, 실온에서 pH를 다시 4.75로 적정하였다. 계속 4.75로 적정된 pH의 변화를 모니터하여, 반응을 모니터하였다. pH의 변화가 검출되지 않을 때, 반응 혼합물을 추가의 1 시간 동안 또는 밤새 놔두었다. 그 다음, 용액을 투석 튜브에 넣고, 투석물에서 ADH가 검출되지 않을 때 까지 DI 물 및 DI 물/에탄올 혼합물(4:1 v/v)에 대하여 교대로 투석을 하였다. 투석된 용액을 3.5 리터의 100% 에탄올에 옮기고, 5g의 NaCl을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 결정화된 변형 HA를 분리하기 위하여, 용액을 7000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 만들어진 아미노-기능화 HA(AFHA II)를 이용시까지 4℃에 보관하였다.
HA 아미노-기능화 과정 III
1.4-1.8 MDa의 분자량을 갖는 2.4 g의 HA 150 (소듐 히아루로네이트 의약품 등급 150, 제품 번호. 2222003로 NovaMatrix FMC Biopolymer.Oslo, Norway에서 상업적으로 입수가능)를 2.0L의 DI 물 중에 용해시키고, 3.4g의 아디프산 디하이드라지드(ADH)를 혼합물에 첨가하였다. 만들어진 용액의 pH를 pH4.75로 적정하고, 균질한 용액을 수득할 때까지 용액을 교반하였다. 400 mg의 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드를 10.0mL DI 물 중에 용해시키고, 혼합물에 첨가하고, 실온에서 pH를 다시 4.75로 적정하였다. 계속 4.75로 적정된 pH의 변화를 모니터하여, 반응을 모니터하였다. pH의 변화가 검출되지 않을 때, 반응 혼합물을 추가의 1 시간 동안 또는 밤새 놔두었다. 그 다음, 용액을 투석 튜브에 넣고, 투석물에서 ADH가 검출되지 않을 때 까지 DI 물 및 DI 물/에탄올 혼합물(4:1 v/v)에 대하여 교대로 투석을 하였다. 투석된 용액을 3.5 리터의 100% 에탄올에 옮기고, 5g의 NaCl을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 결정화된 변형 HA를 분리하기 위하여, 용액을 7000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 만들어진 아미노-기능화 HA(AFHA III)를 이용시까지 4℃에 보관하였다.
HA 아미노-기능화 과정 IV
1.4-1.8 MDa의 분자량을 갖는 2.4 g의 HA 150 (소듐 히아루로네이트 의약품 등급 150, 제품 번호. 2222003로 NovaMatrix FMC Biopolymer.Oslo, Norway에서 상업적으로 입수가능)를 350 mL의 DI 물 중에 용해시키고, 5.0g의 아디프산 디하이드라지드(ADH)를 혼합물에 첨가하였다. 만들어진 용액의 pH를 pH 4.75로 적정하고, 균질한 용액을 수득할 때까지 용액을 교반하였다. 500 mg의 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드를 10.0mL DI 물 중에 용해시키고, 혼합물에 첨가하고, 실온에서 pH를 다시 4.75로 적정하였다. 계속 4.75로 적정된 pH의 변화를 모니터하여, 반응을 모니터하였다. pH의 변화가 검출되지 않을 때, 반응 혼합물을 추가의 1 시간 동안 또는 밤새 놔두었다. 그 다음, 용액을 투석 튜브에 넣고, 투석물에서 ADH가 검출되지 않을 때 까지 DI 물 및 DI 물/에탄올 혼합물(4:1 v/v)에 대하여 교대로 투석을 하였다. 투석된 용액을 3.5 리터의 100% 에탄올에 옮기고, 5g의 NaCl을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 결정화된 변형 HA를 분리하기 위하여, 용액을 7000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 만들어진 아미노-기능화 HA(AFHA IV)를 이용시까지 4℃에 보관하였다.
실험 시리즈 03/105/1-6
6mL의 100% 에탄올 중 152 mg AFHA I 150을 각각 함유하는 두개의 분리된 동일한 슬러리를 준비하였다.
교차-링커(D(-)-소르보스) 용액을 AFHA I 150 슬러리 하에 놓아 9 mL의 DI 물 중 용해된 900mg의 D(-)-소르보스를 함유하는 용액을 첫번째 AFHA I 150 슬러리에 첨가하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 반응 혼합물을 동량의 세 부분 1, 2 및 3으로 나누고, 만들어진 각 부분을 인큐베이터에 넣고, 다음과 같이 37℃에서 순환시켰다:
실험 03/105/1에서, 부분 1을 6일 동안 인큐베이션시켰다.
실험 03/105/2에서, 부분 2를 12일 동안 인큐베이션시켰다.
실험 03/105/3에서, 부분 3을 18일 동안 인큐베이션시켰다.
교차-링커(D(-)-프룩토스) 용액을 AFHA I 150 슬러리 하에 놓아 9 mL의 DI 물 중 용해된 900 mg의 D(-)-프룩토스를 함유하는 용액을 두번째 AFHA I150 슬러리에 첨가하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 반응 혼합물을 동량의 세 부분 4, 5 및 6으로 나누고, 만들어진 각 부분을 인큐베이터에 넣고, 다음과 같이 37℃에서 순환시켰다:
실험 03/105/4에서, 부분 4를 6일 동안 인큐베이션시켰다.
실험 03/105/5에서, 부분 5를 12일 동안 인큐베이션시켰다.
실험 03/105/6에서, 부분 6을 18일 동안 인큐베이션시켰다.
상기 반응 혼합물 1-6의 인큐베이션 후에, 40 mL의 DI 물을 반응 혼합물 1-6의 각각에 첨가하고, 혼합물을 9000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 함께 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 각각의 만들어진 펠렛에 첨가하고 혼합하였다. 혼합물을 9000 rpm에서 20 분 동안 다시 원심분리하였다. 실험 03/105/1, 03/105/1, 03/105/2, 03/105/3, 03/105/4, 03/105/5 및 03/105/6의 만들어진 펠렛에 대하여 결정된 복합체 점성 값과 펠렛에서 몇몇 관찰된 특성의 간단한 설명을 하기 표 5에 요약하였다.
실험 시리즈 03/114/1-4
실험 03/114/1
2 mL의 100% 에탄올 중 50 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. AFHA I 150 슬러리 하에 교차-링커 용액을 놓아 1.5 mL DI 물 중 50 mg D(-)-프룩토스의 용액을 슬러리에 첨가하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 반응 혼합물을 40 mL의 100% 에탄올에 부었다. 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 2일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 완료 후, 40 mL의 DI 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 9000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다.
실험 03/114/2
반응 혼합물을 4일 동안 순환시켜 인큐베이션한 것을 제외하고 상기 실험 03/114/1에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/114/3
50mg의 D(-)-소르보스를 D(-)-프룩토스 대신에 이용한 것을 제외하고 상기 실험 03/114/1에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/114/4
반응 혼합물을 2일 대신에 4일 동안 순환시켜 인큐베이션한 것을 제외하고 상기 실험 03/114/3에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/114/1 , 03/114/2, 03/114/3 및 03/114/4의 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 몇몇 관찰된 펠렛의 특성의 간단한 설명을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 시리즈 03/140/1-4
실험 03/140/1
1 mL의 100% 에탄올 중 50 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 2.0 mL DI 물 중에 300 mg D(-)-리보스를 용해시켜 교차-링커 용액을 제조하였다. 교차-링커 용액을 AFHA I 150 슬러리 하에 놓고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 시험 튜브를 보텍싱하였다. 그 다음 혼합물을 40 mL의 100% 에탄올에 부었다. 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 5일 동안 순환시켰다. 인큐베이션기간의 마지막에, 40 mL의 DI 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 만들어진 혼합물을 7000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 만들어진 펠렛을 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)으로 세척하고, 7000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 펠렛을 18G 주사 바늘을 통해 한번 그 다음 21G 주사 바늘을 통해 한번 압출하여 균질화시키고, 40 mL 생리 NaCl 용액(0.9%) 중에 보관한 다음, 7000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다. Whatman® 여과 종이 번호. 4 (제품 번호 1004 320로 Whatman, USA에서 상업적으로 입수가능)를 이용하여 펠렛을 여과하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시켰다.
실험 03/140/2
교차-링커 용액에 2.0 mL DI 물 중 용해된 50mg의 D(+)-소르보스가 함유된 것을 제외하고 상기 실험 03/140/1에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/140/3
교차-링커 용액에 2.0 mL DI 물 중 용해된 50mg의 L(+)-프룩토스가 함유된 것을 제외하고 상기 실험 03/140/1에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/140/4
교차-링커 용액에 2.0 mL DI 물 중 용해된 300mg의 D(+)-글루코스가 함유되고, 펠렛을 여과 종이를 이용하여 여과하지 않은 것을 제외하고 상기 실험 03/140/1에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/140/1 , 03/140/2, 03/140/3 및 03/140/4의 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 몇몇 관찰된 펠렛의 특성의 간단한 설명을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 03/140/6
1 mL의 100% 에탄올 중 50 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 2.0 mL DI 물 중에 300 mg D-리보스-5-포스페이트 디소듐 염 디하이드레이트를 용해시켜 교차-링커 용액을 제조하였다. 교차-링커 용액을 AFHA I 150 슬러리 층 하에 놓아, AFHA I 150 슬러리를 교차-링커 용액과 혼합시키고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 혼합물을 40 mL의 100% 에탄올에 부었다. 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 5일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 40 mL의 DI 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 만들어진 혼합물을 쉐이킹하고, 7000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 2 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)으로 2회 세척하고, 7000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 몇몇 관찰된 펠렛의 특성에 대한 간단한 설명을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 03/140/6의 결과는 교차-결합된 아미노-기능화 다당류를 위한 환원당의 이용은 단순한 환원당을 이용하는 것에 한정되지 않고, 다양한 다른 환원당 유도체를 본 발명의 교차-결합된 다당류 매트릭스 및 혼성 매트릭스를 수득하는 데에 성공적으로 이용될 수도 있는 것을 나타낸다.
실험 시리즈 03/110/1-4
실험 03/110/1
5 mL의 100% 에탄올 중 50 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 슬러리 하에 교차-링커 용액을 놓아 8 mL DI 물 중 용해된 160 mg DL-글리세르알데히드를 함유하는 교차-링커 용액과 슬러리를 혼합하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 혼합물 6.5mL을 40 mL의 100% 에탄올에 붓고, 보텍싱하였다. 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 1일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 40 mL의 DI 물과 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)을 혼합하며 반응 혼합물에 첨가하고, 만들어진 혼합물을 9000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛을 수득하였다.
실험 03/110/2
40 mL의 1-헥사놀을 40 mL의 100% 에탄올 대신 이용한 것을 제외하고 상기 실험 03/110/1에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/110/3
40 mL의 1-부타놀을 40 mL의 100% 에탄올 대신 이용한 것을 제외하고 상기 실험 03/110/1에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/110/4
40 mL의 2-프로판올을 40 mL의 100% 에탄올 대신 이용한 것을 제외하고 상기 실험 03/110/1에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/110/1, 03/110/2, 03/110/3 및 03/110/4의 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 몇몇 관찰된 펠렛의 특성의 간단한 설명을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 시리즈 03/131/2-5
실험 03/131/2
2 mL의 100% 에탄올 중 50 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 슬러리 하에 교차-링커 용액을 놓아 8 mL DI 물 중 용해된 140 mg DL-글리세르알데히드를 함유하는 교차-링커 용액과 슬러리를 혼합하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 혼합물 3.5mL을 40 mL의 에틸 아세테이트에 붓고, 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 1일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)을 혼합하며 반응 혼합물에 첨가하고, 만들어진 혼합물을 7000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 펠렛을 수득하였다.
실험 03/131/3
40 mL의 아세톤(디메틸 케톤)을 40 mL의 에틸아세테이트 대신 이용한 것을 제외하고 상기 실험 03/131/2에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/131/4
40 mL의 1-헥사놀을 40 mL의 에틸 아세테이트 대신 이용한 것을 제외하고 상기 개시된 실험 03/131/2에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 03/131/5
2 mL의 100% 에탄올 중 50 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 슬러리 하에 교차-링커 용액을 놓아 6 mL DI 물 중 용해된 140 mg DL-글리세르알데히드를 함유하는 교차-링커 용액과 슬러리를 혼합하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 혼합물 8.0mL을 40 mL의 톨루엔에 붓고, 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 6일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 반응 혼합물에 30 mL의 100% 에탄올을 첨가하고, 혼합하고, 7000rpm에서 20 분 동안 원심분리하여 톨루엔을 세척해내었다. 에탄올 세척 및 원심분리를 2회 더 수행하였다. 만들어진 펠렛을 25 mL DI 물과 20 mL 생리 NaCl 용액(0.9%)의 혼합물로 3회 세척하고, 7000rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 최종 세척 단계는 2mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%) 중에 펠렛을 재-현탁시키고, 7000rpm에서 20 분 동안 원심분리하여 수행하였다. 상층액을 제거하고, 시험을 위하여 펠렛을 보관하였다.
실험 03/131/2, 03/131/3, 03/131/4 및 03/131/5의 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 몇몇 관찰된 펠렛의 특성의 간단한 설명을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 03/146/2
2 mL의 100% 에탄올 중 100 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 100 mg의 DL-글리세르알데히드를 40.0mL의 PBS 완충 용액(10mM, pH 7.36) 중에 용해하였다. AFHA I 150 슬러리 하에 교차-링커 용액을 놓아 AFHA I 150 슬리러를 교차-링커 용액과 혼합하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 1일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 혼합물을 10,000rpm에서 15 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠렛을 40 mL DI 물에 재-현탁시키고, 만들어진 현탁액을 실온에서 12 시간 동안 두었다. 그 다음 혼합물을 7000rpm에서 10 분 동안 원심분리하고, 2mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%) 중에 펠렛을 재-현탁시키고, 7000rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 세척을 2회 수행하였다. 만들어진 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 3일 동안 두었다. 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 몇몇 관찰된 펠렛의 특성의 간단한 설명을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 시리즈 05/08/2-4
실험 05/08/2
2 mL의 100% 에탄올 중 50 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 100 mg DL-글리세르알데히드를 3mL DI 물 중에 용해시켰다. AFHA I 150 슬러리 하에 교차-링커 용액을 놓아 교차-링커 용액과 AFHA I 150 슬러리를 혼합하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 혼합물 5.0mL을 40 mL의 디클로로메탄에 붓고, 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 1일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 35 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)을 물질에 첨가하고, 혼합하고, 만들어진 현탁액을 7000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 시험하기 위하여 펠렛을 보관하였다.
실험 05/08/3
40 mL의 헥산을 40 mL의 디클로로메탄 대신 이용한 것을 제외하고 상기 실험 05/098/2에서 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 05/08/4
2 mL의 100% 에탄올 중 50 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 100 mg DL-글리세르알데히드를 3 mL DI 물 중에 용해시켰다. AFHA I 150 슬러리 하에 교차-링커 용액을 놓아 교차-링커 용액과 AFHA I 150 슬러리를 혼합하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 혼합물 5.0mL을 40 mL의 디에틸 에테르에 붓고, 만들어진 반응 혼합물을 수조에 넣고, 37℃에서 2일 동안 쉐이킹하였다. 수조 인큐베이션 기간이 끝나면, 만들어진 물질에 35 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)을 첨가하고, 물질을 현탁시키기 위하여 혼합하였다. 만들어진 현탁액을 7000rpm에서 15 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 최종 세척 단계를 40 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)으로 수행하였다. 그 다음 혼합물을 20000rpm에서 45 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다.
실험 05/08/2, 05/08/3 및 05/08/4에서 수득된 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 몇몇 관찰된 펠렛의 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
HA 를 포함하는 혼성 매트릭스의 추가예
돼지 섬유상 콜라겐을 미국 특허 제 6,682,760로에 상세히 기술된 바와 같이 제조하였다.
실험 03/94/2
5 mL의 100% 에탄올 중 80 mg AFHA I 150의 슬러리를 제조하였다. 2.5 mL DI 물 중에 용해된 40 mg DL-글리세르알데히드를 교차-링커 용액에 포함시켰다. AFHA I 150 슬러리 하에 교차-링커 용액을 놓아 교차-링커 용액과 AFHA I 150 슬러리를 혼합하였다. 또한, 0.4 mL의 피브릴화 콜라겐 스톡 용액(35mg/mL 피브릴화 용액의 농도)를 혼합물에 첨가하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 만들어진 혼합물을 보텍싱하였다. 만들어진 혼합물을 40 mL의 100% 에탄올에 첨가하였다. 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 3일 동안 회전시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 혼합물을 9000rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 남아있는 펠렛을 40 mL DI 물로 세척하고, 20000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다. 남아있는 펠렛을 25 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)과 결합시키고, 1분 동안 24000 RPM에서 turrax-균질화시켰다. 균질화 혼합물을 9000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 만들어진 펠렛을 시험하기 위하여 보관하였다. 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 만들어진 혼성 매트릭스의 펠렛에서 몇몇 관찰된 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 시리즈 04/37/23-29
100% 에탄올 중 AFHA I 150의 슬러리를 표 3에 따라 제조하였다. DL-글리세르알데히드를 하기 표 3에 개시된 양으로 1.0 mL의 DI 물 중 용해시켰다. AFHA I 150 슬러리를 계속 보텍싱하면서 2.0 mL의 피브릴화 돼지 콜라겐 용액(피브릴화 완충액 mL당 35 mg 콜라겐의 농도)에 천천히 첨가하였으며, 각 실험에서 콜라겐의 총량은 표 3에 나타내었다. 그 다음, 1mL의 교차-링커 용액을 콜라겐/AFHA 혼합물에 첨가하고, 결합된 혼합물을 0.5분 동안 24000 RPM에서 turrax-균질화시켜, 균질한 혼합물을 수득하였다. 균질화 혼합물을 40 mL의 100% 에탄올에 첨가하였다. 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 밤새 37℃에서 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 상층액을 제거하였다. 물질을 40 mL DI 물로 1회 세척하고, 6000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 6000rpm에서 15분 동안의 원심분리와 함께 40 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)으로 2회 세척하였다. 실험 04/37/23, 04/37/24, 04/37/25, 04/37/26, 04/37/27, 04/37/28 및 04/37/29에서 다른 반응 혼합물을 제조하는 데 이용된 물질의 정확한 양과 실험적으로 결정된 복합체 점성의 값을 하기 표 3에 요약하였다.
실험 04/39/30. 04/41/31, 04/44/32. 04/48/34, 04/52/35 및 04/52/36
100% 에탄올 중 AFHA I 150의 슬러리를 제조하였다. 각 실험에서 슬러리의 조성은 이하 표 3에 기술하였다. DL-글리세르알데히드(교차-링커로 이용)를 표 3에 기술된 양으로 1.0 mL의 DI 물 중 용해시켰다. 보텍싱하면서 AFHA 용액에 콜라겐 용액을 천천히 첨가하여, AFHA I 150 슬러리를 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36) 중에 현탁된 섬유상 돼지 콜라겐과 혼합하였다. 각 실험에서 사용된 피브릴화 콜라겐의 양은 표 3에 나타내었다. 그 다음, 교차-링커(DL-글리세르알데히드) 용액을 콜라겐/AFHA 혼합물에 혼합하며 첨가하였다. 모든 실험에서 만들어진 반응 혼합물을 모두 0.5분 동안 24000 RPM에서 turrax-균질화시켜, 균질한 혼합물을 수득하였다. 40 mL의 100% 에탄올을 각각의 만들어진 반응 혼합물에 첨가하였다. 만들어진 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 밤새 37℃에서 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 상층액을 제거하였다.
만들어진 각각의 펠렛을 40 mL DI 물로 1회 세척하고, 6000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 다음, 6000rpm에서 15분 동안의 원심분리와 함께 40 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)으로 2회 세척하였다. 그 다음, 각각의 세척된 펠렛을 25mL의 생리 NaCl 용액과 혼합하고, 0.5분 동안 24000 RPM에서 turrax-균질화시켰다. turrax-균질화 후, 각각의 균질화된 혼합물을 6000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 만들어진 펠렛을 시험하였다. 만들어진 펠렛 중 각각 하나의 복합체 점성을 상기 상세히 기술된 바와 같이 결정하였다. 다른 반응 혼합물을 제조하는 데 이용되는 물질의 양과 실험적으로 결정된 복합체 점성의 값을 표 3에 요약하였다.
Figure 112008023708495-PCT00004
실험 04/55/1
2 mL의 100% 에탄올 중 150 mg AFHA IV 150의 슬러리를 제조하였다. 150 mg의 D(-)-프룩토스를 5.0mL의 피브릴화 돼지 콜라겐(피브릴화 완충액 mL 당 약 3 mg 콜라겐의 농도) 중에 용해시켰다. 계속 보텍싱하면서, AFHA I 150 슬러리를 섬유상 콜라겐/D(-)-프룩토스 현탁액과 혼합하였다. 만들어진 혼합물을 24000 RPM에서 0.5분 동안 turrax-균질화시켜, 균질한 혼합물을 수득하였다. 균질한 혼합물을 35 mL의 100% 에탄올 및 0.5 mL의 아세트산(10% v/v)에 첨가하였다. 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 6 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면 상층액을 제거하였다. 남아있는 펠렛을 25 mL 생리 NaCl 용액(0.9%)과 혼합하고, 0.5분 동안 24000 RPM에서 turrax-균질화시켰다. 균질화된 혼합물을 6000 rpm에서 15 분 동안 원심분리시킨 다음, 상층액을 제거하였다. 만들어진 펠렛을 40 mL DI 물로 1회 세척하고, 6000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 다음, 40 mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)으로 2회 세척하고, 6000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 만들어진 혼성 매트릭스의 펠렛에서 몇몇 관찰된 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 03/145/2
2 mL의 100% 에탄올 중 150 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 105 mg의 DL-글리세르알데히드 및 5.0 mg의 소 심장에서의 사이토크롬 c를 3.0 mL의 DI 물에 용해시켰다. AFHA I 150 슬러리 하에 교차-링커 용액을 두어, AFHA I 150 슬러리를 교차-링커 및 단백질 용액과 혼합하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 보텍싱된 혼합물을 40 mL의 에탄올에 첨가하였다. 만들어진 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 2일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면 상층액을 제거하고, 만들어진 물질을 40 mL의 생리 NaCl 용액에 재-현탁시키고, 쉐이킹하고, 7000rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 3회 세척하였다. 18G, 22G 및 25G 주사 바늘을 통해 성공적으로 압출(주사 바늘 당 한번)하여 만들어진 펠렛을 균질화시켰다. 압출 후, 물질을 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)로 세척하고, 7000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 만들어진 혼성 매트릭스의 펠렛에서 몇몇 관찰된 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 03/145/2의 결과는 콜라겐을 제외한 단백질은 당화에 의해 아미노-기능화 다당류에 성공적으로 교차-결합될 수 있음을 나타낸다. 이는 또한 콜라겐과 실질적으로 다른 단백질을 본 발명의 혼성 교차-결합된 매트릭스를 제조하는 데 이용할 수 있는 것을 나타낸다.
상기 단백질/아미노-다당류 당화 매트릭스의 형성은 상이한 단백질을 선택하여, 만들어진 혼성 매트릭스의 유동성을 변형시키는데, 뿐 아니라, 생물적으로 활성인 단백질(이를 테면, 비제한적으로 효소, 성장 자극 또는 성장 억제 단백질, 다양한 신호 단백질 및 펩티드 등)을 매트릭스로 도입시키는 데 유익할 것이다.
실험 03/146/1
2 mL의 100% 에탄올 중 150 mg AFHA I 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 105 mg의 DL-글리세르알데히드 및 3 mL의 헤파린-M(약 40 mg)을 3.0 mL의 DI 물에 용해시켰다. AFHA I 150 슬러리 하에 교차-링커 용액을 두어, AFHA I 150 슬러리를 헤파린을 함유하는 교차-링커 용액과 혼합하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다.
혼합물을 40 mL의 100% 에탄올에 첨가하였다. 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 2일 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면 상층액을 제거하고, 만들어진 물질을 2mL의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 결합된 40 mL의 생리 NaCl 용액(0.9%)과 혼합하여 2회 세척하고, 쉐이킹하고, 7000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 18G, 22G 및 25G 주사 바늘을 통해 성공적으로 압출하여 만들어진 펠렛을 균질화시키고(주사 당 한번), 인큐베이터, 37℃에서 3 일동안 놔두었다. 만들어진 물질은 크림같으나, 견고한 불투명 겔이다.
만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 만들어진 혼성 매트릭스의 펠렛에서 몇몇 관찰된 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 03/146/1은 환원당과의 교차-결합이 다른 아미노-다당류 및 아미노-기능화 다당류(환원당에 의해 교차-결합될 수 있는 아미노기 함유) 및 그의 유도체의 다양한 혼합물에 적용될 수 있음을 나타낸다. 그러한 혼합된 교차-결합 매트릭스는 그것이 교차-결합 매트릭스 내의 다른 다당류 비율 및/또는 특정 타입을 조절하여, 그러한 혼합된 막의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성을 조절하거나 변형시킬 수 있기 때문에 유익할 수 있다.
실험 시리즈 05/02/1-2
실험 05/02/1
2 mL의 100% 에탄올 중 150 mg AFHA II 150을 함유하는 슬러리를 제조하였다. 슬러리 하에 교차-링커 용액을 두어 10 mL DI 물 중 용해된 50 mg의 DL-글리세르알데히드를 함유하는 용액을 AFHA II 150 용액과 혼합하고, 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 보텍싱하였다. 만들어진 혼합물을 40 mL의 100% 에탄올에 부었다. 만들어진 반응 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 5시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면 상층액을 제거하고, 남아있는 펠렛을 35 mL DI 물로 세척하고, 7000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 만들어진 펠렛을 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL의 생리 NaCl 용액으로 2회 세척하고, 재-현탁시키고, 7000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 그 결과 약 30 mL의 연질, 투명 겔이 되었다. 이러한 겔을 15 mL의 100% 에탄올 중에 재현탁시켜 4회 세척하고, 10000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 만들어진 펠렛을 0.5 mL 아세트산 용액(DI 물 중 10%)과 혼합된 35mL의 100% 에탄올로 옮기고, 혼합물을 37℃ 인큐베이터에 두고 24 시간 동안 순환시켰다. 인큐베이션이 끝나고, 상층액을 제거하였다. 남아있는 물질을 DI 물로 세척하고, 37℃에서 1 시간 동안 두었다. 그 다음 샘플을 10000rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 만들어진 펠렛을 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL의 생리 NaCl 용액으로 세척하고, 쉐이킹하고, 10000rpm에서 15분 원심분리하였다. 18G, 20G, 22G, 25G, 27G 및 30G 주사 바늘을 순차적으로 통과시켜 균질화시키고, 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL의 생리 NaCl 용액으로 세척하고, 쉐이킹하고, 10000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 주사기로 옮기고 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 다음, 복합체 점성을 결정하기 위하여 물질을 시험하였다.
실험 05/02/2
이용된 교차-링커 용액에 10 mL DI 물 중 용해된 100 mg의 D(-)-프룩토스가 포함되는 것을 제외하고, 상기 실험 05/02/1에 개시된 바와 같이 실험을 수행하였다. 첫번째 인큐베이션 단계로, 40 mL의 연질의 투명 겔이 수득되었다.
실험 05/02/1 및 05/02/2에서 수득된 최종 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 펠렛의 몇몇 관찰된 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 05/15/1
2 mL의 100% 에탄올 중 150 mg AFHA III 150의 슬러리를 제조하였다. 교차-링커 용액에 10 mL의 DI 물 중 용해된 150 mg의 D(-)-프룩토스를 포함시켰다.
AFHA III 150 슬러리 하에 교차-링커 용액을 두어 AFHA III 150 슬러리를 교차-링커 용액과 혼합하고, 보텍싱하여 균질한 혼합물을 수득하였다. 만들어진 혼합물을 40 mL의 100% 에탄올에 부었다. 반응 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 12시간 동안, 추가로 2일 동안 실온에서 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면 상층액을 제거하였다. 남아있는 물질을 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL DI 물로 세척하고, 8000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 만들어진 펠렛을 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 30 mL의 생리 NaCl 용액으로 세척하고, 쉐이킹하고, 10000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. Whatman® 여과 종이 번호. 113 (제품 번호 1113 320)를 이용하여 샘플을 여과하였다. 여과 후에, 샘플을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하고 시험하였다. 실험으로 약간 불투명한 겔 약 4.0 mL를 수득하였다. 실험 05/15/1에서 수득된 최종 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 펠렛의 몇몇 관찰된 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 05/18/1
2 mL의 100% 에탄올 중 150 mg AFHA III 150의 슬러리를 제조하였다. 교차-링커 용액은 7 mL의 DI 물 중 용해된 150 mg의 D(-)-프룩토스였다. AFHA III 150 슬러리 하에 교차-링커 용액을 두어 AFHA III 150 슬러리를 교차-링커 용액과 혼합하고, 보텍싱하여 균질한 혼합물을 수득하였다. 혼합물을 0.5 mL의 아세트산(DI 물 중 10%)과 혼합된 40 mL의 100% 에탄올에 부었다. 만들어진 혼합물을 인큐베이터에 놓고, 37℃에서 12시간 동안, 추가로 2일 동안 실온에서 순환시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나면 상층액을 제거하였다. 남아있는 물질을 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL DI 물로 세척하고, 8000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 만들어진 펠렛을 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 30 mL의 생리 NaCl 용액으로 세척하고, 쉐이킹하고, 10000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. Whatman® 여과 종이 번호. 113을 이용하여 샘플을 여과하고, 18 게이지 주사 바늘을 통해 압출하여 균질화하였다. 균질화 후에, 샘플을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 펠렛의 몇몇 관찰된 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 시리즈 05/22/1-4
각각 2mL의 100% 에탄올 중 75 mg AFHA IV 150을 함유하는 네개의 슬러리(슬러리 1-4)를 제조하였다. 그 다음 두개의 다른 교차-링커 용액을 다음과 같이 제조하였다:
A. 220 mg의 D(-)-프룩토스를 7 ml의 DI 물 중에 용해.
B. 140 mg의 D(-)-프룩토스를 7 mL의 DI 물 중에 용해.
샘플 1 및 3의 AFHA IV 150 슬러리(각각 실험 05/22/1 및 05/22/3)를 각각 3.5mL의 교차-링커 용액 A와 혼합하고, 샘플 2 및 4의 AFHA IV 150 슬러리(각각 실험 05/22/2 및 05/22/4)를 교차-링커 용액 B와 혼합하였다.
모든 네 샘플에서 혼합은 균질한 혼합물을 수득하기 위하여 계속 보텍싱하면서, AFHA IV 150 슬러리에 교차-링커 용액을 첨가하여 수행된다.
샘플 번호 1 및 2(각각 실험 05/22/1 및 05/22/2)를 24000 RPM에서 0.5 분 동안 turrax-균질화시켰다. 각각의 네개의 반응 혼합물을 따로 40 mL의 100% 에탄올에 부었다. 만들어진 네개의 반응 혼합물을 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 2일 동안 순환시켰다. 인큐베이션이 끝나고 상층액을 제거하였다. 남아있는 펠렛을 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL 생리 NaCl 용액으로 세척하고, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다(원심분리기: Kubota KS-8000, swinging bucket rotor RS 3000/6, Stainless steel bucket 53592). 만들어진 네개의 펠렛을 각각 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL의 생리 NaCl 용액으로 세척하고, 쉐이킹하고, 3000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 만들어진 네개의 펠렛을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 실험 05/22/1, 05/22/2, 05/22/1 및 05/22/2에서 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 펠렛의 몇몇 관찰된 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
실험 시리즈 05/23/1.2
2 mL의 100% 에탄올 중 75 mg의 AFHA IV 150의 두 슬러리를 준비하였다. 70 mg D(-)-프룩토스를 5 mL DI 물 중에 용해시켰다.
균질한 혼합물에 도달하기 위하여 AFHA IV 150 슬러리를 보텍싱하면서 교차-링커 용액을 첨가하여 각 AFHA IC 150 슬러리를 2.5 mL 교차-링커 용액으로 균일화하였다.
샘플 번호 2를 24000 RPM에서 0.5 분 동안 turrax-균질화시켰다. 각각의 혼합물을 40 mL의 에탄올에 첨가하였다. 만들어진 혼합물을 인큐베이터로 옮기고, 37℃에서 2일 동안 순환시켰다. 이후에, 상층액을 제거하였다. 잔사를 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL 생리 NaCl 용액으로 세척하고, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다(원심분리기: Kubota KS-8000, swinging bucket rotor RS 3000/6, Stainless steel bucket 53592). 만들어진 펠렛을 각각 2 mL PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.36)과 혼합된 40 mL의 생리 NaCl 용액으로 세척하고, 쉐이킹하고, 3000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 샘플을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 만들어진 펠렛에 대해 결정된 복합체 점성 값과 펠렛의 몇몇 관찰된 특성을 이하 표 5에 요약하였다.
효소적 분해 저항성 분석
모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 arbohydrate Analysis: A Practical Approach, 2nd ed.: M. F. Chaplin and J. F. Kennedy, IRL Press at Oxford University Press, UK, 1994, (ISBN 0-19-963449- 1P) pp. 324.에 개시된 바와 같이 우론산/카바졸 분석법 및 히아루론산 분해 효소 분해를 이용하여 분해 저항성 분석을 수행하였다.
상기 개시된 일부 실험의 히아루론산 분해 효소 분해 실험의 결과를 도 10에 나타내었다. 두개의 분해 실험을 수행하였다:
1a) 교차- 결합된 HA 의 분해
실험 05/02/2에서 수득된 약 100 ㎕의 교차-결합된 아미노-기능화 HA의 5개 샘플(mL 당 D(-)-프룩토스와 교차-결합된 25.6mg의 AFHA II 150의 농도)을 각각 500 ㎕의 PBS 완충 용액 (10 mM, pH 7.36) 및 10 ㎕의 DI 물 중 용해된 10 유니트의 히아루론산 분해 효소와 혼합하였다. 모든 샘플을 37℃에서 인큐베이션하였다. 정확한 샘플 부피는 하기 표 4A의 두번째 컬럼에 나타내었다. 분해 시작 후, 연속적인 1시간 간격으로 인큐베이션으로부터 샘플을 취하고, 각 제거된 샘플은 1분 동안 물질을 보텍싱하여 균질화시키고, 13000 rpm에서 15분 동안 Heraeus "biofuge pico" 원심분리기로 원심분리하였다.(제품 번호. 75003280, Heraeus # 3325B 로터를 이용, 원심분리기 및 로터는 Kendro Laboratory Products, Germany에서 상업적으로 입수 가능). 만들어진 상층액의 25㎕와 225㎕의 PBS 완충 용액 (10 mM, pH 7.36)을 카바졸 분석을 수행하는 데 이용하였다. 교차-결합된 HA 분해 시험의 결과를 표 4A에 요약하였다.
1b) Perlane ® 제조 번호 7546의 분해
20 mg/mL의 농도를 갖는 약 100㎕의 Perlane® (제조 번호 7576)의 다섯개 샘플을 500 ㎕의 PBS 완충 용액 (10 mM, pH 7.36) 및 10 ㎕의 DI 물 중 용해된 10 유니트의 히아루론산 분해 효소와 혼합하고, 샘플을 37℃에서 인큐베이션하였다. 정확한 샘플 부피는 하기 표 4B의 두번째 컬럼에 나타내었다. 분해 시작 후, 연속적인 1시간 간격으로 인큐베이션으로부터 샘플을 취하였다. 각 제거된 샘플은 1분 동안 물질을 보텍싱하여 균질화시키고, 13000 rpm에서 15분 동안 동일한 Heraeus "biofuge pico" 원심분리기로 원심분리하였다. 만들어진 상층액의 25㎕와 225㎕의 PBS 완충 용액 (10 mM, pH 7.36)을 카바졸 분석을 수행하는 데 이용하였다. 카바졸 분석 과정에 따라, 각 샘플에 대해 525nm에서 흡광도를 측정하였다.
분해 시간의 작용에 따른, 실험 05/02/02로부터 D(-)-프룩토스 교차-결합된 아미노-기능화 HA 매트릭스의 예시적 샘플 및 Perlane®의 상업적으로 수득된 샘플의 시험관 내에서 히아루론산 분해 효소 분해에 대한 % 저항성을 나타내는 개략적인 그래프인 도 12를 참조한다. 도 12의 수직 축은 히아루론산 분해 효소 분해에 대한 저항성을 나타내며(시작하는 HA 양의 퍼센트로 표현되는 시간 0에서 HA의 시작 양으로부터 특정 분해 시간 후 남아있는 HA의 양), 수평 축은 분해 시간(시)를 나타낸다. 도 12에서 곡선 70은 실험 05/02/02에서 수득된 매트릭스의 분해 결과를 나타내며, 72로 표지된 곡선은 Perlane®(제조 번호 7576)의 분해 결과를 나타낸다. 도 12의 그래프로부터, 실험 05/02/02에서 생산된 매트릭스가 Perlane®의 시험된 상업적 샘플의 저항성보다 특히 뛰어나게 히아루론산 분해 효소 분해에 대하여 저항성을 지닌다고 볼 수 있다.
예를 들어, 5 시간의 분해 후, 모든 Perlane®는 분해되었으나, 실험 05/02/02에서 생산된 매트릭스의 약 68%의 샘플은 분해되지 않은 상태로 남아있다. Perlane® 분해 시험의 결과를 표 4B에 나타내었다.
Figure 112008023708495-PCT00005
Figure 112008023708495-PCT00006
Figure 112008023708495-PCT00007
Figure 112008023708495-PCT00008
Figure 112008023708495-PCT00009
실험 05/82/1
150 mg의 AFHA II 150을 440 mL의 DI 물 중에 용해시키고, 용액을 둥근 바닥 플라스크에 옮겼다. 10 mg의 D(-)-프룩토스를 10mL의 염수 중에 용해시켰다. 만들어진 용액을 AFHA II 150 용액과 혼합하고, 만들어진 혼합물을 진공 하에서 플라스크를 회전시켜 천천히 증발시켰다. 농축된 혼합물(약 2 mL)을 가벼운 진공 하에서 37℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간이 끝나고, 30 mL의 염수를 플라스크의 내용물에 첨가하고, 진공 없이 1시간 동안 회전시켰다. 만들어진 겔을 제거하고, Whatman 종이 여과 (No. 113)를 통하여 여과하고, 염수로 겔을 희석하여 6 mL의 최종 부피가 되었다. 그 다음 물질을 16G, 18G, 2OG, 21G 및 22G 주사 바늘을 통하여 순차적으로 압출하였다. 각 압출 단계를 3회 반복하였다. 만들어진 입자는 노란색을 띄었으며, 견고한 일관성을 갖고 있었다.
실험 시리즈 09/95/1-4
실험 09/95/1
200 mg AFHA II 150의 총량을 함유하는 AFHA II 150 (1 mg/mL)의 용액의 수성 샘플을 제조하였다. 피브릴화 돼지 콜라겐(16.5 mg/mL)의 1.2 mL의 용액을 샘플에 첨가하였다. 그 다음, 10 mL 염수 중에 용해된 100 mg의 D(-)-프룩토스를 콜라겐/AFHA II 150 혼합물에 첨가하였다. 만들어진 혼합물을 터빈 교반기(turbine stirrer, IKA®-Werke, GmbH & Co., Germany에서 상업적으로 입수할 수 있는 모델 R 1312)로 800 rpm에서 1분 동안 교반하고, 스테인레스 트레이(tray)로 옮기고, 동결건조시켰다. 동결 건조 후, 샘플을 에탄올/DI 혼합물(90:10 v/v)로 덮고, 37℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 물질을 에탄올/DI 물 혼합물(90:10 v/v)로 3회 세척하고, 샘플을 배수시켜 용매를 제거하고, 샘플을 동결건조하여 건조시켰다. 2 mL의 염수를 동결 건조된 물질에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간이 끝나고, 샘플을 16G 주사 바늘을 통해 압출하고, 4 mL의 염수를 첨가하고, 물질을 다시 18G 및 20G 주사 바늘을 통해 압출하였다.
실험 09/95/2
이용된 D(-)-프룩토스의 양이 130mg이라는 것을 제외하고 상기 실험 09/95/1에 개시된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 09/95/3
이용된 D(-)-프룩토스의 양이 160mg이라는 것을 제외하고 상기 실험 09/95/1에 개시된 바와 같이 실험을 수행하였다.
실험 09/95/4
이용된 D(-)-프룩토스의 양이 100mg이고, 콜라겐이 첨가되지 않는 것을 제외하고 상기 실험 09/95/1에 개시된 바와 같이 실험을 수행하였다(이 실험은 콜라겐 없이 교차-결합된 AFHA II 150을 위한 대조군임).
실험 시리즈 09/102/1-6
AFHA II 150의 300mg 총량을 함유하는 AFHA II 150 수용액(DI 물에서 2.85 mg/mL의 농도)을 샘플을 제조하는 데 이용하였다. 피브릴화 콜라겐의 용액(피브릴화 완충액의 mL 당 16.5 mg 콜라겐의 농도) 1.8mL을 샘플 2-5(각각 실험 09/10/2-5)에 첨가하였다. 1.8 mL의 피브릴화 완충액을 콜라겐 용액 대신에 샘플 1에 첨가하였다(콜라겐이 없는 대조군-실험 09/102/1). 염수 중 D(-)-프룩토스 용액(염수 mL 당 40 mg D(-)-프룩토스의 농도) 5.0 mL을 각각의 여섯개 샘플에 첨가하고, 샘플을 혼합하였다. 모든 만들어진 반응 혼합물을 터빈 교반기로 800 rpm 에서 1분 동안 교반하고; 다른 스테인리스 트레이에 옮기고 동결건조시켰다. 동결 건조 후, 샘플 1, 2 및 3(각각 실험 09/102/1 , 09/102/2 및 09/102/3)을 에탄올/DI 물 혼합물(90:10 v:v)로 덮고, 37℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 샘플 1, 2 및 3(각각 실험 09/102/1, 09/102/2 및 09/102/3)을 에탄올/DI 물 혼합물(90:10 v/v)로 3회 세척하고, 샘플을 배수시켜 용매를 제거하고, 샘플을 동결건조하여 건조시켰다. 샘플 4, 5 및 6(각각 실험 09/102/4, 09/102/5 및 09/102/6)은 세척되지 않았다. 2 mL의 염수를 샘플 1-6의 각각에 첨가하고, 모든 샘플을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 이 끝나고, 모든 샘플을 16G 주사 바늘을 통해 1회 압출하고, 4 mL의 염수를 각 압출된 샘플에 첨가하고, 각각의 샘플을 순차적으로 18G로 한번, 그리고 20G 주사 바늘을 통해 한번 압출하였다.
실험 시리즈 09/102/1-6의 각 실험에서 이용된 물질과 반응 조건의 자세한 양은 하기 표 6에 나타내었다.
Figure 112008023708495-PCT00010
실험 09/102/1-6에서 유발된 겔의 몇몇 특성을 상기 표 5에 나타내었다.
실험 시리즈 11/40/1,2
하기 기술된 실험 11/40/1 및 11/40/2에서 이용된 키토산 베이스는 NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway에서 Protasan UP B 80/200로 상업적으로 입수할 수 있다.
실험 11/40/1
AFHA II 150의 300mg을 함유하는 AFHA II 150 수용액(1.0 mg/mL)을 제조하였다. 0.1 M HCl 중에 용해된 30 mg 키토산을 함유하는 용액(pH 5- 피브릴화 완충액을 첨가하여 적정)과 10 mL 염수 중에 용해된 330 mg의 D(-)-프룩토스를 혼합하면서, AFHA II 150 용액에 첨가하였다. 터빈 교반기로, 800rpm에서 1분 동안 혼합물을 교반하고, 스테인리스 트레이에 옮기고, 동결건조시켰다. 동결 건조후, 샘플을 에탄올/DI 물 혼합물(90:10 v:v)로 덮고, 37℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 만들어진 물질을 에탄올/DI 물 혼합물(90:10 v/v)로 3회 세척하고, 샘플을 배수시켜 용매를 제거하고, 샘플을 동결건조하여 건조시켰다. 4 mL의 염수를 동결 건조된 물질에 첨가하고, 물질을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 이 끝나고, 샘플을 16G 주사 바늘을 통해 압출하고, 8 mL의 염수를 첨가하고, 혼합물을 다시 순차적으로 18G 및 20G 주사 바늘을 통해 압출하였다.
실험 11/40/2
AFHA II 150 용액을 0.1M HCl 중 용해된 60 mg의 키토산(pH 5- 피브릴화 완충액을 첨가하여 적정) 및 10 mL 염수중 용해된 360 mg의 D(-)-프룩토스와 혼합하는 것을 제외하고, 상기 실험 11/40/1에 개시된 바와 같이 실험을 수행하였다. 만들어진 물질은 견고한 균일성을 가지며, 회백색/노란색 색을 가진다.
실험 시리즈 11/40/3-5
실험 11/40/3
AFHA II 150의 300mg을 함유하는 AFHA II 150 수용액(1.0 mg/mL)을 제조하였다. 10 mL 염수중 용해된 1.1 밀리몰(237mg)의 D(+)-글루코사민 하이드로클로라이드의 용액을 AFHA II 150 수용액과 혼합하였다. 혼합물을 터빈 교반기로, 800rpm에서 1분 동안 혼합물을 교반하고, 스테인리스 트레이에 옮기고, 동결건조시켰다. 동결 건조후, 샘플을 에탄올/DI 물 혼합물(90:10 v:v)로 덮고, 37℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 만들어진 물질을 에탄올/DI 물 혼합물(90:10 v/v)로 3회 세척하고, 배수시켜 용매를 제거하고, 샘플을 동결건조하여 건조시켰다. 4 mL의 염수를 동결 건조된 물질에 첨가하고, 물질을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션이 끝나고, 샘플을 16G 주사 바늘을 통해 압출하고, 8 mL의 염수를 첨가하고, 혼합물을 다시 순차적으로 18G 및 20G 주사 바늘을 통해 압출하였다. 만들어진 물질은 견고한 균일성을 가지며, 회백색/노란색 색을 가진다.
실험 11/40/4
이용된 환원당이 396mg(1.1 밀리몰)의 말토스 모노하이드레이트(글루코사민 하이드로클로라이드 대신에)이라는 것을 제외하고, 상기 실험 11/40/3에서 개시된 바와 같이 실험을 수행하였다. 만들어진 물질은 견고한 균일성을 가지며, 회백색/노란색의 겔이었다.
실험 11/40/5
이용된 환원 당이 396 mg(1.1 밀리몰)의 D(+)-락토스 모노하이드레이트(D(+)-글루코사민 하이드로클로라이드 대신)라는 것을 제외하고, 상기 실험 11/40/3에서 개시된 바와 같이 실험을 수행하였다. 만들어진 물질은 견고한 균일성을 가지며, 회백색/노란색의 겔이었다.
제한된 수의 환원당 타입이 상기 본원에 개시된 예시적 실험에서 이용되었으나, 많은 다른 타입의 환원당 및/또는 환원당의 유도체가 본 발명의 교차-결합된 매트릭스를 제조하기 위한 교차-링커로 이용될 수 있다. 상기 환원당은 알도스, 케토스, 2탄당, 3탄당, 4탄당, 5탄당, 6탄당, 7탄당, 8탄당, 9탄당, 10탄당, 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 리보스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 글로스, 아이도스, 갈락토스 및 탈로스, 환원 단당류, 환원 이당류, 환원 삼당류, 환원 올리고당, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 멜리비오스, 튜라노스, 트레할로스, 이소말토스, 라미나리비오스, 만노비오스 및 자일로비오스, 글리세르알데히드, 리보스, 에리트로스, 아라비노스, 소르보스, 프룩토스, 글루코스, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 교차-결합된 매트릭스를 제조하는 데 이용될 수 있는 환원당의 다른 타입은 특히 본원에 모든 목적을 위하여 전체가 참조로 인용된 미국 특허 제5,955,438호, 제6,346,515호, 및 제6,682,760호와 국제 특허 출원 WO 2003/049669호에 개시된 환원당 및 환원당 유도체이다.
본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 매트릭스를 교차-결합하는 데 적합한 환원당 유도체도 이용될 수 있으며, 상기 유도체는 D-리보스-5-포스페이트, 글루코사민 및 본 분야에 알려진 임의의 다른 타입의 환원당 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 임의의 상기 환원 당 및 그의 유도체의 에스테르 및 염이 단독으로 또는 상기 개시된 환원당 타입과 적절하게 임의로 조합되어, 이용될 수도 있다.
본 발명의 추가의 구체예에 따르면, 이용된 환원당(들)은 우회전성, 좌회전성 및 우회전성 및 좌회전성 형태의 혼합물일 수 있다. 하나 이상의 환원당의 라세미 혼합물이 이용될 수도 있다. 또한, 하나 이상의 비대칭(키랄) 탄소 원자를 함유하는 임의의 환원당이 본 발명의 방법 및 매트릭스에 이용될 수도 있으며, 다양한 광학적으로 활성인 이성체(거울상이성체) 및/또는 그의 임의의 혼합물 및 조합물을 포함한다.
본 분야의 추가의 구체예에 따르면, 하나 초과의 환원당이 하나 이상의 단백질(및 또는 임의의 목적하는 첨가제)을 지닌 아미노-기능화 다당류 및/또는 아미노-다당류의 임의의 혼합물 및/또는 아미노-기능화 다당류 및/또는 다른 아미노-다당류의 혼합물 및/또는 아미노-기능화 다당류 및/또는 아미노-다당류를 교차-결합하는 이용될 수 있다는 것이 본 분야의 숙련자에게 인지될 것이다. 예를 들어, 비-제한적인 실시예에 따라, AFHA I 150은 D(-)-리보스 및 D(+)-소르보스의 혼합물과 같이 교차-결합될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 키토산 및 AHFA I 150의 혼합물은 말토스, 글루코스 및 프룩토스를 함유하는 혼합물 중에서 교차-결합될 수 있다. 또다른 예시적인 구체예에서, AHFA, 콜라겐 및 헤파린의 혼합물은 리보스, 글루코사민 및 D-리보스-5-포스페이트를 포함하는 교차-링커의 혼합물과 교차-결합될 수 있다. 이들 구체예는 예시적으로만 주어지며, 이용된 다당류의 수와 타입과 교차-결합 반응 혼합물에 포함된 환원당의 수와 타입을 변화시켜 많은 다른 다양한 변형이 가능하다.
특정 교차-결합 반응이 제한된 예시적 범위의 용매 및 용매 혼합물을 이용하여 상기 본원에 개시되나, 본 발명의 교차-결합 반응에서 이용된 용매 시스템에서 많은 변형과 변이가 될 수 있음은 본 분야의 숙련자에게 인지될 것이다. 이에 따라, 형성하는 데 이용되는 교차-결합 반응은 수용액, 완충 수용액, 물 및/또는 수성 완충 용액 및 하나 이상의 유기 용매, 비-수용액, 이를 테면, 하나 이상의 비-수성 용매 등을 포함하는 용액 중에서 수행될 수 있다. 상기 본원에 개시된 실제 실험에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 이용된 비-수성 용매는 극성 및/또는 친수성 및/또는 물과 혼화할 수 있는 용매일 수 있을 뿐 아니라, 다양한 상이한 비-극성, 비-소수성 및 물과 실질적으로 혼화하지 않는 용매(들)도 포함할 수 있다. 원칙적으로 임의의 용매 또는 용매 조합을 함유하는 임의의 타입의 용매 시스템은 본 발명의 교차-결합 반응을 수행하는 데 이용될 수 있으나, 단, 용매의 선택에서 적당한 주의가 필요하다.
예를 들어, 용매는 바람직하게(필수적이지는 않음) 교차-결합 반응에 악영향을 주거나 방해하는 화학적 활성 그룹 또는 부분을 과량으로 함유하지 않을 것이다 (간섭하는 임의의 부작용이 비바람직하지 않거나, 실제로 수용가능하거나 심지어 바람직한 것이 아닌 한). 유사하게, 아미노-다당류 및/또는 아미노-기능화 다당류와 함께 교차-결합된 임의의 단백질 및/또는 폴리펩티드의 바람직하지 않은 변성을 피하기 위하여 이용되는 용매(들) 타입의 선택에서 주의가 취해질 것이다. 상기 주의를 염두에 두고, 거의 모든 임의의 타입의 용매 또는 용매 혼합물 또는 용매 시스템이 본 발명의 교차-결합 반응을 수행하는 데 이용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 매트릭스는 하나 이상의 단백질, 환원당 및/또는 환원당 유도체의 임의의 바람직한 조합을 지닌 아미노-기능화 다당류 및/또는 아미노-다당류의 임의의 혼합물 및/또는 아미노-기능화 다당류 및/또는 다른 아미노-다당류의 임의의 혼합물 및/또는 아미노-기능화 다당류 및/또는 아미노-다당류의 임의의 적합한 조합을 교차-결합하여 형성될 수 있다. 모든 상기 조합 및 변경은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 임의의 목적하는 출원을 위한 매트릭스를 적응시키기 위해, 상기 다양한 조합의 이용은 만들어진 교차-결합된 매트릭스의 화학적 및/또는 물리적 및/또는 유동적 및/또는 생물학적 특성을 우수하게 조정하는 데 긍정적으로 이용될 수 있다. 이에 따라, 만들어진 매트릭스의 특성은 특히 이용된 아미노-다당류 및/또는 아미노 기능화 다당류의 수 및 특성, 이용된 단백질의 수 및 타입(이용된다면), 교차-결합 환원당의 수 및 타입 그리고 매트릭스 중 함유되는 임의의 다른 첨가제의 특성에 의존될 것이다. 매트릭스 특성은 또한 특히 반응 조건, 반응 온도, pH, 이용된 용매(들)의 타입 및 반응 혼합물에 존재하고/거나 교차-결합 후 매트릭스에 첨가되는 첨가제의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받을 수 있다.
교차-결합 반응 혼합물에서 이용되는 용매(들)이 적어도 하나의 이온화가능한 염(이를 테면, 비제한적으로, 실험 09/95/1 및 실험 09/102/1 - 6의 염수 용액에서 이용된 NaCl 또는 실험 2, 12/1 및 37/1-3 및상기 본원에서 상세히 기술된 다른 실험에서 이용된 PBS)을 포함할 수 있다. 이온화가능한 염(들)은 상기 용액의 이온 세기를 조절하는 데 유용할 수 있으며, 단백질이 반응 용액의 이온 세기에 민감한 경우, 단백질을 포함하는 혼성 매트릭스를 제조하는 방법에서 유익할 수 있다. 본 분야에 알려진 임의의 적합한 이온화가능한 염(들)이 본 분야에 알려진 바와 같이 반응 용액의 이온 세기를 조절하는 데 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 이온화가능한 염의 일부 비-제한적 예는 본 분야에 알려진 바와 같이 다양한 알칼리 금속 염, 알칼리 금속 할리드, 다양한 다른 금속 설페이트 및/또는 포스페이트, 다양한 다른 암모늄 염 등을 포함한다. 그러나, 본 분야에 알려진 임의의 다른 적합한 타입의 이온화가능한 염(들)도 본 발명의 교차-결합 반응에서 이용될 수 있다.
상기 본원에서 개시된 신규한 교차-결합 반응의 산물은 다양한 다른 교차-결합된 다당류 기초의 매트릭스 및 다당류/단백질 기초의 혼성 매트릭스를 수득하는 데 이용될 수 있다. 상기 매트릭스는 주사가능한 제제의 임의의 형태 및/또는 임의의 목적하는 형태로 매트릭스의 고체 형태를 제공하기 위하여, 적절하게 처리되거나, 이로 수득될 수 있으며, 임의의 목적하는 크기 및 형태의 매트릭스 입자, 미소 구체(microsphere), 극미립자(microparticle)의 주사가능한 및 주사가능하지 않은 현탁액을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 당화 방법을 이용한 교차-결합에 의하여 수득될 수 있는 상기 개시된 다당류 기초의 임의의 매트릭스 타입(비제한적으로 다당류/단백질 혼성 매트릭스 포함)을 구성하는 매트릭스의 고체 형태는 시트, 튜브, 막, 스폰지, 플레이크, 겔, 비드, 미소구체, 극미립자 및 다른 관련 기하학적 형태를 비제한적으로 포함할 수 있다. 상기 본원에 개시된 신규한 교차-결합 반응의 산물(당 교차-결합된 다당류 및 당 교차-결합된 혼성 단백질/다당류 매트릭스 포함)은 교차-결합된 매트릭스를 추가의 처리 및/또는 하나 이상의 진행 단계에 적용하여 더 진행되고/거나 처리되고/거나 변형될 수 있다.
상기 처리 및/또는 변형은 비제한적으로, 건조, 동결-건조, 탈수, 임계점 건조, 몰드에서 몰딩(형태의 제품을 형성하기 위하여), 살균, 균질화(매트릭스의 유동 특성과 주사가능성을 변형시키거나 개선시키기 위하여), 기계적 절단(주사의 용이성과 유동적 특성을 변형시키기 위하여), 전리 방사선에 의한 조사(살균 목적 및/또는 추가의 교차-결합 수행 및/또는 다른 목적을 위하여), 전자기 방사선에 의한 조사(살균 목적 및/또는 추가의 교차-결합 수행 및/또는 다른 목적을 위하여), 약제학적으로 허용되는 비히클과 혼합(이를 테면, 조직 충전 및/또는 조직 확대 및/또는 다른 목적을 위한 주사가능한 제제 제조를 위하여), 열적 수단(가압증기멸균기(autoclaving))로 살균, 화학적 수단(이를 테면, 과산화 수소, 에틸렌 옥사이드 등을 이용한 살균)으로 살균, 첨가제 주입 및/또는 상기 진행 단계의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본원에 개시된 신규한 당 교차-결합된 매트릭스의 임의의 바람직하게 변형된 및/또는 건조된 및/또는 형태가 있는 제품 및/또는 제제를 제공하기 위하여, 상기 개시된 추가의 처리 또는 진행 단계의 임의의 적합한 조합이 임의의 적합한 순서로 이용될 수 있다. 모든 상기 개시된 처리법은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 이에 따라 이하 상세하게 기술하지 않는다.
본 발명의 혼성 매트릭스는 비제한적으로 임의의 특정 타입의 콜라겐을 이용한다. 비제한적으로, 천연 콜라겐, 섬유상 콜라겐, 섬유상 아텔로펩티드 콜라겐, 텔로펩티드 함유 콜라겐, 동결건조된 콜라겐, 동물 원으로부터 수득된 콜라겐, 인간 콜라겐, 포유동물 콜라겐, 재조합 콜라겐, 펩신처리된 콜라겐, 재구성된 콜라겐, 소 아텔로펩티드 콜라겐, 돼지 아텔로펩티드 콜라겐, 식물 종으로부터 수득된 콜라겐, 재조합 콜라겐, 유전자공학적으로 조작되거나 변형된 콜라겐, 콜라겐 I, II III, V, XI, XXIV 형, 섬유-관련 콜라겐 IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII 및 XXVI 형, 콜라겐 VIII 및 X 형, IV 형 콜라겐, VI 형 콜라겐, VII 형 콜라겐, XIII, XVII, XXIII 및 XXV 형 콜라겐, XV 및 XVIII 형 콜라겐, 유전적으로 변형된 진핵 또는 원핵 세포에 의해, 또는 유전적으로 변형된 유기체에 의해 제조된 인공적으로 생산된 콜라겐, 정제된 콜라겐 및 재구성된 정제 콜라겐, 섬유상 콜라겐의 입자, 섬유상 재구성 아테로펩티드 콜라겐, 세포 배양 배지로부터 정제된 콜라겐, 유전자공학적으로 조작된 식물에서 유래된 콜라겐, 콜라겐의 단편, 원시-콜라겐, 상기 기술된 콜라겐 타입의 임의의 조합을 포함하는 임의의 바람직한 타입의 콜라겐은 상기 본원에 개시된 바와 같이 본 발명의 혼성 매트릭스를 형성하는 데 이용될 수 있다.
본 출원에 개시된 혼성 매트릭스가 상기 실험적으로 나타낸 사이토크롬 C 및 콜라겐의 이용에 한정되지 않는 것을 본 분야의 숙련자는 인지할 것이다. 본 발명의 혼성 매트릭스는 아미노-다당류 및/또는 아미노-기능화 다당류에 추가로, 하나 이상의 환원당 교차-링커 및/또는 환원당 유도체 교차-링커에 의해 아미노-다당류 및/또는 아미노-기능화 다당류에 교차-결합될 수 있는 단백질(들) 및/또는 폴리펩티드(천연 또는 합성)의 임의의 적합한 타입을 포함하는 매트릭스를 포함할 수 있다. 상기 교차-결합가능한 단백질 또는 펩티드는 비제한적으로 콜라겐, 콜라겐 상과에서 선택된 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 효소, 구조 단백질, 혈액 유래 단백질, 당단백질, 지질단백질, 천연 단백질, 합성 단백질, 호르몬, 성장 인자, 연골 성장 촉진 단백질, 골 성장 촉진 단백질, 세포내 단백질, 세포외 단백질, 막 단백질, 엘라스틴, 피브린, 피브리노겐 및 이의 다양한 상이한 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 일면에 따르면, 본 발명의 교차-결합된 다당류 매트릭스는 적합한 약제학적 첨가제 및/또는 약제학적으로 허용되는 비히클과 함께 또는 이것 없이, 적합한 주사가능한 형태로 제제화될 수 있다. 상기 주사가능한 제제는 적합한 주사기로 패킹될 수 있다(적절한 주사 바늘과 함께 또는 이것 없이). 상기 미리-채워진, 미리-살균된 주사기는 이를 테면, 비제한적으로 주름 제거 적용, 조직 확대, 조직 충전 등과 같은 다양한 미용 및 의학적 적용에 이용될 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예에 따라, 본 발명의 매트릭스는 약제류, 약물류, 단백질, 폴리펩티드, 마취제, 항-박테리아제류, 항-미생물제, 항-바이러스제, 항균제(antifungal agent), 항-진균제(anti-mycotic agent), 항염증제, 당단백질류, 프로테오글리칸류, 글리코사미노글리칸류, 다양한 세포외 매트릭스 성분, 호르몬, 성장 인자, 형질전환 인자(transforming factor), 수용체 또는 수용체 복합체, 천연 폴리머, 합성 폴리머, DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 약물, 치료제, 항-염증제, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 형태형성 단백질(morphogenic protein), 당단백질, 점액 단백질(mucoprotein), 점액다당류, 매트릭스 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 항-염증제, 단백질, 펩티드, 호르몬, 유전 치료법을 위한 유전 물질, 핵산, 화학적으로 변형된 핵산, 올리고뉴클레오티드, 리보 핵산, 디옥시리보 핵산, 키메라 DNA/RNA 작제물, DNA 또는 RNA 프로브, 항-센스 DNA, 항-센스 RNA, 유전자, 유전자 부분, 자연 또는 인공적으로 생성된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, 세포 흡수 및 전사를 증진시키기 위해 요구되는 바이러스 및 비-바이러스 벡터, 글리코사미노글리칸, 콘드로이틴 4-설페이트, 콘드로이틴 6-설페이트, 케라틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 히아루로난, 레시틴 풍부 사이질 프로테오글리칸, 데코린(decorin), 바이글리칸(biglycan), 피브로모듈린(fibromodulin), 루미칸(lumican), 아그레칸(aggrecan), 신데칸(syndecans), 베타-글리칸, 베르시칸(versican), 센트로글리칸(centroglycan), 세르글리칸(serglycin), 피브로넥틴, 피브로글리칸, 콘드로어드헤린(chondroadherin), 피불린(fibulin), 트롬보스폰딘-5(thrombospondin-5), 효소, 효소 억제제, 항체 및 이들의 임의의 조합 및/또는 본 분야에 알려진 임의의 다른 타입의 특성 변형제 또는 물질을 비제한적으로 포함하는 제제 및 물질로 화학적 및/또는 물리적 및/또는 생물학적으로 변형될 수 있다. 상기 제제 또는 물질은 교차-결합이 완료된 다음, 매트릭스에 첨가될수 있다. 추가로 또는 선택적으로, 제제(들) 또는 물질(들)은 교차-결합전에 반응 혼합물에 첨가될 수 있으며, 그 다음 제제(들) 또는 물질(들)의 존재 하에서 교차-결합 반응을 수행하여 형성된 교차-결합 매트릭스내에서 제제(들) 또는 물질(들)을 도입하고/거나 교차-결합시켜, 매트릭스 특성을 변화시킬 수 있다.
상기 첨가된 물질은 본 분야에 알려진 바와 같이 임의의 적합한 가교제에 의하여 다당류 매트릭스에 공유 결합될 수 있다. 선택적으로 또는 추가로, 상기 변형 물질은 본원에 개시된 교차-결합 과정에서 반응 혼합물에 함유될 수 있으며, 이에 따라 교차-결합된 다당류 기초의 매트릭스 또는 혼성 매트릭스에 가두어지거나 도입될 수 있다.
매트릭스를 본 분야에 알려진 임의의 화학적 또는 생물학적 변형제에 적용하여 본원에 개시된 교차-결합 매트릭스가 더 변형될 수 있음을 본 분야의 숙련자는 인지할 것이다. 예를 들어, 교차-결합 후 교차-결합된 매트릭스 성분 상에 남아있는 일부 또는 모든 유리 작용기, 이를 테면, 아미노기 및/또는 카복실기 및/또는 하이드록실기는 매트릭스 특성을 더 조절하기 위하여 상기 그룹을 더 변형시키기 위해, 다른 화학적 그룹 또는 부분(이를 테면, 비제한적으로 아미노기 및/또는 카복실기 및/또는 하이드록실기 및/또는 니트로-기 및/또는 클로로- 및/또는 브로모- 및/또는 요오도- 기 및/또는 퍼옥소-기 및/또는 퍼요오도-기 및/또는 퍼클로로-기 및.또는 임의의 다른 화학적 그룹 및/또는 화학적 부분 등)을 화학적으로 도입하기 위하여, 화학적으로 또는 효소적으로 처리될 수 있다. 상기 가능한 교차-결합-후 변형의 예는 비제한적으로, 혼성 매트릭스의 임의의 포함된 교차-결합된 단백질 또는 폴리펩티드의 단백질 뼈대 또는 교차-결합된 매트릭스의 다당류 뼈대에서 나타나는 유리 하이드록실 또는 카복시기의 에스테르화, 다당류 또는 폴리펩티드 뼈대 상의 임의의 유리 아미노기의 아세틸화, 또는 임의의 다른 타입의 작용기의 본 분야에 알려진 화학적 또는 효소적 변형 반응을 포함할 수 있다. 그러한 변형의 화학은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 이에 따라 이후에서 자세히 설명하지 않았다.
상기 작용기 변형은 특정 목적하는 적용을 위하여 매트릭스를 적응시키기 위하여, 매트릭스 특성(이를 테면, 소수성, 친수성, 다양한 선택된 pH 레벨에서 순하전(net charge), 매트릭스 다공, 매트릭스 물 흡수능, 생체내 및/또는 시험관 내에서 효소 분해에 대한 저항성 등)을 우수하게 조정하고 더 변형시키는 데 유용할 수 있다. 변형된 매트릭스가 생체 적합성을 필요로 하는 용도를 위한 것이라면, 충분한 정도의 생체적합성을 확보하기 위하여, 변형될 화학적 그룹의 선택에서, 그리고 매트릭스 구조에 도입된 임의의 화학적 그룹의 본성에서 주의가 요구된다고 염두에 둘 것이다. 그러나 높은 생체적합성 정도를 요구하지 않는 매트릭스의 다른 적용에서, 상기 열거된 많은 그룹 및 본 분야에 알려진 임의의 다른 화학적 그룹(이를 테면, 비제한적으로 아조-기, 아지도-기, 니트로소-기 등)이 매트릭스의 구조에 도입되어, 매트릭스 구조 및 특성의 추가의 변형을 제공할 수 있다.
본 발명의 매트릭스의 추가의 구체예에 따라, 생 세포는 상기 개시되거나 본원에 개시된 방법을 이용하여 제조된 임의의 교차-결합된 매트릭스에 첨가될 수 있다. 생 세포는 교차-결합하는 동안 또는 그 후에 첨가하여 매트릭스에 함유되거나 함침된 하나 이상의 생 세포를 함유하는 교차-결합된 매트릭스를 형성할 수 있다.
본 발명의 매트릭스의 추가의 구체예에 따라, 매트릭스에 포함된 생 세포는 척추동물 연골 세포, 골아세포, 파골세포, 척추동물 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 줄기 세포 유래 성인 조직, 척추동물 선구 세포, 척추동물 섬유아세포, 하나 이상의 매트릭스 단백질, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 형태형성 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 항-염증제, 단백질, 호르몬, 펩티드를 분비하도록 유전적으로 조작된 세포, 단백질, 펩티드, 호르몬, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 형태형성 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 항-염증제, 당단백질, 점액 단백질 및 점액 다당류로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 분자에 수용체를 발현시키기 위해 조작된 하나 이상의 타입의 생 세포일 수 있다. 몇몇 타입의 다른 세포의 조합이 본 발명의 매트릭스에 포함될 수도 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, 본 출원의 방법에 의해 수득된 교차-결합된 당류 기초의 매트릭스는 다른 적용, 이를 테면, 비제한적으로 조직의 조작(생체내 및 시험관내 적용을 위해)에서 이용할 수 있는 매트릭스 골격, 약제 및 생물(생물학적으로 활성인 단백질, 유전자, 유전자 벡터 등)에서 조절된 전달 시스템, 조직 및 뼈 재생을 유도하기 위한 막, 주사가능하고/거나 이식 가능한 팽화제 및/또는 조직 팽윤 및/또는 미용 용도를 위한 보철 장치(이를 테면, 비제한적으로 주름 충진 및 다른 미용의 및 심미적 목적을 위한 주사가능한 제제), 천연 및/또는 제건설된 및/또는 인공의 기관을 위한 외피, 인공의 조직 또는 기관, 이를 테면 비제한적으로 인공 가슴의 제제를 위한 충전 물질 및 다른 천연 또는 합성 폴리머 구조, 물질 및/또는 매트릭스와, 또는 다른 천연 또는 합성 유기 및 무기 화합물 및/또는 폴리머 및/또는 상기 물질의 모든 조합과 결합된 본 발명의 교차-결합된 다당류를 포함하는 혼성 조성물의 성분으로서 이용하기에 적합할 수 있다.
상기 개시된 샘플 제제 및 많은 반응에서 이용된 완충액이 인산 완충 용액(PBS)이며 본 발명을 실행하기 위하여 필수적인 수단이 없는 것을 본 분야의 숙련자에게 인지될 것이다. 이에 따라, 많은 다른 타입의 완충액 및/또는 완충 용액 및 완충 용매를 이용한 물질 제조 과정 및/또는 본 발명의 다당류 기초의 물질 및/또는 다당류/단백질 기초의 혼성 매트릭스를 제조하기 위한 교차-결합 과정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 교차-결합 반응과 제조에 이용될 수 있는 다른 예시적인 완충액은 비제한적으로 시트르산/시트레이트 완충액, 2-(N-모포리노)에탄설폰산 (MES), 2-비스(2-하이드록시에틸)아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올 (BIS-TRIS), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산) (PIPES), 3-(N-모포리노)프로판설폰산 (MOPS), 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산 (HEPES), 및 본 분야에 아려진 많은 다른 타입의 완충액을 포함할 수 있다. 그러나 완충액이 상기 개시된 교차-결합 반응을 간섭할 수 있는 활성이 있는 화학적 그룹 또는 부분을 함유하지 않도록 하기 위하여, 완충액 조성물의 선택에서 주의가 취해져야 할 것이다. 상기 완충액 및 이용하기 위한 그 선택의 고려는 본 분야에 잘 알려져 있으며, 문헌에 광범위하게 개시되어 있고 이에 따라 본원에서 자세하게 기술하지 않았다.

Claims (35)

  1. 아미노-다당류, 아미노-기능화 다당류 및 이들의 조합에서 선택된 적어도 하나의 다당류를 적어도 하나의 환원당과 반응시켜 교차-결합된 다당류를 형성하는 것을 포함하는 교차-결합된 다당류의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 다당류가 자연적으로 발생하는 아미노-다당류, 합성 아미노-다당류, 아미노 헤테로다당류, 아미노 호모다당류, 아미노-기능화 다당류 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 아미노-기능화 히아루론산 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 아미노 기능화 히아루로난(hyaluronan) 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 키토산 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 헤파린 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 아미노 기능화 글리코사미노글리칸 및 이의 유도체 및 에스테르 및 염, 및 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 환원당이 알도스, 케토스, 알도스의 유도체, 케토스의 유도체 및 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 환원당이 2탄당, 3탄당, 4탄당, 5탄당, 6탄당, 7탄당, 8탄당, 9탄당, 10탄당 및 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하 는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 환원당은 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 리보스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 글로스(gulose), 아이도스(idose), 갈락토스 및 탈로스에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 환원당이 환원 단당류, 환원 이당류, 환원 삼당류, 환원 올리고당, 올리고당의 유도체, 단당류의 유도체, 단당류의 에스테르, 올리고당의 에스테르, 단당류의 염, 올리고당의 염 및 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 환원 이당류가 말토스, 락토스, 셀로비오스, 겐티오비오스(gentiobiose), 멜리비오스(melibiose), 튜라노스(turanose), 트레할로스(trehalose), 이소말토스, 라미나리비오스(laminaribiose), 만노비오스(mannobiose) 및 자일로비오스(xylobiose)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 환원당이 글리세르알데히드, 리보스, 에리트로스, 아라비노스, 소르보스, 프룩토스, 글루코스, D-리보스-5-포스페이트, 글루 코사민 및 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 환원당이 적어도 하나의 환원당의 우선성 형태, 적어도 하나의 환원당의 좌선성 형태 및 적어도 하나의 환원당의 우선성 형태와 좌선성 형태의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 용매 및 적어도 하나의 환원당을 포함하는 용액 중에서 적어도 하나의 다당류를 인큐베이션하여 교차-결합된 다당류를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 용액이 적어도 하나의 완충액을 포함하는 완충 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 적어도 하나의 용매가 용액의 pH를 조절하기 위한 적어도 하나의 완충액을 함유하는 완충 수성 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 적어도 하나의 용매가 용액의 이온 세기를 조절하기 위한 적어도 하나의 이온화가능 염을 포함하는 수성 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 용매가 유기 용매, 무기 용매, 극성 용매, 비극성 용매, 친수성 용매, 소수성 용매, 수혼화성 용매, 비-수혼화성 용매 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 용매가 물, 및 친수성 용매, 극성 용매, 수혼화성 용매 및 이들의 조합에서 선택된 적어도 하나의 부가 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 용매가 물, 인산-완충 용액, 에탄올, 2-프로판올, 1-부탄올, 1-헥산올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 디에틸 에테르, 헥산, 톨루엔 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 교차-결합가능한 아미노기를 지닌 적어도 하나의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 적어도 하나의 다당류 및 적어도 하나의 환원당에 첨가하여, 혼성의 교차-결합된 매트릭스를 형성하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 교차-결합가능한 아미노기를 지닌 적어도 하나의 단백질 및/또는 폴리펩티드가 콜라겐, 콜라겐 상과(superfamily)에서 선택된 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 효소, 구조 단백질, 혈액 유래 단백질, 당단백질, 지질단백 질, 천연 단백질, 합성 단백질, 호르몬, 성장 인자, 연골 성장 촉진 단백질(cartilage growth promoting protein), 골 성장 촉진 단백질(bone growth promoting prtoein), 세포내 단백질, 세포외 단백질, 막 단백질, 엘라스틴, 피브린, 피브리노겐 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 콜라겐이 천연 콜라겐, 섬유상(fibrillar) 콜라겐, 섬유상 아텔로펩티드(atelopeptide) 콜라겐, 텔로펩티드(telopeptide) 함유 콜라겐, 동결건조된 콜라겐, 동물 원으로부터 수득된 콜라겐, 인간 콜라겐, 포유동물 콜라겐, 재조합 콜라겐, 펩신처리된 콜라겐, 재구성된 콜라겐, 소 아텔로펩티드 콜라겐, 돼지 아텔로펩티드 콜라겐, 식물 종으로부터 수득된 콜라겐, 재조합 콜라겐, 유전자공학적으로 조작되거나 변형된 콜라겐, 콜라겐 I, II III, V, XI, XXIV 형, 섬유상-관련 콜라겐 IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII 및 XXVI 형, VIII 및 X 형 콜라겐, IV 형 콜라겐, VI 형 콜라겐, VII 형 콜라겐, XIII, XVII, XXIII 및 XXV 형 콜라겐, XV 및 XVIII 형 콜라겐, 유전적으로 변형된 진핵 또는 원핵 세포에 의해, 또는 유전적으로 변형된 유기체에 의해 제조된 인공적으로 생산된 콜라겐, 정제된 콜라겐 및 재구성된 정제 콜라겐, 섬유상 콜라겐 입자, 섬유상 재구성 아테로펩티드 콜라겐, 세포 배양 배지로부터 정제된 콜라겐, 유전자공학적으로 조작된 식물에서 유래된 콜라겐, 콜라겐의 단편, 원시(proto)-콜라겐, 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 첨가제를 적어도 하나의 다당류 및 적어도 하나의 환원당에 첨가하여 적어도 하나의 첨가제를 함유하는 교차-결합된 매트릭스를 형성하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 적어도 하나의 첨가제가 약제류, 약물류, 단백질, 폴리펩티드, 마취제, 항-박테리아제류, 항-미생물제, 항-바이러스제, 항균제(antifungal agent), 항-진균제(anti-mycotic agent), 항염증제, 당단백질류, 프로테오글리칸류, 글리코사미노글리칸류, 다양한 세포외 매트릭스 성분, 호르몬, 성장 인자, 형질전환 인자(transforming factor), 수용체 또는 수용체 복합체, 천연 폴리머, 합성 폴리머, DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 약물, 치료제, 항-염증제, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 형태형성 단백질(morphogenic protein), 당단백질, 점액 단백질(mucoprotein), 점액다당류, 매트릭스 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 항-염증제, 단백질, 펩티드, 호르몬, 유전 치료법을 위한 유전 물질, 핵산, 화학적으로 변형된 핵산, 올리고뉴클레오티드, 리보 핵산, 디옥시리보 핵산, 키메라 DNA/RNA 작제물, DNA 또는 RNA 프로브, 항-센스 DNA, 항-센스 RNA, 유전자, 유전자 부분, 자연 또는 인공적으로 생성된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, 세포 흡수 및 전사를 증진시키기 위해 요구되는 바이러스 및 비-바이러스 벡터, 글리코사미노글리칸, 콘드로이틴 4-설페이트, 콘드로이틴 6-설페이트, 케라틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 히아루 로난, 레시틴 풍부 사이질 프로테오글리칸, 데코린(decorin), 바이글리칸(biglycan), 피브로모듈린(fibromodulin), 루미칸(lumican), 아그레칸(aggrecan), 신데칸(syndecans), 베타-글리칸, 베르시칸(versican), 센트로글리칸(centroglycan), 세르글리칸(serglycin), 피브로넥틴, 피브로글리칸, 콘드로어드헤린(chondroadherin), 피불린(fibulin), 트롬보스폰딘-5(thrombospondin-5), 효소, 효소 억제제, 항체 및 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 교차-결합 전, 교차-결합 중, 또는 교차-결합 후에, 하나 이상의 생 세포를 적어도 하나의 다당류 및 적어도 하나의 환원당에 첨가하여, 매트릭스에 함침된 적어도 하나의 생 세포를 함유하는 교차-결합된 매트릭스를 형성하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 하나 이상의 생 세포가 척추동물 연골 세포, 골아세포, 파골세포, 척추동물 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 줄기 세포 유래 성인 조직, 척추동물 선구 세포, 척추동물 섬유아세포, 하나 이상의 매트릭스 단백질, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 형태형성 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 항-염증제, 단백질, 호르몬, 펩티드를 분비하도록 유전적으로 조작된 세포, 단백질, 펩티드, 호르몬, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 형태형성 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 항-염증제, 당단백질, 점액 단백질 및 점액 다당류로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 분자에 수용체를 발현하도록 공학적으로 조작된 하나 이상의 타입의 생 세포, 및 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 교차-결합된 다당류를 건조, 동결-건조, 탈수, 임계점 건조, 몰딩, 살균, 균질화, 기계적 절단, 전리 방사선에 의한 조사, 전자기 방사선에 의한 조사, 약제학적으로 허용되는 비히클(vehicle)과 혼합, 첨가제 주입 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 처리에 적용하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1항의 방법으로 제조된 교차-결합된 다당류.
  26. 다당류를 하나 이상의 반응물과 반응시켜 하나 이상의 아미노기를 함유하는 다당류의 유도체를 형성하는 단계; 및
    유도화 다당류를 적어도 하나의 환원당과 교차-결합하여 교차-결합된 다당류를 형성하는 단계를 포함하여, 교차-결합된 다당류를 제조하는 방법
  27. 제 26항에 있어서, 아미노기가 일차 아미노기 및 이차 아미노기에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 하나 이상의 반응물이 카보디이미드를 포함하는 것을 특 징으로 하는 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 하나 이상의 반응물이 아디프산 디하이드라지드의 존재 하에서 카보디이미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28항에 있어서, 카보디이미드가 1-에틸-3-(디메틸 아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 26항에 있어서, 적어도 하나의 환원당이 알도스, 케토스 및 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 26항에 있어서, 적어도 하나의 환원당이 글리세르알데히드, 리보스, 에리트로스, 아라비노스, 소르보스, 프룩토스, 글루코스, D-리보스-5-포스페이트, 글루코사민, 2탄당, 3탄당, 4탄당, 5탄당, 6탄당, 7탄당, 8탄당, 9탄당, 10탄당, 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 리보스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 글로스(gulose), 아이도스(idose), 갈락토스, 탈로스, 환원 단당류, 환원 이당류, 환원 삼당류, 환원 올리고당, 올리고당의 유도체, 단당류의 유도체, 단당류의 에스테르, 올리고당의 에스테르, 단당류의 염, 올리고당의 염, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 멜리비오스, 튜라노스, 트레할로스, 이소말토스, 라미나리비오스, 만노비오스 및 자일로비오스, 및 이 들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 24항의 방법에 의해 제조된 교차-결합된 다당류.
  34. 적어도 하나의 환원당을 적어도 하나의 교차-결합가능한 단백질의 존재 하에서 아미노-다당류, 아미노-기능화 다당류 및 이들의 조합에서 선택된 적어도 하나의 다당류와 교차-결합시켜, 혼성 교차-결합된 매트릭스를 형성하는 것을 포함하는 혼성 교차-결합된 매트릭스의 제조 방법.
  35. 제 34항의 방법에 의해 제조된 교차-결합된 혼성 매트릭스.
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