CN111334502A

CN111334502A - 一种快速提取b族链球菌核酸的方法

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Publication number: CN111334502A
Application number: CN202010187391.8A
Authority: CN
Inventors: 周秋霞; 陈永恒; 冯颖仪; 陈润章; 谭杰峰
Original assignee: Guangzhou Yixin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Yixin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2020-06-26

Abstract

本发明提供了一种提取B族链球菌DNA的试剂盒，包括如下组分：裂解液、蛋白酶K、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液以及96孔板；所述裂解液为包括盐酸胍的混合溶液；所述洗涤液1为含有高氯酸钠的乙醇水溶液；所述洗涤液2为无水乙醇；所述洗脱液为Tris‑Cl缓冲溶液。本发明提供的试剂盒通过预分装的方法，实现了自动化，摆脱了纯手工提取的方法，很大程度上节省了成本。本发明的通过双孔裂解，使得样本量数量不仅仅局限于250微升，有利于获得更多的核酸。本发明解决了传统方法操作多个样本非常耗时的问题，此方法可以同时操作48个样本，提取时间为45分钟。

Description

一种快速提取B族链球菌核酸的方法

技术领域

本发明属于分子微生物学领域，具体涉及一种快速提取B族链球菌核酸的方法。

背景技术

B族链球菌，学名无乳链球菌(S.agalactiae)，革兰氏阳性菌，完全溶血型。因其细胞壁中多糖物质又属于抗原构造分类中的B族，所以用B族链球菌(Group BStreptococcus,GBS)来替代原名。GBS可导致侵袭性的严重反应，是新生儿、围产期女性、成年人的主要细菌性病原。GBS可引起新生儿败血症、肺炎、脑膜炎，甚至引起死亡，幸存下来的新生儿也可能遗留长期病理状态如耳聋、视力受损、发育障碍仪及脑瘫等。GBS感染会诱发产妇多种疾病，其中孕妇感染表现为菌血症、泌尿系统感染、胎膜感染、子宫内膜感染以及创伤感染。GBS对绒毛膜有较强吸附力和穿透力，通过炎症细胞的吞噬作用及细菌产生的蛋白水解酶的直接侵袭，使胎膜局部张力降低，从而导致胎膜早破。GBS也是一种导致成年人患病的病原体，高危人群是老年人、免疫功能低下者，尤其是糖尿病和恶性肿瘤患者。成年人感染GBS后临床表现多样，包括皮肤、软组织、尿路感染，菌血症，肺炎，关节炎和心内膜炎等。基于GBS感染引起的孕妇和新生儿相关症状、疾病的严峻性，产前筛查GBS显得非常重要。现在产前筛查的方法主要培养基法、免疫法、纳米金法。目前最受青睐的方法是从分子角度对GBS进行临床检测，直接检测GBS的核酸。现有的检测技术主要有荧光定量PCR和微滴式数字PCR等技术，但是这些PCR技术的前提就是提取GBS的核酸，GBS的核酸提取是产前筛查GBS的关键。

目前提取GBS的核酸的方法包括：酚-氯仿提取；煮沸法(中山大学达安基因股份有限公司)；磁珠法(广州美基生物科技有限公司)。但也存在局限性：例如：酚-氯仿提取法，使用的氯仿不仅对人体中枢神经系统具有麻醉作用，还会损伤人体的器官如心脏、肝脏、肾脏等，如果长时间接触低浓度的氯仿可能导致慢性中毒，主要症状为呕吐、消化不良、食欲减退、乏力、头痛、失眠等。如果样本在8个以内，整个提取过程要1个小时，随着样本的增加，提取时间更长。煮沸法，由于其中一步要震荡混匀5分钟，不便操作，该方法同时操作的样本不能超过2个样本，若超过两个样本，提取时间相应延长，在震荡5分钟这一步根本无法正常操作；况且，此方法全过程都需要人工操作，人为因素影响较大，增加了GBS的产前筛查筛查的不稳定性，此方法提出来的核酸浓度一般，但是纯度无法达到后续实验的要求。磁珠法，该方法的前处理采用传统的珠打法，需要用到溶菌酶，其价格昂贵，且费时间，前处理以后，还要用smart32核酸提取仪提取近一个小时。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种使用便捷、高效、安全、自动化B族链球菌DNA提取试剂盒，解决目前同类商品提取效率低、提取时间长、安全性能低等问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种提取B族链球菌DNA的试剂盒，包括如下组分：裂解液、蛋白酶K、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液以及96孔板；所述裂解液为包括盐酸胍的混合溶液；所述洗涤液1为含有高氯酸钠的乙醇水溶液；所述洗涤液2为无水乙醇；所述洗脱液为Tris-Cl缓冲溶液。

优选地，所述裂解液包括如下组分：盐酸胍、糖原、Tris-Cl、柠檬酸钠、NP-40、异丙醇。

优选地，所述所述裂解液包括如下组分：终浓度为8mol/L-12mol/L的盐酸胍、终质量为20mg-40mg的糖原、终浓度为0.06mol/l-0.1mol/l Tris-Cl(pH8.0)、终浓度为0.1mol/L-0.3mol/L柠檬酸钠(pH8.0)、终体积比为0.2％-0.5％的NP-40,终体积为300毫升-400毫升的异丙醇。

本发明裂解液的作用为：除去细胞壁，裂解细胞。盐酸胍是一种很强的蛋白质变性剂，用于变性裂解细胞，提取DNA和RNA，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出来的核酸酶。糖原，属于核酸助沉剂，有助于DNA的提取。pH为8.0的Tris-Cl缓冲液可以维持DNA在裂解液中的正常结构。pH值为8.0的柠檬酸钠对于金属离子络合能力比较强，对Ca²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺等离子有较强络合能力，且拥有良好的pH调节能力。另外，柠檬酸钠还具有良好的缓冲性能及稳定性能。NP-40是一种去污剂，能溶解脂质，增加细胞膜的通透性，助于核酸释放。异丙醇能与水以任意比例互溶，可以洗掉核酸表面的蛋白质，有助于核酸与磁珠结合。

优选地，所述洗涤液1为2.5M的高氯酸钠的50％(v/v)的乙醇水溶液。洗涤液1的作用为能够洗去沾在核酸表面的蛋白质。其中高氯酸钠为强氧化剂，也是高离液盐，能有效洗去蛋白质。

优选地，所述洗涤液2为80％(v/v)的无水乙醇。洗涤液2的作用：因为DNA不溶于乙醇，其他盐离子、糖类等能够溶解的性质，所以能通过洗涤液2洗去沾在核酸表面的盐离子。

优选地，所述洗脱液为pH为8.0，浓度为10mM的Tris-Cl缓冲溶液。洗脱液液的作用：将DNA从磁珠上洗脱下来，并且能够稳定保存核酸。

优选地，所述96孔中裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液按照如下分布：裂解液分装于第1列和第7列；洗涤液1分装于第2列和第8列；洗涤液2分装于第3列和第9列；洗涤液2分装于第4列和第10列；第5列和第11列为空；洗脱液分装于第6列和第12列；

或者，所述96孔中裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液按照如下分布：裂解液分装于第1列、第2列和第7列、第8列；洗涤液1分装于第3列和第9列；洗涤液2分装于第4列和第10列；洗涤液2分装于第5列和第11列；洗脱液分装于第6列和第12列。

本发明还提供一种提取B族链球菌DNA的方法，包括以下步骤：

S1使用本发明所述的试剂盒，在第1列、第7列加入菌液，以及蛋白酶K；或者分别在第1列、第2列、和第7列、第8列中加入菌液，并分别在第1列、第2列、和第7列、第8列加入蛋白酶K；

S2使用自动核酸提取仪，设定参数，然后提取DNA。

本发明的有益效果：

1)本发明提供的方法通过预分装的方法，实现了自动化，摆脱了纯手工提取的方法，很大程度上节省了成本。

2)本发明的通过双孔裂解，使得样本量数量不仅仅局限于250微升，有利于获得更多的核酸。本方案也可应用于其他样本，比如：唾液、全血等。

3)本发明解决了传统方法操作多个样本非常耗时的问题，此方法可以同时操作48个样本，提取时间为45分钟。

附图说明

图1为对比例1的检测结果示意图。

图2为对比例2的检测结果示意图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种提取GBS的DNA的试剂盒，组分包括裂解液、蛋白酶K、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液以及96孔板。

裂解液的配制：在300ml的异丙醇中加入终浓度为8mol/L的盐酸胍、0.06mol/L的Tris-Cl(pH8.0)、0.1mol/L的柠檬酸钠(pH8.0)、20mg的糖原、终体积比为0.2％的NP-40(Nonidet P 40)，再加水定容至1升。

洗涤液1为2.5M的高氯酸钠的50％(v/v)的乙醇水溶液。具体配制方法：称取351.15g高氯酸钠，加入200毫升去离子水进行充分溶解，继续加入500毫升的去离子水，再用去离子水定容至1升。

洗涤液2为80％(v/v)的无水乙醇。

洗脱液为10mM的Tris-cl，pH为8.0。具体配制方法：称取120mg Tris-base,加入去离子水进行充分溶解，调节pH值为8.0，用去离子水定容至1升。

蛋白酶K的配制：在100mg的蛋白酶K干粉中加入5毫升的灭菌水，摇匀，直到气泡消失为止。

试剂盒的制备：在96孔板中，第1列和第7列预分装的是裂解液，第2列和第8列预分装的是洗涤液1，第3列和第9列预分装的是洗涤液2，第4列和第10列预分装的是洗涤液2，第5列和第11列为空，第6列和第12列预分装的是洗脱液。封膜：利用热封仪将96孔板封住。

实施例2

裂解液的配制：在400ml的异丙醇中加入终浓度为12mol/L的盐酸胍、0.1mol/L的Tris-Cl(pH8.0)、0.3mol/L的柠檬酸钠(pH8.0)、40mg的糖原、终体积比为0.5％的NP-40(Nonidet P 40)，再加水定容至1升。

洗涤液2为80％(v/v)的无水乙醇。

试剂盒的制备：在96孔板中，第1列、第2列和第7列、第8列预分装的是裂解液，第3列和第9列预分装的是洗涤液1，第4列和第10列预分装的是洗涤液2，第5列和第11列为洗涤液2，第6列和第12列预分装的是洗脱液。该96孔板中无空孔。封膜：利用热封仪将96孔板封住。

实施例3

本实施例提供一种提取GBS的DNA的方法(本实施例使用实施例1的试剂盒)，包括以下步骤：

1：在桌面轻轻拍打96孔板，让所有试剂回流到孔中，再除去封口膜。

2：在第1列、第7列加入250微升的菌液，和20微升的蛋白酶K。

3：按照表1在核酸提取仪smart 32或者S48上设置提取程序，并将其命名为GBS-程序。

4：点击提取仪上的“开门”，仪器门打开后，一定要将磁力套插到仪器中去(注：没有磁力套，不能做实验)。

5：点击“程序运行”，选择刚刚编号的程序GBS-程序。

6：关闭仪器门，点击“继续运行”，约30分钟后，仪器运行结束。

7：将DNA转移至1.5mL离心管中，保存。

表1：Smart 32或S 48核酸提取仪自动化提取程序

实施例4

本实施例提供一种提取GBS的DNA的方法(本实施例使用实施例2的试剂盒)，包括以下步骤：

2：分别在第1列、第2列、和第7列、第8列中加入250微升的菌液(总样本量为500微升)，并分别在第1列、第2列、和第7列、第8列加入20微升的蛋白酶K。

3：按照表2在核酸提取仪smart 32或者S48上设置提取程序，并将其命名为GBS-双孔裂解程序。

5：点击“程序运行”，选择刚刚编号的程序GBS-双孔裂解程序。

7：将DNA转移至1.5mL离心管中，保存。

表2 Smart 32或S 48核酸提取仪自动化提取程序

对比例1比较提取效率

1、样本处理

采用相同样本，针对不同浓度的菌液提取DNA，同时采用实施例3，单孔的裂解法与对照组，然后进行比较。样本分为原菌液和稀释10倍的，分别命名为A和B。

2、实验方案：

实验组为本发明的方法做了6个，分别编号为①②③④⑤⑥，样本量都是250微升，且都是用100微升洗脱。其中，①②③为A样本(原菌液)，④⑤⑥为B样本(稀释10倍)。

对照组做了2个，分别编号为⑦⑧，样本量都是1毫升，且都是用100微升洗脱。其中，⑦为A样本(原菌液)，⑧为样本(稀释10倍)。对照组中使用的试剂为达安试剂(中山大学达安基因股份有限公司，货号2019009)。

3、操作方法

实验组操作方法参考实施例3。

对照组操作方法如下：

取1mL菌液放入1.5mL离心管中，13000r/min离心5min弃上清，加入1mL清洗液震荡重悬，13000r/min离心5min弃上清，加入100μL核酸提取液同时加入1管提取固形物，用强力震荡器高速旋涡震荡5min。置于95℃恒温干浴器上加热2min，然后迅速移至冰上，放置3min。13000r/min离心1min，上清移至新EP管中备用。

4、结果比较

将实验组与对照组提出的B族链球菌核酸进行荧光定量PCR比较，具体操作如下：

取出GBS-PCR反应液，8个PCR反应管，每管15μL，盖上管盖后转移到加样区避光放4℃冰箱备用。把提取出来的核酸加10μL至PCR反应管中，从左往右，分别为①②③④⑤⑥⑦⑧。用PCR仪进行扩增，扩增后的Ct值越小，说明起始拷贝数越高，即提取的核酸浓度越高。实验组与对照组扩增结果，结果如表3、4；图1、2所示。

表3 实验组(实施例3)与对照组原菌液与稀释菌液的扩增结果

由上表可知，对于原菌液，本发明的实验组测试原菌液的平均ct值为21.20，对照组达安试剂测试原菌液的平均ct值为22.86；对于稀释10倍的菌液，实验组试剂检测的稀释10倍菌的平均ct值为24.72；对照组达安试剂检测稀释10倍菌的平均ct值为26.30。可见本发明的提取试剂盒以及方法更优。

对比例2

对比例2采用实施例4的方法进行实验，结果如表4所示：

表4 实验组与对照组原菌液的扩增结果

注：表中实验组中菌液的体积为250x 2微升(因为是双孔裂解法，每个孔250微升，所以样本量为500微升)，对照组中菌液的体积为500微升。

由上表可知，对于提取相同浓度的菌液，本发明试剂裂解500微升的平均ct值为28.99；手提对照组提取500微升的同浓度菌液的平均ct值为29.55。可见本发明的提取试剂盒以及方法更优。

对比例3

对比例3与实施例1相比唯一区别在于裂解液中缺少盐酸胍。

对比例4

对比例4与实施例1相比唯一区别在于裂解液中缺少柠檬酸钠。

对比例5

对比例5与实施例1相比唯一区别在于裂解液中缺少糖原。

对比例6

对比例6与实施例1相比唯一区别在于裂解液中缺少NP-40(Nonidet P 40)。

用实施例1和对比例3～6的试剂盒提取菌液DNA，操作方法采用实施例3的方法，结果如表5

表5 实施例1和对比例3～6的试剂盒提取菌液DNA的Ct值

Ct值	实施例1	对比例3	对比例4	对比例5	对比例6
						原菌液	21.32	25.36	26.55	26.74	27.21
稀释10倍	24.35	28.66	29.84	29.47	30.42

由表5可知，本发明的裂解液中各组分具有协同增效的作用，缺少其中任何一种都会影响菌液DNA的提取效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种提取B族链球菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分：裂解液、蛋白酶K、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液以及96孔板；所述裂解液为包括盐酸胍的混合溶液；所述洗涤液1为含有高氯酸钠的乙醇水溶液；所述洗涤液2为无水乙醇；所述洗脱液为Tris-Cl缓冲溶液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括如下组分：盐酸胍、糖原、Tris-Cl、柠檬酸钠、NP-40、异丙醇。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括如下组分：终浓度为8mol/L-12mol/L的盐酸胍、终质量为20mg-40mg的糖原、终浓度为0.06mol/l-0.1mol/l Tris-Cl(pH8.0)、终浓度为0.1mol/L-0.3mol/L柠檬酸钠(pH8.0)、终体积比为0.2％-0.5％的NP-40,终体积为300毫升-400毫升的异丙醇。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液1为2.5M的高氯酸钠的50％(v/v)的乙醇水溶液。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液2为80％(v/v)的无水乙醇。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为pH为8.0，浓度为10mM的Tris-Cl缓冲溶液。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述96孔中裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液按照如下分布：裂解液分装于第1列和第7列；洗涤液1分装于第2列和第8列；洗涤液2分装于第3列和第9列；洗涤液2分装于第4列和第10列；第5列和第11列为空；洗脱液分装于第6列和第12列；

8.一种提取B族链球菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2使用自动核酸提取仪，设定参数，然后提取DNA。