CN111620926B - 一种将被多糖物质吸附的蛋白质释放到溶液中的方法 - Google Patents

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Abstract

由于淀粉、糊精、糖原等多糖物质在一定温度的水溶液中的溶解性有限，部分未溶解而在溶液中呈现悬浮的状态，若同时存在蛋白质时，蛋白质会吸附在未溶解多糖物质上面，大大降低了蛋白质在溶液中的得率。本发明通过添加单糖、低聚糖、糖醇溶液或其组合，可以高效的将被未溶解多糖物质吸附的蛋白质释放到溶液中，提高溶液中蛋白的得率。

Description

一种将被多糖物质吸附的蛋白质释放到溶液中的方法
技术领域
本发明涉及将被多糖物质吸附的蛋白质释放到溶液中的方法。
背景技术
由于淀粉、糊精、糖原等多糖物质在一定温度的水溶液中的溶解性有限，在溶液中呈现悬浮的状态，由于其本身的吸附特性，若体系中同时存在蛋白质时，蛋白质会吸附在多糖物质上面，大大降低了的蛋白质的可溶性。
无细胞体外蛋白表达体系也称为体外蛋白合成系统，一般是指在细菌、真菌、植物细胞或动物细胞的裂解体系中，加入mRNA或者DNA模板、RNA聚合酶及氨基酸和ATP等组分，完成外源蛋白的快速高效翻译。体外翻译系统中表达蛋白质无需进行细胞转化、细胞培养、细胞收集和破碎步骤，是一种快速、省时、便捷的蛋白质表达方式。某些体外蛋白质合成体系的组分包含多糖物质，如淀粉、麦芽糊精等，形成了悬混的水相反应体系，反应过程中，生成的目标蛋白质会被多糖物质所吸附，某些糊精的粘稠性也易于将蛋白质吸附并包裹其中。反应结束离心后，则被吸附的蛋白质与多糖物质一起留存于沉淀物质中，大大降低了上清液中蛋白含量，提高了蛋白质提取成本。
因此，本领域迫切需要一种提高此类溶液中蛋白质可溶性的方法，从而提高蛋白回收率，降低蛋白质纯化成本。
发明内容
本发明的目的是，提供一种在含有多糖物质及蛋白质的混合物中将被多糖物质吸附的蛋白质转化为可溶态的方法，从而提高溶液中蛋白质含量。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种将被多糖物质吸附的蛋白质释放到溶液中的方法：
在含有多糖物质及蛋白质的混合物中，添加单糖、低聚糖、糖醇溶液或其组合，充分混匀孵育；所述混合物为含有多糖物质及蛋白质的水性体系，或所述水性体系经固液分离得到的沉淀物；所述水性体系中，多糖物质有部分未溶解，且所述蛋白质的至少一部分吸附于未溶解的多糖物质。
进一步的，所述的方法还包括：在充分混匀孵育后分离或检测所述蛋白质。
优选的，所述混匀孵育的温度与所述含有多糖物质及蛋白质的混合物放置的温度相同。
进一步优选的，在所述混匀孵育的温度下，所述单糖、低聚糖、糖醇溶液的浓度达到或接近该温度下的饱和浓度。
优选的，所述单糖、低聚糖、糖醇溶液用PBS缓冲液进行配置。
优选的，所述混匀孵育的方式选自旋转、搅拌、震荡、翻转或其组合。
优选的，所述多糖物质选自淀粉、糊精、糖原、纤维素、琼脂、菊糖、粘多糖之一或其组合。
优选的，所述多糖物质为含有一个或多个葡萄糖结构单元的多糖之一或其组合。
进一步优选的，所述多糖物质选自淀粉、糊精、糖原、纤维素之一或其组合。
进一步优选的，所述糊精是麦芽糊精。
优选的，所述单糖包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、赤藓糖、苏力糖、甘油醛之一或其组合；优选的，所述低聚糖是可溶性的低聚糖，包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、低聚果糖、大豆低聚糖之一或其组合；优选的，所述糖醇包括山梨醇、甘露醇、木糖醇和麦芽糖醇之一或其组合。
本发明还提供一种在体外无细胞蛋白合成体系中将被多糖物质吸附的外源蛋白解吸到溶液中的方法，包括：
(i)提供体外无细胞蛋白合成体系，添加编码外源蛋白的DNA分子模板，孵育反应体系，从而合成所述外源蛋白；
(ii)蛋白合成反应结束后，向反应后混合液中添加单糖、低聚糖、糖醇之一或其组合，充分混匀孵育。
优选的，所述的方法还包括：(iii)分离或检测所述外源蛋白。
本发明还提供一种在体外无细胞蛋白合成体系中将被多糖物质吸附的外源蛋白解吸到溶液中的方法，包括：
(i)提供体外无细胞蛋白合成体系，添加编码外源蛋白的DNA分子模板，孵育反应体系，从而合成所述外源蛋白；
(ii)蛋白合成反应结束后，从反应后混合液分离出上清液，残余沉淀物质中添加单糖、低聚糖、糖醇之一或其组合，充分混匀孵育。
优选的，所述的方法还包括：(iii)分离或检测所述外源蛋白。
优选的，所述体外无细胞蛋白合成体系包括细胞提取物，所述细胞提取物的细胞来源选自下组的一种或多种类型的细胞：大肠杆菌、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞。
有益效果
利用简单添加单糖、低聚糖、糖醇之一或其组合，将原本被多糖物质吸附而出现在沉淀中的可溶性蛋白置换到溶液中，从而提高上清液中蛋白含量，提高蛋白得率，降低蛋白纯化成本。
本发明技术方案可应用于无细胞体外蛋白合成体系，增加目标蛋白质的可溶性，提高蛋白得率。
附图说明
图1反应体系离心后的沉淀用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白tdTomato的效果。
图2反应体系离心后的沉淀用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白tdTomato前后混合液和上清液的RFU值。
图3反应体系离心后的沉淀用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白eGFP的效果。
图4反应体系离心后的沉淀用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白eGFP前后混合液和上清液的RFU值。
图5反应体系离心后的沉淀用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白mScarlet的效果。
图6反应体系离心后的沉淀用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白mScarlet前后混合液和上清液的RFU值。
图7反应体系用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白tdTomato的效果。
图8反应体系用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白tdTomato前后混合液和上清液的RFU值。
图9反应体系用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白eGFP的效果。
图10反应体系用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白eGFP前后混合液和上清液的RFU值。
图11反应体系用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白mScarlet的效果。
图12反应体系用不同糖或糖醇溶出荧光蛋白mScarlet前后混合液和上清液的RFU值。
具体实施方式
在含有糊精、淀粉、糖原等多糖物质及蛋白质的混合液中，由于糊精、淀粉等多糖物质的吸附特性，其易吸附蛋白质等物质，目标蛋白常常因吸附而表现为沉淀状态，从而影响目标蛋白在溶液中的得率。本发明通过向该混合液中添加单糖、低聚糖、糖醇溶液进行混溶孵育，可以将被吸附蛋白质重新释放到溶液中；或者通过向将该混合液固液分离后得到的沉淀物中添加单糖、低聚糖、糖醇溶液进行混溶孵育，可以将被吸附蛋白质重新释放到溶液中。通过单糖、低聚糖、糖醇溶液的助溶效果，降低了被未溶解多糖吸附的蛋白量，增加了溶液中的蛋白得率，方便了蛋白的进一步纯化，降低了成本。
本发明中的技术方案，可用于任何含有糊精、淀粉、糖原等多糖物质的混合体系，若该混合体系中有被糊精、淀粉等多糖物质吸附的组分，且需要将该组分从被吸附状态释放到溶液中，则均可通过添加单糖、低聚糖、糖醇之一或其组合来实现。其中被糊精、淀粉、糖原等多糖物质吸附的组分并不仅限于蛋白质，也可以是其它物质，只要该物质被未溶解的多糖物质吸附。
本发明的技术方案可以应用在水性体系中，也可以在非水性体系中，包括但不限于混合溶剂体系或有机溶剂体系(比如乙醇)，只要该体系中有被糊精、淀粉、糖原等多糖物质吸附的组分，且需要将该组分从被吸附状态释放到溶液中，则均可通过添加单糖、低聚糖、糖醇之一或其组合来实现。
本发明中温度对于本发明的实现无特别限制，只要在某一温度下，混合液中有未溶解的多糖物质，且多糖物质吸附了蛋白质，则通过添加单糖、低聚糖、糖醇溶液充分混匀孵育后，可在同一温度下将部分被吸附蛋白质释放到溶液中。本发明中的单糖、低聚糖、糖醇的浓度没有特殊要求，但为了实现更好的蛋白增溶效果，优选达到或接近某一实验温度下该糖或糖醇的饱和浓度。
本发明中的“体外无细胞蛋白合成体系”、“体外蛋白合成体系”、“无细胞体外蛋白表达体系”、“体外蛋白合成系统”等表述具有相同的含义。本发明的技术方案不只应用于体外无细胞蛋白合成体系，可以自由的应用于任何其它的体系中，只要该体系中有被糊精、淀粉等多糖物质吸附的组分，且需要将该组分从被吸附状态释放到溶液中，则均可通过添加单糖、低聚糖、糖醇之一或其组合来实现。
本发明中的“释放”表达的含义是将被多糖物质吸附的蛋白质与所吸附的多糖分离、解离、解吸附、解吸；从而使得被多糖物质吸附的蛋白质重新回到溶液中。
在本发明中，体外无细胞蛋白合成体系不受特别限制，往往以细胞提取物或细胞裂解液的来源进行区分，来源可以是大肠杆菌、小麦胚芽细胞、兔网织红细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞等；一种优选的无细胞蛋白合成体系为酵母体外蛋白合成体系，较佳的为克鲁维酵母体外蛋白合成体系，更佳地，乳酸克鲁维酵母体外蛋白合成体系。
本发明中，所述蛋白质或外源蛋白不受特别限制，可以选自但不限于下组：荧光素蛋白、荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、萤光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αA、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、融合蛋白、tdTomato荧光蛋白、eGFP蛋白(增强型绿色荧光蛋白)、mScarlet荧光蛋白。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。其中，各个实施例中描述核苷三磷酸混合物及氨基酸混合物的浓度，指的是混合物中单一物质浓度，而非混合物总物质浓度。实施例中以乳酸克鲁维酵母为例进行试验，但并不代表该试验仅能用于乳酸克鲁维酵母。
实施例1体外无细胞蛋白合成体系合成的目标蛋白质的增溶方法一
体外蛋白质合成反应体系：终浓度为36mM pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，49mM醋酸钾，3.7mM醋酸镁，1.8mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.8mM)，0.1mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，各自浓度均为0.1mM)，0.087g/mL的麦芽糊精，1.6mM二硫苏糖醇，2％的聚乙二醇，24mM的磷酸钾，最后加入50％体积的乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
体外蛋白质合成反应：将上述的反应体系中加入15ng/μL编码荧光蛋白tdTomato的DNA模板，混匀后放置在室温(20-30℃)的环境中反应。
不同糖或糖醇溶液的蛋白质增溶效果测试：上述反应后体系取1.5毫升，4000转4度离心10分钟，固液分离，获得离心后的沉淀。沉淀各用1毫升PBS缓冲液重悬洗涤3次，最后将沉淀平均分成6份，6000转4度离心1分钟。6份沉淀分别用不同的糖溶液(用PBS缓冲液进行配置)重悬，室温下旋转混匀2小时。测量混合液的荧光值，6000转室温离心1分钟后，取上清，测量上清的荧光值，利用上清液荧光值与混合液荧光值的比值，来确定蛋白增溶的效果，如图1、2所示。对照组使用的是不含糖或糖醇的PBS缓冲液。
荧光值测定：将待测样品放置于Envision 2120多功能酶标仪(Perkin Elmer)，检测获得相对荧光单位值(Relative Fluorescence Unit,RFU)。
同样的，基于上述同样的反应体系及检测方法，另外两种荧光蛋白分别为eGFP蛋白的测试结果如图3和图4所示；mScarlet蛋白的测试结果如图5和图6所示。使用不同的糖或糖醇溶液，其上清液与混合液的RFU比值如图2、4、6所示。对照组使用的是不含糖及糖醇的PBS缓冲液。
从图1-6可以看到，在使用的糖或糖醇溶液中，蔗糖、麦芽糖、山梨醇、葡萄糖效果相对较好。
实施例2体外无细胞蛋白合成体系合成的目标蛋白质的增溶方法二
体外蛋白质合成反应体系：终浓度为36mM pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，49mM醋酸钾，3.7mM醋酸镁，1.8mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.8mM)，0.1mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，各自浓度均为0.1mM)，0.087g/mL的麦芽糊精，1.6mM二硫苏糖醇，2％的聚乙二醇，24mM的磷酸钾，最后加入50％体积的乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
体外蛋白质合成反应：将上述的反应体系中加入15ng/μL编码tdTomato的DNA模板，混匀后放置在室温(20-30℃)的环境中反应5小时。
不同糖溶液的蛋白质增溶效果测试：上述反应后体系混匀后平均分成8份，按照1:1的体积比，分别加入糖或糖醇溶液(用PBS缓冲液进行配置)，室温下混匀孵育1小时，而后6000转室温离心1分钟，测量离心前后的总反应物混合液和上清的荧光值，如图7、8所示。对照组使用的是不含糖及糖醇的PBS缓冲液。
同样的，基于上述同样的反应体系及检测方法，另外两种荧光蛋白分别为eGFP蛋白的测试结果如图9和图10所示；mScarlet蛋白的测试结果如图11和图12所示。添加不同的糖或糖醇溶液，其上清液与混合液的RFU比值如图8、10、12所示。对照组使用的是不含糖或糖醇的PBS缓冲液。
从图7-12可以看到，与对照例相比，在使用了糖或糖醇溶液后，上清液/混合液的荧光值之比明显变大，说明了上清液中蛋白得率的提升。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种将被多糖物质吸附的蛋白质释放到溶液中的方法，其特征在于：
在含有多糖物质及蛋白质的混合物中，添加单糖、低聚糖、糖醇溶液或其组合，充分混匀孵育；
所述混合物为含有多糖物质及蛋白质的水性体系，或所述水性体系经固液分离得到的沉淀物；
所述水性体系中，多糖物质有部分未溶解，且所述蛋白质的至少一部分吸附于未溶解的多糖物质，
其中，所述单糖为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、赤藓糖、苏力糖之一或其组合；所述低聚糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、低聚果糖、大豆低聚糖之一或其组合；所述糖醇包括山梨醇、甘露醇、木糖醇和麦芽糖醇之一或其组合，
所述水性体系为包含乳酸克鲁维酵母细胞提取物的体外无细胞蛋白合成反应后体系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：在充分混匀孵育后分离或检测所述蛋白质。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混匀孵育的温度与所述含有多糖物质及蛋白质的混合物放置的温度相同。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述混匀孵育的温度下，所述单糖、低聚糖、糖醇溶液的浓度达到或接近该温度下的饱和浓度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单糖、低聚糖、糖醇溶液用PBS缓冲液进行配置。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述多糖物质选自含有一个或多个葡萄糖结构单元的多糖之一或其组合。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述多糖物质选自淀粉、糊精、糖原、纤维素之一或其组合。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述糊精是麦芽糊精。
9.一种在体外无细胞蛋白合成体系中将被多糖物质吸附的外源蛋白解吸到溶液中的方法，其特征在于，包括：
(i)提供体外无细胞蛋白合成体系，添加编码外源蛋白的DNA分子模板，孵育反应体系，从而合成所述外源蛋白；
(ii) 蛋白合成反应结束后，向反应后混合液中添加单糖、低聚糖、糖醇之一或其组合，充分混匀孵育，
其中，所述单糖为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、赤藓糖、苏力糖之一或其组合；所述低聚糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、低聚果糖、大豆低聚糖之一或其组合；所述糖醇包括山梨醇、甘露醇、木糖醇和麦芽糖醇之一或其组合，
所述体外无细胞蛋白合成反应体系包含乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：(iii)分离或检测所述外源蛋白。
11.一种在体外无细胞蛋白合成体系中将被多糖物质吸附的外源蛋白解吸到溶液中的方法，其特征在于，包括：
(i)提供体外无细胞蛋白合成体系，添加编码外源蛋白的DNA分子模板，孵育反应体系，从而合成所述外源蛋白；
(ii) 蛋白合成反应结束后，从反应后混合液分离出上清液，残余沉淀物质中添加单糖、低聚糖、糖醇之一或其组合，充分混匀孵育，
其中，所述单糖为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、赤藓糖、苏力糖之一或其组合；所述低聚糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、低聚果糖、大豆低聚糖之一或其组合；所述糖醇包括山梨醇、甘露醇、木糖醇和麦芽糖醇之一或其组合，
所述体外无细胞蛋白合成体系包括细胞提取物，所述细胞提取物的细胞来源选自乳酸克鲁维酵母细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：(iii)分离或检测所述外源蛋白。
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